一种药物在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用

一种药物在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种药物在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用，所述药物由如下重量份的原料药制成：黄芪100?150重量份，党参80?120重量份，丹参60?100重量份，葛根60?100重量份，淫羊藿60?100重量份，山楂60?100重量份，地黄40?80重量份，当归40?80重量份，黄连40?80重量份，醋延胡索40?80重量份，灵芝40?80重量份，人参20?30重量份，炙甘草20?30重量份。本发明药物直接抑制巨噬细胞吞噬脂质，干扰泡沫细胞的形成；干扰巨噬细胞中NOD1/Rip2信号通路的表达，抑制Rip2的表达，从而抑制巨噬细胞的炎性活化；抑制活化的巨噬细胞分泌MIF和MCP?1；显著上调巨噬细胞表面CD16和CD68的表达，促进巨噬细胞由M1型向M2型转变。
【专利说明】
一种药物在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种药物的新用途，具体地，本发明涉及一种药物在制备抗动脉粥样 硬化药物中的应用，属于中药应用领域。
【背景技术】
[0002] 动脉粥样硬化(AS)是一组称为动脉硬化的血管病中最常见，最重要的一种，是导 致冠心病等心脑血管疾病的最主要的致病因素，是发达国家的主要死亡原因、也是我国的 主要死亡原因。
[0003] 动脉粥样硬化的病因及发病机制极为复杂，目前关于动脉粥样硬化的病因较为一 致的看法是因脂质代谢紊乱、炎症细胞浸润、氧化应激、血管内皮细胞损伤、平滑肌细胞激 活等多种机制相互作用的结果，最终导致斑块的破裂，造成严重心脑血管疾病。
[0004] 目前主要的治疗手段是使用血管生成抑制剂和降脂药物，虽然介入治疗可以使血 管再通，但是再狭窄仍然是目前无法解决的医学难题，尤其是远期疗效并无明显优势。在现 代医学尚无理想治疗药物的情况下，传统医学，尤其是中医药在防治动脉粥样硬化的研究 已成为该领域研究的热点。
[0005] 本发明是在CN 101953935专利的基础上进行的改进发明，本发明引用的专利文件 记载的内容。上述专利未公开该药物在治疗抗动脉粥样硬化中的应用以及该药物的抗动脉 粥样硬化的相关机制。

【发明内容】

[0006] 本发明的第一个目的是提供一种药物在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用，所述 药物由如下重量份的原料药制成：
[0007] 黄芪100-150重量份，党参80-120重量份，丹参60-100重量份，葛根60-100重量份， 淫羊藿60-100重量份，山楂60-100重量份，地黄40-80重量份，当归40-80重量份，黄连40-80 重量份，醋延胡索40-80重量份，灵芝40-80重量份，人参20-30重量份，炙甘草20-30重量份。
[0008] 本发明的第二个目的是提供该药物在制备抑制巨噬细胞摄取脂质的药物中的应 用。
[0009] 优选的，本发明所述的巨噬细胞为THP-1源性巨噬细胞，所述脂质为氧化型低密度 脂蛋白（〇x-LDL)。
[0010] 经过大量的实验验证和分析，发现本发明的组合物能明显抑制巨噬细胞对脂质的 摄取。
[0011]本发明的第三个目的是提供该药物在制备使N0D1和Rip2mRNA在巨噬细胞中的表 达下调的药物中的应用。
[0012] 经过大量的实验验证和分析，发现本发明的药物干预后，N0D1和Rip2mRNA在巨噬 细胞中的表达下调。
[0013] 本发明的第四个目的是提供该药物在制备使Rip2蛋白在巨噬细胞中的表达下调 的药物中的应用。
[0014]经过大量的实验验证和分析，发现本发明的药物干预后，Rip2蛋白表达下降。
[0015]本发明的第五个目的是提供该药物在制备抑制巨噬细胞分泌MCP-1和/或MIF的药 物中的应用。
[0016] 经过大量实验验证和分析，发现本发明的药物能显著抑制巨噬细胞分泌MCP-1和/ 或 MIF。
[0017] 本发明的第六个目的是提供该药物在制备提高巨噬细胞表面抗原CD68和/或CD16 含量的药物中的应用。该药物的浓度为〇~1 〇〇ug/ml时，使得⑶68和⑶16的表达上调。
[0018] 优选的，该药物由如下重量份的原料药制成： 黄苗120重量份 党参100重量份 丹参80重量份 葛根80重量份 淫羊藿80重量份 山楂80重量份
[0019] 地黄60.重量份 当归60重量份 黄连60重量份 醋延胡索60重量份 灵芝60重量份 人参25重量份 炙甘草25重量份。
[0020] 或， 黄苗140重量份 党参90重量份 丹参70重量份 葛根90重量份 淫羊藿90重量份 山楂70重量份
[0021] 地黄50重量份 当归70重量份 黄连70重量份 醋延胡索50重量份 灵芝50重量份 人参28重量份 炙甘草28重量份。
[0022]或， 黄苗110重量份 党参110重量份 丹参90重量份 葛根70重量份 淫羊藿70重量份 山楂90重量份
[0023] 地黄70重量份 当归50重量份 黄连50重量份 醋延胡索70重量份 灵芝70重量份 人参22重量份 炙甘草22重量份。
[0024] 或， 黄苗130重量份 党参100重量份 丹参60重量份 葛根60重量份 淫羊藿70重量份 山楂60重量份
[0025] 地黄40重量份 当归45重量份 黄连40重量份 醋延胡索46重量份 .灵芝50重量份 人参26重量份 炙甘草23重量份。
[0026] 取上述原料药，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床可接受的片剂、颗粒剂、丸 剂、胶囊剂、滴丸、软胶囊剂、缓释剂、口服液体制剂或冻干粉针剂。
[0027] 本发明药物的制备方法包括如下步骤：
[0028] 取原料药中的人参、黄连、醋延胡索、山楂与一半量的黄芪，粉碎成细粉，其余八味 原料药与剩余黄芪加水煎煮1-3次，每次1-3小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至90-95 °C时相 对密度为1.05~1.15，放冷，加一倍量乙醇使沉淀，取上清液，回收乙醇，并浓缩至90-95 °C 时相对密度为1.15~1.25的清膏，与上述药粉混合，制成片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、滴丸、 软胶囊剂、缓释剂、口服液体制剂或冻干粉针剂。
[0029] 本发明药物的制备方法优选包括如下步骤：
[0030] 取原料药中的人参、黄连、醋延胡索、山楂与一半量的黄芪，粉碎成细粉，其余八味 原料药与剩余黄芪加水煎煮2次，第一次2小时，第二次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩 至90 °C时相对密度为1.06~1.12，放冷，加一倍量乙醇使沉淀，取上清液，回收乙醇，并浓缩 至90°C时相对密度为1.20~1.22的清膏，与上述药粉混合，制成片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊 剂、滴丸、软胶囊剂、缓释剂、□服液体制剂或冻干粉针剂。
[0031 ]本发明药物制剂中滴丸的制备方法包括如下步骤：
[0032]取原料药，用8-12重量倍的水浸40-80分钟，煮沸1-3小时，取出药液，药渣再加6-10重量倍的水煎煮70-110分种，合并二次药液，滤过;药液通过已处理好的JD-l(WLD)大孔 吸附树脂柱，树脂用量为原料药重量的1-3倍，控制吸附流速2-4ml/min，吸附完毕，用水冲 洗树脂柱至流出液澄清后，用树脂重量2-4倍的60-90%乙醇洗脱，收集洗脱液，后用1-2体 积倍水冲洗，合并洗脱液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.05-1.20，喷雾干燥，得提取物喷 雾干燥药粉，加入常规辅料制备得滴丸。
[0033] 本发明药物制剂中滴丸的制备方法优选包括如下步骤：
[0034] 取原料药，用10重量倍的水浸60分钟，煮沸2小时，取出药液，药渣再加8重量倍的 水煎煮90分钟，合并二次药液，滤过;药液通过已处理好的JD-l(WLD)大孔吸附树脂柱，树脂 用量为原料药重量的1.5倍，控制吸附流速2-4ml/min，吸附完毕，用水冲洗树脂柱至流出液 澄清后，用树脂重量3倍的70 %乙醇洗脱，收集洗脱液，后用1.5体积倍水冲洗，合并洗脱液， 回收乙醇，浓缩至相对密度为1.08-1.15，喷雾干燥，得提取物喷雾干燥药粉，加入常规辅料 制备得滴丸。
[0035]其中，上述制备方法中喷雾干燥的条件控制为:进料速度为35-40ml/min，雾化速 度：25000-35000rpm，进风温度：130-160°C，出风温度：70-80°C。
[0036] 其中，上述制备方法中喷雾干燥的条件控制优选为:进料速度为37ml/min，雾化速 度:30000rpm，进风温度：145~147 °C，出风温度:71~76 °C。
[0037] 其中，上述制备方法中得提取物后，滴丸的制备方法还可以为：
[0038] 称取聚乙二醇-4000,于60-90 °C下水浴至彻底溶胀，加入上述提取物喷雾干燥药 粉，加入质量比例为药粉:聚乙二醇-4000 = 1:2-6，于80-90 °C下保温搅拌均匀，使药粉完全 溶解分散在聚乙二醇-4000中；移入滴丸机中，保持滴距和滴温，调整滴制参数为：油浴温 度:80-90°C，药液温度:75-85°C，滴盘温度:85-90 °C，制冷温度：10-15°C，管口温度:35-40 °C，滴头口径为:3_/5_，滴速:1滴/1秒-1滴/7秒;调节开关使液滴适速滴入冷凝剂二甲基 硅油或液体石蜡中，药滴经过冷凝收缩成滴丸，收集滴丸，以转速1000-4000转/分离心脱 油，再进入筛选干燥机进行筛选干燥，即得本发明药物滴丸。
[0039] 其中，上述制备方法中得提取物后，滴丸的制备方法还可以优选为：
[0040] 称取聚乙二醇-4000,于80-85 °C下水浴至彻底溶胀，加入上述提取物喷雾干燥药 粉，加入质量比例为药粉:聚乙二醇-4000 = 1:4，于85°C下保温搅拌均匀，使药粉完全溶解 分散在聚乙二醇-4000中；移入滴丸机中，保持滴距和滴温，调整滴制参数为：油浴温度:85 °C，药液温度:80 °C，滴盘温度：87 °C，制冷温度：12 °C，管□温度：37 °C，滴头□径为：3謹/ 5mm，滴速：1滴/2秒-1滴/5秒;调节开关使液滴适速滴入冷凝剂二甲基硅油或液体石蜡中， 药滴经过冷凝收缩成滴丸，收集滴丸，以转速1500-3000转/分离心脱油，再进入筛选干燥机 进行筛选干燥，即得本发明药物滴丸。
[0041] 本发明的有益效果是：
[0042]本发明的药物在抗动脉粥样硬化效果显著，能从多个角度调控动脉粥样硬化的发 生与发展，经过研究发现，本发明的药物直接抑制巨噬细胞吞噬脂质，干扰泡沫细胞的形 成，延缓动脉粥样硬化的形成;干扰巨噬细胞中N0D1/Rip2信号通路的表达，抑制Rip2的表 达，从而抑制巨噬细胞的炎性活化，发挥抗动脉粥样硬化的形成;抑制活化的巨噬细胞分泌 MIF和MCP-1，发挥抗动脉粥样硬化的作用；显著上调巨噬细胞表面⑶16和⑶68的表达，促进 巨噬细胞由Ml型向M2型转变，发挥抗动脉粥样硬化的作用。本发明的药物能从以4个上途径 综合起到防治动脉粥样硬化。
【附图说明】
[0043]图1是巨噬细胞对脂质摄取的情况:ox-LDL刺激24h。
[0044]图2是巨噬细胞对脂质摄取的情况:本发明药物预处理12h后ox-LDL刺激24h。
[0045] 图3是oxLDL对THP-1源性巨噬细胞中NOD 1和Rip2mRNA表达的影响结果图，图中条 带表不：oxLDL的浓度从左至右依次为Omg/1，10mg/l，25mg/l，50mg/l，10mg/l，25mg/l， 5〇11^/1，1〇11^/1，2511^/1，5〇11^/1，时间从左至右依次为811，811，811，811，1611，1611，1611，2411， 24h，24h。
[0046] 图4是本发明药物干预后，oxLDL对THP-1源性巨噬细胞中NODI和Rip2mRNA表达的 影响结果图，图中条带表示:本发明药物的浓度从左至右依次为〇ug/ml，10ug/ml，50ug/ml， 100ug/ml，200ug/ml。
[0047] 图5是oxLDL对THP-1源性巨噬细胞中Rip2蛋白表达的影响结果图，图中条带表示： oxLDL的浓度从左至右依次为0mg/l，10mg/l，25mg/l，50mg/l，10mg/l，25mg/l，50mg/l， 1〇11^/1，2511^/1，5〇11^/1，时间从左至右依次为811，811，811，811，1611，1611，1611，2411，2411，2411。
[0048] 图6是本发明药物干预后，oxLDL对THP-1源性巨噬细胞中Rip2蛋白表达的影响结 果图，图中条带表示：图中条带表示:本发明药物的浓度从左至右依次为〇ug/ml，10ug/ml， 50ug/ml，100ug/ml，200ug/ml。
[0049] 图7:不同浓度的oxLDL刺激THP-1源性巨噬细胞24h，用ELISA法测定细胞培养物上 清液中MIF浓度。
[0050] 图8:50mg/l的oxLDL分别刺激THP-1源性巨噬细胞0、8、16和24h，用ELISA法测定细 胞培养物上清液中MIF浓度。
[0051 ] 图9:不同浓度的oxLDL刺激THP-1源性巨噬细胞24h，用ELISA法测定细胞培养物上 清液中MCP-1浓度。
[0052] 图10:50mg/l的oxLDL分别刺激THP-1源性巨噬细胞0、8、16和24h，用ELISA法测定 细胞培养物上清液中MCP-1浓度。
[0053]图11:本发明药物对oxLDL刺激激活的THP-1源性巨噬细胞分泌MIF的影响。
[0054]图12:本发明药物对oxLDL刺激激活的THP-1源性巨噬细胞分泌MCP-1的影响。
[0055] 图13-1~图13-8: oxLDL对THP-1源性巨噬细胞表面抗原的影响，其中图13-1:空白 对照（平均荧光强度25.2);图13-2 : oxLDL 10mg/l (平均荧光强度28.3);图13-3 : oxLDL25mg/l (平均荧光强度23 · 7);图 13-4: oxLDL 50mg/l (平均荧光强度22 · 3);图 13-5:本 发明药物1〇呢/1111(平均荧光强度54.7);
[0056]图13-6:本发明药物50ug/ml (平均荧光强度60.7);图13-7:本发明药物100ug/ml (平均荧光强度91.6);图13-8:本发明药物200ug/ml(平均荧光强度72.1)。
[0057] 图14-1~图14-8:本发明药物干预后，oxLDL对THP-1源性巨噬细胞表面CD16抗原 的影响，图14-1:空白对照（平均荧光强度29.8);图14-2 : oxLDL 10mg/l (平均荧光强度 30 · 9);图 14-3:oxLDL 25mg/l(平均荧光强度29 · 9);图 14-4:oxLDL 50mg/l (平均荧光强度 26· 9);图14-5:本发明药物10ug/ml(平均荧光强度71 · 2);图14-6:本发明药物50ug/ml (平 均荧光强度92.7);图14-7:本发明药物100ug/ml (平均荧光强度96);图14-8:本发明药物 200ug/ml(平均荧光强度80 · 6)。
【具体实施方式】
[0058] 实施例1
[0059] 用于抗动脉粥样硬化的药物片剂由如下重量份的原料药制成： 黄苗120g 党参100g 丹参80g 葛根80g 淫羊藿80g 山楂80g
[0060] 地黄6〇g 当归60g 黄连 6〇g 醋延胡索60_g灵芝60g 人参25g 炎甘草25g:。
[0061] 所述药物片剂的制备方法，包括以下步骤:取原料药中的人参、黄连、醋延胡索、山 楂与一半量的黄芪，粉碎成细粉，其余八味原料药与剩余黄芪加水煎煮2次，第一次2小时， 第二次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至90°C时相对密度为1.06~1.12，放冷，加一倍 量乙醇使沉淀，取上清液，回收乙醇，并浓缩至90°C时相对密度为1.20~1.22的清膏，与上 述药粉混合，制成颗粒，干燥，压制成1000片(小片），包糖衣或薄膜衣片，或压制成500片(大 片），包薄膜衣，即得。小片每片重〇.3g，每日服用3次，一次4~6片;大片每片重0.6g，每日服 用3次，一次2~3片。
[0062] 用于制备抗动脉粥样硬化药物、用于抑制巨噬细胞吞噬脂质，干扰泡沫细胞的形 成，延缓动脉粥样硬化的形成;干扰巨噬细胞中N0D1/Rip2信号通路的表达，抑制Rip2的表 达，从而抑制巨噬细胞的炎性活化，发挥抗动脉粥样硬化的形成;抑制活化的巨噬细胞分泌 MIF和MCP-1，发挥抗动脉粥样硬化的作用；显著上调巨噬细胞表面⑶16和⑶68的表达，促进 巨噬细胞由Ml型向M2型转变，发挥抗动脉粥样硬化的作用。
[0063] 实施例2
[0064] 用于抗动脉粥样硬化的药物胶囊剂由如下重量份的原料药制成： 黄芪140g 党参9〇g 丹参70g
[0065] 葛根9:0g 淫羊藿9% 山楂70g 地黄50g 当归70g 黄连70g
[0066] 醋延胡索50g 灵芝5Qg 人参28g 炙甘草28g。
[0067] 所述药物胶囊剂的制备方法，包括以下步骤:取原料药中的人参、黄连、醋延胡索、 山楂与一半量的黄芪，粉碎成细粉，其余八味原料药与剩余黄芪加水煎煮2次，第一次2小 时，第二次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至90 °C时相对密度为1.06~1.12，放冷，加一 倍量乙醇使沉淀，取上清液，回收乙醇，并浓缩至90 °C时相对密度为1.20~1.22的清膏，与 上述药粉混合，制成胶囊剂。用于制备抗动脉粥样硬化药物、具有明显的抗动脉粥样硬化的 作用。用于抑制巨噬细胞吞噬脂质，干扰泡沫细胞的形成，延缓动脉粥样硬化的形成;干扰 巨噬细胞中N0D1/Rip2信号通路的表达，抑制Rip2的表达，从而抑制巨噬细胞的炎性活化， 发挥抗动脉粥样硬化的形成;抑制活化的巨噬细胞分泌MIF和MCP-1，发挥抗动脉粥样硬化 的作用；显著上调巨噬细胞表面⑶16和⑶68的表达，促进巨噬细胞由Ml型向M2型转变，发挥 抗动脉粥样硬化的作用。
[0068] 实施例3
[0069] 用于抗动脉粥样硬化的药物颗粒剂由如下重量份的原料药制成： 设芪ll〇g 党参110g 竹参9〇g 葛根70g 淫羊藿70g 山楂90g
[0070] 地黄7.0g 当归.5.0g 黄连50g 醋延胡索70g 灵芝70g 人参22g 炙甘草22g。
[0071] 所述药物颗粒剂的制备方法，包括以下步骤:取原料药中的人参、黄连、醋延胡索、 山楂与一半量的黄芪，粉碎成细粉，其余八味原料药与剩余黄芪加水煎煮2次，第一次2小 时，第二次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至90 °C时相对密度为1.06~1.12，放冷，加一 倍量乙醇使沉淀，取上清液，回收乙醇，并浓缩至90 °C时相对密度为1.20~1.22的清膏，与 上述药粉混合，制成颗粒剂。用于制备抗动脉粥样硬化药物、具有明显的抗动脉粥样硬化的 作用。用于抑制巨噬细胞吞噬脂质，干扰泡沫细胞的形成，延缓动脉粥样硬化的形成;干扰 巨噬细胞中N0D1/Rip2信号通路的表达，抑制Rip2的表达，从而抑制巨噬细胞的炎性活化， 发挥抗动脉粥样硬化的形成;抑制活化的巨噬细胞分泌MIF和MCP-1，发挥抗动脉粥样硬化 的作用；显著上调巨噬细胞表面⑶16和⑶68的表达，促进巨噬细胞由Ml型向M2型转变，发挥 抗动脉粥样硬化的作用。
[0072] 实施例4
[0073]用于抗动脉粥样硬化的药物丸剂由如下重量份的原料药制成： 故芪丨30g 党参100g 丹参6Qg 葛根60g 淫羊藿70g 山楂60g
[0074] 地黄40g 当归45g 黄连40g 醋延胡索46g 灵芝50g 人参26g 炙甘草23g。
[0075] 所述药物丸剂的制备方法，包括以下步骤:取上述原料药，加入常规辅料，按照常 规工艺制成丸剂。用于制备抗动脉粥样硬化药物、具有明显的抗动脉粥样硬化的作用。用于 抑制巨噬细胞吞噬脂质，干扰泡沫细胞的形成，延缓动脉粥样硬化的形成;干扰巨噬细胞中 N0D1/Rip2信号通路的表达，抑制Rip2的表达，从而抑制巨噬细胞的炎性活化，发挥抗动脉 粥样硬化的形成;抑制活化的巨噬细胞分泌MIF和MCP-1，发挥抗动脉粥样硬化的作用;显著 上调巨噬细胞表面⑶16和⑶68的表达，促进巨噬细胞由Ml型向M2型转变，发挥抗动脉粥样 硬化的作用。
[0076] 实施例5
[0077] 用于抗动脉粥样硬化的药物口服液由如下重量份的原料药制成： ?Λ??ζ 120g 立 # 100g j'J'# 80g 葛根80g 淫羊蕾80g 山楂80g
[0078] 地黄6〇g 当归60g 黄连60g 醋延胡索6〇g灵芝6_ 人参25g 炎甘草25g,_>
[0079] 所述药物口服液的制备方法，包括以下步骤:取上述原料药，加入常规辅料，按照 常规工艺制成口服液。用于制备抗动脉粥样硬化药物、具有明显的抗动脉粥样硬化的作用。 用于抑制巨噬细胞吞噬脂质，干扰泡沫细胞的形成，延缓动脉粥样硬化的形成;干扰巨噬细 胞中N0D1/Rip2信号通路的表达，抑制Rip2的表达，从而抑制巨噬细胞的炎性活化，发挥抗 动脉粥样硬化的形成;抑制活化的巨噬细胞分泌MIF和MCP-1，发挥抗动脉粥样硬化的作用； 显著上调巨噬细胞表面⑶16和⑶68的表达，促进巨噬细胞由Ml型向M2型转变，发挥抗动脉 粥样硬化的作用。
[0080] 实施例6
[0081] 用于抗动脉粥样硬化的药物注射剂由如下的原料药制成： w it； 140g 党参 9〇g 丹参
[0082] 葛根90g 淫羊藿90g 山楂70g 地黄50g 当归70g 黄连70g
[0083] 醋延胡索50g 灵芝5〇:g 人参2:8g 炙甘草28g。
[0084] 所述药物注射剂的制备方法，包括以下步骤:取上述原料药，加入常规辅料，按照 常规工艺制成注射剂。用于制备抗动脉粥样硬化药物、具有明显的抗动脉粥样硬化的作用。 用于抑制巨噬细胞吞噬脂质，干扰泡沫细胞的形成，延缓动脉粥样硬化的形成;干扰巨噬细 胞中N0D1/Rip2信号通路的表达，抑制Rip2的表达，从而抑制巨噬细胞的炎性活化，发挥抗 动脉粥样硬化的形成;抑制活化的巨噬细胞分泌MIF和MCP-1，发挥抗动脉粥样硬化的作用； 显著上调巨噬细胞表面⑶16和⑶68的表达，促进巨噬细胞由Ml型向M2型转变，发挥抗动脉 粥样硬化的作用。
[0085] 实施例7
[0086] 用于抗动脉粥样硬化的药物滴丸由如下重量份的原料药制成： 黄芪120g 党参l()0g 丹参80g 葛根80g 淫羊藿80g 山楂80g
[0087] 地黄60:g 当归60g 黄连60g: 醋延胡索60g灵芝60g 人参25g 炙甘草25g。
[0088] 所述药物滴丸的制备方法，包括以下步骤：
[0089] 取原料药，用10重量倍的水浸60分钟，煮沸2小时，取出药液，药渣再加8重量倍的 水煎煮90分钟，合并二次药液，滤过;药液通过已处理好的JD-1 (WLD)大孔吸附树脂柱，
[0090] 树脂用量为原料药重量的1.5倍，控制吸附流速2-4ml/min，吸附完毕，用水冲洗树 脂柱至流出液澄清后，用树脂重量3倍的70%乙醇洗脱，收集洗脱液，后用1.5体积倍水冲 洗，合并洗脱液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.08-1.15,喷雾干燥，得提取物喷雾干燥药 粉，加入常规辅料制备得滴丸，丸重49-52mg/粒，□服，一次10粒，一日3次。用于制备抗动脉 粥样硬化药物、具有明显的抗动脉粥样硬化的作用。用于抑制巨噬细胞吞噬脂质，干扰泡沫 细胞的形成，延缓动脉粥样硬化的形成;干扰巨噬细胞中N0D1/Rip2信号通路的表达，抑制 Rip2的表达，从而抑制巨噬细胞的炎性活化，发挥抗动脉粥样硬化的形成;抑制活化的巨噬 细胞分泌MIF和MCP-1，发挥抗动脉粥样硬化的作用；显著上调巨噬细胞表面⑶16和⑶68的 表达，促进巨噬细胞由Ml型向M2型转变，发挥抗动脉粥样硬化的作用。
[0091] 实验例
[0092] 为阐明本发明药物抗动脉粥样硬化及其作用机制，用按上述实施例1方法制备得 到的片剂（以下称本发明药物)进行下列实验以证明其疗效，但不能对本发明的范围构成任 何限制。
[0093] 1实验材料与仪器
[0094]人单核细胞系THP-1购自中科院上海细胞库;胎牛血清购自（兰州民海生物公司）； RPMI1640培养基(Hyclone和Gibco);0X-LDL(北京欣源佳和生物科技有限公司）；RNA提取试 剂盒（宝生物工程有限公司）；引物合成（BI0NEER公司）；佛波酯（Sigma);逆转录试剂盒 (BI0NEER);鼠抗人β-actin、兔抗鼠 i3-actin(江苏碧云天生物技术研究所）；兔抗人N0D1多 克隆抗体、羊抗兔多克隆抗体、兔抗人Rip2多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc); RIP A裂解液、金鸡纳酸（B C A)蛋白浓度测定试剂盒、蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟化物 (PMSF)、蛋白质免疫印迹法(Western blot)荧光检测试剂盒(BeyoECL Plus江苏碧云天生 物技术研究所）；人MIF ELISA试剂盒(上海细胞生物公司），人MCP-1 ELISA试剂盒(达科为 生物技术有限公司）。流式细胞仪（美国BD公司Facscalibar)，流式细胞抗体CD16-FITC、 CD68-FITC、IgG2a-FITC(美国BD公司），其他试剂为国产或进口分析纯。
[0095] 2实验方法
[0096] 2.1发明药物对THP-1源性巨噬细胞的毒性实验
[0097] THP1细胞用含10 %胎牛血清的RPMI-1640培养基于37°C，5 %C02培养箱中，每24- 48h按悬浮细胞传代方法1:2~1:3传代一次。选取传3~4代以后细胞，以IX 107/ml细胞密 度接种于培养皿，加入终浓度160nmol/L的PMA，刺激24h后细胞由悬浮状态转化为贴壁状 态。形态学上呈梭形、椭圆形或伸出伪足，细胞体积增大，表明THP-1细胞已转化为巨噬细 胞。用MTT法检验了发明药物对THP-1源性巨噬细胞的毒性作用。实验重复三次，分别以发明 药物终浓度分别为500ug/ml、400ug/ml、200ug/ml、100ug/ml、50ug/ml、10ug/ml，刺激THP-1 源性巨噬细胞24小时。观察有无毒性。
[0098] 2.2发明药物对THP-1源性巨噬细胞脂质摄取的抑制
[0099] 用50mg/L的ox-LDL刺激THP-1源性巨噬细胞24小时，用油红0染色法观察巨噬细胞 对脂质摄取；用1 〇〇ug/ml的发明药物液预处理THP-1源性巨噬细胞12小时，再用50mg/L的 ox-LDL刺激THP-1源性巨噬细胞24小时，用油红0染色法观察巨噬细胞对脂质摄取。
[0100] 2.3oxLDL对THP-1源性巨噬细胞中N0D1和Rip2mRNA表达的影响及本发明药物干预 研究
[0101] 分别用oxLDL以10mg/l、25mg/l和50mg/l刺激THP-1源性巨噬细胞8h、16h和24h，用 RT-PCR法检测N0D1和Rip2的mRNA表达情况。
[0102] 以本发明药物终浓度1(^8/!111、5(^8/1111、10(^8/1111和20(^8/1111预处理1'冊-1源性巨 噬细胞12h，以ox-LDL50mg/l刺激THP-1源性巨噬细胞24h，细胞分为5组：空白对照组，本发 明药物l〇μg/ml处理组，本发明药物50μg/ml处理组，本发明药物100μg/ml处理组和本发明 药物200μg/ml处理组。用TRIZ0L试剂（TAKARA公司）提取各组样本总RNA，逆转录合cDNA，进 行PCR循环。Bioneer公司合成引物序列RIP2-F: 5 ' 一TCCTGGAAATCACAGTTGG-3 '，RIP2-R: 5'-TGAGGTCCTTGTAGGCTTG -3'PCRif 1 bp； N0D-F GCTGAAGGGTGACTAAACGG-3 '，N0D-R: 5 ' 一ATGAGCGGGCAAGAGGAC-3 ' PCR扩增产物长度为 148bp。内参照采用GAPDH。取RT-PCR产物在1 %琼脂糖凝胶电泳中电泳，样品上样量均10μ1， DNA marker 5μ1，溴化乙徒染色，100v200mA，25min电泳。
[0103] 2.4.(?〇^对1'冊-1源性巨噬细胞中勵01和1^?2蛋白表达的影响及本发明药物干 预研究
[0104] 分别用 oxLDL 以 10mg/l、25mg/l 和 50mg/l 刺激 THP-1 源性巨噬细胞 8h、16h 和 24h， 2ml胰酶消化细胞，收集细胞。1500rmp离心10min弃上清，2ml PBS洗涤，4°C2000rmp离心 5min，加入细胞裂解液裂解细胞，冰上静置10min后，4°C 14000rmp离心15min』CA法进行蛋 白定量。加等体积SDS loading煮沸使蛋白变性。电泳分离蛋白质，220mA lOOrnin。将蛋白质 转移至PVDF膜上。孵育一抗(购自Santa Cruz公司）4°C过夜，TBST洗膜10分钟三次，孵育二 抗，室温2h，TBST洗膜10min三次。Wsetern blot荧光检测试剂激发荧光，显示于X光片，显 影，定影后进行图像分析。
[0105] 以本发明药物终浓度1(^8/!111、5(^8/1111、10(^8/1111和20(^8/1111预处理1'冊-1源性巨 噬细胞12h，以ox-LDL50mg/l刺激THP-1源性巨噬细胞24h，细胞分为5组：空白对照组，本发 明药物l〇μg/ml处理组，本发明药物50μg/ml处理组，本发明药物100μg/ml处理组和本发明 药物200μg/ml处理组。2ml胰酶消化细胞，收集细胞。1500rmp离心10min弃上清，2ml PBS洗 涤，4 °C 2000rmp离心5min，加入细胞裂解液裂解细胞，冰上静置lOmin后，4 °C 14000rmp离心 15mindBCA法进行蛋白定量。加等体积SDS loading煮沸使蛋白变性。电泳分离蛋白质， 220mA lOOmin。将蛋白质转移至PVDF膜上。孵育一抗(购自Santa Cruz公司）4°C过夜，TBST 洗膜10分钟三次，孵育二抗，室温2h，TBST洗膜lOmin三次。Wsetern blot荧光检测试剂激发 荧光，显示于X光片，显影，定影后进行图像分析。
[0106] 2.50XLDL对THP-1源性巨噬细胞培养物上清液中炎症因子的影响及本发明药物干 预研究
[0107] 分别用10mg/L、25mg//L和50mg/L的oxLDL刺激THP-1源性巨噬细胞24小时，收集培 养物的上清液，储存在-20 °C冰箱。按照ELISA试剂盒说明书方法，将试剂盒提供的原倍标准 品在EP管中加入标准品稀释液倍比稀释，分别设空白孔、标准品孔、待测样品孔。在标准孔 中加标准品1〇〇μ1，待测样品1〇〇μ1，37°C温箱孵育90min，洗板5次，除空白孔外加入生物素 化抗体工作液，封板胶封孔，37 °C温箱孵育60min，洗板5次，除空白孔外，加入酶结合物工作 液，封板胶封孔，37 °C温箱避光孵育30min。洗板5次，加入显色液，37 °C温箱避光孵育15min， 迅速加入终止液，混匀后即刻在450nm波长下读值，测定MIF、MCP-1的浓度。结果发现oxLDL 能以剂量依赖的方式诱导THP-1源性巨噬细胞表达巨噬细胞移动抑制因子(MIF)(见图3); 我们用50mg/L的oxLDL分别刺激THP-1源性巨噬细胞8小时、16小时和24小时，发现oxLDL能 以时间依赖的方式诱导THP-1源性巨噬细胞表达巨噬细胞移动抑制因子(MIF)
[0108] 以本发明药物终浓度1(^8/!111、5(^8/1111、10(^8/1111和20(^8/1111预处理1'冊-1源性巨 噬细胞12h，以ox-LDL50mg/l刺激THP-1源性巨噬细胞24h，细胞分为5组：空白对照组，本发 明药物l〇μg/ml处理组，本发明药物50μg/ml处理组，本发明药物100μg/ml处理组和本发明 药物200μg/ml处理组。收集培养物的上清液，储存在-20 °C冰箱。用ELI SA法测定细胞培养物 上清液中MIF和MCP-1的浓度。
[0109] 2.6oxLDL对THP-1源性巨噬细胞表面抗原的影响及本发明药物干预研究
[0110] 分别用1〇、25和50mg/L的oxLDL刺激THP-1源性巨噬细胞24小时，以空白做对照，以 本发明药物终浓度10、50、100和20(^8/1111预处理1'冊-1源性巨噬细胞1211，以(《-〇^5011^/1 刺激细胞24h，采用流式细胞仪(FACSCalibar，美国BD公司）测定细胞表面CD16、CD68的表达 水平。在流式专用试管中分别加入20μ1荧光素标记的CD16、CD68单克隆抗体(美国BD公司）， 100μ1细胞悬液振荡混匀，室温避光15min孵育，加入溶血素2ml，震荡混匀，室温避光孵育 lOmin，2500rpm离心3分钟，弃上清，加入roS(PH 7.4)0.5ml混匀，重悬细胞上机检测。以荧 光素标记的IgG2a-FITC(美国BD公司）作为同型对照。用CelQuest软件分析结果，以荧光阳 性的细胞的平均荧光强度来表示。
[0111] 2.7数据处理与统计学方法
[0112] 所有数据以均数土标准差(i±s)表示，应用SPSS17.0统计软件包对数据进行统计 分析，两组计量资料，方差齐性的组间比较采用成组t检验，方差不齐釆用秩和检验。多组计 量资料方差齐性的釆用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。
[0113] 3实验结果
[0114] 3.1本发明药物对THP-1源性巨噬细胞的毒性实验
[0115] 结果显示所有浓度本发明药物对细胞均无毒性作用，但低浓度(50ug/ml和10ug/ ml)和高浓度（500ug/ml)对细胞生长有轻度抑制作用，中等浓度（400ug/ml、200ug/ml和 lOOug/ml)对细胞生长有轻度增殖作用，但差异均无统计学意义。根据此实验结果，考虑到 本发明药物终浓度400ug/ml和500ug/ml在临床应用时可能存在剂量过大的问题，因此本研 究中本发明药物预处理的终浓度确定为l〇ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml。
[0116] 3.2本发明药物对THP-1源性巨噬细胞脂质摄取的抑制
[0117] 用50mg/L的ox-LDL刺激THP-1源性巨噬细胞24小时，用油红0染色法观察巨噬细胞 对脂质摄取（图1)，光镜下可见成堆吞噬oxLDL的巨噬细胞。用100ug/ml的本发明药物液预 处理THP-1源性巨噬细胞12小时，再用50mg/L的ox-LDL刺激THP-1源性巨噬细胞24小时，用 油红0染色法观察巨噬细胞对脂质摄取（图2)，发现本发明药物能明显抑制巨噬细胞对脂质 的摄取。
[0118] 3.3 oxLDL对THP-1源性巨噬细胞中N0D1和Rip2mRNA表达的影响及本发明药物干 预研
[0119] 究
[0120] oxLDL对THP-1源性巨噬细胞中N0D1和Rip2mRNA表达的影响结果如图3所示，结果 显示不同浓度的oxLDL刺激THP-1源性巨噬细胞均能诱导N0D1和Rip2mRNA的表达。
[0121] 本发明药物干预后mRNA水平，如图4所示，随着本发明药物预处理浓度的增加， N0D1和Rip2的表达下调。
[0122] 3.4 oxLDL对THP-1源性巨噬细胞中N0D1和Rip2蛋白表达的影响及本发明药物干 预研究
[0123] oxLDL对THP-1源性巨噬细胞中N0D1和Rip2蛋白表达的影响结果如图5所示，与RT-PCR结果不同的是，无论是否受ox-LDL刺激，THP-1源性巨噬细胞中没有N0D1蛋白的表达，但 N0D1下游的Rip2信号能够被ox-LDL以时间和浓度依赖的方式诱导表达，在24h时达到高峰。
[0124] 本发明药物干预后未见N0D1蛋白表达，如图6所示，随着本发明药物预处理浓度增 加，Rip2蛋白表达下降。
[0125] 3.5oxLDL对THP-1源性巨噬细胞培养物上清液中炎症因子的影响及本发明药物干 预研究
[0126] oxLDL对THP-1源性巨噬细胞培养物上清液中炎症因子的影响结果见图7-图8。
[0127] oxLDL能以浓度和时间依赖的方式诱导THP-1源性巨噬细胞表达单核细胞趋化因 子(MCP-1)，见图 9,图 10。
[0128] 本发明药物对oxLDL激活THP-1源性巨噬细胞培养物上清液中炎症因子的影响见 图11 MIF和MCP-1的浓度。结果显示本发明药物能显著抑制oxLDL刺激激活的THP-1源性巨 噬细胞分泌MIF(见图11)。如图11所示，尽管100μg/ml和200μg/ml的本发明药物的抑制效果 无统计学差异，但明显优于50μg/ml的本发明药物。而50μg/ml的本发明药物抑制效果明显 优于l〇μg/ml的本发明药物。10μg/ml的本发明药物虽能抑制THP-1源性巨噬细胞分泌MIF， 但差异无统计学意义。
[0129] 同样本发明药物能显著抑制oxLDL刺激激活的THP-1源性巨噬细胞分泌MCP-1 (见 图⑵。
[0130] 如图12所示，尽管100μg/ml和200μg/ml的本发明药物的抑制效果无统计学差异， 但明显优于50μg/ml的本发明药物。50μg/ml与10μg/ml的本发明药物的抑制效果无统计学 差异。
[0131] 3.6 oxLDL对THP-1源性巨噬细胞表面抗原的影响及本发明药物干预研究
[0132] oxLDL对THP-1源性巨噬细胞表面抗原的影响及本发明药物干预研究结果如图13-1~图13-8所示，从图中我们可以看出，低浓度oxLDL刺激对THP-1源性巨噬细胞表面⑶68的 表达有轻度上调，随着刺激浓度的增加，CD68的表达下调，以50mg/L最为明显。用本发明药 物预处理后，能上调⑶68的表达，并有浓度依赖性，在100ug/ml时达到高峰，但随着浓度的 进一步增加，⑶68的表达下降。
[0133] 从图14-1~图14-8中我们可以看出，大剂量的oxLDL刺激能引起THP-1源性巨噬细 胞表面⑶16表达下调。用不同浓度的本发明药物预处理后，能显著上调THP-1源性巨噬细胞 表面CD16的表达，并有浓度依赖性，在100ug/ml时达到高峰，但随着浓度的进一步增加， ⑶16的表达下降。
[0134] 4实验结论
[0135] 单核细胞和巨噬细胞在动脉粥样硬化进展中具有重要作用。一旦进入病变，单核 细胞产生趋化因子如IL-8和细胞因子如IL-1，它们能进一步加重局部炎症。单核细胞能分 化成为巨噬细胞，吞噬oxLDL颗粒，变成泡沫细胞。巨噬细胞与oxLDL结合也能调节单核细胞 功能。激活的巨噬细胞能产生多种炎症因子、趋化因子、粘附分子和多种酶的激动剂和抑制 剂，连接先天和获得性免疫，调节脂质蓄积，促进血栓形成，参与血管的重构和斑块的失稳 定。
[0136] 本研究以人单核细胞株THP-1细胞为基础，研究本发明药物对巨噬细胞中N0D1/ Rip2信号通路的调节机制及对巨噬细胞表型和脂质摄取功能的影响，为进一步阐明本发明 药物防治冠心病的机制提供实验依据。
[0137] 本发明药物直接抑制巨噬细胞吞噬脂质，干扰泡沫细胞的形成，延缓动脉粥样硬 化的形成;干扰巨噬细胞中N0D1/Rip2信号通路的表达，抑制Rip2的表达，从而抑制巨噬细 胞的炎性活化，发挥抗动脉粥样硬化的形成;抑制活化的巨噬细胞分泌MIF和MCP-1，发挥抗 动脉粥样硬化的作用；显著上调巨噬细胞表面CD16和CD68的表达，促进巨噬细胞由Ml型向 M2型转变，发挥抗动脉粥样硬化的作用。
[0138] 另外，当本发明药物浓度为0ug/ml时，此时加入一定浓度的对比例1~4中的药物， 产生的结果与当本发明药物浓度为〇ug/ml时的结果相同，说明以特定的配方和配比关系组 成的药物才具有抗动脉粥样硬化的作用以及上述作用机制。
【主权项】
1. 一种药物在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用，其特征是，所述药物由如下重量份 的原料药制成： 黄巧100-150重量份，党参80-120重量份，丹参60-100重量份，葛根60-100重量份，淫羊 蕾60-100重量份，山植60-100重量份，地黄40-80重量份，当归40-80重量份，黄连40-80重量 份，醋延胡索40-80重量份，灵芝40-80重量份，人参20-30重量份，炙甘草20-30重量份。2. 权利要求1所述的药物在制备抑制巨隧细胞摄取OX-U3L的药物中的应用和/或药物 在制备使NOD1和化p2mRNA在巨隧细胞中的表达下调的药物中的应用和/或在制备使Rip2蛋 白在巨隧细胞中的表达下调的药物中的应用和/或在制备抑制巨隧细胞分泌MCP-1和/或 MIF的药物中的应用和/或在制备提高巨隧细胞表面抗原CD68和/或CD16含量的药物中的应 用。3. 如权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述药物由如下重量份的原料药制成： 黄巧120重量份 觉参100重量份 丹参80重量份 葛根80重量份 淫羊蕾80重量份 山檀溯重量份 地黄60重量份 当向60重量份 黄连60重量份 醋延胡索60重量份灵芝60重量份 人参25重量份 炙甘草25重量份。4. 如权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述药物由如下重量份的原料药制成： 黄苗140重量份 觉参90重量份 丹参70重量份 葛根90重量份 淫羊蕾90重量份 山植70重量份 地黄50重量份 当扫70重量份 黄连70重量份 醋延胡索50重量份灵芝50重量份 人参28重量份 炙甘草28重量份。5. 如权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述药物由如下重量份的原料药制成： 黄巧11:0垂量粉 觉参110重量條丹参90重量份 葛根70重量份 淫羊馨70壁量份 山稽90重量份 地黄70重童份 当归50重量份 黄连50重量份 醋延胡秦70重量份 灵芝70重量份人参22重量份 炙甘草22重量份。6. 如权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述药物由如下重量份的原料药制成： 黄巧]30重量份 党参100重量份 丹参60重量份 葛根60重量份 淫羊蕾70重量份 山梭60重量份 地黄40重量份 当因45重量化 黄连40重量份 醋延胡索46重量份 灵芝50重量份 人参26重量份 炙甘草23重量份。7. 如权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述药物的制备方法包括W下步骤:取原料 药中的人参、黄连、醋延胡索、山植与一半量的黄巧，粉碎成细粉，其余八味原料药与剩余黄 巧加水煎煮1-3次，每次1-3小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至90-95 °C时相对密度为1.05~ 1.15，放冷，加一倍量乙醇使沉淀，取上清液，回收乙醇，并浓缩至90-95 °C时相对密度为 1.15~1.25的清膏，与上述药粉混合，制成片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、滴丸、软胶囊剂、缓 释剂、口服液体制剂或冻干粉针剂。8. 如权利要求7所述的应用，其特征是，所述药物的制备方法包括W下步骤:取原料药 中的人参、黄连、醋延胡索、山植与一半量的黄巧，粉碎成细粉，其余八味原料药与剩余黄巧 加水煎煮2次，第一次2小时，第二次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至90°C时相对密度 为1.06~1.12，放冷，加一倍量乙醇使沉淀，取上清液，回收乙醇，并浓缩至90°C时相对密度 为1.20~1.22的清膏，与上述药粉混合，制成片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、滴丸、软胶囊剂、 缓释剂、口服液体制剂或冻干粉针剂。9. 如权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述药物的滴丸制剂的制备方法包括如下 步骤： 取原料药，用10重量倍的水浸60分钟，煮沸2小时，取出药液，药渣再加8重量倍的水煎 煮90分钟，合并二次药液，滤过;药液通过已处理好的JD-1大孔吸附树脂柱，树脂用量为原 料药重量的1.5倍，控制吸附流速2-4ml/min，吸附完毕，用水冲洗树脂柱至流出液澄清后， 用树脂重量3倍的70%乙醇洗脱，收集洗脱液，后用1.5体积倍水冲洗，合并洗脱液，回收乙 醇，浓缩至相对密度为1.08-1.15，喷雾干燥，得提取物喷雾干燥药粉，加入常规辅料制备得 滴丸。10. 如权利要求9所述的应用，其特征是，所述喷雾干燥的条件为：进料速度为35- 40ml/min，雾化速度:25000-35000巧m，进风溫度：130-160 °C，出风溫度:70-80 °C。11. 如权利要求10所述的应用，其特征是，所述喷雾干燥的条件为：进料速度为37ml/ min，雾化速度:30000巧m，进风溫度：145~147 °C，出风溫度:71~76 °C。12. 如权利要求9所述的应用，其特征是，在得提取物物喷雾干燥药粉后，按如下方法制 备成滴丸： 称取聚乙二醇-4000，于80-85 °C下水浴至彻底溶胀，加入上述提取物喷雾干燥药粉，加 入比例为药粉:聚乙二醇-4000 = 1:4,于85°C下保溫揽拌均匀，使药粉完全溶解分散在聚乙 二醇-4000中；移入滴丸机中，保持滴距和滴溫，调整滴制参数为：油浴溫度:85°C，药液溫 度：80°C，滴盘溫度：87°C，制冷溫度：12°C，管口溫度：37°C，滴头口径为：3mm/5mm，滴速：1 滴/2秒一1滴/5秒;调节开关使液滴适速滴入冷凝剂二甲基硅油或液体石蜡中，药滴经过冷 凝收缩成滴丸，收集滴丸，W转速1500-3000转/分离屯、脱油，再进入筛选干燥机进行筛选干 燥，即得本发明药物滴丸。
【文档编号】A61P9/10GK105935390SQ201610466113
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】丁彦春, 姜作玲, 王辉, 张冬雪, 蔡妍, 侯亮
【申请人】上海医药集团青岛国风药业股份有限公司