地平5μΜ和ω -芋螺毒素 MVIIC ΙμΜ)的存在下，Ca2+成像证实:20个神经元中的18个 对pH下降作出了响应，其具有可检测到的细胞内CahaCalO的浓度的升高（图7A)。一般而 言，[Ca 2+]i残余会在低pH溶液的长期灌注期间升高。在一些细胞中，[Ca2+]i升高的持续时间 甚至长于酸灌注的持续时间（图7A)。长期持续的Ca 2+响应表明在无损神经元中的ASIC响应 可能会比在全细胞记录中更少地被去敏感，或表明经由ASIC的Ca 2+的进入可引发随后的自 细胞内存储的Ca2+释放。采用ΙμΜ毒胡萝卜内酯(thapsigargin)的神经元预孵育部分地抑制 了 Ca2+升高的持久成分，表明自细胞内存储的Ca2+释放也可促进酸诱导细胞内Ca2+的累积(η =6,数据未显示）。类似于Ca2+离子承载的电流（图6B)，[Ca2+]^峰值和持续升高被阿米洛 利和PcTX毒素极大地抑制（图7A和7B，n = 6-8)，这与酸诱导[Ca2+]i的升高中同源ASICla的 参与相一致。ASIC1基因的敲除在所有神经元中消除了酸诱导[Ca^h的升高而不会影响 NMDA受体介导的的Ca2+响应（图7C，n = 8)。膜片钳的记录证实了 52个ASIC1V_神经元中的52 个在pH6.0处缺乏酸激活电流，这与ASICla亚单位的缺席相一致。然而，将pH降至5.0或4.0， 在52个ASIC1 V_神经元中的24个中激活了可检测到的电流，表明这些神经元中ASICla亚单 位的出现（图7D)。进一步的电生理学研究表明ASIC1+神经元具有对各种电压门控通道和 NMDA、GABA受体门控通道的正常响应(数据未显示）。
[0150] (d)ASIC的阻滞保护了酸中毒引发的、与谷氨酸无关的神经元损伤
[0151] 图8显示了表明酸孵育可引发与谷氨酸受体无关的受ASIC的阻滞所保护的神经元 损伤的示例性数据。图8A和8B显示了相比于相同时间点的pH7.4组(通过幸存神经元的细胞 体染色和死亡神经元的核的碘化丙啶(PI)染色，还分析了用荧光素二乙酸酯(FDA)的酸诱 导神经元损伤），通过皮层神经元在PH7.4(实心柱）或6.0 (空心柱）的ECF中孵育1小时（图 8A)或24小时（图8B)所引发的与时间相关的LDH释放的示例性数据的图表，N = 20-25孔，*p〈 0.05，以及林p〈0.01。图8C显示了阐释由100μΜ阿米洛利或100ng/mL PcTX毒素所造成的酸 诱导LDH释放的抑制的图表(n = 20-27，*p〈0.05，以及林p〈0.01)。对于所有的实验，在ECF中 均存在MK801、CNQX和尼莫地平（图8A-C)。
[0152] 参见图8，研究了在pH7.4或6.0的含MK801、CNQX和尼莫地平的ECF中孵育的24孔培 养板上生长的神经元的酸诱导损伤。通过测定各个时间点的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH)的释放（Koh and Choi,J.Neurosci. ,1987,20:83-90)(图8A和8B)及 通过幸存/死亡细胞的荧光染色测定了细胞损伤。相比于pH7.4下处理的神经元，1小时的酸 孵育（pH6.0)引发了 LDH释放的时间相关性增长（图8A)。24小时后，引发了最大LDH释放的 45.7%±5.4%(11 = 25孔）。？册.0下的持续处理引发了更大的细胞损伤（图88，11 = 20)。与 LDH测定相一致，采用荧光素二乙酸酯和碘化丙啶的幸存/死亡染色显示出类似的由1小时 酸处理造成的细胞死亡的增长(数据未显示）。采用PH6.5的ECF的1小时孵育同样引发了显 著但比采用pH6.0的ECF更少的LDH释放(n = 8孔，数据未显示）。
[0153] 测试了阿米洛利和PcTX毒素对酸诱导LDH释放的影响，以确定ASIC的激活是否参 与了酸诱导的、与谷氨酸受体无关的神经元损伤。在1小时的酸孵育之前的10分钟或期间加 入100μΜ阿米洛利或100ng/mL PcTX毒素显著降低了LDH释放（图8C)。经过24小时，LDH释放 由45.3% ±3.8%被阿米洛利降至31.1% ±2.5%以及被PcTX毒素降至27.9% ±2.6% (n = 20-27，p〈0.01)。尽管仅使用阿米洛利的持久孵育（例如，5小时)增加了LDH释放，但在pH7.4 的ECF中添加阿米洛利或PcTX毒素后1小时并不会影响基线LDH释放(n = 8,数据未显示）。
[0154] (e)同源ASICla的激活是造成酸中毒引发的损伤的原因
[0155] 图9为一系列呈现出表明AS IC1 a可能参与了体外的酸诱导损伤的示例性数据的图 表。图9A显示了阐释通过降低[Ca2+]e来抑制酸诱导LDH释放的示例性数据(n=ll-12，**p〈 0.01，相比于pH 6.0,1.3Ca2+)。图9B显示了阐释酸孵育引发了在ASICla转染的而非未转染 的C0S-7细胞中的LDH释放的增长的示例性数据(η = 8-20)。阿米洛利（100μΜ)抑制了 AS IC1 a 转染细胞中的酸诱导LDH释放(对于7.4比6.0和6.0比6.0+阿米洛利，*p〈0.05)。图9C显示了 阐释ASIC1+神经元中酸诱导损伤的缺乏及凭借阿米洛利和PcTX毒素的保护的示例性数据 (各组中η = 8，p>0.05)。图9D显示了阐释在0⑶下培养的皮层神经元中LDH释放的酸诱导增 长的示例性数据(ri = 5)。通过结合1小时0GD/酸中毒而引发的LDH释放并不会被水溶性维生 素 E(trolox)和左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)所抑制(n = 8-ll)。在ASICrli经元中0GD并 不会增强酸诱导的〇)!1释放(对于口!17.4比口!16.0，*邙〈0.01，以及对于口!16.0比6.0+?(^父 毒素，*p〈0.05)。对于所有的实验，在ECF中均存在MK801、CNQX和尼莫地平（图9A-D)。
[0156] 在常规或减少的[Ca2+]e的存在下用pH 6.0的ECF处理神经元以确定Ca2+的进入是 否在酸诱导损伤中起了作用（参见图9)。如同用PcTX毒素阻滞ASICla，Ca 2+由1.3降至0.2mM 抑制了酸诱导的LDH释放（由40.0% ±4.1 %降至21.9% ±2.5%) (n = 11-12，p〈0.01;图 9A)。未测试不含Ca2+的溶液，因为[Ca2+] e的完全移除可能会激发大的经由Ca2+敏感阳离子 通道的内向电流，这可在其它方面使得数据理解变得复杂。通过阿米洛利和PcTX(非特异性 和特异性ASICla阻滞剂)或通过降低^一+^而对酸损伤的抑制表明：可渗透Ca 2+的ASICla的 激活可能参与了酸诱导神经元损伤。
[0157] 研究了未转染和ASICla转染的⑶S-7细胞的酸损伤，以提供ASICla的激活参与了 酸损伤的另外的证据。C0S-7为通常用于ASIC的表达的细胞系，这是因为其缺乏内源性的通 道。融合后(铺板36-48小时后），用pH 7.4或6.0的ECF处理细胞1小时。酸孵育后24小时测定 LDH释放。相比于pH7.4处理的细胞，用pH 6.0的ECF处理未转染的C0S-7细胞并不会造成LDH 释放的增长(对于口117.4，10.3%±0.8%，以及对于口!16.0,9.4%±0.7%小=19和20孔卬 >0.05，图9B)。然而，在稳定转染ASICla的COS-7细胞中，pH 6.0下的1小时孵育使LDH释放由 15.5% ±2.4%显著增长至24.0% ±2.9% (n = 8孔，p〈0.05)。在这些细胞中，阿米洛利（100 μΜ)的添加抑制了酸诱导的LDH释放(图9B)。
[0158] 同样研究了单独用编码GFP的cDNA或GFP加 ASICla的cDNA瞬时转染的CHO细胞的酸 损伤。所述转染之后(24-36小时），用酸性溶液(pH 6.0)孵育细胞1小时，并在酸孵育的24小 时之后测定细胞损伤。一小时的酸孵育在GFP/ASICla组中而非用单独的GFP转染的组中极 大地减少了幸存的GFP阳性细胞(数据未显示）。
[0159] 进行了针对来自ASICV，ASIC1V1、鼠的培养皮层神经元的细胞毒性实验，以进 一步证实ASICla在酸中毒引发的神经损伤中的参与。再一次地，ASIC +a神经元在6.0时的1 小时酸孵育引发了被阿米洛利和PcTX毒素所减少的可观的LDH释放(n = 8-12)。然而，ASIC +/+神经元的一小时酸处理并不会在24小时后造成LDH释放的显著增长(对于pH 7.4，13.8% ±0.9%，以及对于pH 6.0,14.2% ±1.3%，N=8，p>0.05)，这显示出这些神经元对酸损伤 的耐力（图9C)。另外，ASIC1基因的敲除同样消除了阿米洛利和PcTX毒素对酸诱导的LDH释 放的影响（图9C，各自n = 8)，进一步表明阿米洛利和PcTX毒素对皮层神经元的酸诱导损伤 的抑制（图8C)是由于ASIC1亚单位的阻滞。与酸孵育相反，用ImM NMDA+ΙΟμΜ甘氨酸对 ASIC1V，经元的1小时处理(在不含Mg2+的[pH 7.4]ECF中）在24小时后引发了最大LDH释放 的84.8% ±1.4% (n = 4,图9C)，显示出对其它细胞损伤过程的常规响应。
[0160] (f)模拟的局部缺血通过ASIC加剧了酸中毒导致的、与谷氨酸无关的神经元损伤
[0161] 由于ASIC电流的大小可被脑缺血细胞溶胀的细胞和神经化学成分，花生四烯酸和 乳酸盐所增大，且更重要的是，ASIC电流的去敏感作用可被模拟的局部缺血所显著降低(参 见图5A和5C)，则可预见在局部缺血状况中的ASIC的激活会产生更严重的神经元损伤。为了 检验这个假设，使神经元在氧糖剥夺(OGD)条件下接受1小时的酸处理。在所有的溶液中加 入MK801、CNQX和尼莫地平以抑制电压门控Ca 2+通道和与OGD有关的谷氨酸受体介导的细胞 损伤。在OGD条件下采用pH 7.4的ECF的一小时孵育在24小时后仅引发了最大LDH释放的 27.1%±3.5%(n = 5,图9D)。这个发现与带有谷氨酸受体和电压门控Ca2+通道的阻滞的1小 时的OGD不会引发实质的细胞损伤的在先报导(Aarts et al.，2003)相符。然而，1小时的 OGD，结合酸中毒(pH 6.0)，引发了最大LDH释放的73.9%±4.3%(11 = 5，图90，？〈0.01)，明 显大于没有OGD时酸引发的LDH释放(参见图8六，？〈0.05)<^31(：1 &阻滞剂？(^乂毒素（1001^/ mL)的添加使酸/OGD引发的LDH释放显著降至44.3%±5.3%(n = 5，p〈0.05j9D)。
[0162] 用来自ASICl+小鼠的培养神经元进行了同样的实验。然而，不同于含有ASICI的 神经元，结合OGD和酸的1小时处理在ASIC1-/-神经元中仅稍稍提高了LDH释放（由26.1 % 土 2.7%升至30.4% ±3.5%，N= 10-12,图9D)。这个发现表明：0⑶造成的酸引发的损伤的加 剧很可能是由于OGD加剧了 ASIC1介导的中毒。
[0163]已证实由反应性氧/氮物质激活的可渗透Ca2+的非选择性阳离子传导的激活导致 了与谷氨酸受体无关的神经元损伤(Aarts et al，Cel 1，2003，115:863-877)。操作者可通 过直接清理自由基(例如，水溶性维生素 E)或减少自由基的产生(例如，左旋硝基精氨酸甲 酯)来显著降低长期OGD引发的细胞损伤。为了确定短期0⑶与酸中毒的结合所引发的神经 元损伤是否涉及类似的机制，检验了水溶性维生素 E和左旋硝基精氨酸甲酯对OGD/酸诱导 的LDH释放的效果。如图9D所示，无论水溶性维生素 Ε(500μΜ)还是左旋硝基精氨酸甲酯(300 μΜ)，均不具有对结合的1小时OGD/酸中毒引发的神经元损伤的明显效果(n = 8-ll)。另外的 实验还证实：ASIC阻滞剂阿米洛利和PcTX毒素对TRPM7通道的传导无效（Aarts et al. supra)。综上，这些发现有力地表明：在我们的研究中，ASIC而非TRPM7通道的激活很可 能是造成结合的1小时0GD/酸中毒引发的神经元损伤的原因。
[0164] (g)体内局部缺血性脑损伤中ASICla的激活
[0165] 图10显示了阐释体内脑局部缺血中，凭借ASICI阻滞剂和ASICI基因敲除的神经保 护的数据。图10A显示了得自TTC染色的大脑切片的示例性数据的图表，其中显示了来自注 射了 aCSF(n = 7)、阿米洛利(n=ll)或PcTX毒素 (n = 5)的大鼠的大脑中的染色体积（"梗死 体积"），与aCSF注射组相比，*p〈0.05和#p〈0.01。图10B显示了阐释来自ASICl v:j、鼠的大 脑中的梗死体积的减少（各组η = 6)的示例性数据的图表，与+/+组相比，*p〈0.05和**p〈 0.01。图10C显示了阐述来自腹腔注射10mg/kg美金刚(memantine，Mem)或者腹腔注射美金 刚并伴随着侧脑室注射PcTX毒素(500ng/mL)的小鼠的大脑中的梗死体积的减少的示例性 数据的图表，与aCSF注射相比并在美金刚与美金刚+PcTX毒素之间，**p〈0.01(各组n = 5)。 图10D显示了阐述来自腹腔注射美金刚的ASICl+/+(Wt)或ASIC1+小鼠的大脑中的梗死体积 的减少的示例性数据的图表(各组η = 5)，*p〈0.05和**p〈0.01。
[0166] 测试了短暂局灶性缺血的大鼠模型中阿米洛利和PcTX毒素的保护效果(Longa et al.，Stroke，1989，20:84-91)，以确定ASICla的激活是否参与了体内局部缺血性脑损伤。通 过短暂地阻塞大脑中动脉(MCA0)而引发了局部缺血（100分钟）。在所述局部缺血之前的30 分钟和之后侧脑室注射总共6yL的单独的人造 CSF(aCSF)、含阿米洛利（lmM)的aCSF、或者 PcTX毒素(500ng/mL)。用于4周龄大鼠的脑室和脊髓液的体积估计为~60yL。假定注入的阿 米洛利和PcTX均匀地分散于CSF中，则预计阿米洛利的浓度为~100μΜ及PcTX的浓度为~ 50ng/mL，此为被发现在细胞培养实验中有效的浓度。局部缺血后24小时通过TTC染色确定 了梗死体积(Bederson et al ·，Stroke, 1986,17:1304-1308)。局部缺血（100分钟）在注射 aCSF的大鼠中产生了329.5±25.6mm3的梗死体积(η = 7)，但在注射阿米洛利的大鼠中仅为 229.7±41.11111113(11 = 11印〈0.05)以及在注射？(^乂毒素的大鼠中仅为130.4±55.〇1111113(降低 了~60%)(11 = 5，口〈0.01)(图10八）。
[0167] ASIC1V1、鼠被用于进一步证实ASICla在体内局部缺血性脑损伤中的参与。如之 前所描述的（Stenzel-Poore et al ·，Lancet，2003，362:1028-1037 )，使雄性ASIC1+/+、 ASIC1+/-和ASIC1V-小鼠（~25g，具有同类系C57B16背景)接受60分钟的MCA0。与通过ASICla 的药物学阻滞的保护（如上所述）相一致，与+/+小鼠（84.6± 10.6mm3，N = 6，p〈0.01)相 比，-/-小鼠显示出明显较小（降低了~61 % )的梗死体积(32.9 ±4.7mm3，N=6)。+/_小鼠也 显示出减小的梗死体积(56.9 ± 6.7mm3，N=6，p〈0.05)(图10B)。
[0168] 为了确定在谷氨酸受体阻滞的背景下，ASICla通道的阻滞或ASICI基因的敲除是 否会在体内提供额外的保护，则在60分钟的MCA0之后立即向C57B16小鼠腹腔(i . p.)注射美 金刚（10mg/kg)并伴随着在局部缺血之前的15分钟或之后侧脑室（i.c.v.)注射总体积0.4μ L的单独的aCSF或含PcTX毒素（500ng/mL)的aCSF。在i . ρ.注射生理盐水并i . c. ν.注射aCSF 的对照小鼠中，60分钟的MCA0造成了 123.6± 5.3mm3的梗死体积(n = 5，图10C)。在腹腔注射 美金刚且侧脑室注射aCSF的小鼠中，相同持续时间的局部缺血造成了73.8±6.9mm3的梗死 体积(n = 5，p〈0.01)。然而，在注射美金刚和PcTX毒素的小鼠中，仅造成了47.0 ± 1. 1mm3的 梗死体积(相比于对照组和美金刚组，η = 5，p〈0.01，图1OC)。这些数据表明同源ASICla的阻 滞可在NMDA受体阻滞的背景下，在体内局部缺血中提供额外的保护。额外的保护还可在用 药物NMDA阻滞处理的ASIC1 V1、鼠中观察到（图10D)。在i.p.注射生理盐水或10mg/kg美金 刚的ASIC1+/+小鼠中，60分钟的MCA0分别造成了 101.4 ± 9.4mm3或61.6 ± 12.7謹3的梗死体积 (各组中η = 5，图10D)。然而，在注射美金刚的ASIC1V1、鼠中，相同持续时间的局部缺血造 成了 27.7 ± 1.6mm3的梗死体积(n = 5)，明显小于注射美金刚的ASIC1VM、鼠的梗死体积(p〈 0.05)〇
[0169]总之，这些数据证实:可渗透Ca2+的ASICla的激活是新颖的、与谷氨酸无关的基于 局部缺血性脑损伤的生物机制。
[0170] 实施例2: PcTX神经保护的时间窗
[0171]参见图11，本实施例描述了测定啮齿动物中风发作后PcTX毒素在不同时间下的神 经保护效果的示例性的实验。简而言之，通过阻塞大脑中动脉(MCA0)而引发了啮齿动物的 脑局部缺血（中风）。在引发后的指定时间下，向各个啮齿动物的侧脑室注入人造脑脊液 (