牛尿酚治疗皮肤病的用途的制作方法

专利名称：牛尿酚治疗皮肤病的用途的制作方法
牛尿酚治疗皮肤病的用途相关申请本发明是申请日为2005年2月17日的申请序列号No. 11/059,951的部分继续申 请，所述11/059，951在35U. S. C. § 119(e)下要求申请日为2004年4月28日的美国临时 专利申请序列号No. 60/521，457的申请日权益。此外，本发明是申请日为2005年10月20 日的申请序列号No. 10/533，045的部分继续申请，所述No. 10/533，045是申请日为2003年 10月29日的PCT序列号NO.US2003/034441的继续申请，所述US2003/034441指定了美国， 以英文公布，在35U. S. C. § 119(e)下要求申请日为2002年10月29日的美国临时系列专 利申请60/422，469的申请日权益。此外，本发明是申请日为2003年7月24日的申请序列 号No. 10/625,989的部分继续申请，所述No. 10/625，989在35U. S. C. § 119(e)下要求申请 日为2002年7月24日的美国临时专利申请序列号60/398，270的申请日权益和申请日为 2008年7月3日的专利申请序列号No. 12/167,813的申请日权益，No. 12/167，813是申请 日为2003年7月24日的申请序列号No. 10/625，934 (现在的美国专利7，396，855)的继续 申请，所述No. 10/625，934在美国法典35U. S. C. § 119(e)下要求申请日为2002年7月24 日的美国临时专利申请序列号No. 60/398，270的申请日权益。所有上述申请通过引用整体 并入本文。联邦资助的研究或开发本发明得到以下政府支持国立卫生研究所(NIH)给予的资助#NS39951，以及美 国农业部(USDA)给予的资助 #NRI 2002-00798 和 #NRI2004-01811。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术：
本发明涉及牛尿酚及其作用机理和作为治疗和预防受雄激素调节的生理性和病 理性病况的治疗性化合物的用途。近年来，植物性雌激素由于其针对年龄相关的疾病(例如心血管疾病和骨质疏 松)和激素依赖的癌症(即乳腺癌和前列腺癌)的潜在的保护作用，而受到越来越多的研 究性关注。主要有三类植物性雌激素1)异黄酮(主要来源于大豆)、2)木脂素(大量发现 于亚麻仁中)和3)香豆苯醚(coumestans)(来源于发芽的植物例如紫花苜蓿(alfalfa)。 在这三种主要类别中，由于含大豆的食品来源容易并广泛，人们对异黄酮的消费具有最大 的影响。异黄酮中，染料木素(genistain)和大豆苷元(daidzein)被认为具有最强的雌 激素作用，因此大部分的注意力都指向这些分子(Knight et al.，Obstet Gyneco, 187 897-904,(1996) ；Setchel1，KDR. Am J Clin Nutr, 129 1333S-1346S(1998) ；Kurzeret al, Annu Rev Nutr，17 :353_381 (1997))。然而，这些异黄酮分子在大豆食物中以生物活性形 式存在的水平不高，而是以前体的形式以高丰度存在。例如，染料木苷(genistin)，染料木 素的前体，是含有分子碳水化合物部分的糖苷形式。此外，还存在丙二酰糖苷和乙酰糖苷形 式。这些缀合物在胃肠(GI)道中由肠道细菌代谢，所述肠道细菌将碳水化合物部分水解， 生成生物活性的植物性雌激素，染料木素。糖苷配基大豆苷元发生的代谢步骤相同，其转化 自糖苷形式大豆苷(daidzin)。大豆苷元在“生成牛尿酚”的哺乳动物中再进一步代谢成牛尿酚，所述牛尿酚然后可以在生产牛尿酚的个体的血浆中找到。除非食用大豆，否则牛尿酚 在绝大多数健康成年人的尿中通常是不存在的。体内牛尿酚的形成完全依赖于肠道菌群， 证据是下述发现当用大豆饲养无菌以及无植物性雌激素喂养的动物时发现其并不排泄牛 尿酚，并且人类新生儿或从出生开始仅喂养大豆食物的4个月龄的婴儿的血浆和尿中也不 存在牛尿酚，原因是新生儿中还没有发展出肠道菌群。(参见Setchell et al,The Lancet, 1997 ；350 23-27)。异黄酮的酚环使得这些化合物能结合雌激素受体(ER)并模拟雌激素。虽然染料 木素和大豆苷元结合雌激素受体，但与雌二醇相比其亲和力较低，并且对ERi3的亲和力比 对ERa高。因此异黄酮(如染料木素和代谢物S-牛尿酚)在机体各处多个组织位点中起 天然的选择性雌激素受体调节物(SERMs)的作用。在一些组织中，有证据显示植物性雌激 素起雌激素激动剂的作用，而在另外的组织中，它们又显示出与他莫西芬和雷洛昔芬相当 的拮抗剂特征，其中SERM活性似乎是性激素依赖性和性别依赖性的。尽管大量科学文献关注大豆或三叶草中的天然异黄酮，但很少有关于它们的肠来 源代谢物的作用或效果的报道。牛尿酚(7-羟基-3-(4'羟基苯基)_色满)是植物性雌激 素大豆苷的主要代谢产物，大豆苷是大豆和豆制品中含量丰富的主要异黄酮之一。然而牛 尿酚并不是植物性雌激素，因为它不是植物的天然成分。它不天然存在于任何一种基于植 物的产品中。事实上，它是完全由肠细菌代谢产生的非留体异黄酮，然而只有约30-40%的 人类具有将大豆异黄酮转化成牛尿酚的必需菌群。之前牛尿酚的研究已经证实牛尿酚具有某些弱的雌激素性质，与性激素结合球蛋 白和α-胎蛋白结合，还具有抗氧化剂的活性。在食用大豆的“产生牛尿酚”的哺乳动物的 尿和血浆中，牛尿酚的S-对映体(S-牛尿酚)是唯一的牛尿酚形式，也是人类肠细菌产生 的唯一牛尿酚对映体。R-和S-对映体构象不同，相应地影响了它们的生物活性。例如，只 有牛尿酚的S-对映体以足够的亲和力结合ER亚型，从而与报道的人类正常循环牛尿酚水 平相关。前列腺的发育和成熟依赖于雄激素的作用，人类的良性前列腺增生(BPH)的形 成明确需要在衰老过程中与睾丸雄激素的联合。然而，睾酮不是负责前列腺生长的主要 雄激素。如最近的前列腺癌症的治疗所证明的，主要的前列腺雄激素是5 α - 二氢睾酮 (5 α -DHT)，所述治疗涉及用5 α -还原酶抑制剂减少5 α -DHT。虽然在人类BPH中5 α -DHT 水平没有升高，但在衰老的过程中前列腺中的5 α-DHT水平保持稳定，虽然血浆中睾酮的 浓度降低。在前列腺间质和基底细胞中睾酮被5α-还原酶转化成5α-DHT。5 α-DHT主 要负责前列腺的发育和BPH的发病。5 α -还原酶抑制剂能将前列腺体积减小20% -30%。 这种腺组织的减小是通过诱导凋亡产生的，组织学上表现为导管的萎缩。5α_还原酶有两 种同工型，1型和2型，前列腺主要表达2型同工型，肝和皮肤主要表达1型同工型。病人 已被鉴定为缺乏2型5 α -还原酶而非1型。具有2型5 α -还原酶无效突变的基因靶向敲 除小鼠显示类似于缺乏5 α -还原酶的人的表型。1型5 α -还原酶敲除雄性小鼠在生育功 能上表型正常。已报道了其他泌尿生殖组织例如附睾、睾丸、引带和海绵体组织(corporal cavernosal tissue)中5 α -还原酶的酶活性或免疫组织化学检测。数量上，由于性别上更高的肾上腺皮质应激性，女性分泌的雄激素量比雌激素多。 通常被归类为雄激素的主要循环类固醇根据血浆浓度递减的顺序，包括脱氢表雄酮硫酸盐(DHEAS)，脱氢表雄酮(DHEA)(源自肾上腺皮质)，雄烯二酮㈧，睾酮⑴和5 α -DHT,虽然 只有最后两种能结合雄激素受体至显著的程度。其他三种类固醇被更适当地认为是前雄激 素。5 α-DHT主要是睾酮代谢的外周产物。睾酮以游离形式和结合蛋白质的形式循环，所述 蛋白质包括白蛋白和性类固醇激素结合球蛋白(SHBG)，其水平是决定游离睾酮浓度的重要 因素。绝经后卵巢是分泌雄激素的器官，绝经过渡期或绝经期的发生不直接影响睾酮的水 平。一些研究工作已经开始关注用于治疗雄激素依赖性疾病的甾体化合物的开发，所 述疾病例如为多毛症，雄激素样秃发症，良性前列腺肥大(BPH)和前列腺癌。主要通过对 遗传缺乏留类5 α-还原酶的男性的临床评价暗示DHT是这些疾病进程的病因因素。通过这 些研究，抑制这种酶成为设计和合成新的抗雄激素(antiandrogenic)药物的药理学策略。 然而，还不清楚抑制5α还原酶是否对系统有毒害作用，其已被使用5 α还原酶抑制剂的传 统治疗方法报道的副作用引起的禁忌症例如降低的性欲，勃起障碍和射精障碍证实。把抑 制DHT的作用作为靶点的多种策略的开发将成为雄激素调节的病况的治疗的重大进步。尽管最近对牛尿酚涉及雌激素作用的药理学有了一定了解，我们的研究显示牛尿 酚有效的抗雄激素作用是独特和新颖的，并且开启了预防或治疗雄激素相关病况的新途 径。结合或隔绝5 α-DHT将提供抑制其对5 α-DHT敏感组织的作用的方法。目前没有对 5 α -DHT特异的已知配体，但这类试剂明显优于直接靶向雄激素受体的无选择性化合物相 比或雄激素合成相关的酶。

发明内容
本发明涉及共调节雄激素作用和雌激素作用的方法，所述方法通过以足以结合游 离5 α -DHT (从而抑制5 α -DHT与雄激素受体的结合)并结合雌激素受体亚型的用量施用 包含S-牛尿酚的异构牛尿酚，来缓解人或非人物种的一种或多种生理性和病理性皮肤病
况/病症。本发明还涉及调节雄激素作用的方法，所述方法通过以足以结合游离5 α-DHT并 抑制5 α -DHT与雄激素受体结合的用量施用包含R-牛尿酚的异构牛尿酚，来缓解人或非人 物种的一种或多种生理性和病理性皮肤病况/病症。本发明进一步涉及治疗和预防受雄激素作用调节的雄激素相关疾病的方法，所述 方法通过以足以结合游离5 α -DHT (从而抑制5 α -DHT与雄激素受体的结合)并结合雌激 素受体亚型的用量施用包含S-牛尿酚的对映异构牛尿酚来实现。本发明也可涉及治疗和预防受雄激素作用调节的雄激素相关疾病的方法，所述方 法通过以足以结合游离5 α -DHT并抑制5 α -DHT与雄激素受体结合的用量施用包含R-牛 尿酚的对映异构牛尿酚来实现。本发明还涉及含有S-牛尿酚的对映异构牛尿酚用于治疗和预防受雄激素作用调 节的雄激素相关疾病的用途，所述用途通过以足以结合游离5 α -DHT并抑制5 α -DHT与雄 激素受体结合和足以结合雌激素受体亚型的用量施用包含S-牛尿酚的对映异构牛尿酚来 实现。本发明还涉及对人或非人物种的一种或多种生理性和病理性皮肤病况/疾病提 供个人化治疗的方法，所述病况/疾病受DHT和雌激素受体的调节，所述方法包含1)评价病人的一种或多种疾病状态或病况；2)评价病人的牛尿酚生产者状态；3)从包含下列的组 中选定治疗的最佳方案a)施用模式，b)剂量，c)施用间隔和d)牛尿酚剂量中对映异构体 的比例。本发明的方法和组合物对选自以下的多种皮肤病况/疾病的治疗和缓解有效皮 肤完整性，胶原蛋白的产生，弹性蛋白的产生，弹性蛋白酶，皮肤厚度，皮肤的血流，皮肤的 充盈，皮肤含水量，阴道干涩，预防基质金属蛋白酶引起的胶原蛋白和弹性蛋白的裂解，修 复和预防皮肤的皱纹，增加葡糖胺聚糖和透明质酸用于改善的皮肤外表，伤口愈合，皮肤伤 疤的改善，通过改善皮脂腺功能减轻油性皮肤，皮肤老人斑，和粉刺，男性和女性型秃发，多 毛症，头皮、脸部和身体毛发的健康和生长，顶泌(汗)腺功能，皮肤炎症，皮肤的免疫功能， 皮肤毛孔大小，皮肤温度，以及涉及雄激素和/或雌激素影响的类固醇激素合成/激素作 用、类固醇代谢和类固醇结合受体代谢中皮肤和毛发的异常。另一个实施方式中，本发明涉及调节雄激素作用从而缓解受试者至少一种皮肤或 毛发病况的方法。所述方法包括施用牛尿酚，其中至少是R-牛尿酚，其中R-牛尿酚结 合游离5 α - 二氢睾酮并抑制5 α - 二氢睾酮与雄激素受体的结合。此方法中，牛尿酚可以 包括至少5% R-牛尿酚。此方法中，牛尿酚可以包括至少10% R-牛尿酚。此方法中，牛尿 酚可以包括至少20% R-牛尿酚。此方法中，牛尿酚可以包括至少25% R-牛尿酚。此方法 中，牛尿酚可以是S-牛尿酚和R-牛尿酚的外消旋混合物。此方法中，牛尿酚可以进一步包 括足量结合雌激素受体亚型的S-牛尿酚。另一个实施方式中，本发明涉及缓解受试者至少一种皮肤或毛发病况的方法。该 方法包括施用包含牛尿酚的组合物，所述牛尿酚中至少是R-牛尿酚，其中R-牛尿酚结 合游离5 α - 二氢睾酮和抑制5 α - 二氢睾酮与雄激素受体的结合。此方法中，牛尿酚可以 包括至少5% R-牛尿酚。此方法中，牛尿酚可以包括至少10% R-牛尿酚。此方法中，牛尿 酚可以包括至少20% R-牛尿酚。此方法中，牛尿酚可以包括至少25% R-牛尿酚。此方法 中，牛尿酚可以是S-牛尿酚和R-牛尿酚的外消旋混合物。此方法中，组合物可以是局部、透 皮或皮下施用。此方法中，组合物可以是局部组合物，包含至少约0. 001%至约10%的牛尿 酚。此方法中，组合物可以进一步包含药学活性物质或赋形剂。此方法中，组合物可以口服， 剂量是至少约0.005mg/kg体重的牛尿酚。此方法中，组合物可以是迟释或缓释制剂。此方 法中，组合物可以通过乳液，喷雾液，护垫，绷带或透皮贴剂的形式施用。此方法中，牛尿酚 可以进一步包括足量结合雌激素受体亚型的S-牛尿酚。此方法中，皮肤或毛发的状态可以 经至少下列一种以美容形式改善a)通过细胞重生诱导提高的皮肤完整性；b)增强皮肤的 含水量或湿度；c)增加葡糖胺聚糖和透明质酸用于改善皮肤光泽；d)降低经表皮的水分流 失，皮肤剥落和脱皮；e)滋补得到有活力的健康皮肤；f)改善皮肤厚度和增强细胞的耐久 性；g)加强皮肤的胶原蛋白和改善皮肤健康；h)促进皮肤的伸缩性以及改善皮肤的保护性 能；i)增加弹性蛋白以改善皮肤的弹性；j)保护免受弹性蛋白酶的损伤；k)保护免受胶原 蛋白酶的损伤；1)保护免受基质金属蛋白酶的损伤；m)修复和减轻真皮皱纹和改善皮肤质 地；η)减小皮肤毛孔尺寸和增强皮肤的光滑度；ο)复原和恢复皮肤；P)改善伤疤的外观和 皮肤磨损；q)通过最小化皮脂腺分泌减轻油性皮肤；r)减轻按年代的，内在和外在的皮肤 的真皮衰老；s)改善皮肤老人斑；t)增强毛发的色素沉着和U)改善皮肤色调。此方法中， 通过至少一种以下的手段药学上改善皮肤或毛发的病况a)增加皮肤中的血流；b)改善皮肤的温度和皮肤的温度调节；C)增加真皮厚度和抑制成纤维细胞的凋亡；d)诱导胶原蛋白 的产生和增强皮肤的充盈；e)诱导弹性蛋白的产生和增加皮肤弹性；f)抑制弹性蛋白酶以 改善皮肤的质地和真皮纹理；g)修复和治疗皱纹和改善皮肤质地；h)正面影响血管形成， 皮肤厚度和皮肤充盈，和减慢衰老的进程；i)减少基质金属蛋白酶以正面影响皮肤胶原蛋 白和弹性蛋白；j)增强皮肤的修复和伤口的愈合；k)改善伤疤的外观和皮肤磨损；1)通过 最小化皮脂腺分泌减轻油性皮肤；m)稳定皮肤颜色的变化和毛发的色素沉着以及增强皮 肤的亮度；η)治疗，改善和对抗高色素沉着，老人斑和光老化带来的损害；ο)减轻或消除粉 刺；P)减轻头皮头发的减少或增强头皮头发的保留(在男性和女性型秃发中)；q)延迟面 部和身体毛发的生长，减少面部和身体毛发的生长和减轻多毛症；r)减轻顶泌腺分泌和减 轻过量汗腺功能(汗腺炎和腋臭)；s)减轻皮肤炎症和阴道干燥和t)减轻涉及雌激素和/ 或雄激素影响的类固醇激素合成和功能，和类固醇代谢与类固醇结合受体代谢中皮肤和毛 发的异常。在另一个实施方式中，本发明涉及增强皮肤外观的方法。方法包括施用包含牛尿 酚的组合物的步骤，所述牛尿酚中至少1 %是R-牛尿酚，其中R-牛尿酚结合游离5 α - 二氢 睾酮和抑制5 α - 二氢睾酮与雄激素受体的结合。此方法中，牛尿酚可以进一步包括足量结 合雌激素受体亚型的S-牛尿酚。


图1显示S-牛尿酚和R-牛尿酚对映体的化学结构。图2显示健康成年人口服施用R-牛尿酚后血浆中R-牛尿酚的出现/消失曲线。图3显示[3H] 5 α -DHT+牛尿酚出现明显的峰，而单独的[3H] 5 α -DHT没有。图4Α显示与前列腺共同孵育后[3H] 5 α -DHT+牛尿酚出现两个明显的峰㈧。图4Β显示与前列腺共同孵育后[3H] 5 α -DHT仅出现单独的峰⑶。图5显示牛尿酚与[3H] 5 α -DHT特异性结合。图6显示喂养Phyto-600或无Phyto饮食的雄性大鼠(不禁食)的血糖水平。图7显示喂养Phyto-600或无Phyto饮食的雄性大鼠(不禁食)的甲状腺(T3) 血清水平。图8显示基于无-Phyto饮食的三组大鼠在接受牛尿酚注射或载剂注射后28天的
睾丸重量。图9A显示非秃的皮肤上雌激素受体β (ER- β),5α-还原酶(5 α -R)和雄激素受 体(AR)的分布。图9B显示人皮肤的毛囊球部的ER β，5 α -R和AR的分布。图9C显示人皮肤的皮脂腺的ER β，5 α -R和AR的分布。图10显示与加入组织培养基的对照物质或牛尿酚(外消旋混合物)孵育后表皮 中前胶原的合成。图11显示与加入组织培养基的对照物质或牛尿酚(外消旋混合物)孵育后表皮 加真皮中平均的前胶原合成。图12显示与加入组织培养基的对照物质或牛尿酚(外消旋混合物)孵育后真皮 中前胶原的合成。
图13显示人真皮单层成纤维细胞与加入培养基的0. 01 %，0. 001 %和0. 0001 %牛 尿酚，0. 01 %，0. 001 %和0. 0001 % 17 β -雌二醇，载剂或抗坏血酸孵育后，通过MTT试验测 量的代谢活性。图14显示人真皮单层成纤维细胞与加入培养基的0. 01 %，0. 001 %和0. 0001 %牛 尿酚，0.01%，0. 001%和0. 0001% 17 β-雌二醇，载剂或抗坏血酸孵育后，通过胶原I型C 末端前肽ELISA测量的胶原蛋白沉积。图15显示人真皮单层成纤维细胞与加入培养基的载剂或0. 001%牛尿酚孵育后， 通过MTT试验测量的代谢活性。水平线表示用未处理对照培养物测定的基线。图16显示人真皮单层成纤维细胞与加入组织培养基的二乙二醇单乙基醚 (transcutol)载剂，0. 0001 %牛尿酚，或抗坏血酸孵育后，通过胶原I型C末端前肽ELISA 测定的胶原蛋白沉积。水平线表示用未处理对照培养物测定的基线。图17显示人真皮单层成纤维细胞与加入组织培养基的未处理的介质，抗坏血酸， 0. 001%牛尿酚，0. 001% 5 α-DHT或0. 001%牛尿酚和0. 001% 5 α-DHT的组合孵育后，通 过MTT测定测量的代谢活性。水平线表示用未处理对照培养物测定的基线。图18显示与加入组织培养基的载剂，10，1，或0. Inm 5 α-DHT，100，10，或Inm牛 尿酚，或5 α-DHT和牛尿酚的组合孵育后，前列腺癌细胞分泌的前列腺特异性抗原(PSA)水 平。图19显示与加入组织培养基的载剂，IOnm牛尿酚，或IOnm 17 β -雌二醇孵育后， 人真皮单层成纤维细胞的3维(3-D)培养物中胶原I型蛋白表达的荧光活化的细胞分选 (FACS)分析。图20显示与加入组织培养基的载剂，IOnm牛尿酚，或IOnm 17 β -雌二醇孵育后， 人真皮单层成纤维细胞的3-D培养物中，胶原III型蛋白表达的荧光素活化的FACS分析。图21显示与加入组织培养基的载剂，IOnm牛尿酚，或IOnm 17 β -雌二醇孵育后， 人真皮单层成纤维细胞的3-D培养物中，基质金属蛋白酶-3(ΜΜΡ-3)蛋白表达的FACS分 析。图22显示与加入组织培养基的载剂，IOnm牛尿酚，或IOnm 17 β -雌二醇孵育后， 人真皮单层成纤维细胞的3-D培养物中，弹性蛋白表达的FACS分析。图23显示与加入组织培养基的载剂，IOnm牛尿酚，或IOnm 17 β -雌二醇孵育后， 人真皮单层成纤维细胞的3-D培养物中，弹性蛋白酶蛋白表达的FACS分析。图24显示与加入组织培养基的载剂，IOnm牛尿酚，或IOnm 17 β -雌二醇孵育后， 人真皮单层成纤维细胞的3-D培养物中，通过FACS进行的凋亡的细胞周期分析。图25显示与加入组织培养基的载剂，IOnm牛尿酚，或IOnm 17 β -雌二醇孵育后， 人真皮单层成纤维细胞的3-D培养物中，通过FACS进行的处于S-G2M相周期的细胞周期分 析。图26显示连续注射载剂或牛尿酚25天后雄性大鼠的尾部皮肤温度。图27显示与加入组织培养基的载剂，IOnm牛尿酚，IOnm 17 β-雌二醇，或抗坏血 酸孵育后，通过胶原I型C末端前肽ELISA测量的人真皮单层成纤维细胞的胶原蛋白沉积 的结果。图28显示用于测试载剂(乙醇)，牛尿酚外消旋体或S-牛尿酚的刺激性的眼刺激性检测(ocular irritection)模型。图29显示用于测试载剂(乙醇)，牛尿酚外消旋体或S-牛尿酚的刺激性的真皮刺 激实验模型。图30是显示直接结合5 α -DHT的牛尿酚异构体比例的图表(平均值士 s. e. m.)。图31的图表说明在人真皮器官型培养物中，雌激素受体亚型阻断剂他莫西芬 (TAM)对于牛尿酚对胶原I型产生的正面影响的阻断。图32的图表说明在人真皮等同物培养物中，雌激素受体亚型阻断剂TAX对于牛尿 酚对胶原I型和III型和弹性蛋白的正面影响的阻断。图33的图表显示在器官型人全厚度等同物中，体外给予不同浓度的非外消旋牛 尿酚(0. 3至0. 0001% )测定的存活力和细胞毒性。图34的图表显示使用非外消旋牛尿酚和已知组织穿透剂对人真皮成纤维细胞中 胶原蛋白的刺激。图35的图表显示非外消旋牛尿酚刺激人类真皮成纤维细胞中胶原蛋白沉积的效^ ο图36是在半脸(half-face)实验中通过给予非外消旋牛尿酚进行的摄像分析的 照片。对附图和目前优选的实施方式的详述在这里，术语“皮肤”指的是包含人或非人个体体被的细胞层，以及其结构元件例 如毛发、毛囊、皮脂腺、顶泌(汗)腺、手指甲和脚指甲。更进一步地，本发明使用的术语“皮 肤”包括延伸自相邻皮肤的粘膜组织，例如嘴和口腔、鼻子和鼻路、眼睛和眼皮、耳朵和外耳 道，以及会阴，和肛门和泌尿生殖器口的组织。在这里，术语“受影响的部位”指的是要用治疗性分子或包含治疗性分子的化合物 治疗的皮肤区域。受影响的部位可以是寻求治疗的皮肤病况或疾病的部位。在一些情形中， 受影响的部位可以包含个体所有的皮肤。可选择的，受影响的部位可以是寻求改善美容性 质的部位，其同样可以包括个体所有的皮肤。在这里，术语“系统的”或“系统性地”指的是通过血流或淋巴系统达到皮肤的受 影响的部位进行治疗的施用方式。系统性治疗的实例包括但不限于，口服灌胃或消化，静脉 内或皮下泵输注，和肌肉内、腹膜内、真皮下注射(hypodermic)或皮下(subdermic)注射。在这里，术语“局部的”或“局部地”指的是直接应用于皮肤的受影响的部位的施 用方式。局部治疗的实例包括，但不限于应用乳霜、乳液、香波、调理液、喷雾、护垫、绷带、尿 布、预湿小毛巾(proistened towellte)或透皮贴剂；和经静脉内注射或导入锭剂或栓剂 的局部施用。在这里，术语“皮肤参数”指的是皮肤健康的各种指标，包括但不限于胶原蛋白和 弹性蛋白的生产水平，弹性蛋白酶、皮肤厚度、皮肤中的血流、皮肤充盈和含水量、基质金属 蛋白酶引发的胶原蛋白和弹性蛋白裂解的防止、皮肤皱纹的消失、为了正常皮肤外观的葡 糖胺聚糖和透明质酸的存在、皮肤伤口愈合的能力、正常的皮脂腺功能、皮肤老人斑的不存 在或色素沉着障碍、皮肤毛孔大小、皮肤温度和毛发和指甲的正常生长。在这里，术语“皮肤完整性”指的是细胞外基质中胶原蛋白和弹性蛋白的存在，所 述蛋白使得皮肤能够伸长和回缩，从而允许运动。
牛尿酚(7-羟基-3-(4 ‘-羟基苯基)_色满)代表大豆苷和大豆苷元的主要代谢 物——在大豆和大豆食物中大量存在的异黄酮，并且是一种重要的生物活性分子。喂养富 含植物性雌激素饮食的动物，例如啮齿动物中，主要循环的异黄酮是牛尿酚，约占总循环异 黄酮水平的70-90%。然而，人体中不是这样。牛尿酚是通过来自大豆的大豆苷的糖缀合物和甲基化异黄酮芒柄花黄素或在三 叶草中发现的其糖的缀合物的水解形成的。一旦形成，牛尿酚显示为代谢惰性的，不经过进 一步的生物转化，保留II相代谢或肝中轻微程度的附加的羟基化。与大豆苷元和染料木素 一样，主要的II相反应是葡萄糖醛酸化和程度较小的硫酸化。在尿中存在的牛尿酚是大豆 消化的函数的原始发现之后，我们观察到约50-70%的成年人即使天天食用大豆食物，尿液 中也没有牛尿酚排泄，原因不清楚。而且，即使给予纯的异黄酮化合物，从而去除食物基质 的任何影响，许多人也不能将大豆苷元转化成牛尿酚。这种现象导致将人定义为“牛尿酚生 产者”或“非牛尿酚生产者”(或“低牛尿酚生产者”)来形容这两种不同的人群。通过经验得到了划分这两种人群的边界值。血浆牛尿酚浓度小于IOng/ mL(40nmol/L)的属于“非牛尿酚生产者”，水平大于lOng/mL(40nmol/L)的定义为“牛尿酚 生产者”。这种区别也可以通过尿中的水平得到，牛尿酚生产者是排泄大于lOOOnmol/L的 人。虽然个体间对牛尿酚的排泄差别很大，但能生产牛尿酚和不能生产的个体之间区分很 明显，其与催化该反应的酶动力学中的前体-产物关系一致。因此尿中大豆苷和牛尿酚水 平之间存在反相关，并且迄今为止未定义显著的性别差异。牛尿酚的作用机理已经被认为是皮肤健康和疾病的重要分支，表明牛尿酚在雄 激素和/或雌激素调节的皮肤和毛发病理过程的治疗中有广泛和重要的应用。牛尿酚能 作为抗雄激素或雌激素受体的激动剂或拮抗剂。牛尿酚的抗雄激素性质是独一无二的， 这是因为牛尿酚不与雄激素受体(AR)结合，而是特异性地高亲和力结合5α_ 二氢睾酮 (5 α -DHT)，从而防止5 α -DHT结合AR。而且，牛尿酚的R-和S-对映异构体都特异性结合 5 α -DHT,隔绝5 α -DHT和AR，抑制5 α -DHT在体内生理过程的作用。由R-牛尿酚和S-牛 尿酚组成的外消旋牛尿酚，以及单独的R-牛尿酚或S-牛尿酚，选择性地结合5 α -DHT。哺乳动物中，有两种主要的雄激素，睾酮和其5 α -还原的代谢物，5 α -DHT。 5 α -DHT被认为是哺乳动物体中作用最强的雄激素。由位于人类X染色体上的单拷贝基因 编码的AR特异性地调节雄激素的作用。虽然睾酮和5 α -DHT都结合AR，但是仅受睾酮轻微 影响的某些组织(即前列腺，毛囊等)受5 α -DHT很大的影响。而且，5 α -DHT涉及许多疾 病和病症。因为牛尿酚特异性结合5 α -DHT并抑制其作用，表明牛尿酚在雄激素调节的皮 肤和毛发病理过程的治疗中有广泛和重要的应用。牛尿酚与类固醇雌激素雌二醇有相似的结构。附图1显示了 R-牛尿酚和S-牛尿 酚的化学结构。牛尿酚在异黄酮中是独一无二的，其具有手性中心从而存在两种不同的对 映异构体形式，R-和S-对映异构体。R-和S-牛尿酚构像上不同，这预示着其将影响牛尿 酚对映体与二聚ER复合物空腔中结合位点的配位方式，以及与5 α -DHT的结合方式。约50%的牛尿酚以游离或未结合的形式在人体循环，并且比血浆中的游离大豆苷 元(18. 7% )或雌二醇(4. 6% )的比例显著更高。由于未结合的部分可用于进行受体占据， 并且假定地可用于结合5 α -DHT，所以这可有效增强牛尿酚的总效力。所有已知的之前对牛尿酚的研究似乎都是用牛尿酚的外消旋形式进行的。通常缺少存在两种形式的牛尿酚或其对映体作用可不同的评价，据我们所知目前没有关于单个对 映体的特异性作用或活性的报道。R-和S-牛尿酚特异性结合5 α-DHT。牛尿酚外消旋体， R-牛尿酚或S-牛尿酚不结合雄激素受体(AR)。与17 β -雌二醇相比，R-和S-牛尿酚对映 体与ER α的亲合力(分数(1/210)和分数(1/49))分别小于17 β-雌二醇。然而，S-牛 尿酚对映体看起来具有ER β高选择性，具有相对高的ER β亲和力。对映体S-牛尿酚结合 ER β的浓度与17 β -雌二醇相似[牛尿酚，Kd = 0. Ixm vs. 17 β -雌二醇，Kd = 0. 15nm]， 但其对ERi3亚型优先的亲和力将S-牛尿酚定义为SERM。R-牛尿酚对映体以约{分数 (1/100)}的亲和力结合，但是，如果R-牛尿酚以非常高的浓度存在，它就不具有SERM性质。 因此，S-和R-牛尿酚具有选择性结合最强循环雄激素——5 α -DHT的能力，并且S-牛尿酚 对ER β具有充分的亲和力，从而定义它具有SERM的性质。 大豆苷元的天然代谢物S-牛尿酚和R-牛尿酚拮抗有效的雄激素二氢睾酮 5 α -DHT作用的能力为预防和治疗其中强效雄激素5 α -DHT发挥有害作用的疾病的美容、 饮食、营养药品和药理学方法提供了机会，所述疾病包括但不限于，前列腺癌、肥胖症、皮肤 疾病和毛发缺损。另外，S-牛尿酚的雌激素作用也可对治疗或预防BPH和前列腺癌有利， 这归功于牛尿酚在雌激素受体水平上和作为抗雄激素的联合作用。
虽然不天然存在，但由于能调节体内受雄激素介导的过程，R-牛尿酚是非常重要 的。在结合研究中，牛尿酚对映体特异性结合5 α -DHT，但不结合睾酮、DHEA或雌激素。这 样，牛尿酚不直接结合雄激素受体自身就能隔绝5 α -DHT与雄激素受体。体内研究表明对 未经阉割的雄性大鼠进行牛尿酚处理能显著降低前列腺和附睾而不是睾丸的重量。给予用 5 α -DHT处理的阉割的雄性大鼠牛尿酚后，牛尿酚抑制了 5 α -DHT对前列腺的营养作用，以 及对血浆促黄体生成素(LH)水平的负反馈作用。通过特异性结合5 α -DHT和阻止5 α -DHT与雄激素受体(AR)的结合，而不是自身 与AR结合，牛尿酚能起抗雄激素作用。而且，已经与AR结合的5 α -DHT不能再被异构的牛 尿酚竞争性结合。异构的牛尿酚可以被用来在体外或体内与5 α-DHT接触。当在体内接触 5 α -DHT时，可以通过任何路径施用牛尿酚，所述路径允许吸收牛尿酚进入血液或局部应用 进入皮肤。生物学上可获得的5 α -DHT在结合牛尿酚之前是游离的，并不被任何天然配体
纟口口。生殖器官例如前列腺和附睾已知是受雄激素控制的。之前的数据显示青春期前， 当循环的雄激素水平很低时，用含有大量大豆衍生的异黄酮的饮食喂养的大鼠具有不被这 种饮食改变的前列腺重量。然而，青春期后，当雄激素水平升高时，与喂养无植物性雌激素 饮食的动物相比，喂养富含植物性雌激素饮食的大鼠的前列腺重量显著下降。这些数据与 本发现相似，本发现即经牛尿酚处理的未经阉割大鼠显示前列腺和附睾重量显著下降，但 不改变睾丸或垂体的重量。值得注意的是，如果前列腺和附睾的值相对于体重被标准化 (每100克)，则所述比例在牛尿酚处理过的值和对照值之间仍然显著不同。牛尿酚也抑制 5 α -DHT对前列腺和附睾的雄激素营养作用，而不显著改变睾酮水平。5 α-DHT对循环的血浆促黄体生成素(LH)水平有负反馈作用。牛尿酚通过结 合5 α -DHT显著升高LH水平并防止这种反馈作用。牛尿酚完全逆转5 α -DHT对性腺切除 (GDX)的雄性中LH水平的抑制作用，但5ci-DHT加牛尿酚处理的雄性大鼠显示与对照值相 似的LH水平。这些数据进一步提示牛尿酚具有结合5 α-DHT的特定能力(推测在血循环系统中)，并阻碍5 α -DHT在LH生产或分泌中的激素作用。因此本发明的一个实施方案是 通过用对映异构的牛尿酚接触个体的5 α -DHT来调节个体LH水平的方法。牛尿酚可以通 过允许将牛尿酚吸收入皮肤或血液的任何路径施用，其施用的量与要被治疗的疾病的性质 和个体的大小一致。在某些方案中，可能需要提供系统和局部的联合治疗。对映异构的牛尿酚可以通过化学合成制备，可以通过已知方法，典型地利用手性 相柱从外消旋混合物中分离得到。可以使用生物学方法得到具有高对映选择性的S-牛尿 酚，所述生物学方法利用与源自异黄酮例如大豆苷元的牛尿酚的代谢相关的产生牛尿酚的 微生物。PCT专利公开W004-009035描述了这些方法，其整体被引入作为参考。诵过I合予S-牛尿酚、R-牛尿酚和、混合物来治疗疾病本发明为个体受试者提供一种手段，来克服不能体内产生牛尿酚或尤其是供应 R-牛尿酚的问题，所述手段通过直接提供牛尿酚对映体、S-牛尿酚或R-牛尿酚、非外消旋 S-牛尿酚和R-牛尿酚的外消旋或非外消旋混合物来实现，避免对生产这些化合物的肠道 细菌的需要或摄取含牛尿酚前体的异黄酮的大豆食品的需要。输送S-牛尿酚不仅能补充 “牛尿酚生产者”也能补充“非牛尿酚生产者”体内S-牛尿酚的生成。当牛尿酚生产者产生的日常S-牛尿酚水平由于下列原因不足时，给他的饮食中 补充牛尿酚对映体或混合物是有利的，1)消耗的异黄酮不足以产生牛尿酚，2)抗生素的使 用消除了从前体异黄酮制造牛尿酚的肠道细菌的活性，或3)其他影响牛尿酚生产或吸收 水平的健康因素，例如短肠综合征或肠造口的手术构建，例如回肠造口术。另外，补充的牛 尿酚水平被认为对人的健康和生活质量有增强作用。本发明提供以足够对雄激素相关疾病以及其他相关病况产生健康益处的用量输 送S-牛尿酚、R-牛尿酚、外消旋牛尿酚或非外消旋的牛尿酚混合物的方法。牛尿酚的抗雄 激素活性能影响体内许多组织。特别地，5 α -DHT的抑制雄激素的活性对预防和治疗以下有 利女性和男性型秃发、面部和身体毛发生长(多毛症)、皮肤健康(粉刺、抗衰老例如预防 皱纹和修复以及抗光老化)，和皮肤完整性(胶原蛋白和弹性蛋白的坚稳性)。该方法可以 是局部施用、系统性施用或局部和系统性联合施用。对于局部施用，应用于皮肤受影响的部位的牛尿酚浓度的范围在0. 001%到10% 之间。其他实施方案中，应用于皮肤受影响的部位的牛尿酚浓度的范围在0.01%到10% 之间。典型地，0.01%到能有效诱导提高的皮肤完整性，胶原蛋白的产生，弹性蛋白的 产生，弹性蛋白酶，皮肤厚度，皮肤的血流，皮肤的充盈，皮肤含水量，预防基质金属蛋白酶 导致的胶原蛋白和弹性蛋白的裂解，皮肤皱纹的修复和预防，增加用于改善皮肤外观的葡 糖胺聚糖和透明质酸，伤口愈合，皮肤伤疤的改善，通过改善皮脂腺功能减轻油性皮肤，皮 肤老人斑和皮肤亮度，粉刺，男性和女性型秃发，多毛症，头皮、脸部和身体毛发的健康和生 长，顶泌(汗)腺功能，皮肤炎症，皮肤的免疫功能，皮肤毛孔大小，皮肤温度，以及涉及雄激 素和/或雌激素影响的类固醇激素合成/激素作用、类固醇和类固醇结合受体代谢中皮肤 和毛发的异常。在某些方案中，由于皮肤病况或疾病的存在或病人是非牛尿酚生产者，需要 较高的剂量。这种情况下，局部应用的牛尿酚浓度可以高达10 %，可以更加频繁地进行局部 施用，或可以联合或替代局部施用地使用系统施用。对于系统施用，给予足量含牛尿酚的组合物，以在哺乳动物血浆中产生至少5纳 克每毫升(ng/mL)、更典型地至少lOng/mL或更高的瞬时对映异构牛尿酚水平，或尿液中高于lOOOnmol/L的瞬时对映异构牛尿酚水平。典型地，口服的组合物的剂量为至少约 0. 005mg,至少约lmg，更典型地至少5mg，和高达200mg，更典型地达50mg的异构牛尿酚。图 2的R-牛尿酚血浆出现/消失的药代动力学曲线显示了健康成年人口服20mg R-牛尿酚对 映体后血浆中典型的R-牛尿酚血浆浓度。健康成年人口服20mg S-牛尿酚后血浆中典型 的S-牛尿酚生物利用度水平与R-牛尿酚显示的相似。输送足量的R-和/或S-牛尿酚的能力被认为比输送牛尿酚的外消旋混合物更有 优势。首先，单独的R-牛尿酚或S-牛尿酚的效力典型地是外消旋混合物的至少2倍。第 二，人体只产生S-牛尿酚，因而只含S-牛尿酚的组合物代表含身体熟悉的成分S-牛尿酚 的“天然”产品。第三，由于R-牛尿酚对映体具有独一无二的性质，只含或基本只含R-对 映体的治疗组合物可以产生有利和/或治疗作用。第四，给予R-牛尿酚可以补充存在的任 何内源性S-牛尿酚，从而在体内产生雌激素性和抗雄激素性两种作用。本发明包括对映异构的牛尿酚用于治疗和预防与男性和女性型秃发相关的疾病 和病况的用途。5 α -DHT已知是头皮毛发缺损的原因。雄激素，特别是主要的循环雄激素睾 酮被转化成更强效的雄激素二氢睾酮(5 α -DHT)(在毛囊中)，5 α -DHT对头皮毛囊的激素 作用造成了毛发缺损。因此，如果能阻断5 α -DHT的激素作用，例如通过在本发明中使用牛 尿酚结合循环中(血管中)和毛囊中的5 α-DHT，就能减轻或预防头皮毛发缺损。本发明包括对映异构的牛尿酚用于治疗和预防与面部和身体毛发相关的疾病和 病况的用途。面部和身体的毛发受雄激素调控，但与头皮毛发的调控相反。具体地，更强效 的雄激素，5 α-DHT，增加面部和身体的毛发。5 α-DHT还增加皮脂腺的皮脂(油)生成，其 有利于粉刺的增加。因此，牛尿酚结合5 α-DHT能减轻面部和身体的毛发以及皮脂(油) 的分泌，和减少或预防粉刺。本发明包括对映异构的牛尿酚用于治疗和预防与皮肤效果、皮肤品质和完整性、 皮肤老化、皮肤光老化和皮肤色素沉着和亮度相关的疾病和病况的用途。雌激素，绝经期之 前尤其是之后，通过增加弹性蛋白和胶原蛋白的含量改善皮肤健康以改进皮肤的性质或坚 稳性。同样地，当皮肤受粉刺或其他皮肤破坏(搔伤、突起的水疱或小切口等)损伤时，如 果存在雌激素或类雌激素化合物例如牛尿酚，则修复的过程更快并且皮肤治愈地更好。人 们认为对映异构的牛尿酚特别是S-牛尿酚或对映体混合物或外消旋的牛尿酚能刺激弹性 蛋白和胶原蛋白，还能保护免受光老化。牛尿酚阻断5 α-DHT的激素作用的能力能降低皮 脂腺产生的皮脂油，从而减轻或消除粉刺。由于S-牛尿酚结合雌激素受体(主要是ERi3)， 这种类雌激素分子的保护作用刺激皮肤中的弹性蛋白和胶原蛋白。另外，由于牛尿酚是强 抗氧化剂，它能保护皮肤避免衰老，包括光老化。性类固醇激素参与了皮肤发育和功能例如分泌的调控，还包括一些皮肤病理性疾 病。公认雌激素和雄激素的作用受皮肤、毛发和皮肤相关腺体中它们的受体的存在的调节。 参见 Pelletier 和 Ren，Histol Histopathology, 19 :629_636，2004。例如雄激素受体(AR) 定位于表皮/真皮的大多数角化细胞中，并且在约10%的成纤维细胞中观察到AR。然而， AR在皮脂腺的基底细胞和皮脂腺细胞中大量存在。AR在毛囊的表达受限于真皮乳头细胞。 ER^在表皮、皮脂腺(基底细胞和皮脂腺细胞)和外泌汗腺中高量表达。在毛囊中，ER^ 广泛表达于真皮乳头细胞、内鞘细胞、基质细胞和包括凸出部分的外鞘细胞。由于牛尿酚是大豆苷元的代谢物并具有选择性雌激素受体调节剂(SERMS)的性质，在某些细胞和组织位置，它起雌激素激动剂的作用而在其他地方它起雌激素拮抗剂的 作用，有理由推测牛尿酚在含ER3的多种细胞/组织中起双重类雌激素作用。由于R-牛 尿酚对ER α或ER β的亲和力很低，公认牛尿酚(外消旋体)能够通过其对映体S-牛尿酚 结合ERi3。然而，由于能够特异性结合并生物学上灭活5 α-DHT，S-牛尿酚和R-牛尿酚两 者具有可观的重要性，所述5CI-DHT在以下中起重要作用a)头皮和面部/身体毛囊生长， 例如雄激素样秃头症或男性型秃发，女性多毛症或女性型秃发，b)粉刺和皮脂腺功能，c) 伤口愈合和d)皮肤病症，例如顶泌腺障碍，化脓性汗腺炎或腋臭。最后，已知雌激素对皮肤 参数、伤口愈合、毛囊健康、皮脂腺和顶泌腺功能、表皮和毛囊色素沉着和恶性黑色素瘤起 正面影响。雌激素已知是人类皮肤维持的主要激素因素。已知它刺激真皮中胶原蛋白的生 成，增加皮肤厚度，增加皮肤的血管形成和增加表皮的有丝分裂活性。参见Brincat MP, Maturitas,29 107-117,2000 ；Punnonen R, Acta ObstetGynecol Scand Suppl,21 :3_44, 1972 ；Hasselquist，M B et al.，J Clin Endocrinol Metab，50 :76_82，1980 ；禾口 Shah M G 与Maibach H I,Am JClin Dermatol, 2 :143_150，2001。特别地，像Pirila E et al. ,Curr Med Chem, 8 :281_294，2001描述的，已知雌激素是基质金属蛋白酶(MMP)的天然调节剂。已 知MMPs可以裂解胶原蛋白和弹性蛋白。这种裂解可能是由于环境(接触化学制品、污染、 极端温度环境_冷或热)、机械(面部肌肉的收缩，例如微笑、皱眉、吸烟或用吸管喝东西) 或生物学的老化。这些因素受遗传学和老化的自然过程的影响，在老化过程中，皮肤变薄， 由于胶原蛋白尤其是弹性蛋白的减少而出现皱纹，皮肤的强健面貌衰落。雌激素治疗还显 示增加葡糖胺聚糖的浓度(粘多糖酸和透明质酸)，所述葡糖胺聚糖促进皮肤的含水量或 湿度以及影响皮肤的充盈。同样参见Raine-Fenning N J et al.，Am J Clin Dermatol,
4:371-378，2003。本发明包括S-牛尿酚或S-和R-牛尿酚的外消旋或非外消旋混合物用于缓解或 阻断涉及雌激素受体(例如他莫西芬)的癌症治疗的负性影响。已经证实他莫西芬治疗能 引起阴道干涩，这能通过牛尿酚的SERM作用得到改善。可以以相似的方式使用本发明以改 善伴随绝经期或绝经后阴道干涩的阴道干涩。本发明包括S-牛尿酚或S-和R-牛尿酚的外消旋或非外消旋混合物用于阻断
5α -DHT的负性作用以及降低MMPs从而正面影响皮肤胶原蛋白、弹性蛋白、血管形成和皮 肤厚度以及皮肤充盈，并减缓环境、机械和生物学老化的进程。雌激素对伤口愈合的速率和质量很重要。参见Pirila Eet al.，Curr Med Chem, 8 :281-294，2001 和 Ashcroft G E et al. ,Nat Med，3 1209-1215，1997。已经证明 ER3 是 成年人头皮皮肤和皮肤的毛囊皮脂腺单元(毛囊)的主要雌激素受体。参见Thornton M J et al. , Exp Dermatol, 12 181-190, 2003禾口 Thornton M J et al. , J InvestDermatol Symp Proc, 8 :100-103，2003。而且，有报道称生理水平的5 α-DHT通过破坏免疫功能和引发炎 症抑制伤口的愈合。参见 Nitsch S M et al. ,Arch Surg，139 157-163，2004 和 Gilliver S C et al. ,Thromb Haemost，90 :978_985，2003。MMPs 还参与了伤口 愈合并受雌激素的调 节。本发明包括S-牛尿酚、R-和S-牛尿酚的外消旋或非外消旋混合物通过其R-和 S-对映体与细胞外和细胞内的5 α -DHT结合来生物学失活这种强效雄激素并正面影响伤口愈合的用途。同时，R-和S-牛尿酚的外消旋或非外消旋混合物能通过ERi3激素调节机 理改善伤口愈合的速率和质量。头皮毛囊的内置活性节奏使得生长新毛发并脱掉旧的。这种活性被认为是受类 固醇激素的影响。头皮毛囊生长特异性地被5 α -DHT抑制，同时，面部和身体毛囊也受 5 α-DHT的刺激。根据Brincat (参见上文的文献)的描述，已知绝经期后的妇女经历女性 型秃发模式是由于卵巢类固醇激素的缺失和这期间雄激素/雌激素比例的增加。在这期 间，绝经期后女性还经历多毛症或提高的面部和身体毛发生长，并在前绝经期期间具有提 高的雄激素生成。前绝经期妇女伴随增加的雄激素生成同样经历多毛症。参见Reed M J与 Franks S, Baillieres Clin Obstet Gynaecol，2 :581_595，1988。具有低雄激素水平的经 阉割的雄性，或具有遗传性5 α-DHT还原酶缺失的人不会患有男性型秃发(Trueb R Μ,Εχρ Gerontol, 37 :981_990，2002)。体外和体内研究表明雌激素加快毛囊的生长或生命周期并刺激真皮乳头细胞的 血管内皮生长因子(VEGF)的分泌，这种因子影响毛囊的血流。同样参见Lachgar S et al., J Invest Dermatol Symp Proc，4 :290_295，1999。本发明包括S-牛尿酚或R-和S-牛尿酚的外消旋或非外消旋混合物使强效雄激 素5 α -DHT生物学失活并抑制其对男性和女性头皮毛囊生长的负性作用的用途。牛尿酚能 刺激毛囊生命周期并增加真皮乳头细胞的血管内皮生长因子从而正面影响头皮毛发的生 长。相反，R-牛尿酚和/或S-牛尿酚能阻断5 α -DHT的激素作用，并且减少面部和身体的 毛发生长。雌激素减小男性和女性的皮脂腺大小并抑制其分泌。参见Pochi P E与Strauss J S, J Invest Dermatol，62 :191_210，1974 禾口 Larie F et al. , Horm Res，54 :218_229， 2000。ERi3在皮脂腺中广泛而高量表达，雌激素作用通过这种受体明显地降低与毛囊相关 的脂腺分泌。另一方面，皮脂腺中的雄激素受体被5 α-DHT激活。皮脂腺的5 α-DHT刺激 与招引细菌相关的油脂的产生，从而促进并产生粉刺。本发明包括S-牛尿酚或R-和S-牛尿酚的外消旋或非外消旋混合物使强效雄激 素5 α -DHT生物学失活并抑制皮脂腺对油脂分泌的产生从而减少粉刺的发生的用途。对映 体(R-牛尿酚和S-牛尿酚)的联合能减小皮脂腺大小并抑制其油脂产生以参与缓解或预 防粉刺。顶泌腺从毛囊外根鞘长出并保持与其相连。顶泌腺与身体的多毛区域相关，这 些区域绝大多数从腋窝和腹股沟发汗，如Jakubovic H R et al.，Dermatology，第三版， Philadelphia，W. B. Saunders, 1992，69_77页所述。化脓性汗腺炎和腋臭是由于与腋窝和腹 股沟相关的大汗腺的炎症引起的疾病。参见Sato T et al. ,Br J Dermatol, 139 =806-810, 1998。患这些病症的病人有顶泌腺排出的过量或不正常的气味(腋臭)。这种疾病在女性 中更常见，并似乎能用雌激素和/或抗雄激素治疗改善，暗示着这种特殊化的腺体受雌激 素和雄激素的调控。同样参见 Offidanl A et al. ,J Clin Pathol，52 :829_832，1999。特 别地，当研究雄激素作用时，检测到顶泌(汗)腺有过量或不正常气味的受试者的顶泌腺中 有高水平的5 α还原酶活性，5 α -DHT的作用也参与了这些病况。本发明包括S-牛尿酚、R-和S-牛尿酚的外消旋或非外消旋混合物使强效雄激素 5 α -DHT失活并抑制顶泌腺对汗液分泌的产生并减少汗腺炎和腋臭的发生的用途。与之相随地，在一定比例对映异构体(R-牛尿酚和S-牛尿酚)的组合中，牛尿酚能减小顶泌腺对 汗液的产生以参与预防汗腺炎和腋臭。一些研究显示表皮黑色素细胞是雌激素响应的。存在一些口服含雌激素的避孕药 导致女性脸部高色素沉着的报道，如Wade T R et al.，Obstet Gynecol, 5 =233-242,1978 所述。本发明包括S-牛尿酚或R-和S-牛尿酚的外消旋或非外消旋混合物使强效雄激 素5 α -DHT生物学失活并促进牛尿酚对雌激素受体的激素作用的用途。通过牛尿酚的SERM 作用可以抑制表皮黑色素细胞，得到发亮皮肤的效果。因此，牛尿酚对于老人或皮肤斑，尤 其是脸部和手上的，将是有效的治疗手段。本发明包括S-牛尿酚或R-和S-牛尿酚的外消旋或非外消旋混合物使强效雄激 素5 α -DHT失活并促进牛尿酚对雌激素受体的激素作用的用途。通过牛尿酚的SERM作用可 以刺激毛囊黑色素细胞，得到促进毛发色素沉着的结果。参见Tobin D J与Bystryn J C， Pigment Cell Res,9 :304_310，1996 ；Thorton M J,ExpDermatology, 11 487-502,2002 ；禾口 Ohuchi A et al.,在Third Intercontinental Meetingof Hair Research Societies,日 本，2001中。因此，牛尿酚可以是调控毛囊的色调和颜色并从而改变毛发的色素沉着的有效 治疗手段。由于毛囊与恶性黑色素瘤的形成相关，牛尿酚的SERM性质可以正面方式影响 恶性黑色素瘤。参见 Kanda N 与 Watanabe S, J Invest Dermatol，117 :274_283，2001 ； Richardson B et al. , Br J Cancer,80 2025-2033,1999 ；禾口 Durvasula R et al.， Climacteric，5 1970200，2002。例如，对用雌二醇孵育的人转移性黑色素瘤细胞系进行处 理能抑制3H-胸腺嘧啶的吸收，这能被抗雌激素的施用抵消。而且，雌二醇能通过激活粘连 蛋白来抑制人黑色素瘤细胞的侵入。最后，女性出现恶性黑色素瘤的平均年龄是50岁初 期，与绝经期出现的时间相同。传统认为黑色素瘤是雌激素受体阳性肿瘤，然而最近的证据 反驳了这点。本发明包括S-牛尿酚或R-和S-牛尿酚的外消旋或非外消旋混合物使强效雄激 素5 α -DHT失活并促进牛尿酚对雌激素受体的激素作用的用途。通过牛尿酚的SERM作用 可以抑制恶性黑色素瘤的形成并使毛囊黑色素细胞稳定化，导致恶性黑色素瘤的预防和治疗。本发明的其他实施方式包括牛尿酚在雄激素相关的皮肤或毛发病症以及由于雌 激素/雄激素平衡被打乱产生的病症中作为诊断剂的用途。这些实施方案中，给予个体牛 尿酚用于结合5 α -DHT，从而防止5 α -DHT和雄激素受体结合。然后测量雌激素平衡的变化 或评估雄激素_结合的变化，以诊断或进一步阐明皮肤或毛发的雄激素相关的异常。已经发现牛尿酚能通过增加弹性蛋白和胶原蛋白的量来改善皮肤性质或坚稳性 从而提高皮肤的健康状态。人们认为这种作用的机理是阻断5 α -DHT的激素作用，这继而 可以降低皮脂腺的油脂产生从而减轻粉刺和其他皮肤病症。由于牛尿酚，特别是S-牛尿酚 结合雌激素受体，类雌激素分子在皮肤中刺激产生弹性蛋白和胶原蛋白的保护作用被认为 受ERi3调节。另外，牛尿酚的抗氧化剂性质保护免受光老化，通常是皮肤的老化。为了评估关于所述治疗部分的5 α -DHT的结合能力，可以提前或与其他治疗部分 同时施用牛尿酚用来结合5 α -DHT0同样，为了评估用于在缺乏5 α -DHT结合的情况下雄激素结合部分用于储存雄激素活性和平衡雌激素活性的效力，施用牛尿酚后可以施用雄激素 结合部分。进一步地，为了替代这些天然存在或源于5 α -DHT的无生命的5 α -DHT结合部 分，在存在5 α -DHT结合部分的情况下可以施用牛尿酚。可以通过提供牛尿酚的口服剂量形式来施用对映异构的牛尿酚，这使得有效量的 牛尿酚吸收入血流。若需要可以口服之外的途径施用牛尿酚。例如，可以考虑以直肠或尿 道施用来施用牛尿酚，用于治疗变大的前列腺或预防前列腺的变大。另外，考虑可以分离和 合成牛尿酚分子的活性配体结合位点用于施用，这样可以提供5 α -DHT结合而不需要完整 的牛尿酚分子。牛尿酚分子或其具有5 α -DHT结合能力的片段的剂量依赖于施用方式和要 治疗的病况。基于我们的体内研究，显然相对低剂量的牛尿酚拮抗高得多的5 α -DHT剂量， 这可以解释为牛尿酚结合血清蛋白质的能力和5 α -DHT有很大差别。后者多数结合蛋白进 行循环，而牛尿酚有50%是游离的。通常，使接受者血流中产生足够的牛尿酚或其活性部分 的浓度的剂量至少是约0. 2mg牛尿酚每kg接受者体重，优选至少约0. 5mg/kg。若不导致明 显的剂量限制性副作用，可以显著提高剂量到高于约10mg/kg。可以用微囊形式进行口服施 用，该形式可以提供药物的迟释或缓释。可以多种形式局部、透皮和皮下施用牛尿酚，所述形式包括乳液、软膏、泡沫 (包括剃须膏)和喷雾，或作为适于局部应用的底物的活性成分，所述底物例如为护 垫、手术绷带、黏性绷带、预湿的小毛巾、婴儿或成年人失禁尿布(例如描述于美国专利 No. 5，525，346，其被引入作为参考)、女性卫生用品、或透皮皮肤贴剂(例如描述于美国专 利No. 5，613，958和No. 6，071，531，其被引入作为参考)，机电设备，包括微泵系统(例如描 述于美国专利No. 5，693，018和No. 5，848，991，其被引入作为参考)和皮下埋植(例如描述 于美国专利No. 5，468，501，其被引入作为参考)。适用于实践本发明的组合物包含至少生理学可接受量的牛尿酚，其可以至少部分 结合和隔绝游离5 α -DHT (但不是睾酮或DHEA)从而防止个体施用后其与雄激素受体的结 合，因此具有健康和疾病的重要分支，和在受雄激素调节的病理过程的治疗中具有广泛和 重要的应用。含S-牛尿酚，R-牛尿酚，牛尿酚外消旋混合物或牛尿酚非外消旋混合物的组合物 可以用于口服。所述组合物或含该组合物的产品可以是投放市场的或公共机构的食品、药 物和OTC药物。食品组合物每份可以包含至少lmg，典型地至200mg的对映异构的牛尿酚或 牛尿酚混合物。口服施用的药剂每剂可以包含至少lmg，典型地至200mg的对映异构的牛尿 酚或牛尿酚混合物。局部应用的产品可以包含至少0.001%或0.01%，以及至10%重量的 S-牛尿酚或R-牛尿酚或对映异构体混合物。所选择的浓度范围包括约0. 001 %至约3%， 约0. 001%至约1%，约0. 01%至约3%，约0. 至约1%，约0. 1%至约3%，约0. 至约 5%，约0.3%至约1%，约0.3%至约3%，约0.3%至约5%，约0.5%至约1%，约0. 5%至 约3 %，和约0. 5 %至约5 %。典型地，0. 01 %至1 %是可以应用于不同时间间隔的有效浓度 范围。某些方案中，优选以至多5%的浓度应用牛尿酚来治疗某些病理学情形或疾病。由于 病况或疾病的严重程度，或因为个体是非牛尿酚生产者，因此需要给予更大量的外源性牛 尿酚可能还有需要高达10%浓度的情况。本发明的局部组合物可以包括其他化妆品和药学活性物质以及赋形剂。合适的化 妆品和药学试剂包括，但不限于，抗真菌剂、维生素、抗炎症剂、抗菌剂、镇痛剂、一氧化氮合酶抑制剂、驱虫剂、美黑霜、表面活性剂、保湿剂、稳定剂、防腐剂、消毒剂、增稠剂、润滑齐U、 湿润剂、螯合剂、皮肤穿透促进剂、润肤剂、香料和着色剂。对于某些个体，优选联合使用系统和局部施用。这可以是由于病况或疾病的严重 程度，或因为个体是非牛尿酚生产者，因此需要给予更大量的外源性牛尿酚。对映异构的牛尿酚还可以是对映异构牛尿酚的缀合物，在C-4’或C-7’位置与选 自葡萄糖醛酸苷、硫酸、乙酸、丙酸、葡萄糖苷、乙酰葡萄糖苷、丙二酰葡萄糖苷和其混合物 的缀合物缀合。用于施用给受试者来治疗和/或预防雄激素相关疾病和病况或降低其患病倾 向性的受试者、含对映异构牛尿酚或其混合物的组合物或制剂可以还包含一种或多种药 学上可接受的佐剂，运载体和/或赋形剂。这些药学上可接受的佐剂，运载体和/或赋 形剂是本领域公知的，例如 Handbook of PharmaceuticalExcipients，第二版，American Pharmaceutical Association，1994 (引入作为参考)描述的。可以片剂、胶囊、用于重新溶 解的粉末、糖浆、食物(例如食物棒、饼干、点心和其它本领域公知的标准食品形式)或饮料 配制物施用该组合物。饮料可含有调味剂、缓冲液等。组合物可包含S-牛尿酚和R-牛尿酚的非外消旋混合物，所述混合物中S-牛尿 酚的对映体过量(EE)为大于0%到小于90%。具有0%的EE的组合物是两种对映体为 50 50的外消旋混合物。所述组合物可直接通过从外消旋混合物中不完全分离和去除 R-牛尿酚或S-牛尿酚对映体任一来制备。所述组合物也可通过联合含牛尿酚的混合物 (非外消旋或外消旋混合物)的第一牛尿酚组分，和含主要由S-牛尿酚或R-牛尿酚组成 的组合物的第二组分来制备。这样产生的非外消旋组合物具有过量的S-牛尿酚或R-牛 尿酚。基于组合物中含有的R-牛尿酚或S-牛尿酚组分的明确的益处或指示，可制备一种 组合物，其中包含的S-牛尿酚和R-牛尿酚的比例为大于约50 50到约99. 5 1，更典 型地约51 49到约99 1，以及从小于约50 50到约1 99. 5，更典型地约49 51 到约1 99。该组合物典型地不包括显著量的任何其他雄激素受体结合化合物。可选的 S-牛尿酚比R-牛尿酚的比例包括约3 1到约19 1，约3 1到约9 1，约4 1到 约19 1，以及约4 1到约9 1。适宜口服施用的组合物可存在于分离的单位中，例如胶囊、扁胶囊、锭剂或片剂， 每种都含有预定量的提取物；作为粉末或颗粒；作为溶液或水性或非水性液体中的悬浮 液；或者作为水包油或油包水的乳液。对本发明更完整的理解和使用可以从以下实验获得。实验1.测定牛尿酚的S-和R-对映体的受体结合能力进行体外结合研究来检测S-和R-对映体牛尿酚对雌激素受体ER α和ER β的相 对亲和力。完整长度的大鼠ERa表达载体(pcDNA-ERa ；RH Price UCSF)和ER0表达载 体(pcDNA-ERβ ；T A Brown, Pfizer, Groton, Conn.)被用于在体外利用 TnT-偶联的网状 细胞溶解物系统(Promega，Madison, Wis.)和T7-RNA聚合酶，在30°C反应90分钟合成激 素受体。翻译反应混合物保存在-80°C备用。为了计算并确定S-牛尿酚和R-牛尿酚对映 体对ERa和ERii的亲合力，将IOOyL的网状细胞溶解物上清液的等分试样与浓度渐增 (0. Ol-IOOnM)的[3H] 17 β-雌二醇(Ε2)在适宜的时间和温度孵育，即室温90分钟(ERβ) 或4°C 18小时(ERa)。这些时间通过经验确定，并代表受体与雌激素的最佳结合。使用300倍过量的ER激动剂二乙基己烯雌酚在平行试管内评估非特异性结合。孵育后，将孵育的反 应物通过 ImL 亲脂性 S 印 hadex LH-20 (Sigma-Aldrich Co.，SaintLouis，Mo.)柱，分离结合 和未结合的[3H]E2。根据以前公开的方案(Handa etal.，1986 ；0，Keefe和Handa，1990)， 用 TEGMD(10mM Tris-Cl, 1. 5mmEDTA, 10%甘油，25mm钼酸盐，和 Imm二硫苏糖醇，pH7. 4)-饱 和的 S印hadex 组装一次性吸液管头(lmL，Labcraff ； Curt in Matheson Scientific, Inc, Houston, Tex.)，来构建柱子。为进行层析，用TEGMD (100 μ L)重新平衡柱子，将孵育反应 物分别加入各柱中，并在柱上再孵育30分钟。这次孵育后，将600 μ L的TEGMD加入到各柱 中，收集流出物，加入4mL闪烁液，并在2900TR Packard闪烁计数仪(Packard Bioscience, Meri den，Conn.)中计数样品(每个5分钟)。使用竞争结合实验评估牛尿酚的S-牛尿酚和R-牛尿酚对映体的雌激素性质。根 据S-和R-牛尿酚与[3H] E2竞争结合ER的能力，显示两种对映体对体外翻译的ER的亲和 力有很大区别。S-牛尿酚对映体显示对ERβ的亲和力最大[Kd(riM) = 0.73士0.2]，而其 对ERa的亲合力经比较相对较低[Kd(riM) = 6. 41 士 1. 0]。R-牛尿酚对映体对ERβ的亲合 力[Kd(nM) = 15. 4士 1.3]和对 ERa 的亲合力[Kd(nM) = 27. 38士3. 8]更低。作为对照， 在该系统中17 β-雌二醇与ERo以Kd (nM) =0.13结合，与ER β以Kd(nM) = 0. 15结合。研究表明仅S-牛尿酚对映体与ER以足够的亲合力结合，从而与人体中报道的循 环牛尿酚水平具有潜在的相关性。与17 β -雌二醇相比，S-牛尿酚和R-牛尿酚对映体与 ERa的相对亲合力分别是17 β-雌二醇的{分数(1/49)}和{分数(1/211)}。但S-牛尿 酚对映体似乎大多为ERβ选择性的，其对ERβ的亲合力相对较高；而R-牛尿酚对映体与 ER β结合的亲合力是S-牛尿酚的约{分数(1/100)}。从两种对映体的结合特异性方面来 看，仅S-牛尿酚存在于人血浆和尿中的分离和结合的测定是明显的。实验2. R-牛尿酚的生物利用度过夜禁食后将20mg纯的R-牛尿酚以口服形式施用给健康成年人。接下来的24 小时内在固定的时间间隔收集血样，用选定的离子监测的同位素稀释气相色谱-质谱法确 定牛尿酚血浆浓度。8小时后观察到迅速出现的牛尿酚的血浆峰浓度。R-牛尿酚的终消除半衰期 为约8小时。电喷射质谱证实血浆中存在的牛尿酚是R-牛尿酚对映体(PCT专利公开 W004-009035)，从而确认它是稳定的，不经历任何外消旋化或肠道中进一步的生物转化。图 2显示R-牛尿酚的血浆出现/消失曲线。这些结果证实若以药物或营养补剂制剂形式给予 的R-牛尿酚是生物可利用的。当口服给予健康成年人S-牛尿酚也得到相似的结果。
实施例下列实施例展示出了本发明的使用以及派生的益处。为了证明本发明的有效性， 使用下列方案，并将参照下列实施例进行本发明实施例使用的方案1.测试材料储液的制备将约20至40mg的测试材料称量入预称皮重的无菌玻璃小瓶中，并记录精确的重 量。计算得到50% w/v的溶液的载剂体积，然后加入载剂。根据实施例的说明，使用2种不 同的载剂。DMSO载剂用 100% DMSO(EMDBioscience Cat. #MX1458_6，批次#42364321)制备。二乙二醇单乙基醚载剂用100%二乙二醇单乙基醚(Gattefosse a. s. a.，Cedex, France) 制备。然后充分涡旋样品直到干粉已经都可见地溶入溶液中。某些情况下，样品需要短暂 加温至37°C。储液等分试样可以小份的等分试样冷冻，并储存在约-20°C下，或制备后立即 使用。制备用于测试的牛尿酚外消旋混合物的浓度为0(对照)，0.3，1.0和5.0%。用浓度 为50 μ g/ml的抗坏血酸DMEM/F-12作为阳性对照。储液稀释使用后立即丢弃。2. MTT 试验进行MTT试验来测定组织培养物中的牛尿酚毒性。细胞存活力和增殖的测量是细 胞种群对外界因素响应的一系列体外试验的基础。四唑盐的还原是广泛被接受的可靠的 研究细胞增殖的方法。MTT试验是对细胞代谢活性的量热分析(ATCC5Gaithersberg Md.； Catalogue#30-1010K)。黄色的四唑盐MTT (3- (4，5- 二甲基噻唑基-2) -2，5- 二苯基四氮唑 溴化物)被代谢活性细胞还原生成还原性等同物例如NADH和NADPH。形成的细胞内的紫色 甲臜可以溶解并用分光光度计方法计量。MTT细胞增殖试验测量细胞增殖速率和相反地，当 代谢活动导致凋亡或坏死时，测量细胞存活力的降低。细胞数和产生的信号之间建立线性 关系，由此可以精确量化细胞繁殖速率的变化。某些方案或实验中，MTT试验的结果将用来 标准化前胶原I型C肽试验。用测试系统中使用的测试材料进行相容性测试。每种测试材料的等分试样和等体 积的2mg/ml MTT溶液在玻璃测试管中混合。盖上盖子，室温、无光下孵育约2小时除非转 化迅速发生。颜色变成紫色说明测试材料可能自发地还原MTT，造成假反应。如果观察到有 颜色变化，则运行“空白组织孔”。在这些空白中添加和试验相同用量的测试材料，并只进行 到最长时间点。若观察到背景读数，需要在分别的测试材料中将其减去。3.组织培养中TestSkin的使用使用TestSkin II组织评估测试材料的促进或抑制胶原蛋白合成的能力。这顶测 试同样用来评估接触测试材料后组织的存活力。TestSkin II由力学稳定并具有生理学功能 的皮肤结构组成，其精密模仿活的人皮肤的实际结构和生物响应机理。该组织具有表皮和 真皮。上部表皮层由活的人角质细胞组成并具有分化好的角质层。表皮长在支持性真皮层 上，所述真皮层由分散于活的人真皮成纤维细胞中的牛胶原蛋白网组成，所述人真皮成纤 维细胞使胶原蛋白排列成致密基质。根据下面的组织培养方案使用TestSkin。TestSkin组织培养方案，第1天需要使用足量的6孔板来完成实验并放置于孵箱(hood)中。打开含有每个培养 板的包装，拿走培养板盖，将其倒置放在工作面上。6孔板的每个孔中放置一个Millicell 以及Iml DMEM/F-12。盖上盖子，将6孔板静置直至对TestSkin II单元切片并准备好储存。 为了对TestSkin II单元切片，用70%乙醇擦拭密封的冲头的外表面。使用无菌剪打开冲 头，拿走含TestSkin II单元的托盘。拿走TestSkin II单元托盘的盖子，倒置放于工作面， 使盖子的内面保持无菌。用无菌镊子移动TestSkin II的transwell并放置于盖子的内面。 为了对TestSkin II单元切片，使用无菌活体检查冲头(8mm)。将冲头放置于TestSkin II单 元的表面，慢慢往下压并同时扭转。来回转动冲头约1/4圈，同时使用足够的压力以切穿皮 肤和聚碳酸酯膜。不完全扭转冲头，因为这样可能割到皮肤。将个体切片与剩下的皮肤分离 时用无菌尖嘴镊移动所述切片；只抓住切片的边缘，并小心不挤压或折叠切片。小心地将切 片的真皮面朝下置于Millicell上，确保其水平放置，并且Millicell底部和皮肤之间没有气泡。先放置一角再慢慢放低剩余的部分对于不产生气泡是有帮助的。表皮面仍然朝上， 带有真皮的聚碳酸酯膜靠着Millicell平放。重复此步骤直到分离正确数目的切片并放置 在6孔板的Millicells中。切割完成后，盖上盖子将培养板放置于孵箱中，在约37士2°C和 5士 CO2下过夜(16-24小时)。TestSkin组织培养方案，第2天吸出每个孔中的培养液，用Iml新鲜的DMEM/F-12培养液替换。对每个处理组(阴 性对照，阳性对照和测试材料)而言，在组织上加入10μ1材料，并盖上给药垫。然后将组 织放回入孵箱，在约37士2°C和5士 CO2下孵育约48小时。TestSkin组织培养方案，第3天再一次局部加入每份组织10 μ 1的不同处理至所有测试样品。把该组织放回孵箱 中，在约37士2°C和5士 CO2下孵育约24小时。TestSkin组织培养方案，第4天去掉每个孔中的培养液，并冷冻以便进行下面的前胶原试验。每个处理组的4份 组织样品中的3份立即进行MTT试验。每个处理组的第四份组织用福尔马林固定，埋入石 蜡，切片，然后进行组织染色。用显微镜对组织切片进行弹性蛋白和胶原蛋白分析。用DMEM/F-12 (预热至37 士 2°C )制备2mg/ml MTT溶液(对于2mg/组织是足够 的)。室温下用搅拌盘混合MTT溶液10-15分钟。然后4000rpm离心溶液5分钟。去掉颗 粒状物，只使用上清液。给6孔板的孔加入MTT溶液(2ml/孔)。从Millicell插入物中拿 走组织，用洗瓶里的至少5ml PBS在烧杯上方漂洗。所有测试材料取出后停止漂洗。然后把 组织放入6孔板的对应孔中。培养板在摇床平台上以125rpm，约37士2°C和5士 CO2下 孵育约2小时。2小时孵育结束时，移走MTT溶液并丢弃。每孔加入Iml PBS静置2分钟， 重复2遍。吸走每次的PBS洗液。接触MTT后，组织在600 μ g/ml嗜热菌蛋白酶溶液(加入DMEM/F-12得到2ml的 总体积)中，37士2°C下孵育30分钟。该孵育时间对于分离组织的真皮和表皮层被认为是 足够的。表皮期望浮于真皮的顶端。组织的真皮部分放置在一套单独的6孔板中。用每孔 Iml异丙醇将两套培养板中的MTT萃取出来。培养板放置在摇床平台上1小时。异丙醇萃 取后，将200 μ 1萃取物转移至相应的96孔板的孔中。540nm下对平板进行读数。4.人真皮成纤维细胞组织培养方案将来自新生包皮的原代人真皮成纤维细胞的10-11代接种至48孔板，密度 为2.4\104细胞数/孔/0. 5ml培养液，所述培养液由带Ix非必需氨基酸(HyClone Cat. #SH30238. 01，批次 #AMC15759)、Ix 抗生素 / 抗霉菌素(SigmaCat. #A5955,批 次 #13K2363)和 2 % 小牛血清(HyClone Cat. #SH30072. 03，批次 #ANF_18955)的 DMEM(MediaTech，Cat. #10_017_CV，批次#10017103)组成。使用的还有来自上一批次的 小牛血清(批次#AMM17780)的样品。细胞在37°C，潮湿的5% CO2的孵箱内培养约16-24 小时，然后更换培养液并往孔中的培养液加入牛尿酚、抗坏血酸(Sigma Cat.#A4544，批次 #073K0139)或载剂。在测试或对照材料的存在下将细胞培养约48小时。5.器官型、三维真皮培养物为了制备器官型、三维(3D)培养物，将真皮成纤维细胞接种至尼龙网并基本按照 描述生长约8个星期(参见Fleishmajer，J Invest Dermatol,97 :638_643，1991 ；Contard,Cell Tissue Res, 273 :571_575,1993 禾口 Pinney, Liu, Sheeman 与 Mansbridge, J Cell Physiology, 183 =74-82, 2000)。这种体外模型精密模仿真皮的发育，为器官型性质的研究 提供了系统，所述性质例如为支持表皮分化的能力(参见Slivka，J Invest Dermatol, 100 40-46,1993)和胶原蛋白微纤维形成(Contard, Cell Tissue Res，273 :571_575，1993)。2 星期以后对所有3D培养物补充20 μ g/mL抗坏血酸，但单层培养物不补充。其他方面，单层 和3D实验的所有材料和步骤基本相等。为了在检测不到雌激素活性水平的环境中检验雌激素性测试材料的效果，在添加测试材料之前将3D实验生长于不含酚红的培养液中3个星期，因此其从未接触酚红染料。6.人前列腺癌细胞培养物人前列腺癌细胞系来源于ATCC(ATCC#CRL-1740，LNCAP-FGC)，并在 37°C，5% CO2 的潮湿孵箱中，加入5%胎牛血清(Hyclone Cat. #SH30088. 03，批次编号APC20780)和5mM Hepes (Sigma Cat. H-0887)、lx 抗生素 / 抗霉菌素(Sigma Cat. #A5955)的 RPMI 培养基 (Sigma Cat. #R-8758)中进行培养。细胞扩展至T-150培养瓶，传3代，然后在液氮中，在含 10% FBS和10% DMSO作为冷冻保存剂的RPMI培养基中冷冻保存并储藏。然后将冷冻小瓶 在37°C水浴下解冻，再次扩展1至2代，然后用RPMI 5% FBS培养基接种入96孔板，每96 孔的0. 2ml培养基中含10，000细胞数。约48小时后，将培养基更换为不含酚红的含2% FBS和Ix抗生素/抗霉菌素的DMEM/F12 (GibcoCat. #21041-025)，加入源自IOx储液的测 试材料以及DMSO/载剂对照至合适浓度。将细胞在测试材料和对照的存在下培养约48小 时，之后取出培养基上清液以进行前列腺特异性抗原(PSA)ELISA。7.胶原蛋白I型C-前肽ELISA合成胶原蛋白(I、II、III、IV和V型)作为前体分子，称之为前胶原蛋白。它们含 有额外的称之为前肽的肽序列，这种序列可以促使前胶原蛋白分子在内质网中缠绕成三倍 螺旋构像。分泌过程中，前肽从胶原蛋白三倍螺旋分子上裂解下来后，三倍螺旋胶原蛋白聚 合成细胞外胶原纤维。因此，游离前肽的数量化学计量地反映了合成的胶原蛋白分子的数 量(Takara Biomedicals，胶原I型C-前肽试剂盒)。真皮成纤维细胞主要合成I型胶原蛋白，C末端前肽的裂解对于在细胞外基质 中沉积成纤维是必需的。所述前肽可以用不识别细胞培养上清液中的未加工形式的抗 血清测量，还在临床上用来衡量病人血清中的纤维化。裂解的前肽量沉积的I型胶原蛋 白的量成正比，并可以使用经纯化的标准和商业的ELISA试剂盒(Takara Mirus, Inc., Cat. #TAK-MK-101)精确量化。48小时后，在测试材料或对照的存在下，取出培养基上清液，立刻根据厂商的说明 书使用ELISA试剂盒、使用Molecular Device Vmax 96孔板酶标仪读数和SoftMax软件进 行分析。由于抗坏血酸(抗坏血酸盐，SigmaCat. #A4544，批次#073K0139)已知可以刺激胶 原蛋白的沉积，其被用作阳性对照，加入培养基的最终浓度是20 μ g/ml。经载剂处理的培养 基或单独的培养基作为阴性对照或空白对照。从培养板或孔中收集来源于组织培养的上清液或培养基。足量上清液在 2000-3000rpm下离心5_10分钟，量化胶原I型C-前肽。沉淀颗粒在研究中不使用。实验 溶液的制备方法如下标准溶液(640noPIP/mi)
标准溶液用Iml双蒸水再水化并在工作台面上用间断地缓慢滚动约10分钟的方 式进行混合。标准按表1显示的来制备。标准溶液在4°C下可以稳定1周。对标准的测试
重复两次。表1用于前胶原I型C-肽的标准溶液
权利要求
一种调节雄激素作用以改善受试者至少一种皮肤或毛发病况的方法，所述方法包括施用牛尿酚，其中至少1％是R 牛尿酚，其中，所述R 牛尿酚结合游离的5α 二氢睾酮并抑制所述5α 二氢睾酮与雄激素受体的结合。
2.根据权利要求1的方法，其中所述牛尿酚包含至少5%的R-牛尿酚。
3.根据权利要求1的方法，其中所述牛尿酚包含至少10%的R-牛尿酚。
4.根据权利要求1的方法，其中所述牛尿酚包含至少20%的R-牛尿酚。
5.根据权利要求1的方法，其中所述牛尿酚包含至少25%的R-牛尿酚。
6.根据权利要求1的方法，其中所述牛尿酚是S-牛尿酚和R-牛尿酚的外消旋混合物。
7.根据权利要求1的方法，其中所述牛尿酚还包含用量足以结合雌激素受体亚型的 S-牛尿酚。
8.一种改善受试者至少一种皮肤或毛发病况的方法，包括施用包含牛尿酚的组合 物，其中至少是R-牛尿酚，其中，所述R-牛尿酚结合游离的5 α - 二氢睾酮并抑制所述 5 α-二氢睾酮与雄激素受体的结合。
9.根据权利要求8的方法，其中所述牛尿酚包含至少5%的R-牛尿酚。
10.根据权利要求8的方法，其中所述牛尿酚包含至少10%的R-牛尿酚。
11.根据权利要求8的方法，其中所述牛尿酚包含至少20%的R-牛尿酚。
12.根据权利要求8的方法，其中所述牛尿酚包含至少25%的R-牛尿酚。
13.根据权利要求8的方法，其中所述牛尿酚是S-牛尿酚和R-牛尿酚的外消旋混合物。
14.根据权利要求8的方法，其中所述组合物是局部、透皮或皮下施用。
15.根据权利要求8的方法，其中所述组合物是包含至少约0.001%至约10%牛尿酚的 局部组合物。
16.根据权利要求8的方法，其中所述组合物还包含一种药学活性物质或赋形剂。
17.根据权利要求8的方法，其中所述组合物以每千克体重至少约0.005mg牛尿酚的剂量口服施用。
18.根据权利要求8的方法，其中所述组合物处于延释或缓释制剂中。
19.根据权利要求8的方法，其中所述组合物经由乳液、喷雾液、护垫、绷带或透皮贴剂 的形式施用。
20.根据权利要求8的方法，其中所述牛尿酚还包含用量足以结合雌激素受体亚型的 S-牛尿酚。
21.根据权利要求8的方法，其中所述皮肤或毛发的状态可以经至少下列一种以美容 形式改善a)通过细胞更新诱导提高的皮肤完整性；b)增加皮肤的含水量或湿度；c)增加葡糖胺聚糖和透明质酸用于改善皮肤光泽；d)降低经表皮的水分流失，皮肤剥落和脱皮；e)滋补得到有活力的健康皮肤；f)改善皮肤厚度和增强细胞的耐久性；g)加强皮肤的胶原蛋白和增强皮肤健康；h)增强皮肤的伸缩性以及改善皮肤的保护性能；i)增加弹性蛋白以改善皮肤的弹性； j)用以抵挡弹性蛋白酶的保护；k)用以抵挡胶原蛋白酶的保护；1)用以抵挡基质金属蛋白酶的保护；m)修复和减轻真皮皱纹的外观和改善皮肤质地；η)减小皮肤毛孔尺寸和增强皮肤的光滑度；ο)复原和恢复皮肤；P)改善皮肤磨损和伤疤的外观；q)通过最小化皮脂腺分泌减轻油性皮肤；r)减轻皮肤按年代的、内在和外在的真皮衰老；s)改善皮肤老人斑；t)增强毛发的色素沉着；和u)改善皮肤色调。
22.根据权利要求7的方法，其中所述皮肤或毛发的病况通过至少一种以下的手段药 学上改善a)增加皮肤中的血流；b)改善皮肤的温度和皮肤的温度调节；c)增加皮肤厚度和抑制成纤维细胞的凋亡；d)诱导胶原蛋白的产生和增加皮肤的充盈性；e)诱导弹性蛋白的产生和增加皮肤弹性；f)抑制弹性蛋白酶以改善皮肤的质地和真皮纹理；g)修复和治疗皱纹和改善皮肤质地；h)正面地影响血管形成，皮肤厚度和皮肤充盈性，和减慢衰老的进程；i)减少基质金属蛋白酶，以正面地影响皮肤胶原蛋白和弹性蛋白； j)增强皮肤的修复和伤口的愈合；k)改善皮肤磨损和伤疤的外观； 1)通过改善皮脂腺功能减轻油性皮肤；m)稳定皮肤颜色的变化和毛发的色素沉着以及促进皮肤的亮度； η)治疗、改善和对抗色素沉着过度，老人斑和光老化； ο)减轻或消除粉刺；P)减轻头皮头发的减少或促进头皮头发的保留(在男性和女性型秃发中)； q)延迟面部和身体毛发的生长，减少面部和身体毛发的生长和减轻多毛症； r)减轻顶泌腺分泌和减轻过量汗腺功能(汗腺炎和腋臭)； s)减轻皮肤炎症和阴道干燥；和t)减轻皮肤和毛发在涉及雄激素和/或雌激素效果的类固醇激素合成与功能以及类 固醇与类固醇结合受体代谢中的反常。
23.一种改善皮肤外观的方法，包括施用包含牛尿酚的组合物，其中至少是R-牛尿 酚，其中R-牛尿酚结合游离的5 α - 二氢睾酮并抑制所述5 α - 二氢睾酮与雄激素受体的结合。
24.根据权利要求23的方法，其中所述牛尿酚还包含用量足以结合雌激素受体亚型的 S-牛尿酚。
全文摘要
本发明提供了牛尿酚治疗皮肤病的用途。植物性雌激素大豆苷元的主要代谢产物牛尿酚(7-羟基-3-(4′-羟基苯基)-色满)在体外和体内特异性结合并阻断5α-二氢睾酮(DHT)。牛尿酚可以结合循环的游离DHT并将其与雄激素受体隔绝，从而改变受雄激素调控的生长和生理性激素响应。这些数据提出解释牛尿酚生物学性质的一种新模型。牛尿酚特异性结合并隔绝DHT与雄激素的能力的显著性在健康和疾病之间具有重要分支，并可提示牛尿酚在治疗和预防雄激素调节的皮肤和毛发病理学上有广泛和重要的用途。因此，牛尿酚可以特异性结合DHT和预防DHT在影响皮肤和毛发的生理和病理性进程中的生物学作用。
文档编号A61P17/08GK101987097SQ20101050291
公开日2011年3月23日 申请日期2010年8月2日 优先权日2009年7月31日
发明者埃德温·道格拉斯·李帕特, 特伦特·D·伦德, 罗伯特·J·翰达, 肯尼思·大卫·瑞吉纳德·赛彻尔 申请人:布莱阿姆青年大学;科罗拉多州立大学研究基金会;儿童医院医药中心