用于肿瘤诊疗一体化的复合纳米药物及其制备方法

用于肿瘤诊疗一体化的复合纳米药物及其制备方法
【专利摘要】本发明公开一种用于肿瘤诊疗一体化的复合纳米药物及其制备方法，本发明通过纳米载体负载化疗药物、光动力药物和能逆转肿瘤细胞多药耐药MDR?1基因的shRNA质粒，所述纳米载体以表面排列有贵金属纳米粒的磁性纳米球为内核，表面修饰氨基的介孔二氧化硅为外壳，通过层层自组装技术在核壳结构表面形成具有pH响应的聚电解质薄膜层结构。本发明复合纳米药物集靶向给药、多模成像、化学治疗、光动力治疗、基因治疗于一体，可同时应用于肿瘤早期诊断、影像介导和实时监控的治疗，克服了现有技术肿瘤诊断与治疗分离的缺陷；此外，本发明复合纳米药物制备工艺简单、可操作性强、适于工业生产。
【专利说明】
用于肿瘤诊疗一体化的复合纳米药物及其制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种用于肿瘤诊断治疗一体化的多功能复合纳米药物、制备方法。
【背景技术】
[0002]肿瘤是目前威胁人类健康的重大疾病之一，尤其是恶性肿瘤。恶性肿瘤正在成为威胁人类生命的头号杀手，每年肿瘤在全世界范围的患病率正逐步提高，而且，肿瘤的死亡率也在不断上升。肿瘤的有效治疗要求尽早、准确发现，从而实现及时治疗，改善治疗效果，然而，目前肿瘤的诊断和治疗一直是科学界的一个难题。
[0003]在肿瘤的早期诊断中，用不同模式的成像技术来获取肿瘤的结构、代谢和生化信息是至关重要的。在临床上普遍使用的肿瘤诊断技术有X-射线断层扫描成像(CT)、正电子发射断层显像(PET)、核磁共振成像(MRI)以及荧光成像(FOI)，尤其是MRI和荧光成像因其独特的非侵入无损伤优点颇受青睐。
[0004]核磁成像是临床常用的成像模式，它可以提供高质量的生物体结构信息。其中，超顺磁纳米粒子可以有效地减少氢质子的横向弛豫时间(T2)，增强T2序列的核磁成像对比度。因此，超顺磁纳米粒子在核磁成像中的应用已经引起了人们的极大关注和广泛研究，特别是在肿瘤诊断中的应用。
[0005]然而，在实际病例中，单一的成像模式不能完全提供肿瘤的形态和功能信息，所以发展多模成像技术可以充分发挥各个成像模式的长处，这样可以大大提高肿瘤诊断的精度。通常，在成像中需要注射对比剂来增强信号，如果顺次利用不同的成像模式进行检测可能需要对患者注入不用的对比剂，这样不仅耗时，而且增加患者的痛苦和毒副作用。所以发展一种可以同时应用于多种成像技术的探针可以解决以上的问题，并且多模探针聚集的位置可以作为各个成像模式图像的参考点，这样对不同模式图像的融合会有较大的帮助。
[0006]目前临床上治疗恶性肿瘤的方法主要有手术切除、化学治疗和放射治疗等。虽然手术切除是首选方法，但由于早期肿瘤发病部位比较隐匿，且癌细胞具有高转移的特点，许多癌症患者在开始治疗时就发现癌细胞已发生转移现象，导致原发病灶部位无法被有效识别并完全切除。在不能采取手术治疗的情况下，根据组织类型考虑采用放疗或者化学药物治疗。组织类型不同，首选的方法也不同，如肺的鳞状上皮癌对放射线敏感，而肺腺癌则对化学治疗比较敏感。而一些特殊部位的肿瘤，即便没有远处转移，但手术可能会造成严重的并发症，如脑干，肺门，肝脏门脉区，一旦出现手术闪失，容易造成患者死亡。这种情况下，放疗或化疗为首选的治疗手段。放射治疗是通过高能粒子或光波破坏细胞遗传物质将肿瘤细胞直接消灭。但在实施过程中，对周围正常组织细胞也会受到射线损伤，正常组织细胞受到射线损伤容易突变，增加形成新肿瘤的风险。化学治疗作为一种全身性治疗手段，利用化学药物来抑制肿瘤的增殖、转移和浸润，可以有效地杀伤肿瘤。化学治疗对原发灶、转移灶和亚临床转移灶均有治疗作用，然而化学治疗多是针对生长旺盛的组织进行非选择性杀伤，同时人体的造血系统和免疫系统对化学药物也极为敏感，因此化学治疗对造血系统和免疫系统也具有严重损伤;此外，化疗药物还有在肿瘤组织处分布较低的问题，并且肿瘤细胞对化疗药物产生耐受性从而导致细胞耐药，进而提高了肿瘤治疗的难度。
[0007]肿瘤的多药耐药性(MDR)是指肿瘤细胞接触一种抗肿瘤药物并产生耐药后，同时对结构和作用机理不同的抗肿瘤药物具有交叉耐药性。MDR是肿瘤细胞耐药的常见方式，也是肿瘤化疗失败的主要原因。因此，MDR是当前使用化学药物治疗肿瘤亟待解决的问题。
[0008]目前研究肿瘤耐药机制主要是从MDR基因表达的产物入手，而RNA干扰技术可特异性和选择性地沉默靶基因表达。对于克服肿瘤的多药耐药性，通过抑制MDR基因的表达避免生物体细胞对化学药物治疗的耐受性。RNA干扰技术的机制是外源性双链RNA，如siRNA进入细胞后，在胞质中的RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，随后反义链再与细胞内的一些核酸内切酶或解旋酶等结合形成RNA诱导的沉默复合物(RISC) HSC与目标基因的mRNA同源区特异性结合，在结合部位酶解切割mRNA，从而使mRNA降解导致相应的基因表达沉默。siRNA是约22个碱基对长度的双链核糖核酸序列，呈负电性，易溶于水，具有高效的基因沉默效应。
[0009]目前，传统的化学治疗和基因沉默结合治疗肿瘤已获得极大的关注，并取得较好的治疗效果。然而，siRNA这种负电性的生物分子递送到肿瘤细胞内相对很困难，因此，通过设计、改造、研发出一种新型多功能药物载体，能够有效实现RNA沉默功能是s iRNA靶向基因沉默研究当中的最大挑战。
[0010]现阶段临床肿瘤诊断与治疗分离，由于其固有的局限性并不能及时对肿瘤做出准确判断与有效处理，往往会延误肿瘤患者最佳的治疗时间，因此有必要研发集多种功能为一体的诊疗药物，将诊断和治疗两者有机同步地结合起来，以实现诊断的同时进行治疗的目的。在肿瘤的诊断与治疗领域中，特别引起人们广泛兴趣的就是纳米材料与纳米技术，纳米材料应用于药物输送和成像的优势体现于其多功能性，许多纳米材料自身具有提升成像能力的特性，纳米技术的应用也可以同时实现治疗和监测药物在体内的作用位点及治疗效果。因此，设计和构建诊疗一体化复合纳米药物同时实现肿瘤早期诊断、影像介导和实时监控的治疗是当今医学技术研究中的热点与难点。

【发明内容】

[0011]鉴于上文所述，本发明公开了一种用于肿瘤诊疗一体化的复合纳米药物、制备方法，这两个方面的技术方案具体如下文所述:
[0012]本发明公开的第一方面是提供一种用于肿瘤诊疗一体化的复合纳米药物，所述复合纳米药物是通过纳米载体以物理吸附或化学键合的方式结合化疗药物、光动力药物和能逆转肿瘤细胞多药耐药MDR-1基因的ShRNA质粒;所述复合药物的纳米载体以表面排列有贵金属纳米粒的磁性纳米球为内核，以表面修饰氨基的介孔二氧化硅为外壳，通过层层自组装技术
[0013](Layer-by_Layer，LbL)在所述核壳结构表面依次形成带负电荷的聚电解质与带正电荷聚电解质层交替的薄膜层;所述聚电解质层为具有PH响应的聚合物。
[0014]本发明中用于肿瘤诊疗一体化的复合纳米药物，其所述复合药物的纳米载体中磁性纳米球的材料为N1、Co、Fe、Fe304、Y-Fe2O3和MeFe2O4中任一种，点状排列在磁性纳米球表面的贵金属纳米粒的材料为Au或Ag;
[00?5]优选地，所述复合药物的纳米载体内核为表面修饰有Au纳米粒的Fe304纳米球的结构。
[0016]本发明中用于肿瘤诊疗一体化的复合纳米药物，其所述化疗药物根据常用分类分为烷化剂、抗代谢药、抗癌抗生素、植物类、激素类和杂类等，下文所述药物为常用化疗药物，但并不代表本发明中化疗药物局限于下文所述药物，在实际病例中根据肿瘤的类型和患者情况选择。例如燒化剂；环磷酰(Cyclophosphamide)，塞替派(Th1tepa)，司莫司汀(Semustine)，盐酸氮芥(Chlormethine Hydrochloride)，白消安(马利兰，Busulfan)，苯丁酸氮芥(ChlorambuciI)，氮甲(Formylmerphalan)，卡莫司汀(Carmustine)，六甲蜜胺(Altretamine)，洛莫司汀(Lomustine)，苯丙氨酸氮芥(DL-Phenylalanine Mustard)，硝卡芥(Nitrocaphane)，异环磷酰胺(Ifosfamide)，二溴甘露醇(Mitobronitol);抗代谢药;阿糖胞苷(Cytarabine)，氟尿啼啶(Fluorouraci I)，甲氨蝶呤(Methotrexate)，轻基脲(Hydroxycarbami de)，替加氟(Tegafur)，甲异靛(Meisoindigotin)，巯嘌呤(Mercaptopurine);抗癌抗生素；放线菌素D(更生霉素，Dactinomycin)，丝裂霉素(Mitomycin)，盐酸阿霉素(Doxorubicin Hydrochloride)，盐酸平阳霉素(BleomycinA5 Hydrochloride)，盐酸表柔比星(Epirubicin Hydrochloride )，盐酸卩比柔比星(Pirarubicin Hydrochloride)，盐酸柔红霉素(Daunorubicin Hydrochloride);植物类天然抗肿瘤药;高三尖杉酯碱(Homoharringtonine)硫酸长春新碱(醛基长春碱，VincristineSulfate)，轻喜树碱(Hydroxycamptothecin)，依托泊苷(Etoposide)，硫酸长春地辛(Vindesine Sulfate)，硫酸长春減(Vinblastine Sulfate)，重酒石酸长春瑞宾(Vinorelbine Bitartrate)，紫杉醇(PaclitaxeI)，长春质碱，长春瑞宾碱，多稀紫杉醇，莪术油，人参多糖，秋水仙碱，9-氨基喜树碱，7-乙基喜树碱，榄香烯;激素抗肿瘤药;氨鲁米特(Aminoglutethimide)，他莫昔芬(Tamoxi f en)，氟他胺(Flu tami de )，戈那瑞林(Gonadorel in)，醋酸亮丙瑞林(Leuprorelin Acetate)，来曲挫(Lelrozol);卡钼(Carboplatin)，盐酸丙卡巴餅(甲基巴餅，Procarbaz ine Hydrochloride)，安卩丫啶(Amsacrine)，枸f缘酸达卡巴嘆(Dacarbazine Citrate)，门冬酰胺酶(L-门冬酰胺酶，Asparaginase)，顺钼(Cisplatin)，盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone Hydrochloride)。
[0017]本发明中用于肿瘤诊疗一体化的复合纳米药物，光动力药物为可引发光动力反应破坏细胞结构的药物。所述光动力药物包括但不局限于下文所述药物，应根据实际病例灵活选择D例如第一代光敏剂;血卩卜啉衍生物(hematoporphyrin deriva-tive，HPD)，二血卩卜啉謎(dihaematoporphyrin ether，DHE)和Por_f imer sodium(Photofrin Π );第二代光敏剂;5_氨基酮戊酸(5-ALA)，间-四轻基苯基二氢P卜酷(meso-tetrahydroxyphenyl chlorin，m-TH-PC)，初卩卜啉锡(tin et1purpurin?SnEtz)，亚甲基兰(methyIene blue)和亚甲苯兰(toluidine blue)，苯口卜啉(benzoporphyrin)衍生物以及lutelium texaphyrins(Lu-Tex)，苯并卩卜啉衍生物单酸(BFO-MAiVertoporfin)，酿青类(Phthalocyanines)，得克萨卩卜琳(Texaphyrins)，N_天门冬醜基二氣卩卜酷(N-aspartyl chlorin e6，Npe6)，金丝桃素(hypercin)，血啉甲謎(Her-mimether，HMME);等。
[0018]优选地，选择chlorin e6(Ce6)作为光动力药物，Ce6存在较长的三重态时间，能够有效的对肿瘤细胞进行杀伤作用，在红外区域有很好的吸收，在活体中能够进行荧光成像，并且Ce6能够很快的被代谢出体外。
[0019]本发明中用于肿瘤诊疗一体化的复合纳米药物中，所述带负电荷的聚电解质为海藻酸钠、聚丙烯酸或聚乙二醇；所述带正电荷的聚电解质为壳聚糖、聚乙烯胺或聚乙烯亚胺。
[0020]本发明的用于肿瘤诊疗一体化的复合纳米药物中，所述纳米载体的浓度为0.1?10mg/ml，所述化疗药物的浓度为0.1?10mg/ml，所述光动力药物的浓度为0.I?10mg/ml，所述质粒的浓度为10?500yg/ml。
[0021]本发明公开的第二方面是提供一种用于肿瘤诊疗一体化的复合纳米药物的制备方法，包括以下步骤:
[0022]步骤A:将预先制备的纳米载体分散在超纯水中，制备浓度为0.1?10mg/ml纳米载体水溶液，所述纳米载体以表面排列有贵金属纳米粒的磁性纳米球为内核，以表面修饰氨基的介孔二氧化硅为外壳，通过层层自组装技术在所述核壳结构表面依次形成带负电荷的聚电解质与带正电荷聚电解质交替的薄膜层，直至得到目标层数;所述聚电解质层为具有pH响应的聚合物；
[0023]步骤B:在步骤A得到的纳米载体水溶液中加入化疗药物和光动力药物形成混合溶液，混合溶液中溶质的质量关系为化疗药物:光动力药物:纳米载体=I: 1:1?5，将所述混合溶液置于摇床加载I?72小时后放入压强为13Pa?15Pa的真空箱中存放I?24小时，通过离心去除未加载在纳米载体上的药物，收集沉淀物待用；
[0024]步骤C:在步骤B所得沉淀物中加入能逆转肿瘤细胞多药耐药MDR-1基因的shRNA质粒，所述复合化疗药物和光动力药物的纳米载体与质粒的质量比为10?100:1，将所述混合溶液在室温下静止0.5?5小时，制得所述复合纳米药物。
[0025]本发明中用于肿瘤诊疗一体化的复合纳米药物的制备方法中步骤A中，优选地，纳米载体具有以表面点状排列有Au纳米粒的磁性纳米球Fe304-Au为内核，表面修饰氨基的介孔二氧化硅为外壳，通过层层自组装技术在所述核壳结构表面修饰依次形成带负电的海藻酸钠和带正电壳的聚糖交替的薄膜层结构；
[0026]优选纳米载体的制备方法具体如下:
[0027]Al:配制Fe3O4-Au溶液，加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)作为模板剂，搅拌至混合均匀，然后加入去离子水和氨水，在30?50 0C水浴条件下搅拌I?4小时，向所述溶液中添加正硅酸乙酯(TEOS)作为硅源，用乙酸乙酯(EA)调节pH至弱碱性，继续在30?50°C水浴条件下搅拌反应4?8小时，待反应结束，冷却至室温后，将反应产物离心，取沉淀物用无水乙醇反复清洗5?10次，将产物溶解于无水乙醇中制得含有模板剂的Fe304_Au@mSi02纳米粒子的溶液；
[0028]A2:将硝酸铵(NH4NO3)溶解于无水乙醇后水浴加热，然后加入步骤Al所得溶液中，磁力搅拌使溶液混合均匀，冷凝回流20?60分钟，待反应结束，自然冷却到室温，离心分离得到沉淀物，用无水乙醇清洗5?10次，经冷冻干燥处理制得Fe304_Au@mSi02纳米粒子，密封保存；
[0029]A3:将步骤A2得到的Fe3O4-AuOmS12纳米粒子溶解于无水乙醇中，在60?100°C水浴条件下磁力搅拌混合均匀，然后加入3-氨丙基三乙基硅烷(APTES)，将所述混合溶液充分冷凝回流4?8小时，待反应结束，冷却至室温，将反应产物用无水乙醇后清洗5?10次，经冷冻干燥处理，制得Fe3O4-AuOmS12-NH2纳米粒子，密封保存；
[0030]A4:配制Fe3OfAuOmS12-NH2溶液，并向其中滴加海藻酸钠(ALG)溶液，将所述混合溶液在室温下磁力搅拌反应I?4小时，反应结束经离心处理，取沉淀物用NaCl溶液洗涤2?
5次，得到Fe3OrAuOmS12-ALG ；
[0031 ] A5:将步骤A4得到的Fe3O4-AuOmS12-ALG溶于NaCl溶液中，并向其中滴加壳聚糖(CHI)溶液，将所述混合溶液在室温下磁力搅拌I?4小时，反应结束经离心处理，取沉淀物用去离子水洗涤2?5次，将所得物经冷冻干燥处理，得到Fe3O4-AuOmS12-PEM复合纳米粒子，密封保存。
[0032]本发明中用于肿瘤诊疗一体化的复合纳米药物的制备方法的步骤B和步骤C在步骤A所得纳米载体上分别进行光动力药物、化疗药物的加载和基因药物的加载。由于肿瘤细胞的异常能量代谢和对特定蛋白的自身调节，形成了和正常细胞不同的酸性胞内微环境，本发明制备出的复合纳米药物具有PH响应的特性，在中性或弱碱性环境下不释放，在酸性环境中稳定释放，从而可以尽量减少化疗药物对正常细胞的损伤;本发明制备出的复合纳米药物具有光响应的特性，通过优选光动力药物Ce6在激发状态下产生单线态氧或活性氧自由基，从而杀死肿瘤细胞;本发明制备出的复合纳米药物通过外加磁场可实现药物靶向输运，提高药物治疗效果。
[0033]相比于现有技术，本发明具有以下有益效果:
[0034]1、本发明的复合纳米药物集靶向给药、多模成像、化学治疗、光动力治疗、基因治疗于一体，同时应用于肿瘤早期诊断、影像介导和实时监控的治疗，克服了现有技术肿瘤诊断与治疗分尚的缺陷。
[0035]2、本发明的复合纳米药物可用作核磁成像、荧光成像以及CT这三种成像技术的生物探针，基于同一探针的不同成像技术联合使用有利于互补单一成像模式的不足，并且可以有效解决诊断操作过程耗时、多种对比剂的使用会增加患者的痛苦和毒副作用等问题。
[0036]3、本发明的复合纳米药物构建的磁性靶向给药系统中通过基因沉默技术，在肿瘤胞内酸性条件下释放所携带的基因，所述基因在细胞内被切割成siRNA，能够有效沉默耐药基因MDR-1的表达，从而避免了生物体细胞对化学药物治疗的耐受性。
[0037]4、本发明的复合纳米药物可通过磁、光和pH的刺激调控复合纳米药物的靶向作用和药物释放，从而实现对肿瘤的诊断与治疗。
[0038]5、本发明的复合纳米药物制备工艺简单、可操作性强、适于工业生产，可用于多种药物协同治疗肿瘤，肿瘤的Ce6荧光成像、MRI和CT成像以及肿瘤的靶向给药和pH响应性给药。
【附图说明】
[0039]图1为复合纳米药物制备流程示意图；
[0040]图2为纳米载体(Fe3O4-AuOmS12-PEM)的透射电镜图(TEM图)；
[0041 ]图3为复合纳米药物的药物释放规律曲线；
[0042]图4为纳米载体(Fe3O4-AuOmS12-PEM)生物相容性示意图；
[0043]图5为MCF-7细胞内吞复合纳米药物的激光扫描共聚焦显微图；
[0044]图6为复合纳米药物对MCF-7治疗的P1-Cam效果示意图；
[0045]图7为不同给药方案下小鼠右后腿肿瘤大小变化的对比图；
[0046]图8为CT/MR双模态成像图，其中(a)为MR图像，(b)为CT成像。
【具体实施方式】
[0047]以下依据实施例和说明书附图对本发明进行进一步叙述:如图1所示，本示意图仅仅用于说明本发明复合纳米药物制备的流程，本发明不局限于本附图所示内容。
[0048]本发明通过表面修饰形成表面排列有点状Au粒(粒径约为5?1nm)的Fe3O4磁性纳米球，用介孔二氧化娃(MSNs)包裹前述形成的Fe304_Au纳米粒子形成核壳结构，其中磁性纳米球材料的选择，本领域人员结合公知常识可以将Fe3O4替换为N1、Co、Fe、γ-Fe2O3或MeFe2O4,然后将制得的Fe3O4-AuOmS12纳米粒子通过酰胺反应使表面氨基化得到Fe3O4-AuOHiS12-NH2纳米粒子，通过层层自组装依次修饰海藻酸钠(ALG)和壳聚糖(CHI)交替的薄膜层结构，从而制得复合纳米载体Fe3O4-AuOmS12-PEM;然后通过加载光动力药物、化疗药物和基因药物制得复合纳米药物Fe304-Au@mSi02(Dox/Ce6)-PEM/P-gp shRNA。
[0049]实施例1:
[0050]共输送药物与基因的纳米载体的制备方法，具体步骤如下:
[0051 ] Al:配制浓度为5mg/ml的Fe3O4-Au溶液，加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)作为模板剂，搅拌5分钟至混合均匀，然后加入去离子水和氨水，在40°C水浴条件下搅拌2小时，向所述溶液中添加正硅酸乙酯(TEOS)作为硅源，用乙酸乙酯(EA)调节pH至弱碱性，继续在40°C水浴条件下搅拌反应6小时，待反应结束，冷却至室温后，将反应产物离心，取沉淀物用无水乙醇反复清洗6次，将产物溶解于无水乙醇中制得含有模板剂的Fe3O4-AuOmS12纳米粒子的溶液；
[0052]A2:将硝酸铵(NH4NO3)溶解于无水乙醇后水浴加热，然后加入步骤Al所得溶液中，磁力搅拌使溶液混合均匀，冷凝回流40分钟，待反应结束，自然冷却到室温，离心分离得到沉淀物，用无水乙醇清洗6次，经冷冻干燥处理制得Fe3O4-AuOmS12纳米粒子，密封保存；
[0053]A3:将步骤A2得到的Fe3O4-AuOmS12纳米粒子溶解于无水乙醇中，在80°C水浴条件下磁力搅拌混合均匀，然后加入3-氨丙基三乙基硅烷(APTES)，将所述混合溶液充分冷凝回流6小时，待反应结束，冷却至室温，将反应产物用无水乙醇后清洗6次，经冷冻干燥处理，制得Fe304-Au@mSi02_NH2纳米粒子，密封保存；
[0054]A4:配制Fe3O4-AuOmS12-NH2溶液，并向其中滴加海藻酸钠溶液，将所述混合溶液在室温下磁力搅拌反应2小时，反应结束经离心处理，取沉淀物用NaCl溶液洗涤3次，得到Fe304-Au@mS i O2-ALG ；
[0055]A5:将步骤A4得到的Fe3O4-AuOmS12-ALG溶于NaCl溶液中，并向其中滴加壳聚糖溶液，将所述混合溶液在室温下磁力搅拌2小时，反应结束经离心处理，取沉淀物用去离子水洗涤3次，将所得物经冷冻干燥处理，得到Fe3O4-AuOmS12-PEM复合纳米粒子，密封保存。
[0056]根据以上操作制得纳米载体(Fe3O4-AuOmS12-PEM)，其透射电镜图(TEM图)如图2所示，从图2中可以看到纳米载体分散性良好，粒径大约为2 20nm，聚电解质(PHM)层成功修饰于以表面点状排列有Au纳米粒的磁性纳米球Fe3O4-Au为内核，表面修饰氨基的介孔二氧化娃为外壳的核壳结构表面(Fe304-AuimS12-NH2)。
[0057]实施例2:
[0058]一种用于肿瘤诊疗一体化的复合纳米药物的制备方法，具体步骤如下:
[0059]步骤A:将实施例1制备的纳米载体分散在超纯水中，制备浓度为lmg/ml纳米载体水溶液，所述纳米载体以表面排列有贵金属纳米粒子的磁性纳米球为内核，以表面修饰氨基的介孔二氧化硅为外壳，通过层层自组装技术在所述核壳结构表面依次形成带负电荷的聚电解质与带正电荷聚电解质交替的薄膜层，直至得到目标层数;所述聚电解质层为具有pH响应的聚合物；
[0060]步骤B:在步骤A得到的纳米载体水溶液中加入化疗药物和光动力药物形成混合溶液，混合溶液中溶质的质量关系为化疗药物:光动力药物:纳米载体=I: 1:1?5，将所述混合溶液置于摇床加载I?72小时后放入压强为13Pa?15Pa的真空箱中存放I?24小时，通过离心去除未加载在纳米载体上的药物，收集沉淀物待用；
[0061 ]步骤C:在步骤B所得沉淀物中加入能逆转肿瘤细胞多药耐药MDR-1基因的shRNA质粒，所述复合化疗药物和光动力药物的纳米载体与质粒的质量比为10?100:1，将所述混合溶液在室温下静止0.5?5小时，制得所述复合纳米药物。
[0062]从图3，可以发现化疗药物在酸性环境下释放，说明本发明复合纳米药物具有很好的pH响应。
[0063]实施例3:
[0064]纳米载体的血液相容性:
[0065]步骤1:取新鲜小鼠血，3000rpm/min离心10分钟除去上清液得到红细胞，然后将产物连续用PBS缓冲液清洗5次；
[0066]步骤2:用PBS缓冲液将红细胞稀释10倍，然后分别取0.1ml红细胞稀释液加入到
0.9ml 浓度为 25yg/ml、50yg/ml、100yg/ml、200yg/ml、400yg/ml 的载体溶液中依次编号为 I?5号管，取0.1ml红细胞稀释液加入到0.9mI PBS缓冲液编号为6号管，作为阴性对照，取
0.1ml红细胞稀释液加入到0.9ml蒸馏水中编号为7号管，作为阳性对照；
[0067]步骤3:将步骤2中所得I?7号的溶液轻微混合后放入37 V水浴中孵育3小时，然后在转速为3000rpm/min的条件下离心3分钟；
[0068]步骤4:测取步骤3所得的I?7号管中上清液在波长范围为450?750nm的紫外吸收。
[0069]如图4所示，纳米载体浓度达到400yg/ml时几乎都没有产生溶血现象，通过此项实验说明该纳米载体具有很好的血液相容性。
[0070]实施例4:
[0071 ]复合纳米药物的细胞内吞实验，具体步骤如下:
[0072]步骤1:使用1640培养基培养人乳腺肿瘤细胞(MCF-7细胞)，分别在6个相同的设有爬片的24孔板中接种同样数量的处于对数生长期的细胞，过夜培养；
[0073]步骤2:将本发明的复合纳米药物重悬于1640培养基中，超声溶解，所述复合纳米药物中化疗药物的浓度为2yg/ml，光动力药物Ce6的浓度为4yg/ml;
[0074]步骤3:除去所述6个24孔板中的培养基，均用PBS缓冲液清洗3次后，在6个24孔板中加入等量的复合纳米药物，并置于孵箱中分别孵育0.5小时、I小时、2小时、4小时、6小时、12小时。
[0075]步骤4:除去完成孵育的24孔板中的培养基，用PBS缓冲液清洗3次以除去未被细胞内吞的复合纳米药物，然后滴加质量分数为4%的多聚甲醛固定细胞30分钟，固定完成后用PBS缓冲液清洗3次，再使用DAPI染色10分钟，用PBS缓冲液清洗3次；
[0076]步骤5:将步骤4所得爬片置于激光扫描共聚焦显微镜下，观察MCF-7细胞对复合纳米药物的内吞情况。
[0077]图5为MCF-7细胞内吞复合纳米药物的共聚焦实验效果图；实验通过DAPI染细胞核，在波长为405nm的条件下激发为蓝色，而Ce6在波长为630nm的条件下激发成绿色，化疗药物在波长为488nm的条件下激发成红色。根据细胞内各颜色深浅的改变，可以看出纳米复合物与MCF-7细胞共孵育0.5小时后，纳米复合物就可以被细胞内吞，并且随着共孵育时间的增加，细胞内绿色和红色也逐渐加深，在12小时达到最大值。同时也可以发现，纳米复合物被细胞内吞后，聚电解质(PEM)层被分解，释放化疗药物和光动力药物Ce6，化疗药物扩散进入细胞核，而光动力药物Ce6主要分布在细胞质中，这有利于肿瘤的协同治疗，提高抗肿瘤效果。
[0078]综上所述，随着复合纳米药物与MCF-7细胞共孵育时间的增加，细胞内吞复合纳米药物逐渐增加，说明复合纳米药物能够很好的被MCF-7细胞内吞。
[0079]实施例5:
[0080]复合纳米药物体外协同抗肿瘤作用实验，具体包括以下步骤:
[0081 ] 步骤1:使用1640培养基培养MCF-7细胞，在96孔板中接种I X 14个细胞，过夜培养；
[0082]步骤2:在步骤I所得的96孔板上取15个孔，并等分为5个组，分别向各个组中加入10uL 的 1640 培养基、10uL 的 Fe304-Au@mSi02(Ce6)-PEM 溶液、10uL 的 Fe3OfAuOmS12(Dox)-PEM 溶液、10uL 的 Fe304-Au@mSi02(Dox/Ce6)-PEM 溶液和 10uL 的 Fe3OfAuOmS12(Dox/Ce6)-PEM/P-gp siRNA溶液，其中化疗药物(Dox)的浓度为2ug/ml，光动力药物Ce6的浓度为4ug/ml，将上述96孔板置于孵箱中孵育12小时；
[0083]步骤3:将步骤2孵育后的细胞用PBS溶液洗涤3次，然后使用波长为660nm，功率为2W/cm2的激光器对载有Ce6组进行10分钟激光照射，再放入二氧化碳孵箱中孵育60小时，最后采用CCK-8法对治疗效果进行检测。
[0084]图6为通过P1-CalceinAM双染色法检测复合纳米药物协同抗肿瘤作用的效果图，钙黄素-AM在活细胞内通过脂酶作用脱去AM基可发出强绿色荧光，因为钙黄素-AM亲脂性强，碘化丙啶(PI)只能穿过死细胞，嵌入细胞中的DNA产生红色荧光。因此，在图6中，活细胞被染色为绿色，死细胞被染色为红色，从图6中可以发现载有Ce6和Dox的两组中有部分红色出现，有一定的治疗效果，但是同时载有Ce6和Dox组以及同时载有Dox、Ce6和P-gp sh RNA组中几乎只有红色，表明具有更好的治疗效果，说明复合纳米药物对于杀死肿瘤细胞具有非常好的协同治疗效果。
[0085]实施例6:
[0086]复合纳米药物体内协同抗肿瘤作用的实验，具体包括以下步骤:
[0087]步骤1:将鼠乳腺肿瘤细胞(EMT-6细胞)接种于Balb/c雌性小鼠右后腿，待接种肿瘤长到一定大小时实验；
[0088]步骤2:将接种肿瘤成功的小鼠随机分为6组，分别记为I?6组，标记I组为生理盐水对照组，2 组为 Fe3OfAuOmS12-PEM 组，3 组为 Fe3OfAuOmS12 (Ce6)-PEM组，4 组为 Fe3OfAuOmSi02(Dox)-PEM组，5 组为 Fe304-Au@mSi02(Dox/Ce6)-PEM，6 组为 Fe304-Au@mSi02(Dox/Ce6)-PEM/P-gp s iRNA组，
[0089]步骤3:将步骤2中标记2?6组的纳米药物分别溶解分散于生理盐水中制成各组所用药品溶液，其中，I组为不添加药物且与其余组等量的生理盐水，4组、5组和6组中使用同种化疗药物(Dox)并且浓度均为lmg/ml，3组、5组和6组中Ce6浓度均为0.4mg/ml;将配制的药物给药于对应组小鼠，给药方式优选为瘤内给药，给药剂量为50yL;
[0090]给药后2小时，使用功率为2W/cm2，波长为660nm的激光器照射3组、5组和6组(即为载有Ce6的组)小鼠的肿瘤部位1分钟；
[0091 ]本实验各组小鼠给药为每周给药一次，一共给3次药，最后观察记录各组肿瘤大小、小鼠体重变化情况。
[0092]图7为上述给药方案后小鼠右后腿肿瘤大小变化的对比图；从图7可以看到，生理盐水组和纳米载体(Fe3O4-AuOmS12-PEM)组都不能抑制小鼠肿瘤的增大，载有光动力药物Ce6的3组或载有化疗药物(Dox)的4组对于肿瘤有一定的抑制作用，而同时载有光动力药物Ce6和化疗药物(Dox)的5组以及载有光动力药物Ce6、化疗药物(Dox)和基因药物P-gp siRNA的6组对小鼠肿瘤具有非常好的抑制作用，尤其是6组具有显著治疗作用。综上所述，本发明复合纳米药物具有很好的协同治疗效果。
[0093]实施例7:
[0094]纳米载体核磁共振(MRI)与CT(电子计算机X射线断层扫描技术)双模态成像
[0095]步骤1:将实施例1制备的Fe3O4-AuOmS12-PEM纳米载体超声分散于去离子水中，分别制备浓度为Omg/ml,0.8mg/ml，1.6mg/ml，2mg/ml，4mg/ml溶液，分别取各组溶液0.5ml加入到含有0.5mL琼脂糖溶液的离心管中混合均匀，待混匀溶液冷却至室温，使用微计算机断层扫描技术(Micro-CT)进行扫描拍照；
[0096]步骤2:将实施例1制备的Fe3O4-AuOmS12-PEM纳米载体超声分散于去离子水中，分别制备浓度为Omg/ml，0.4mg/ml，0.8mg/ml，lmg/ml，2mg/ml溶液，加入到琼脂糖溶液中混合均匀，待混匀溶液冷却至室温，使用磁场大小为3T的核磁共振成像系统对纳米载体的成像效果进行检测。
[0097]如图8所示，由于纳米载体(Fe304-Au@mSi02_PEM)中包裹有Fe304纳米粒子和Au纳米粒子，因此是比较理想的MRI和CT造影剂。其中，从图(a)中可看出，随着纳米载体浓度的增大，MR图像逐渐变暗，成像效果逐渐变好。从图(b)中可看出，随着纳米载体浓度的增大，CT图像逐渐变亮，成像效果逐渐变好。综上所述，本发明的纳米载体能很好的进行MR与CT的双模态成像。
【主权项】
1.用于肿瘤诊疗一体化的复合纳米药物，其特征在于，所述复合纳米药物是通过纳米载体以物理吸附或化学键合的方式结合化疗药物、光动力药物和能逆转肿瘤细胞多药耐药MDR-1基因的shRNA质粒;所述纳米载体以表面排列有贵金属纳米粒的磁性纳米球为内核，以表面修饰氨基的介孔二氧化硅为外壳，通过层层自组装技术在所述核壳结构表面依次形成带负电荷的聚电解质与带正电荷聚电解质交替的薄膜层结构;所述带负电荷的聚电解质和所述带正电荷的聚电解质为具有pH响应的聚合物。2.根据权利要求1所述的用于肿瘤诊疗一体化的复合纳米药物，其特征在于，所述纳米载体中磁性纳米球的材料为N1、Co、Fe、Fe304、γ _Fe203和MeFe204中任一种。3.根据权利要求1所述的用于肿瘤诊疗一体化的复合纳米药物，其特征在于，所述纳米载体中贵金属纳米粒的材料为Au或Ag。4.根据权利要求1所述的用于肿瘤诊疗一体化的复合纳米药物，其特征在于，所述带负电荷的聚电解质为海藻酸钠、聚丙烯酸或聚乙二醇。5.根据权利要求1所述的用于肿瘤诊疗一体化的复合纳米药物，其特征在于，所述带正电荷的聚电解质为壳聚糖、聚乙烯胺或聚乙烯亚胺。6.根据权利要求1所述的用于肿瘤诊疗一体化的复合纳米药物，其特征在于，所述纳米载体的浓度为0.1?10mg/ml，所述化疗药物的浓度为0.1?10mg/ml，所述光动力药物的浓度为0.1?10mg/ml，所述质粒的浓度为10?500ug/ml。7.用于肿瘤诊疗一体化的复合纳米药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤A:将预先制备的纳米载体分散在水中，制备浓度为0.1?10mg/ml纳米载体水溶液，所述纳米载体以表面排列有贵金属纳米粒子的磁性纳米球为内核，以表面修饰氨基的介孔二氧化硅为外壳，通过层层自组装技术在所述核壳结构表面依次形成带负电荷的聚电解质与带正电荷聚电解质交替的薄膜层，直至得到目标层数;所述聚电解质层为具有PH响应的聚合物； 步骤B:在步骤A得到的纳米载体水溶液中加入化疗药物和光动力药物形成混合溶液，混合溶液中溶质的质量关系为化疗药物:光动力药物:纳米载体=1:1:1?5，将所述混合溶液置于摇床加载I?72小时后放入压强为13Pa?15Pa的真空箱中存放I?24小时，通过离心去除未加载在纳米载体上的药物，收集沉淀物待用； 步骤C:在步骤B所得沉淀物中加入能逆转肿瘤细胞多药耐药MDR-1基因的shRNA质粒，所述复合化疗药物和光动力药物的纳米载体与质粒的质量比为10?100:1，将所述混合溶液在室温下静止0.5?5小时，制得所述复合纳米药物。8.根据权利要求6所述的用于肿瘤诊疗一体化的复合纳米药物的制备方法，其特征在于，所述步骤A中纳米载体具有以表面点状排列有Au纳米粒的磁性纳米球Fe304_Au为内核，表面修饰氨基的介孔二氧化硅为外壳，通过层层自组装技术在所述核壳结构表面修饰依次形成海藻酸钠薄膜层和壳聚糖薄膜层，所述纳米载体的制备方法具体如下: Al:配制Fe3O4-Au溶液，加入十六烧基三甲基溴化钱作为模板剂，搅拌至混合均匀，然后加入去离子水和氨水，在30?50°C水浴条件下搅拌I?4小时，向所述溶液中添加正硅酸乙酯作为硅源，用乙酸乙酯调节PH至弱碱性，继续在30?50°C水浴条件下搅拌反应4?8小时，待反应结束，冷却至室温后，将反应产物离心，取沉淀物用无水乙醇反复清洗5?10次，将产物溶解于无水乙醇中制得含有模板剂的Fe3O4-AuOmS12纳米粒子的溶液； A2:将硝酸铵溶解于无水乙醇后水浴加热，然后加入步骤Al所得溶液中，磁力搅拌使溶液混合均匀，冷凝回流20?60分钟，待反应结束，自然冷却到室温，离心分离得到沉淀物，用无水乙醇清洗5?10次，经冷冻干燥处理制得Fe3O4-AuOmS12纳米粒子，密封保存； A3:将步骤A2得到的Fe3O4-AuOmS12纳米粒子溶解于无水乙醇中，在60?100°C水浴条件下磁力搅拌混合均匀，然后加入3-氨丙基三乙基硅烷，将所述混合溶液充分冷凝回流4?8小时，待反应结束，冷却至室温，将反应产物用无水乙醇后清洗5?10次，经冷冻干燥处理，制得Fe304-Au@mSi02_NH2纳米粒子，密封保存； A4:配制Fe3O4-AuOmS12-NH2溶液，并向其中滴加海藻酸钠溶液，将所述混合溶液在室温下磁力搅拌反应I?4小时，反应结束经离心处理，取沉淀物用NaCl溶液洗涤2?5次，得到Fe304-AuimSi02-ALG ； A5:将步骤A4得到的Fe3O4-AuOmS12-ALG溶于NaCl溶液中，并向其中滴加壳聚糖溶液，将所述混合溶液在室温下磁力搅拌I?4小时，反应结束经离心处理，取沉淀物用去离子水洗涤2?5次，将所得物经冷冻干燥处理，得到Fe3O4-AuOmS12-PEM复合纳米粒子，密封保存。
【文档编号】A61K49/08GK105963717SQ201610380706
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】刘贻尧, 陈银, 杨红, 吴春惠, 曾红娟
【申请人】电子科技大学