活性 组分来将所述药物组合物配制为用于缓释。设计缓释形式以通过维持恒定的药物水平特定 的时间段而在预定的速率下释放活性成分。这可通过多种剂型而实现，包括但不仅限于脂 质体及药物-聚合物的结合物，如水凝胶。
[0112] 在另一个实施方式中，将所述药物组合物配制为用于延迟释放，从而使得所述活 性组分在给药时并不立即释放。延迟释放载体的非限定性实例为在肠中而非胃中溶解的肠 溶衣口服药物。
[0113] 在另外的实施方式中，将所述药物组合物配制为一部分所述活性组分即刻释放， 剩余活性组分随后缓释。在一个实施方式中，所述药物组合物被配制为可被服用以使所述 活性组分快速释放的粉剂。在另一个实施方式中，所述药物组合物被配制为液体、胶体、液 态的悬浮液或乳剂的形式。所述液体、胶体、悬浮液或乳剂可以裸剂的形式或包含于胶囊中 而被受治者服下。
[0114] 在再一个实施方式中，所述药物组合物可被提供为皮肤或透皮贴剂以控制和/或 持久地局部施用所述活性组分。
[0115]实施例
[0116]以下实施例描述了本发明选择的方面和实施方式，尤其是描述了 ASIC抑制作用的 体外和体内效果的数据，以及示例性的用作抑制剂的胱氨酸结肽。这些实施例用于说明的 目的，而不应当被理解为限定本发明的范围。
[0117] 实施例1:通过阻塞可渗透钙的酸敏感离子通道的局部缺血的神经保护
[0118] 参见图2-10,此实施例描述了显示ASICla在调解局部缺血性损伤中的作用以及 ASICla抑制剂减轻局部缺血性损伤的能力的实验。Ca2+毒性在局部缺血性脑损伤中扮演了 关键性的角色。由于谷氨酸拮抗剂的大量人体试验显示在中风中不能有效的保护神经，在 局部缺血的脑部中发生细胞的毒性Ca 2+负载的机理变得尚不明朗。酸中毒是局部缺血的常 见特征，并在脑损伤中扮演了关键性的角色。此实施例证实:酸中毒激活了可导致与谷氨酸 受体无关的、与Ca 2+有关的神经元损伤的可渗透Ca2+的酸敏感离子通道(ASIC)。因此，缺乏 内源性的ASIC的细胞可抵御酸的损害，而可渗透Ca 2+的ASICla的转染则可建立敏感性。在局 灶性缺血中，侧脑室注射ASICla阻滞剂或敲除ASICla基因可保护大脑免遭局部缺血性损 伤，并可比谷氨酸拮抗作用产生更大的效力。
[0119] 正常的大脑需要葡萄糖的完全氧化以满足其能量需求。在局部缺血期间，氧气耗 尽迫使大脑切换到无氧糖酵解。作为糖酵解的副产物的乳酸与ATP水解产生的质子的积累 会导致局部缺血的大脑中的pH的下降并加剧局部缺血性脑损伤。
[0120] 酸敏感离子通道(ASIC)为一类在哺乳动物中枢和周围神经系统的各处神经元表 达的配体门控通道。迄今为止，已克隆了六种ASIC亚单位。这些亚单位中的四种形成由酸性 pH激活的功能性的同源多聚(homomul t imer i c)通道，以传导钠选择性的、阿米洛利敏感的 阳离子电流。所述ASIC亚单位中的两种(ASICla和ASIC2a亚单位)已被证明富含于大脑中。
[0121] 实验过程
[0122] 神经元的培养
[0123] 氟烷麻醉之后，从E16瑞士小鼠 （Swiss mice)或P1ASIC1+/+和ASICl-/-小鼠身上解 剖出大脑皮层，并在37 °C下用0.05 %的胰蛋白酶-EDTA孵育10分钟。然后用火焰抛光的玻璃 吸管将组织捣碎，以2 X 105细胞/孔或106细胞/盖玻片的密度放置于聚-L-鸟氨酸涂覆的24 孔培养板或25 X 25mm玻璃盖玻片上。神经元用补充了 10%马血清的MEM(用于E16的培养)或 补充了B27的神经基质培养基(Neurobasal medium)(用于P1的培养)来培养，并在12天之后 用作电生理学和毒性的研究。通过添加5-氟-2-脱氧尿苷和尿苷来抑制神经胶质的生长，制 得了含90%神经元（由NeuN和GFAP染色法(数据未显示)所测定）的培养细胞。
[0124] 电生理学
[0125] ASIC的电流用全细胞膜片钳(whole-cel 1 patch-clamp)和快速灌注技术(€881：-perfusion technique)来记录。正常的细胞外溶液(ECF)包含（单位mM): 140NaCl、5.4KC1、 25HEPES、20葡萄糖、l·3CaCl2、l·0MgCl2、0·0005TTX(pH7·4)、320-335m0sm。为生成低pH溶 液，加入了各种不同量的HC1。对于pH〈6.0的溶液，采用MES代替HEPES以更可靠地缓冲pH。贝占 片电极包含（单位mM) :140CsF、2.0MgCl2、1.0CaCl2、10HEPES、llEGTA、4MgATP(pH 7.3)、 300m0sm。无 Na+的溶液由10mM CaCl2、25mM HEPES组成，并以等渗的NMDG或蔗糖来替代NaCl (Chu et al. ,2002)。利用多管灌注系统（SF_77B，Warner Instrument公司）以供溶液的快 速交换。
[0126] 细胞损伤试验--LDH测定
[0127] 将细胞用ECF洗涤三次，随机分为治疗组。在所有组中加入MK801 (ΙΟμΜ)、CNQX(20y Μ)和尼莫地平(nim〇dipine)(5yM)以消除谷氨酸受体和电压门控Ca2+通道的潜在的二次激 活。之后是酸孵育，37°C下在神经基质培养基中洗涤和孵育神经元。利用LDH测定工具 (Roche Molecular Biochemicals公司）在培养基中测定了LDH的释放。将介质（100yL)由培 养孔转移至96孔培养板中，并与所述工具所提供的100yL的反应溶液混合。30分钟后，利用 酶标仪(Spectra Max Plus，Molecular Devices公司）在492nm处测定了光密度。减去在620 处的背景吸收。通过在各个实验的结尾用1 %的Triton X-100的孵育15分钟，在各个孔中获 得了最大释放的LDH。
[0128] Ca2+成像
[0129] 将在25 X 25mm玻璃盖玻片上生长的皮层神经元用ECF洗涤三次，并在22°C下用5μΜ 的Fura-2乙酰氧基甲基酯孵育40分钟，洗涤三次，再在常规ECF中孵育30分钟。在倒置显微 镜(Nikon TE300)上将盖玻片转移至灌注室中。用氙灯照亮细胞，并用40x UV的萤石油浸物 镜观察，并利用冷却的CCD摄影机（Sensys KAF 1401，Photometries公司）获得了影像。在 Axon成像工作台软件（Axon Imaging Workbench software)(Axon Instruments公司）控制 的PC中获得并分析了数字图像。通过所述软件控制快门和滤光轮(Lambdal〇-2)以使得细胞 在340或380nm激发波长下定时发光。在510nm的福射波长处检测到了Fura-2焚光反应。凭借 视野内的细胞的限定区域中的平均像素比值分析了比率图像(340/380)。所述值被输出至 SigmaPlot以供进一步的分析。
[0130] 荧光素二乙酸酯染色与碘化丙啶吸收
[0131] 细胞在含有荧光素二乙酸酯(FDA)(5yM)和碘化丙啶(ΡΙ)(2μΜ)的ECF中孵育30分 钟，之后用不含染料的ECF洗涤。在配备有对于ΡΙ在580/630nm处激发/辐射和对于FDA在 500/550nm处激发/辐射的外荧光的显微镜(Zeiss)上观察和计数存活(FDA阳性)和死亡(PI 阳性)的细胞。利用配备有BQ 8000sVGA图像采集卡的光电DEI-730摄像机收集图像，并用计 算机软件(Bioquant，TN公司）来分析。
[0132] C0S-7细胞的转染
[0133] 在含10%HS和l%PenStrep(GIB⑶）的MEM中培养了⑶S-7细胞。在~50%的融合 下，利用FuGENE6转染剂(Roche Molecular Biochemicals公司），米用在pcDNA3载体中的用 于ASIC与GFP的cDNA共转染了细胞。用于ASIC的DNA(0.75yg)和0.25yg的用于GFP的DNA被用 于每个35mm培养皿中。选取GFP阳性的细胞以在转染后用膜片钳记录48小时。为稳定ASICla 的转染，在所述转染一周后将500yg/mL的G418加入到培养基中。在G418的存在下，幸存的耐 G418的细胞被进一步地培养并传递>5代(passage)。然后细胞用膜片钳和免疫荧光染色来 检查，用于ASICla的表达。
[0134] 氧糖剥夺（Oxygen-Glucose Deprivation)
[0135] 35°C 下在含 85%Ν2、10%Η2 和 5%C〇2 的气体的厌氧室（Model 1025，Forma Scientific公司）中，在pH 7.4或6.0下神经元被不含葡萄糖的ECF洗涤三次及孵育。1小时 后通过在常规的细胞培养孵育器中用神经基质培养基替换所述不含葡萄糖的ECF并孵育培 养物而终止氧糖剥夺(0GD)。随着HEPES缓冲的ECF的使用，1小时的0⑶使pH由7.38稍稍降低 至7·28(η = 3)和由6.0稍稍降低至5·96(η = 4)。
[0136] 局灶性缺血
[0137] 通过使利用1.5 %异氟烷、70 %Ν20和28.5 %02而麻醉的插管和通气的雄性大鼠 (SD，250-300g)和小鼠（具有同类系C57B16的背景，~25g)的大脑中动脉的线栓(MCA0)而引 发了短暂的局灶性缺血。用恒温控制的加热板和发热灯将直肠和颞肌的温度维持在37°C± 0.5°C。通过经颅激光多普勒来监测脑部血流。剔除血流未降低20%以下的动物。
[0138] 局部缺血24小时后用水合氯醛杀死动物。快速取出脑部，间隔1mm(小鼠）或2mm(大 鼠）冠状切片，并通过浸入活体染料(2 % ) 2，3，5-三苯基四氮唑盐酸盐(TTC)中来染色。通过 从未局部缺血的半球的面积中减去局部缺血的半球中被TTC染色的正常区域来计算梗死面 积。通过加和所有切片的梗死面积并乘以切片厚度来计算梗死体积。采用具有在后部至前 囟0.8mm、侧边至中线1.5mm以及腹侧至硬脑膜3.8mm的立体定位下插入的导管的微量注射 栗，通过立体定位技术进行了大鼠的脑室注射。所有的操作和分析均通过不知所属治疗组 的个体来进行。
[0139] 莖里
[0140] (a)酸中毒激活小鼠的皮层神经元的ASIC
[0141] 图3和4显示了关于培养小鼠的皮层神经元的ASIC的电生理学和药理学的示例性 数据。图3A和3B为图示了通过pH由7.4降至所示的pH值而激活的ASIC电流的pH相关性的图 表。剂量响应曲线符合具有6.18±0.06的平均pH Q.5的Hill公式(n=10)。图3C和3D为图示了 ASIC的电流-电压关系的图表(n = 5)。使在各个电压下的ASIC电流的幅度向在-60mV下记录 的标准化。图4A和4B为图示了阿米洛利所造成的ASIC电流的剂量依赖性阻滞的图表，IC 50 = 16.4±4.1以]?小=8。图4(：和40为图示了？(^乂毒素所造成的431(：电流的阻滞的图表，**?〈 0.01ο
[0142] 记录了培养小鼠的皮层神经元的ASIC电流(参见图3)。_6〇11^的维持电势下，在大 多数的神经元中，细胞外的pH(pH e)急速下降至低于7.0诱发了具有少量稳态成分的较大的 瞬态内向电流（图3)。内向电流的幅度随着pHe的下降而以S形上升，生成了6.18 ± 0.06的 pHo. 5 (η = 10，图3B)。获得了线性I -V关系和接近于Na+平衡电势的逆转(n = 6,图3C和3D)。这 些数据证实：降低pHe可激活小鼠的皮层神经元中常见的ASIC。
[0143] 测试了阿米洛利，ASIC的非特异性阻滞剂，对酸激活电流的影响(参见图4)。如图4 所示，阿米洛利剂量依赖性地阻滞了皮层神经元中的ASIC电流，IC 5Q为16.4 ±4.1μΜ(η = 8， 图4Α和4Β)。图4C和4D中显示了PcTX毒素对皮层神经元中的酸激活电流的影响。在100ng/mL 下，PcTX毒素可逆地阻滞了 ASIC电流的47%±7%的峰值幅度(11=15，图4(：和40)，表明同源 的ASICla对总的酸激活电流的显著贡献。在大多数的皮层神经元中，提高PcTX的浓度并不 会导致ASIC电流的幅度的进一步的下降(n = 8,数据未显示），表明在这些神经元中共存有 PcTX不敏感的ASIC(例如，异源的ASICla/2a)。
[0144] (b)通过模拟的局部缺血增强了ASIC响应
[0145]图5显示了表明模拟的局部缺血可提高ASIC的活性的示例性数据。图5A为一系列 显示了 1小时的0GD之后ASIC电流的幅度的上升和去敏感作用的下降的示例性曲线。图5B为 阐释了在0GD神经元中ASIC电流幅度的上升的概括性数据的图表，N = 40和44，*p〈0.05。图 5C为一系列显示了在0GD神经元中的下降的ASIC电流去敏感作用的示例性曲线和概括性数 据，~=6，*邙〈0.01。图50为一对显示了1小时的060之后，控制条件下在八31(：1_ /_神经元中在 pH6.0缺乏酸激活电流的示例性曲线(η = 12和13)。
[0146] 由于酸中毒可能是脑局部缺血的首要特征，决定测试ASIC是否可在局部缺血条件 下被激活以及局部缺血是否可改变这些通道的特性，参见图5。记录1小时的氧糖剥夺(0GD) 后神经元中的ASIC电流。简而言之，将一组培养物用不含葡萄糖的细胞外液(ECF)洗涤三次 并接受0GD，同时使对照培养物接受含葡萄糖的ECF的洗涤并在常规的细胞培养孵育器中孵 育。1小时后通过在所述常规的孵育器中用神经基质培养基替换不含葡萄糖的ECF并孵育培 养物而终止0GD。然后当神经元不存在形态学上的变化时，在所述0GD之后1小时记录ASIC电 流。0GD的治疗导致了 ASIC电流的幅度的平缓上升(对照组中1520±138pA，N = 44;Pj_0GD 后的神经元中1886±185?44 = 40，？〈0.05，图5六和58)。更重要的是，电流衰减的时间常数 的增大表明，0⑶导致了 ASIC去敏感作用的突然降低(对照组中814.7 ± 58.9ms，N=6; 0⑶后 的神经元中1928.9±315.71118小=6，？〈0.01，图54和5〇。类似于之前在海马神经元中的研 究(Wemmie et al ·，2002)，在来自ASIC1V-小鼠的培养皮层神经元中，pH由7 · 4降低至6 · 0并 不会激活任何的内向电流(n = 52)。在这些神经元中，1小时的0GD并不会激活或增强酸引发 的响应（图?，η = 12和13)。
[0147] (c)酸中毒引发经由ASICla的与谷氨酸无关的Ca2+的进入
[0148] 图6和7显示了表明皮层神经元中的ASIC可以是可渗透的Ca2+，且Ca2+的渗透性可 取决于ASICla的示例性数据。图6A显示了用含10mM Ca2+的无 Na+的ECF作为仅有的电荷载体 获得的示例性曲线。在PH6.0下记录了内向电流。校正液体接界电势(n = 5)之后的平均逆转 电势为~_17mV。图6B显示了阐释由阿米洛利和PcTX毒素造成的Ca2+介导的电流的阻滞的代 表性曲线和概括性数据。Ca 2+介导的电流的峰值幅度通过1 ΟΟμΜ阿米洛利(n = 6，p〈0.01)降 至对照组值的26%±2%以及通过100即/11^?(^父毒素(11 = 5，口〈0.01)降至22%±0.9%。图 7A显示了表明由pH降至6.0导致的[Ca2+]i的上升的作为pH的函数的示例性的340/380nm比 率。将神经元浸入具有用于电压门控Ca 2+通道的阻滞剂（5μΜ尼莫地平和ΙμΜω-芋螺毒素 MVIIC)和谷氨酸受体（ΙΟμΜ MK801和20μΜ CNQX)的含1.3mM CaCl2的常规ECF中。图7A的小 图显示了示例性的1〇〇μΜ阿米洛利对[Ca2+]^酸诱导上升的抑制。图7B显示了阐释相比于 PH6.0组，阿米洛利和PcTX毒素对[Ca2+]^?诱导上升的抑制的示例性的概括性数据，N = 6-8，*邙〈0.01。图7(：显示了匪04出现/缺席时作为口!1的函数的示例性的340/38011111比率，证 实ASIC1 V_神经元中缺乏[Ca2+]i的酸诱导上升;神经元具有对NMDA的正常响应(n = 8)。图7D 显示了阐释在ASIC1V_神经元中在pH6.0时缺乏酸激活电流的示例性曲线。
[0149] 利用标准离子置换方案(Jia et al.，Neuron，1996,17:945-956)和Fura-2荧光反 应的Ca2+成像技术(Chu et al ·，2002，J.Neurophysiol · 87:2555-2561)确定了皮层神经元 中的ASIC的Ca2+渗透性。利用含有10mM Ca2+的浴溶液(不含Na+和不含K+)作为仅有的电荷载 体并在-60mV的维持电势下，我们记录下18个神经元中的15个的内向电流大于50pA，显示了 大多数皮层神经元中的ASIC的显著的Ca 2+渗透性（图6A)。与同源ASICla通道的激活相一致， 10mM Ca2+所承载的电流被非特异性ASIC阻滞剂阿米洛利和ASICla特异性阻滞剂PcTX毒素 极大地阻滞（图6B)<Xa 2+介导的电流的峰值幅度通过100μΜ阿米洛利(n = 6，p〈0.01)降至对 照的26%±2%以及通过100ng/mL PcTX毒素 (n = 5，p〈0.01)降至22%±0.9%。在其它主要 Ca2+进入途径的阻滞剂(针对谷氨酸受体的MK801 1 ΟμΜ和CNQX 20μΜ;针对电压门控Ca2+通 道的尼莫