可吸附蜂毒肽的水凝胶纳米颗粒的制备方法及其亲和性的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药材料制备领域，具体涉及一种可吸附蜂毒肽的水凝胶纳米颗粒的制备方法及其与蜂毒肽之间亲和性的检测方法。
【背景技术】
[0002]水凝胶纳米颗粒(nanoparticles hydrogels，NPs)含水量高，类似于生物组织，有良好的生物相容性。纳米水凝胶内部可以负载具有生物活性的组分，并且对外界刺激如温度、pH值、光等产生响应会发生体积、折光系数、凝胶网络通透性等变化。人们致力于制备各种各样的NPs，其与生物分子如多肽、蛋白质亲和吸附作用制成稳定性好、可靠且可大规模生产的、达到取代抗体的目的的研究，并且这种NPs廉价易得，在生物纳米技术领域引起了广泛的关注。
[0003]生物大分子间(如蛋白质-蛋白质)的相互作用有静电作用、亲水/疏水作用以及在三维立体结构界面上互补的范德华力。而一般这种NPs的构建则也可具备多种官能团，通过静电作用、氢键作用、三维立体结构界面上互补的范德华力，或者亲水/疏水作用识别复杂如蛋白质、多肽或碳水化合物等生物靶标。可以通过调控和优化共聚反应的单体组成和比例，从而达到这种纳米颗粒的构建。
[0004]特别地，这种NPs可以捕获毒素分子，并且可以在活体中进行毒素中和，有“塑料抗体(plastic antibody)”之称。与小分子解毒剂相比，这种由NPs制成的“塑料抗体”通过多位点相互作用，与目标物生物大分子表面接触的区域更大，从而更有效地中和目标毒素的毒性。并且，NPs尺寸足够小，几乎能达到体内的各个地方，比如毛细血管、器官，甚至体内细胞。
[0005]蜂毒肽(蜂毒肽)又称溶血肽，是一种典型的阳离子多肽，由26个氨基酸残基组成，分子量为2840，是蜂毒中最主要的活性成分，约占蜂毒干重的50%。蜂毒肽能够在各种肿瘤细胞中诱导细胞周期阻滞、增长抑制、凋亡和坏死。它对人类肝细胞瘤和神经胶质瘤细胞系产生明显的生长抑制和细胞毒性。它具有两性分子属性，通过造成缺陷、破坏或气孔形成，扰乱细胞膜双分子层的完整性。由此产生脂质双分子层的开放将导致跨膜电化学梯度的崩溃。所以这个特性决定蜂毒肽既可以溶于水中，又可以与膜自然结合，进而可溶解细胞，具有强溶血作用或肥大细胞的脱颗粒作用，它的溶血性能是一个有效的定量评价手段。
[0006]加州大学的Shea课题组[YuH,Lee S H,Kanazawa H，et al.Proceedings of theNat1nal Academy of Sciences，2012，109( 1):33-38.]基于N_叔丁基丙稀酰胺、N_异丙基丙烯酰胺和丙烯酸三种单体合成的NPs人工合成了蜂毒肽的抗体，并且将其运用于老鼠的活体试验中，获得良好的效果。但目前本发明中涉及到的一种可吸附蜂毒肽的水凝胶纳米颗粒的制备及亲和性检测方法尚未见文献报道。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的问题是提供一种可吸附蜂毒肽的水凝胶纳米颗粒的制备及亲和性检测方法。
[0008]为了解决上述问题，本发明提供了一种可吸附蜂毒肽的水凝胶纳米颗粒的制备方法，其特征在于，将N，N-二乙基丙烯酰胺(DEA)和丙烯酸(AAc)单体、交联剂及乳化剂按比例用去离子水溶解于容器中，并在室温下鼓入氮气除氧，磁力搅拌，反应温度升至60-80°C，保温20min-60min并且保持氮气气氛，加入引发剂引发聚合反应3_6h，透析，即得水凝胶纳米颗粒溶液。
[0009]优选地，所述交联剂为N，N’_亚甲基双丙烯酰胺;其添加量为单体质量总和的1%-15%。
[0010]优选地，所述乳化剂为十二烷基硫酸钠;其添加量为单体质量总和的1%-7%。
[0011 ]优选地，所述引发剂为过硫酸铵;其添加量为单体质量总和的0.1 。
[0012]优选地，所述透析步骤具体为:采用去离子水浸泡3-7天，每天换一次水。
[0013]进一步地，所用透析袋的截留分子量为8000-14000。
[0014]本发明提供了上述可吸附蜂毒肽的水凝胶纳米颗粒亲和性的检测方法，其特征在于，配制4 % -10 %的血红细胞溶液，取1 OOyL将其与70yL的水凝胶纳米颗粒、1 OyL的磷酸盐缓冲溶液(PBS)及20yL的蜂毒肽溶液在离心管中混合，于37°C下保温30min;然后，将其在37°C离心5min，将100yL上清液转移至新的离心管中，用UV-Vis表征上清液吸光度的变化;测定红细胞100%溶血和红细胞在缓冲液中自发溶血的两组吸光度值，中和溶血百分数即可直观地反应蜂毒肽对红细胞的溶血作用，从而判断纳米颗粒对蜂毒肽的吸附作用。若纳米颗粒对蜂毒肽有吸附效果，则保护了红细胞阻止其发生溶血。
[0015]其中，中和溶血百分数=(样品吸光度-阴性对照组吸光度)/(阳性对照组吸光度-阳性对照组吸光度)X 100%。
[0016]优选地，所述血红细胞为牛血红细胞。
[0017]优选地，所述磷酸盐缓冲溶液浓度为0.01M-0.1M。
[0018]优选地，所述蜂毒肽溶液浓度为5_50μΜ。
[0019]优选地，所述离心时的离心力为1000-10000g。
[0020]本发明以N，N_二乙基丙烯酰胺(DEA)、丙烯酸(AAc)为单体共聚，合成温敏性的聚合物纳米颗粒对蜂毒肽进行控制和释放，采用溶血性试验检测NPs与蜂毒肽之间的亲和性。
[0021]本发明的有益效果在于:
[0022](1)本发明采用的合成均在水相中完成，使用的单体和助剂均为常见试剂，绿色环保且容易实现，使这种NPs具有廉价易得的优点。
[0023](2)本发明的NPs对蜂毒肽有明显的吸附效果，NPs与蜂毒肽之间有亲和力。这种NPs稳定性好、可靠且可大规模生产，有望达到取代抗体的目的。
【附图说明】
[0024]图1为不同单体比例的P(DEA/AAc)水凝胶纳米颗粒对蜂毒肽的吸附效果(DEA:AAc,wt%:(a)90%/10%(b)80%/20%(c)70%/30%(d)60%/40%)
【具体实施方式】
[0025]为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
[0026]实施例1
[0027](1)水凝胶纳米颗粒的制备:
[0028]取0.45gDEA、0.05gAAc、0.025g交联剂N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、0.025g乳化剂十二烷基硫酸钠溶于50mL超纯水中，并在室温下鼓入氮气除氧，磁力搅拌，反应温度升至70°C，保温30min并且保持氮气气氛，加入0.0025g引发剂过硫酸铵，继续反应4h。然后把所得反应物浸泡于超纯水中透析7天，每天换一次水，去除残留反应原料及反应体系中的电解质，即得。
[0029](2)水凝胶纳米颗粒吸附蜂毒肽的溶血性中和试验:
[0030]配制6%的血红细胞溶液，取100yL将其与70yL的NPs(其中NPs的浓度调为五组分别为5，10，50，100，500μg/mL，NPs的单体比例DEA:AAc为90%/10%，wt%)、10μL的磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.1M)及20yL的蜂毒肽(18μΜ)溶液在离心管中混合。于37°C下保温30min。在37°C离心(3，000g)5min，将100yL上清液转移至新的离心管中。用UV-Vis表征上清液吸光度的变化。
[0031]实施例2
[0032](1)水凝胶纳米颗粒的制备:
[0033]取0.40gDEA、0.10gAAc、0.025g交联剂N，N’-亚甲基双丙烯酰