栗壳提取物及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明涉及一种栗壳提取物及其制备方法和应用，属于天然产物提取应用技术领域。该制备方法包括以下步骤：提取：以板栗壳为原料，以体积百分浓度为40％?100％的乙醇水溶液为溶剂，进行溶剂提取，回收溶剂，即得栗壳提取物。上述栗壳提取物具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)的作用，能够将该提取物作为PTP1B抑制剂使用，用于治疗糖尿病、肥胖症及其它由此引发的并发症。
【专利说明】
栗壳提取物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及天然产物提取应用技术领域，特别是涉及一种栗壳提取物及其制备方 法和应用。
【背景技术】
[0002] 目前，临床上常将糖尿病分为胰岛素依赖型（IDDM，I型糖尿病)和非胰岛素依赖型 (NIDDM，Π 型糖尿病)两类，其中Π 型糖尿病在糖尿病中占90% JH0预计，由于人口老龄化、 肥胖、不健康的饮食以及缺乏运动的生活方式，到20 25年，糖尿病患者的数目将由1995年的 1.35亿上升为3亿。
[0003] Π 型糖尿病的特征是胰岛素敏感组织，如骨骼肌、肝、脂肪组织对胰岛素作用的抵 抗。虽然其具体机制尚不清楚，但胰岛素信号在其传导通路中的减弱甚至阻断必定是具有 直接关系的。
[0004] PTPases(蛋白酪氨酸磷酸酯酶)在胰岛素信号通路中多个环节起作用，如将自身 磷酸活化的IR去磷酸化，从而降低受体激酶活性;或将IRS-l、IRS-2、Shc等胰岛素受体的底 物中蛋白酪氨酸残基去磷酸化，从而负调控胰岛素作用受体后通路。特定的PTPases和胰岛 素通路中的酪氨酸激酶间的酶活性不平衡可能是引起Π 型糖尿病胰岛素抵抗的原因。
[0005] 因此，通过寻找选择性作用于该通路中PTPases的抑制剂，抑制其活性，加强和延 长胰岛素信号，成为越来越受重视的治疗Π 型糖尿病的新途径。
[0006] 目前，PTP1B(蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B)选择性抑制剂的研究取得了一定的进展，但 大多研究局限于肽类和类肽化合物，例如:根据PTP1B去磷酸化的底物序列设计的抑制剂 EEDE(F2PMP)M、Glu-F2PMP-F2PMP，虽然这些肽类化合物具有较高的选择性和较强的抑制活 性，但它们的不易穿透细胞膜，以及肽类磷酸的结构使其很难成为药物候选化合物。
[0007] 最近，在非肽类PTP1B抑制剂的报道中，2-羧甲氧基苯甲酸类化合物对PTP1B有很 强的抑制作用，更重要的是，其中（23)-2^(-(2-苄基-苯并呋喃)-3-联苯-4-氧]-3-苯基-丙酸化合物不仅对PTP1B有很强的选择抑制性，还对降低ob/ob小鼠血浆中的葡萄糖和胰岛 素水平有显著作用。这是第一例从药理学上直接证明PTP1B抑制剂具有抗糖尿病活性的证 据(Malamas，M. S·et al .J.Med.Chem. 2000,43，1293-1310)。这为我们从天然资源里寻找高 效、高选择性的小分子非肽类PTP1B抑制剂提供了机遇。
【发明内容】
[0008] 基于此，本发明从天然资源里寻找，提供一种具有PTP1B抑制活性的天然成分。
[0009] -种栗壳提取物的制备方法，包括以下步骤：
[0010] 提取：以板栗壳为原料，以体积百分浓度为40 % -100 %的乙醇水溶液为溶剂，进行 溶剂提取，回收溶剂，即得栗壳提取物。
[0011 ] 本发明涉及的板栗(Castanea mollissima Blume)，属壳斗科Fagaceae栗属坚果 类植物，又名栗、栗子、大栗等，是我国的特产植物，主产于广东、广西、云南、江西等地。板栗 的入药部位包括根、皮、叶、花、外果皮(栗壳）、内果皮(栗皮）、总苞(栗毛球或壳斗)等。
[0012] 上述板栗壳为板栗的外果皮，通常认为其药性甘、涩、平，具有降逆、止血的功效。
[0013] 本发明人经过长期的实验研究后发现，板栗外果皮（即栗壳)的乙醇提取物具有抑 制蛋白酪氨酸磷酸酯酶IB(PTP1B)的作用，能够将该提取物作为PTP1B抑制剂使用，用于治 疗糖尿病、肥胖症及其它由此引发的并发症。
[0014] 在其中一个实施例中，所述提取步骤中，所述溶剂为体积百分浓度为70%-80%的 乙醇水溶液，优选75 %的乙醇水溶液。本发明人通过实验发现，以70 % -80 %的乙醇水溶液 提取得到的栗壳提取物具有更佳的抑制PTP 1B活性。
[0015] 在其中一个实施例中，所述提取步骤中，所述原料质量与溶剂体积的比值为lg:5-10ml，分2-4次进行超声波提取，每次30min-60min。以上述方法提取，具有提取效率高，操作 性强，得到产物活性好的优点。
[0016] 在其中一个实施例中，还包括纯化步骤，所述纯化步骤为：
[0017] 将所述提取步骤得到的栗壳提取物上样至大孔吸附树脂，进行纯化，用体积比为 1 -3:8 (优选2:8)的甲醇-水溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，即得。
[0018] 通过进一步的纯化，能够富集该提取物的组合物中真正对PTP1B有抑制活性的成 分。并且，本发明人经过大量的实验后发现，对PTP1B有抑制活性的成分主要存在于1-3:8的 甲醇-水洗脱液中，其它组份的洗脱液中成分的活性均不如该组份。
[0019] 在其中一个实施例中，所述纯化步骤中，所述大孔吸附树脂的型号为HP-20型。以 该型号的大孔吸附树脂纯化上述栗壳提取物，能够较好的富集该提取物的组合物中真正对 PTP1B有抑制活性的成分。
[0020] 在其中一个实施例中，所述纯化步骤中，将所述提取步骤得到的栗壳提取物上样 至大孔吸附树脂后，依次用体积比为〇:1〇、〇.5-2:9、1-3:8的甲醇-水溶液梯度洗脱，收集体 积比为1-3:8部分的甲醇-水溶液的洗脱液，回收溶剂，即得。先用水和体积比为0.5-2:9的 甲醇-水溶液梯度洗脱，去除其中部分杂质成分，具有较好的纯化效果。
[0021] 在其中一个实施例中，所述纯化步骤中，以体积比为0:10的甲醇-水溶液洗脱1-3 个柱体积；以体积比为〇. 5-2:9的甲醇-水溶液洗脱1-3个柱体积；以体积比为1-3:8的甲醇-水溶液洗脱1-3个柱体积。以上述柱体积的洗脱液洗脱，能够最大限度的去除杂质成分并保 留对PTP 1B有抑制活性的成分。
[0022] 本法明还公开了上述的栗壳提取物的制备方法制备得到的栗壳提取物。该栗壳提 取物具有PTP1B抑制活性的作用，为一种天然PTP1B抑制剂，可作为抑制蛋白酪氨酸磷酸酯 酶1B的抑制剂和/或作为胰岛素增敏剂使用，用于预防和治疗糖尿病、肥胖症及其并发症。
[0023] 本法明还公开了上述的栗壳提取物作为抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B的抑制剂和/ 或作为胰岛素增敏剂中的应用。
[0024] 在其中一个实施例中，所述蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B的抑制剂，和/或所述胰岛素增 敏剂在制备用于预防和治疗糖尿病、肥胖症及其并发症的药物中应用。
[0025] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0026] 本发明的一种栗壳提取物的制备方法，采用该方法制备得到的栗壳提取物，具有 抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶ΙΒ(ΡΤΡΙΒ)的作用，能够将该提取物作为PTP1B抑制剂使用，用于 治疗糖尿病、肥胖症及其它由此引发的并发症。对开发利用中国的药用植物资源具有重要 意义。
[0027]并且，该栗壳提取物的制备方法具有操作性强，适用于工业化生产的优点。
【附图说明】
[0028]图1为实施例中提取物分别对STZ致高血糖大鼠胰岛素敏感性的影响；
[0029] 图2为实施例中提取物分别对STZ致高血糖大鼠糖耐量的影响。
【具体实施方式】
[0030] 为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中 给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所 描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻 全面。
[0031] 除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的 技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具 体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语"和/或"包括一个或多个相 关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0032] 以下实施例中，所使用的大孔树脂(HP-20)色谱，为北京绿百草科技发展有限公 司；STZ(链脲佐菌素），sanland产品，分析纯，临用前在4°C冰浴中用0.05mol/ml柠檬酸pH 4.5溶液配制，立即使用；消渴丸，广州中一药业有限公司，批号:GF0085。
[0033] 实施例1
[0034] -种栗壳提取物，通过以下方法制备得到：
[0035] 1、提取。
[0036] 将干燥切碎的板栗(Castanea mollissima Blume)壳，用体积百分浓度为100%浓 度的乙醇（即纯乙醇），按照板栗壳与乙醇料液比（g/ml)为5-10倍量，进行超声波提取2-4 次，每次30min-60min，合并提取液。在本实施例中，板栗壳为500g，乙醇为5L，超声波提取3 次，每次60min。
[0037] 随后，提取液减压浓缩回收乙醇，至较难浓缩，合并浓缩液，继续于敞口容器中加 热尽可能挥尽乙醇，放凉，得到100%乙醇提物32g，干燥后得到栗壳提取物，即为组份I。
[0038] 2、纯化。
[0039] 将所述提取步骤得到的栗壳提取物上样至大孔吸附树脂(HP-20)，进行纯化，分别 用甲醇/水(￥八，〇:1〇，1 :9,2:8，10:0)为洗脱液，每种洗脱液1以相当于2个柱体积），进行梯 度洗脱，收集甲醇/水(v/V，2:8)的分离组份，收集洗脱液（甲醇/水=2:8)，将洗脱液常温减 压浓缩，干燥，得栗壳提取物精制组份4.3g，即为组份HI。
[0040] 实施例2
[0041 ] -种栗壳提取物，通过以下方法制备得到：
[0042] 1、提取。
[0043] 将干燥切碎的板栗(Castanea mollissima Blume)壳，用体积百分浓度为75%浓 度的乙醇水溶液，按照板栗壳与乙醇料液比（g/ml)为5-10倍量，进行超声波提取2-4次，每 次30min-60min，合并提取液。在本实施例中，板栗壳为500g，乙醇为5L，超声波提取3次，每 次60min。
[0044] 随后，提取液减压浓缩回收乙醇，至较难浓缩，合并浓缩液，继续于敞口容器中加 热尽可能挥尽乙醇，放凉，得到100%乙醇提物38.2g，干燥后得到栗壳提取物，即为组份Π 。
[0045] 2、纯化。
[0046] 将所述提取步骤得到的栗壳提取物上样至大孔吸附树脂(HP-20)，进行纯化，用甲 醇/水(￥八，〇:1〇，1:9,2:8，10:0)为洗脱液，每种洗脱液1以相当于2个柱体积），进行梯度洗 脱，收集甲醇/水(v/v，2:8)的分离组份，收集洗脱液（甲醇/水=2:8)，将洗脱液常温减压浓 缩，干燥，得栗壳提取物精制组份6.2g，即为组份Η Π 。
[0047] 并且，在该实施例中，还将醇/水(v/v，0:10,1:9,10:0)组份的洗脱液常温减压浓 缩，干燥，分别得到组份A，组份Β和组份C。
[0048] 实施例3
[0049] -种栗壳提取物，通过以下方法制备得到：
[0050] 1、提取。
[0051 ] 将干燥切碎的板栗(Castanea mollissima Blume)壳，用体积百分浓度为50%浓 度的乙醇水溶液，按照板栗壳与乙醇料液比（g/ml)为5-10倍量，进行超声波提取2-4次，每 次30min-60min，合并提取液。在本实施例中，板栗壳为500g，乙醇为5L，超声波提取3次，每 次60min。
[0052] 随后，提取液减压浓缩回收乙醇，至较难浓缩，合并浓缩液，继续于敞口容器中加 热尽可能挥尽乙醇，放凉，得到100%乙醇提物28.5g，干燥后得到栗壳提取物，即为组份m。
[0053] 2、纯化。
[0054]将所述提取步骤得到的栗壳提取物上样至大孔吸附树脂(HP-20)，进行纯化，用甲 醇/水(￥八，〇:1〇，1:9,2:8，10:0)为洗脱液，每种洗脱液1以相当于2个柱体积），进行梯度洗 脱，收集甲醇/水(v/v，2:8)的分离组份，收集洗脱液（甲醇/水=2:8)，将洗脱液常温减压浓 缩，干燥，得栗壳提取物精制组份3.1 g，即为组份ΗΙΠ 。
[0055] 试验例1
[0056]上述实施例得到的提取物的抑制PTP1B活性试验。
[0057] 1、实验方法。
[0058]用于筛选的蛋白酪氨酸磷酸酯酶PTP1B是从大肠杆菌中表达并纯化的GST融合蛋 白（来源:美国，货号:A0230)。采用紫外底物pNPP，观察不同浓度对重组酶的活性抑制，以初 步评价化合物的药用效果。
[0059]由于PTP1B水解底物pNPP的磷脂得到的产物在410nm处有很强的光吸收。因此可以 直接检测41 Onm处光吸收的变化以观察酶的活性变化，以及化合物对其的抑制情况。并以正 钒酸钠为阳性对照，其IC5〇为2. Ομπιο?/L。实验结果如下表所示：
[0060] 表1.不同提取物对PTP1B抑制活性的IC5Q (η = 10)
[0062]实验结果显示:不同浓度乙醇提取物及活性组份对抑制PTP1B活性效果都不相同， 其中组份Π 和组份Η Π (75 %乙醇提取物及75 %乙醇提取物精制组份)对抑制PTP1B活性效 果最佳，其IC5〇 分别为15 · 5 ± 1 · 5μg/ml和11 · 3 ± 1 · 4μg/ml。
[0063] 而组份A、B、C与组份ΗΠ 相比，几乎无活性，说明在75%乙醇提取物中，具有抑制 PTP1B效果的活性成分主要存在于甲醇/水(v/v，2:8)的洗脱液中。
[0064] 试验例2
[0065] 上述实施例得到的提取物分别对STZ致高血糖大鼠降血糖实验。
[0066] 1、实验方法。
[0067] 以昆明大鼠100只（雄性），随机分组成空白组、模型组(Diabetic control )、实验 组(组份I，组份HI，组份Π ，组份ΗΠ ，组份m，组份ΗΙΠ )、消渴丸对照组(XKW)。
[0068] 除空白组外，各组禁食不禁水1 d，以STZ(在4 °C冰浴中用0.05mo 1 /ml柠檬酸pH4.5 溶液配制，立即使用)腹腔注射60mg/kg，造糖尿病模型。注射后72h断尾取血测定血糖(测前 禁食6h)，血糖值高于11. lmmol/L用于实验（10只/组）。
[0069] 实验组分别以组份I、组份HI、组份Π 、组份ΗΠ 、组份ΙΠ 、组份ΗΙΠ 灌胃（200mg/kg); XKW组以消渴丸灌胃（250mg/kg);空白组、模型组灌胃等体积生理盐水。给药30d，每天称重、 给药一次。末次给药后，断尾取血测定血糖(测前禁食6h)。实验结果如下：
[0070] 表2.不同提取物对STZ致高血糖大鼠降血糖情况
[0072]实验结果显示：实验组大鼠血糖均有不同程度的下降，其中以组份Π 和组份ΗΠ (75%乙醇提取物及75%乙醇提取物精制组份)灌胃的实验组与模型组比较，降低血糖作用 最显著。实验数据表明，组分ΗΠ 的降糖效果与消渴丸相当。
[0073] 试验例3
[0074]上述实施例得到的提取物对STZ致高血糖大鼠胰岛素敏感性的影响实验。
[0075] 1、实验方法。
[0076] 实验组分别以组份I，组份HI，组份Π ，组份ΗΠ ，组份ΙΠ ，组份ΗΙΠ 灌胃（200mg/kg); XKW组以消渴丸灌胃（250mg/kg);空白组、模型组灌胃等体积生理盐水。给药30d，每天称重、 给药一次。以上各组在给药30d内，每天腹腔注射长效人胰岛素 llU/kgjOd后，各组大鼠四 天内每天分别腹腔注射速效人胰岛素0.05、0.5、1.0、2.5IU/kg，测定给速效人胰岛素前后 的血糖，计算比值。实验结果如图1所示。
[0077]从图1的实验结果中显示，不同浓度乙醇提取物及活性组份对STZ致高血糖大鼠胰 岛素敏感性均有改善，但各组份效果不同。其中组份Π 和组份ΗΠ (75%乙醇提取物和75% 乙醇提取物精制组份)与模型组比较，胰岛素敏感性增强效果较好，组份ΗΠ 效果最显著。实 验数据表明，组份ΗΠ 的降糖效果与XZK组相当。
[0078] 试验例4
[0079] 上述实施例得到的提取物分别对STZ致高血糖大鼠糖耐量的影响实验。
[0080] 1、实验方法
[0081 ] 实验组分别以组份I，组份HI，组份Π ，组份ΗΠ ，组份m，组份ΗΙΠ 灌胃（300mg/kg); XKW组以消渴丸灌胃（250mg/kg);空白组、模型组灌胃等体积生理盐水（每组10只）。给药 30d，每天称重、给药一次。以上各组给药30d后禁食4h(9:00~13:00)，灌胃葡萄糖(300mg/ kg)，测定灌胃前(Omin)及灌胃后30min，60min，120min血糖。实验结果如图2所示。
[0082]从图1的实验结果中显示，各组药物均有提高STZ致高血糖大鼠的糖耐量的趋势， 但各组份效果不同。其中组份Π 和组份ΗΠ (75%乙醇提取物和75%乙醇提取物精制组份） 效果较好，组份Η Π 效果最佳。实验数据表明，组份Η Π 的降糖效果优于XZK组。
[0083] 试验例5
[0084] 上述实施例得到的提取物分别对STZ致高血糖大鼠体重变化实验。
[0085] 实验组分别以组份I，组份HI，组份Π ，组份ΗΠ ，组份ΙΠ ，组份ΗΙΠ 灌胃（300mg/kg); XKW组以消渴丸灌胃（250mg/kg);空白组、模型组灌胃等体积生理盐水。给药30d，每天称重、 给药一次。实验结果如下：
[0086] 表3.不同提取物对STZ致高血糖大鼠体重变化情况(η = 10)
[0088] 实验结果显示：不同浓度乙醇提取物及活性组份对STZ致高血糖大鼠体重的降低 作用均不相同。其中组份Π 和组份ΗΠ (75%乙醇提取物和75%乙醇提取物精制组份)与模 型组比较，降低体重效果最佳。实验数据表明，组分ΗΠ 的降糖效果与XKW组相当。
[0089] 通过上述试验例的实验结果，分析认为:胰岛素敏感性降低和胰岛细胞功能受损 是2型糖尿病发病机制的主要因素，而ΡΤΡ1Β的高度表达可引起机体对胰岛素敏感性降低和 瘦素抵抗，从而引起2型糖尿病和肥胖症。
[0090] 试验数据显示，本发明的栗壳提取物能够显著抑制ΡΤΡ1Β活性(试验例1)。并通过 STZ致高血糖大鼠降血糖实验(试验例2)，充分肯定了本发明提取物对糖尿病模型动物的降 血糖作用，也提示各组药物均有缓解糖尿病临床多饮、多尿症状的作用特点，且进一步通过 STZ致高血糖大鼠胰岛素敏感性研究表明（试验例3)，本发明提取物能够明显改善机体对胰 岛素的敏感性，提高胰岛素的生物利用度。通过对STZ致高血糖大鼠糖耐量检测显示(试验 例4)，本发明的栗壳提取物可以显著提高机体糖耐量。通过大鼠体重变化试验数据得知(试 验例5)，本发明提取物对抑制体重增加均有显著效果。
[0091] 综合上述相关试验数据，表明本发明提取物对治疗2型糖尿病、肥胖症及并发症有 潜在的实际意义。
[0092] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实 施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存 在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0093] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护 范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种栗壳提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 提取：以板栗壳为原料，以体积百分浓度为40 % -100 %的乙醇水溶液为溶剂，进行溶剂 提取，回收溶剂，即得栗壳提取物。2. 根据权利要求1所述的栗壳提取物的制备方法，其特征在于，所述提取步骤中，所述 溶剂为体积百分浓度为70 % -80 %的乙醇水溶液。3. 根据权利要求1所述的栗壳提取物的制备方法，其特征在于，所述提取步骤中，所述 原料质量与溶剂体积的比值为lg:5-10ml，分2-4次进行超声波提取，每次30min-60min。4. 根据权利要求1-3任一项所述的栗壳提取物的制备方法，其特征在于，还包括纯化步 骤，所述纯化步骤为： 将所述提取步骤得到的栗壳提取物上样至大孔吸附树脂，进行纯化，用体积比为1-3:8 的甲醇-水溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，即得。5. 根据权利要求4所述的栗壳提取物的制备方法，其特征在于，所述纯化步骤中，所述 大孔吸附树脂的型号为HP-20型。6. 根据权利要求4所述的栗壳提取物的制备方法，其特征在于，所述纯化步骤中，将所 述提取步骤得到的栗壳提取物上样至大孔吸附树脂后，依次用体积比为〇:1〇、〇.5-2:9、1-3:8的甲醇-水溶液梯度洗脱，收集体积比为1-3:8部分的甲醇-水溶液的洗脱液，回收溶剂， 即得。7. 根据权利要求6所述的栗壳提取物的制备方法，其特征在于，所述纯化步骤中，以体 积比为0:10的甲醇-水溶液洗脱1-3个柱体积；以体积比为0.5-2:9的甲醇-水溶液洗脱1-3 个柱体积；以体积比为1-3:8的甲醇-水溶液洗脱1-3个柱体积。8. 权利要求1-7任一项所述的栗壳提取物的制备方法制备得到的栗壳提取物。9. 权利要求8所述的栗壳提取物作为抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶IB的抑制剂和/或作为 胰岛素增敏剂中的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述蛋白酪氨酸磷酸酯酶IB的抑制剂， 和/或所述胰岛素增敏剂在制备用于预防和治疗糖尿病、肥胖症及其并发症的药物中应用。
【文档编号】A61P3/04GK105902583SQ201610338795
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】郭传明, 崔龙
【申请人】郭传明, 崔龙