拉帕酚f抑制肿瘤细胞生长的用图
【专利说明】拉帕酚F抑制肿瘤细胞生长的用途
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2013.05.07提交的美国临时申请N0.61/820,542的优先权，其公开 通过引用引入本文。
【背景技术】
[0003] 癌症在美国和世界范围内仍然是主要的健康问题。在美国，2012年诊断出估计新 增超过150万预计新的癌症病例且癌症患者中有577190名死于癌症。癌症造成的死亡占美 国全部死亡的近4/1。虽然增强的早期肿瘤诊断和管理显著提高患者的存活率，但仍然需要 发展和发现新的抗癌疗法，因为有些患者对目前的抗癌药物表现出不敏感或治疗一段时间 后出现抗药。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种用于抑制肿瘤细胞生长的方法和组合物。如在本文中所用，术语 肿瘤细胞和癌细胞可互换使用。在一个实施方式中，所述肿瘤细胞为实体肿瘤细胞。在另一 个实施方式中，所述肿瘤细胞为血癌细胞(血液肿瘤细胞）。一方面，所述组合物包括药学上 可接受的载体中的拉帕酸F。一方面，所述方法包括向个体给药包括治疗有效量的拉帕酸F 的组合物。
【附图说明】
[0005] 图1:A.拉帕酚F的化学结构。B和C.通过细胞菌落形成实验(B)证明的或相差显微 镜检查(C)显示的拉帕酚F抑制各种组织类型中肿瘤细胞生长。所示细胞用拉帕酚F(50yM) 处理72小时或未用拉帕酚F(50yM)处理。D和E.3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮 唑溴化物(MTT)实验的结果显示拉帕酚F以时间依赖性方式和剂量依赖性方式抑制不同癌 细胞株中的肿瘤细胞的生长。F和G.用拉帕酚F(50yM)对MCF10A非致癌性乳腺上皮细胞处理 3天(F)或6天(G)。处理后，收集细胞进行MTT实验(G)或在相差显微镜(F)下拍摄照片。H.菌 落形成实验的结果显示拉帕酚F通过A549(肺）、HCT116(结肠)和DU145(前列腺)肿瘤细胞抑 制菌落形成。I-N.MTT实验的结果显示拉帕酚F抑制白血病细胞株、黑色素瘤细胞株和肉瘤 细胞株中的细胞生长。
[0006] 图2:拉帕酚F诱导G1和G2细胞周期阻滞。（A)对用溶剂(DMS0)或拉帕酚F (50μΜ)处 理72小时的细胞进行流式细胞仪细胞周期分析。（Β)对用拉帕酚F(50yM)处理72小时的RK0 细胞进行DAPI染色。还显示出有丝分裂细胞相对于总细胞的数量(有丝分裂指数，MI)。
[0007] 图3:拉帕酚F对关键细胞周期调节蛋白的调控。A-D.用溶剂(DMS0)或拉帕酚F(50μ Μ)对指定细胞处理指定的时间且通过蛋白免疫印迹法分析不同的细胞周期调节蛋白的蛋 白表达。"C":溶剂处理的对照组。
[0008] 图4:拉帕酚F对半胱天冬酶激活的影响。用溶剂(DMS0)或拉帕酚F(50yM)对指定细 胞处理指定的时间。使用指定的抗体通过蛋白免疫印迹法分析半胱天冬酶8、9和3(由半胱 天冬酶原水平的降低来表示)的激活。"C":溶剂处理的对照组。
[0009]图5:p21在拉帕酚F-介导的细胞周期蛋白B/CDK1下调和G2阻滞中的作用。（A和B) 对拉帕酸F未处理(DMS0)或处理(拉帕酸F)的p21-精通(p21-proficient)(亲代的）和p21-缺陷（p21基因敲除）的HCT116细胞进行细胞周期蛋白B和CDKl的蛋白表达分析(A);或在表 达靶向p21转录的两个不同区域的任意序列shRNA或P21-特异性shRNA的细胞中分析细胞周 期蛋白B和⑶K1的蛋白表达(B)<X和D.表达任意序列shRNAi或两个不同的p21shRNA的RK0细 胞和MDA-MB-231细胞的细胞周期分析。细胞未经处理(DMS0)或用拉帕酚F(25yM)处理72小 时，并通过流式细胞仪确定细胞周期谱图。
[0010]图6:拉帕酚F诱导野生型p53细胞和缺陷-p53的细胞中p21-启动子的激活。A和B MCF-7、MDA-MB-231和RK0细胞未经处理或用拉帕酚F(50yM)处理48小时;然后将细胞分成两 部分;一部分用于通过Northern杂交分析p21mRNA表达(A)且另一部分用于通过蛋白免疫印 迹法进行p21蛋白分析(B)。使用全长p21cDNA作为Northern杂交分析的探针。C和D.不同p53 状态的拉帕酚F处理和未处理的细胞中p21启动子荧光素酶活性。RK0细胞和MCF-7细胞表达 野生型-P53蛋白而MDA-MB-231表达突变型-p53 AeLa细胞具有人乳头状瘤病毒;且p53蛋白 在这些细胞中是非功能性的。转染了P21启动子荧光素酶构建体的细胞未经处理(DMS0)或 用拉帕酚F(50yM)处理24小时，然后分析荧光素酶活性。
[0011] 图7:拉帕酚F通过减少其半衰期抑制突变型-p53的表达。A-C.拉帕酚F对表达野生 型P53的细胞(MCF-7和RK0)中的野生型p53蛋白表达具有最小的影响；然而拉帕酚F大大减 少了突变型_p53蛋白在MDA-MB-231、MDA-MB-468和T47D细胞中的表达(B和ChD和E.拉帕酚 F的处理降低了 MDA-MB-231细胞中突变型-p53蛋白的半衰期。首先用拉帕酚F(50yM)或未用 拉帕酚F对细胞处理24小时，然后向细胞培养基中加入放线菌酮(50μg/ml)培养0-8小时并 在加入放线菌酮后〇、2、4、6和8小时收集细胞。对样品进行蛋白质印记分析并确定用拉帕酚 F处理或未用拉帕酚F处理的细胞的突变型-p53的半衰期。F和G.拉帕酚F降低了 T47D细胞中 突变型-P53蛋白的半衰期。按所述确定突变型-p53的半衰期。
[0012] 图8:拉帕酚F下调通常在人类癌症中过度表达并与致癌性转化有关联的多种致癌 蛋白的表达。A-C.拉帕酚F抑制c-Myc(A)、MDM2(B)和HuR(C)的表达。未对细胞进行处理 (Τ'）或用拉帕酚F(50yM)处理指定时间并使用指定的抗体进行蛋白质印迹分析。
[0013] 图9:拉帕酚F对作为异种移植物的Hela肿瘤细胞的生长抑制作用。用溶剂或拉帕 酚F(5毫克/千克/天或10毫克/千克/天）（静脉注射)对荷瘤小鼠处理15天。如在方法和材料 中所述的对肿瘤尺寸、肿瘤体积和动物体重进行监测。结果表示为平均值±SEM。相比于拉 帕酚F组，*?〈0.05。8中所列照片显示取自未经处理(溶剂小=7)或用拉帕酚？(511^/1^小= 7;和10mg/kg，N=6)处理的小鼠的实际肿瘤。
【具体实施方式】
[0014] 我们已经确定了拉帕酚F的抗肿瘤(抗癌)细胞增殖作用并证明了其在肿瘤细胞株 中的细胞生长抑制活性和在动物模型中的肿瘤抑制活性。我们的结果表明拉帕酚F对代表 包括结肠、乳腺、肺、宫颈、前列腺、白血病、黑色素瘤和肉瘤细胞的不同组织的多种肿瘤细 胞株发挥强烈的生长抑制作用。
[0015] 在一个实施方式中，本发明提供了用于抑制癌细胞生长的组合物和方法。所述组 合物包括拉帕酸F。所述方法包括向个体给药治疗有效量的包括拉帕酸F的组合物。已知拉 帕酚F的结构。在图1A中还提供了拉帕酚F的结构。
[0016] 在一个实施方式中，本发明提供了一种用于抑制实体肿瘤细胞生长的方法，所述 方法包括向个体给药治疗有效量的包括拉帕酚F的组合物。在另一个实施方式中，本发明提 供了一种用于抑制包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤的血液肿瘤(血癌）细胞生长的方法，所述 方法包括向个体给药治疗有效量的包括拉帕酸F的组合物。
[0017] 不希望受任何特定理论的束缚，我们的研究表明拉帕酚F主要通过诱导GjPG2细胞 周期阻滞介导其生长抑制作用。除了其对细胞周期调控的作用，拉帕酚F还触发一些肿瘤细 胞株中细胞死亡。不同细胞株响应于拉帕酚F处理的细胞周期谱图并不相同，比如，MCF-7细 胞主要在6 1被阻滞而RK0和MDA-MB-231细胞主要在G2被阻滞。拉帕酚F调控一些关键的细胞 周期调节因子(p21、p27、细胞周期蛋白B和CDK1和CDK2)的表达（图3)。拉帕酚F诱导的p21和 P27的诱导以及⑶K1的抑制可足以阻止从GjljS的细胞周期进程。同样地，⑶K1和细胞周期 蛋白B的强烈抑制可足以将细胞阻滞在G 2。我们的研究进一步确定p21对拉帕酚F介导的细 胞周期蛋白B和CDK1的下调和G2-阻滞是至关重要的。在p21-缺失的细胞中拉帕酚F介导的 细胞周期蛋白B和CDK1的减少消失（图5 )，而且进一步地，在缺乏p21的情况下，拉帕酚F介导 的〇2细胞周期阻滞也被显著改变（图5)。因此，我们的结果表明p21诱导在拉帕酚F介导的细 胞反应中是重要的事件且在拉帕酚F介导的细胞周期蛋白B/CDK1抑制和6 2细胞周期阻滞中 起关键作用。
[0018] 我们的研究还表明拉帕酚F诱导p21mRNA表达的强烈诱导，p21mRNA表达的强烈诱 导可以表明在转录水平发生响应拉帕酚F的p21的激活。由于增加的p21启动子活性，可出现 由拉帕酚F增强的p21mRNA表达（图6)。值得注意的是，在表达野生型p53(RK0和MCF-7)的细 胞中以及在具有突变型和非功能性p53(MDA-MB-231和HeLa)的细胞中发生拉帕酚F处理后 的P21启动子激活。此外，在缺乏p53基因（ρ537?的细胞中可以诱导P21。这表明拉帕酚F触 发的P21的诱导以p53依赖性的方式发生。
[0019] 表型，拉帕酚F还诱导表达野生型-p53(MCF-7和RK0)或突变型/非功能性p53(MDA-MB-231和HeLa)的细胞中的生长抑制。拉帕酚F还降低突变型-p53表达并减少突变型-p53蛋 白半衰期（图7)。我们的发现表明拉帕酚F抑制突变型-p53表达并对拉帕酚F在靶向具有突 变型-P53的肿瘤细胞中的用途提供支持。
[0020] 我们的结果还表明拉帕酚F显著抑制大量致癌蛋白的表达;这些致癌蛋白包含C-Myc，MDM2和HuR蛋白（图8)。所有这些表明蛋白（c