aCSF)、PcTX毒素(0.5yL，500ng/mL总蛋白）或灭活(煮沸)毒素。如图11所示，PcTX毒素的给 药在中风发作后一小时和三小时均使中风体积减少了 60 %。另外，若在MCA0开始后五小时 停止治疗，仍可维持可观的中风体积的减少。因此，由ASIC的抑制所致的神经保护可具有中 风发作后延长了的治疗时间窗，使得中风受治者从中风开始数小时后的治疗中获益。ASIC 阻滞在中风神经保护方面的这个效果比采用谷氨酸拮抗剂的NMDA受体的钙通道阻滞(实验 性中风治疗的主要目标)的效果更强。迄今为止，没有谷氨酸拮抗剂具有如此处ASICla选择 性抑制所示的这种良好的曲线。
[0172] 实施例3:示例性的胱氨酸结肽
[0173]此实施例描述了示例性的胱氨酸结肽，包括全长PcTX和缺失PcTX衍生物，其可在 培养细胞中被筛选，在局部缺血的动物(例如，啮齿动物，如小鼠或大鼠）中测得，和/或被施 用至局部缺血的人类受治者。
[0174]图12显示了以50示出的示例性胱氨酸结肽PcTxl的以单字母编码的主要氨基酸序 列（SEQ ID NO: 1)，其具有所示的与氨基酸位置1-40有关的多种示例性肽特征。肽50可包含 六个半胱氨酸残基，其形成胱氨酸键52、54、56以生成胱氨酸结基序58。所述肽还可包括一 个或多个β折叠区域60和带正电的区域62 A端区域64和C端区域66可位于所述胱氨酸结基 序的两侧。
[0175] 图13显示了图12的PcTxl肽50与该肽的多种示例性缺失衍生物相对齐的对比。这 些衍生物可包括:N端缺失70(SEQIDN0 :2)、部分C端缺失72(SEQIDN0:3)、全C端缺失74 (SEQ ID N0:4)和N/C端缺失76(SEQ ID N0:5)。其它的PcTxl衍生物可包括，例如，在维持与 原始PcTxl序列的至少约25%或约50%的序列相似性或一致性的同时，一个或多个氨基酸 的缺失、嵌入或替换。
[0176] 可检测各个PcTxl衍生物的选择性抑制ASIC蛋白的能力和/或针对局部缺血的效 果(如果有的话）。可采用任何适宜的检测系统以进行包括本发明别处所述的任何的基于细 胞的测定系统和/或动物模型系统的此检测。同样或另选地，可在局部缺血的人类受治者中 检测所述PcTxl衍生物。
[0177] 实施例4: PcTX毒素对ASICla的选择性
[0178] 此实施例描述了相对于培养细胞中表达的其它ASIC蛋白或ASIC蛋白的组合，测定 PcTX毒素(及由此获得的PcTxl毒素)对单独的ASICla的选择性的实验。用PcTX毒素(25ng/ mL，针对表达ASICla的细胞；以及500ng/mL，针对表达ASIC2a、ASIC3或ASICla+2a的细胞)处 理表达指定的ASIC蛋白的C0S-7细胞。在通道半最大激活的pH(pH 0.5)下测定通道电流。如 图14所示，PcTX毒素在25ng/mL的蛋白质浓度下极大地阻滞了由ASICla同源通道介导的电 流，并在500ng/mL下对由同源的ASIC2a、ASIC3或异源的ASICla/ASIC2a介导的电流没有影 响(η = 3-6)。在500ng/mL下，PcTX毒素也不会影响由其它配体门控通道(例如，NMDA和GABA 受体门控通道)或电压门控通道(例如，Na+、Ca2+和K+通道)介导的电流(n = 4-5)。这些实验 表明：PcTX毒素及由此获得的PcTxl肽为针对同源的ASICla的特定的阻滞剂。利用此基于细 胞的测定系统，可测定多种合成肽或其它的候选抑制剂的ASIC抑制作用的效力和选择性 (例如，参见实施例3)。
[0179] 实施例5 :PcTX毒素的鼻腔给药的神经保护
[0180] 此实施例描述了说明经鼻腔施用PcTX毒素在中风的动物模型系统中减轻局部缺 血引发的损伤的效力的示例性数据。通过阻塞大脑中动脉在雄性小鼠中引发了脑局部缺 血。在阻塞开始后一小时，将动物作为对照处理或用PcTX毒素处理(鼻腔导入50yL 5ng/mL (总蛋白）的PcTx)。如图15所示，相对于对照处理，PcTX毒素的鼻腔给药导致如梗死体积所 定义的局部缺血引发的损伤(局部缺血性损害)降低了 55%。鼻腔给药可凭借基本上沉积于 鼻腔通道而非吸入肺中的喷剂和/或可凭借至少部分吸入肺中的气雾剂而实现。在一些实 施例中，鼻腔给药相比于其它的给药路径可具有许多的优点，如更有效地传送至大脑和/或 适于局部缺血受治者的自主给药。
[0181] 实施例6:阿米洛利和阿米洛利类似物对ASICla通道的抑制作用
[0182] 如图16所示，阿米洛利和阿米洛利类似物苯扎米尔、非那米尔和EIPA以剂量依赖 的方式阻滞了 ASICla电流。类似地，阿米洛利和阿米洛利类似物苯扎米尔和EIPA以剂量依 赖的方式阻滞了 AS I C2a电流（图17)。表1总结了阿米洛利和阿米洛利类似物对AS IC1 a通道 的抑制作用。阿米洛利为此通道的有效抑制剂，具有7.7μΜ的IC50。
[0183] 表1阿米洛利和阿米洛利类似物对AS IC1 a通道的抑制作用
[0184]
[0185] 实施例7:阿米洛利和阿米洛利类似物的侧脑室注射降低了小鼠的梗死体积
[0186] 如上所述，使小鼠接受60分钟的阻塞大脑中动脉(MCA0KMCA0后一小时通过侧脑 室注射施用阿米洛利或阿米洛利类似物苯扎米尔、苄普地尔(bepridel)、EIPA或KB-R7943。 局部缺血引发一天后评价动物。如图18所示，阿米洛利或阿米洛利类似物苯扎米尔、苄普地 尔、EIPA或KB-R7943的侧脑室注射有效减少了梗死体积。
[0187] 实施例8:阿米洛利的静脉注射降低了小鼠的梗死体积
[0188] 如上所述，使小鼠接受60分钟的阻塞大脑中动脉(MCA0KMCA0后1、3或5小时通过 静脉注射施用阿米洛利。局部缺血引发一天后评价动物。如图19所示，阿米洛利的静脉注射 有效减少了梗死体积。阿米洛利的有效的CNS渗透可通过脑局部缺血/再灌注后危及了血脑 障壁的事实来解释。图20显示了阿米洛利的静脉注射具有5h的长效治疗窗。
[0189] 实施例9:疏水性的阿米洛利类似物对各种通道的结构活性关系 [0190]如表1所示，用烷基取代阿米洛利的C-5氨基导致了对ASICla通道的效力的减小。 该取代提高了对ASIC3通道的效力（Kuduk et al ·，Bioorg · Med · Chem · Lett ·，2009，19 : 2514-2518)。当将疏水性基团取代到结构的胍基部分上时，会获得相反的结果。实际上，苄 基取代的胍基类似物(苯扎米尔)为测得的最强效的ASICla阻滞化合物(IC50 = 4.9yM))。总 之，这些结果显示:阿米洛利为ASICla通道的有效抑制剂，具有7.7μΜ的IC5Q。它们还提供了 结构活性关系（参见图21)以用于设计可抑制ASICla通道的阿米洛利类似物。因此，在一些 实施方式中，通过在阿米洛利结构的胍部分引入变化来产生阿米洛利类似物。由于阿米洛 利仅是Na+/Ca 2+离子交换器的非常弱的抑制剂（IC5Q= 1. ImM)。所述阿米洛利类似物也很可 能是Na+/Ca2+离子交换器的非常弱的抑制剂。在一些实施方式中，所述阿米洛利类似物被设 计为具有比ASIC3通道更高的针对ASICla的选择性。在另外的实施方式中，在阿米洛利结构 中引入了环结构（如环胍基团）以提高ASICla电流的抑制效力。阿米洛利的一个或多个N-H 基团也很可能会形成与3-氨基的内部的或与离子通道的Η键。
[0191] 小鼠的体内结果显示：在32.5μΜ的血浆浓度（50yL X ImM的静脉剂量）和12.5μΜ的 总的脑浓度（1μLΧ500μΜ的侧脑室剂量)下可实现功效。由此可估计:为实现适于人类中风 的急性治疗的有效浓度，仅需要在效力上增长10倍。因此，筛选新颖的类似物以使A SIC1 a IC50的效力由对于阿米洛利和苯扎米尔来说的4至8μΜ提高至<1μΜ。
[0192] 在一些实施方式中，所述阿米洛利类似物包括苯扎米尔的甲基化类似物（图21的 式1-5)和苯扎米尔的脒基类似物（图21的式6)。在另外的实施方式中，所述阿米洛利类似物 包含形成于胍基团上的环。在另外的实施方式中，所述阿米洛利类似物包含用于提高 AS IC1 a电流的抑制效力的酰胍基。
[0193] 阿米洛利以ImM是可溶于水的，且在50yL每针的剂量下在治疗小鼠模型的局部缺 血中是有效的。在65kg人类上的相同剂量（以mg/kg为基准）可能会接近40mg，且需要超过 160mL的注射体积。类似地，已有报导苯扎米尔具有在0.9%生理盐水中的0.4mg/mL( 1.7mM) 的溶解度，这允许在10mL注射液中仅5mg苯扎米尔二盐酸盐的给药。因此，需要具有更高的 水溶性的阿米洛利类似物。在一些实施方式中，所述阿米洛利类似物在胍基上包含水增溶 性基团，如N，N-二甲基氨基或糖基，以改善水溶性。在一些实施方式中，所述阿米洛利类似 物具有 5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM 或更高的水溶性。在 另外的实施方式中，所述阿米洛利类似物具有允许在单次1 OmL注射液中将1 Omg、25mg、 50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的剂量通过静脉施用至人体的溶解 度。在更另外的实施方式中，所述阿米洛利类似物具有允许在单次2mL注射液中将10mg、 25mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg 或500mg的剂量通过侧脑室施用至人 体的溶解度。
[0194] 以上所述的本公开可包括一个或多个具有独立用途的不同的发明。各个发明已以 其优选的方式被公开。这些优选的方式，包括本文中公开和阐释的【具体实施方式】，不应以限 制性的观念去理解，因为还可以有许多的变体。本发明的主题包括本文所公开的各种元素、 特征、功能和/或性能的全部的新颖的和非显而易见的组合和次组合。以下的权利要求特别 指出了认为是新颖性和非显而易见性的组合和次组合。在元素、特征、功能和/或性能的其 它组合和次组合中体现的发明可在要求本申请或相关申请的优先权的申请中声明。这些权 利要求，无论是否指向不同的发明或相同的发明，以及无论是否比原始权利要求的保护范 围更宽、更窄、等同或不同，均应被视为包含于本公开的发明的主题之内。
【主权项】
1. 一种用于减轻受治者神经损伤的方法，包括：向所述受治者施用治疗有效量的包含 阿米洛利、阿米洛利类似物或它们的药学上可接受的盐的药物组合物。2. 权利要求1所述的方法，其中，所述活性组分包括阿米洛利或其药学上可接受的盐。3. 权利要求1所述的方法，其中，所述活性组分包括阿米洛利类似物或其药学上可接受 的盐。4. 权利要求3所述的方法，其中，所述阿米洛利类似物选自苯扎米尔、非那米尔、5-(N-乙基-N-异丁基)-阿米洛利(EIPA)、苄普地尔、KB-R7943、5-(N-甲基-N-异丁基)阿米洛利、 5-( N，N-六亚甲基)阿米洛利和5-( N，N-二甲基)阿米洛利盐酸盐。5. 权利要求4所述的方法，其中，所述阿米洛利类似物为苯扎米尔。6. 权利要求3所述的方法，其中，所述阿米洛利类似物为苯扎米尔的甲基化类似物。7. 权利要求3所述的方法，其中，所述阿米洛利类似物包含形成于胍基团上的环。8. 权利要求3所述的方法，其中，所述阿米洛利类似物包含酰胍基。9. 权利要求3所述的方法，其中，所述阿米洛利类似物包含形成于胍基团上的水增溶性 基团，其中所述水增溶性基团为N，N-二甲基氨基或糖基。10. 权利要求1所述的方法，其中，所述药物组合物通过静脉给药。11. 权利要求1所述的方法，其中，所述药物组合物通过鞘内给药。12. 权利要求1所述的方法，其中，所述药物组合物通过侧脑室给药。13. 权利要求2所述的方法，其中，所述阿米洛利、阿米洛利类似物或它们的药学上可接 受的盐以0. lmg-10mg/kg体重的剂量范围给药。14. 权利要求1所述的方法，其中，在局部缺血事件开始的一小时内施用所述药物组合 物。15. 权利要求1所述的方法，其中，在局部缺血事件开始的五小时内施用所述物组合物。16. 权利要求1所述的方法，其中，在局部缺血事件开始的一小时与五小时之间施用所 述物组合物。17. 权利要求1所述的方法，其中，所述神经损伤为神经系统损伤。18. 权利要求1所述的方法，其中，所述神经损伤为脑损伤。19. 一种治疗受治者脑损伤的方法，包括：向所述受治者施用治疗有效量的包含阿米洛 利、阿米洛利类似物或它们的药学上可接受的盐的药物组合物。20. 权利要求19所述的方法，其中，所述药物组合物通过静脉、鞘内或侧脑室给药。21. 权利要求19所述的方法，其中，所述阿米洛利类似物选自苯扎米尔、非那米尔、 EIPA、苄普地尔、KB-R7943、5-(N-甲基-N-异丁基)阿米洛利、5-(N，N-六亚甲基)阿米洛利和 5-(N，N-二甲基)阿米洛利盐酸盐。22. 权利要求19所述的方法，其中，所述阿米洛利类似物为苯扎米尔。23. 权利要求19所述的方法，其中，所述阿米洛利类似物选自苯扎米尔的甲基化类似 物、含有形成于胍基团上的环的阿米洛利类似物、含有酰胍基的阿米洛利类似物和含有形 成于胍基团上的水增溶性基团的阿米洛利类似物，其中所述水增溶性基团为N，N-二甲基氨 基或糖基。24. -种减轻由进入神经元的离子流的变化而导致的神经系统损伤的方法，包括：向需 要此治疗的受治者施用治疗有效量的包含阿米洛利、阿米洛利类似物或它们的药学上可接 受的盐的药物组合物。25. 权利要求24所述的方法，其中，所述药物组合物通过静脉、鞘内、侧脑室或肌肉给 药。26. 权利要求24所述的方法，其中，所述阿米洛利类似物选自苯扎米尔、非那米尔、 EIPA、苄普地尔、KB-R7943、5-(N-甲基-N-异丁基)阿米洛利、5-(N，N-六亚甲基)阿米洛利和 5-(N，N-二甲基)阿米洛利盐酸盐。27. 权利要求24所述的方法，其中，所述阿米洛利类似物为苯扎米尔。28. 权利要求24所述的方法，其中，所述阿米洛利类似物选自苯扎米尔的甲基化类似 物、含有形成于胍基团上的环的阿米洛利类似物、含有酰胍基的阿米洛利类似物和含有形 成于胍基团上的水增溶性基团的阿米洛利类似物，其中所述水增溶性基团为N，N-二甲基氨 基或糖基。29. -种减轻神经系统损伤的方法，包括：向需要此治疗的受治者施用治疗有效量的包 含阿米洛利、阿米洛利类似物或它们的药学上可接受的盐的药物组合物。30. 权利要求29所述的方法，其中，所述药物组合物通过静脉、鞘内、侧脑室或肌肉给 药。31. 权利要求29所述的方法，其中，所述阿米洛利类似物选自苯扎米尔、非那米尔、 EIPA、苄普地尔、KB-R7943、5-(N-甲基-N-异丁基)阿米洛利、5-(N，N-六亚甲基)阿米洛利和 5-(N，N-二甲基)阿米洛利盐酸盐。32. 权利要求29所述的方法，其中，所述阿米洛利类似物为苯扎米尔。33. 权利要求29所述的方法，其中，所述阿米洛利类似物选自苯扎米尔的甲基化类似 物、含有形成于胍基团上的环的阿米洛利类似物、含有酰胍基的阿米洛利类似物和含有形 成于胍基团上的水增溶性基团的阿米洛利类似物，其中所述水增溶性基团为N，N-二甲基氨 基或糖基。34. -种用于减轻神经系统损伤的药物组合物，包含:有效量的阿米洛利、阿米洛利类 似物或它们的药学上可接受的盐；以及药学上可接受的载体，其中将所述药物组合物配制 为用于静脉、鞘内或侧脑室注射。35. 权利要求34所述的药物组合物，其中，所述阿米洛利类似物选自苯扎米尔、非那米 尔、EIPA、苄普地尔、KB-R7943、5-(N-甲基-N-异丁基）阿米洛利、5-(N，N-六亚甲基)阿米洛 利和5-( N，N-二甲基)阿米洛利盐酸盐。36. 权利要求34所述的方法，其中，所述阿米洛利类似物选自苯扎米尔的甲基化类似 物、含有形成于胍基团上的环的阿米洛利类似物、含有酰胍基的阿米洛利类似物和含有形 成于胍基团上的水增溶性基团的阿米洛利类似物，其中所述水增溶性基团为N，N-二甲基氨 基或糖基。37. -种用于减轻神经系统损伤的药物组合物，包含:有效量的阿米洛利类似物或其药 学上可接受的盐；以及药学上可接受的载体。38. 权利要求37所述的方法，其中，其中将所述药物组合物配制为用于静脉、鞘内、侧脑 室或肌肉注射。39. 权利要求37所述的药物组合物，其中，所述阿米洛利类似物为苯扎米尔的甲基化类 似物。40. 权利要求37所述的药物组合物，其中，所述阿米洛利类似物包含形成于胍基团上的 环。41. 权利要求37所述的药物组合物，其中，所述阿米洛利类似物包含酰胍基。42. 权利要求37所述的药物组合物，其中，所述阿米洛利类似物包含形成于胍基团上的 水增溶性基团，其中所述水增溶性基团为N，N-二甲基氨基或糖基。
【专利摘要】本申请公开了可用于减轻受治者的神经损伤或神经系统损伤的包含阿米洛利和/或阿米洛利类似物的组合物。公开了此组合物的配方。本申请进一步涉及通过向受治者施用治疗有效量的含有阿米洛利、阿米洛利类似物或它们的药学上可接受的盐的药物组合物，以治疗神经损伤或神经系统损伤的方法。
【IPC分类】A61K31/4965, A61P25/00, A61K31/496, A61K31/495
【公开号】CN105592849
【申请号】CN201380079011
【发明人】熊志刚, 罗杰·P·西蒙
【申请人】莫尔豪斯医学院
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2013年8月21日
【公告号】EP3035931A1, WO2015026339A1