一种基于碳纳米点的复合纳米点及其制备工艺的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及应用于荧光生物成像技术的复合碳纳米点及其制备、纯化工艺。
【背景技术】
[0002]荧光成像是近十年来新兴的活体与离体生物光学成像技术，因其具备操作简便，对生物损伤小，成像结果直观、测量快速、灵敏度高及测量成本低等诸多优点而成为离体生物样本、活体小动物成像的一种理想方法。利用这种成像技术，可以直接实时观察被标记的基因或细胞在活体动物体内的分布和参与的生物、病理过程及反应，因而广泛运用于研究各种疾病的发生发展过程、药物的作用机制、体内代谢和新药的筛选。荧光探针是荧光成像技术中的核心组成部分，它直接决定了成像的部位、成像时间以及图像重建后的清晰度，因此荧光成像技术主要取决于荧光探针的不断发展与功能化。目前最常见的荧光探针是有机荧光染料和量子点，不过有机荧光染料存在抗光漂白的能力差，半衰期短等缺点，而量子点虽然在这两方面有本质的改善，但其生物相容性差，细胞毒性大从而限制了其进一步的广泛运用。
[0003]碳纳米点以其化学惰性、光闪烁缺乏、光漂白率低、毒性低、生物相容性好等优点日益受到关注。碳纳米点可以应用于多个领域，诸如生物成像、光催化、检测、激光、LED、能量储存与转变装置等。近期在碳纳米点合成方法领域的进展使其可以经由完善的碳结构(比如graphene、多壁碳纳米管)通过从上到下法(top?down)制得，或者是经由含碳的化学物质(比如梓檬酸钱和乙二胺四乙酸)通过从下到上法(down?top)制得。值得注意的是，这些方法制得的碳纳米点都需要表面氧化或钝化才能够发光和具备水溶性。另外，一步法制备得到表面钝化的碳纳米点(如微波反应法)也有报道，它具有启动敏捷、加热易控制、加热过程均匀等优点。
[0004]近年来，近红外荧光探针因其性噪比大、背景干扰强、生物穿透性强(可对较深的组织进行成像)而成为研究的热点，本发明采用的亚甲基蓝(Methylene Blue)是被美国食品药品监管局(FDA)认证的荧光成像染料，其发射波长700纳米左右，属于近红外区域，但由于这种染料体内稳定性较差，代谢周期短等不足，需要构建负载染料分子的载体以提高其在生物环境内的稳定性。将碳纳米点与焚光染料相结合构建复合焚光碳纳米点有利于最终实现这一复合生物材料在生物成像与临床成像等领域的广泛应用。
【发明内容】
[0005]本发明的第一个目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种基于碳纳米点的复合纳米点，该复合纳米荧光造影材料具有良好的生物相容性和安全性，荧光成像灵敏度高，有望在生物医学影像、靶向诊断与治疗、药物筛选与优化、体内标记与示踪等领域得到更广泛的应用，并在个性化医疗等方面具有潜在价值。
[0006]本发明的第二个目的在于提供一种操作安全、快速简便、成本低廉的一步法微波辐射制备水溶性复合碳纳米点及对其高效分离纯化的方法，使所得的碳纳米点可用于负载亚甲基蓝染料分子以实现高灵敏度的荧光成像。所提供的上述复合碳纳米点制备与纯化的工艺操作安全、快速简便、成本低廉，易实现产业化生产。
[0007]为实现本发明的第一个目的，本发明公开了一种以碳纳米点为主体组分，以荧光染料分子为负载组分的纳米复合物。制备碳纳米点所用的碳源可以为枸杞浸出液、豆浆或食用牛奶中的任一种，负载组分为亚甲基蓝，粒子直径范围为100?500纳米，电位范围为-30?10毫伏，亚甲基蓝在复合纳米点中的浓度为1?10微克/毫升。
[0008]为实现发明的第二个目的，本发明提供如下技术方案:一种所述的基于碳纳米点的复合纳米点的制备工艺，其特征在于包括以下步骤:
a.取所述碳源和0.5毫克/毫升亚甲基蓝溶液，按体积比0.1:1?10:1混合，混合液用超纯水稀释1?10倍，制得前体溶液；
b.将上述前体溶液放置微波反应仪中，仪器参数设置为:温度100?180°C、时间30?300分钟；
c.反应体系静置30分钟以上，离心分离出上清液，即得复合碳纳米点粗产物；
d.对复合纳米点的粗产物进行纯化。
[0009]可采用超滤或透析的方法对上述复合碳纳米点粗产物进行纯化，获得可用于荧光成像的基于碳纳米点的复合纳米点。
[0010]本发明采用的微波辐射制备水溶性碳纳米点的方法，完全在水相中进行，操作安全，快速简便，毒性小，原料安全易得。经过透析与超滤纯化后所得的水溶性碳纳米点有很好的单分散性，荧光性质和量子产率高，稳定性好，具有良好的水溶性，可以作为荧光标记物广泛用于生物检测和分析，对发展医用荧光造影材料、拓展荧光造影剂的制备工艺、为荧光成像在生物医学领域的广泛适用性具有重要意义。
[0011]下面结合说明书附图和【具体实施方式】对本发明做进一步介绍。
【附图说明】
[0012]图1为复合碳纳米点的制备工艺流程框图；
图2a为实施例1复合碳纳米点的粒度分布图；
图2b为实施例1复合碳纳米点的电位表征图；
图3a为实施例2复合碳纳米点的粒度分布图；
图3b为实施例2复合碳纳米点的电位表征图；
图4a为实施例3复合碳纳米点的粒度分布图；
图4b为实施例3复合碳纳米点的电位表征图；
图5a为实施例1复合碳纳米点的激发波长340?440的荧光谱图；
图5b为实施例1复合碳纳米点的激发波长650的荧光谱图；
图6a为实施例2复合碳纳米点的激发波长340?440的荧光谱图；
图6b为实施例2复合碳纳米点的激发波长650的荧光谱图；
图7a为实施例3复合碳纳米点的激发波长340?440的荧光谱图；
图7b为实施例3复合碳纳米点的激发波长650的荧光谱图；
图8为单纯碳纳米点与复合碳纳米点体外荧光成像效果对比图；
图9为小鼠尾静脉注射