一种热致水凝胶降糖药物制剂及其制备方法

一种热致水凝胶降糖药物制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明属于高分子材料与医疗技术领域，具体涉及一种热致水凝胶降糖药物制剂及其制备方法。该热致水凝胶降糖制剂含有降糖多肽和热致凝胶化的聚合物，通过下述制备方法：按原料配方，将药物直接溶解于以溶液形式存在的聚合物热致凝胶中，采用凝胶直接包裹多肽，通过多肽与聚合物之间的共组装行为实现多肽药物的缓慢释放，制得能降低血糖的长效缓释制剂。
【专利说明】
一种热致水凝胶降糖药物制剂及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于高分子材料和医疗技术领域，具体涉及一种具有热致成胶特性的水凝 胶降糖药物制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 现有技术公开了糖尿病（diabetes mellitus，DM)是一种由遗传和环境因素相互 作用而引起的代谢综合症。由于胰岛素分泌不足或胰岛素敏感性降低，引起糖尿病患者一 系列代谢紊乱，临床上主要表现为高血糖，久之会引起多个器官系统受损，并引发严重的并 发症等，该疾患已经成为严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。糖尿病主要分为I型 和II型糖尿病，其中II型糖尿病的发病率占糖尿病患者总数的90%以上，其发病机理是由 于胰岛β细胞胰岛素分泌缺陷和胰岛素抵抗。糖尿病给患者的家庭和社会带来严重的负 担。近几十年来，随着人类科学技术的进步和医疗水平的飞速发展，糖尿病治疗药物的研发 取得了不少进展。
[0003] 利拉鲁肽（Liraglutide)是由丹麦诺和诺德公司（Novo Nordisk Inc.)研发的 一种胰高血糖素样肽-I (GLP-I)类似物，于2009年6月和2010年1月分别被EMA和FDA 批准上市，用于成年人II型糖尿病的治疗。利拉鲁肽的分子式为C172H265N43O 51，分子量为 3751. 20。利拉鲁肽与内源性人GLP-I主要区别是在第34位上将人体内天然的GLP-I的 精氨酸替换为赖氨酸，在第26位的赖氨酸上通过谷氨酸与一个16个碳的脂肪酸相连，C16 脂肪链的存在大大增加了利拉鲁肽的疏水性，从而提高了药物的稳定性，C16脂肪链被认为 能够增强利拉鲁肽和白蛋白的非共价键结合，从而大大延长利拉鲁肽在体内的半衰期。与 GLP-I相似，利拉鲁肽作用于GLP-I受体，激动该受体刺激胰岛素按照葡萄糖浓度依赖性方 式释放、降低血浆胰高血糖素水平，并可直接作用于β细胞促进其增殖与分化。利拉鲁肽 具有延迟胃排空，增加饱腹感，降低食欲，减轻体重，降低收缩压等功效。由于利拉鲁肽与内 源性人GLP-I具有97%氨基酸序列同源性，因而其抗体生成的发生率和抗体水平较低，具 有很高的安全性和较少的副作用。利拉鲁肽的商品注射剂诺和力? (Victoza? )2011年10 月9日正式在中国上市。其规格为3毫升：18毫克预填充注射笔，适用于单用二甲双胍或 磺脲类药物最大可耐受剂量治疗后血糖仍控制不佳的患者，可与二甲双胍或磺脲类药物联 合应用。利拉鲁肽的3mg装注射针剂Saxenda?·于2014年12月还被FDA批准作为治疗慢性 肥胖的药物，作为饮食控制和体育锻炼的补充。Saxenda?也是目前唯一被FDA批准的减肥 针剂。其他的GLP-I类似物中，如阿必鲁肽，利司那肽，杜拉鲁肽，索玛鲁肽等近年来同样被 广泛研究，其中大部分已经被批准上市或处于临床研究阶段。
[0004] 然而，对于每日注射型的降糖多肽，如利拉鲁肽注射剂需每日1次皮下注射才能 起到降糖作用，对于患者而言，这种注射给药方式仍然显得过于频繁，同时复杂的给药方案 给患者带来较大痛苦和诸多不便。因此制备利拉鲁肽等降糖多肽的长效缓释制剂对增加药 物的生物利用度，降低注射给药的频率，提高患者用药的顺应性具有巨大的临床价值和意 义。目前利拉鲁肽等降糖多肽的长效缓释制剂尚未见有报道。
[0005] 长效注射给药系统载体的选择一般有如下三种：（1)油性溶液或混悬型注射制 剂；（2)非生物降解埋植剂；(3)可生物降解注射剂。随着聚合物材料科学的飞速发展，可生 物降解材料为骨架的给药系统逐步成为长效注射给药的主流载体，其中以聚酯类材料的应 用最早也最为成熟。聚酯类可生物降解材料在生物体内可逐渐降解为乳酸、乙醇酸等体内 固有的小分子有机物，再经体内三羧酸循环排出。其中，以丙交脂（D，L-lactide，LA)，乙交 脂（glycolide，GA)和ε -己内酯（ε -caprolactone，CL)为单体的聚合物或共聚物是聚酯 类材料中运用最多的可生物降解聚合物。
[0006] 近十年来，国内外科研工作者通过在PEG亲水嵌段上引入可降解的聚酯嵌段或聚 氨基酸嵌段，制备了各种各样的PEG/聚酯（聚氨基酸）两亲性嵌段共聚物，并且发现在具 有适当的整体亲疏水平衡时，所合成的PEG/聚酯（聚氨基酸）嵌段共聚物可以在低温时溶 解在水中，同时由于材料的两亲性，嵌段共聚物能够通过自组装形成胶束，随着温度升高， 这些胶束将会进一步发生聚集，形成"胶束-凝胶"的网络。这种能够随温度升高而发生 sol-gel转变的聚合物水体系被称为热致水凝胶（thermogel)。
[0007] 与其他注射给药系统相比，PEG/可降解聚酯（聚氨基酸）热致水凝胶具有诸多优 点：（1)低温下的溶液状态使得其可以通过普通注射器注射即可植入体内，操作方便，同时 材料良好的生物降解性和生物相容性，避免了后续的手术取出；(2)通过体温自发物理交 联形成凝胶，凝胶化和包埋过程均不易使包埋的活性物质失活；（3) "低温溶液、高温凝胶" 的特点方便了制剂的制备，只需把聚合物溶液同药物简单混合即可，并且整个制备过程几 乎不涉及任何有机溶剂；(4)在低温溶液状态下可直接过滤除菌，无需射线、高压蒸汽灭菌 法等复杂的处理过程，保证了药物的安全性和稳定性；（5)药物缓释行为可以通过简单地 改变材料组成、结构性质等进行调控。因此PEG/聚酯（聚氨基酸）热致水凝胶是多肽、蛋 白长效注射给药系统研究的理想载体之一。
[0008] 然而，多肽类药物用水凝胶体系制备药物缓释制剂的过程中，由于多肽类药物良 好的水溶性，使其往往面临前期突释和后期释放不完全的问题。前期突释使得其初期释放 了大量的药物，达不到缓释的目的，而后期释放不完全导致大量药物存留在凝胶中，造成后 期药量不足，无法达到平稳持续给药的效果。目前针对所述问题的解决方案之一是在药物 制剂中加入各种辅料来调节药物的释放行为，如，中国专利申请号为201210305356. 7的专 利公开了一种温敏凝胶药物制剂及其制备方法。该温敏凝胶药物制剂原料配方含有药物， 温敏凝胶组合物，以及辅料C ;所述的辅料C为金属盐、糖类物质、以及注射用的亲水性聚合 物中的一种或多种；所述的金属盐为药学上可接受的且水溶液中离解二价金属阳离子的金 属盐；所述的药物为水溶液中以阴离子形态存在的物质A，所述的物质A为蛋白质药物、多 肽类药物和糖肽类抗生素中的一种或多种。该专利通过多种药物辅料的协同作用，能够有 效的改善蛋白质药物、多肽类药物和糖肽类抗生素的突释问题，但是其制备方案复杂，同时 一种或多种药用辅料的引入还会极大的影响温敏凝胶组合物本身凝胶的性质，甚至影响所 制备制剂的可注射性。
[0009] 迄今为止通过药物与水凝胶材料在分子层面的相互自组装作用调节药物的可控 水凝胶缓释制剂很少见诸报道。鉴于现有技术存在的问题，本申请的发明人拟提供一种具 有热致成胶特性的可皮下或肌肉注射的长效凝胶降糖缓释制剂及其制备方法，以解决水凝 胶递送多肽、蛋白药物过程中的常见初期突释和后期释药不完全的问题。

【发明内容】

[0010] 本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种具有热致成胶特性的可皮下 或肌肉注射的长效凝胶降糖缓释药物制剂及其制备方法。
[0011] 本发明利用热致水凝胶材料包载多肽类药物，制得可皮下或肌肉注射的长效凝胶 缓释制剂，通过药物与水凝胶材料在分子层面的相互自组装作用调节药物的缓释行为，解 决水凝胶递送多肽、蛋白药物过程中的常见初期突释和后期释药不完全的问题。本发明的 缓释制剂相比于GLP-1，利拉鲁肽等降糖多肽的结构修饰，特别是疏水组分的引入，能明显 提高药物的稳定性，增强药物和白蛋白的非共价键结合，从而能显著延长多肽药物在体内 的半衰期；同时，本发明缓释制剂中的结构修饰，能为其与PEG/聚酯（聚氨基酸）两亲性热 致水凝胶材料之间实现有效的分子间相互作用提供了可能。
[0012] 具体的，本发明公开了一种热致水凝胶降糖药物制剂，其含有降糖多肽和热致凝 胶化的聚合物，通过下述方法制备：按原料配方，将药物直接溶解于以溶液形式存在的聚合 物热致凝胶中，采用凝胶直接包裹多肽，通过多肽与聚合物之间的共组装行为实现多肽药 物的缓慢释放，制得能降低血糖的长效缓释制剂。
[0013] 更具体的，本发明的热致水凝胶降糖药物制剂，其特征在于，其由药物和可注射的 聚合物热致水凝胶组成；所述的药物为降糖多肽，所述的热致水凝胶由两亲性嵌段聚合物 和溶媒组成，该凝胶体系在室温或低温下处于溶液状态，在人体温度下能够自发转变为凝 胶，其中两亲性嵌段共聚物的亲水嵌段为聚乙二醇（PEG)，疏水嵌段为可降解聚酯或聚氨基 酸。
[0014] 本发明的热致水凝胶药物制剂中，药物与聚合物载体材料之间能够发生共组装作 用。
[0015] 本发明的热致水凝胶药物制剂中，其载药凝胶体系具有热致凝胶化性能，药物制 剂在室温或低温下处于溶液状态，在人体温度下能够自发转变为凝胶。
[0016] 本发明中，热致水凝胶药物制剂其聚合物水体系的溶胶-凝胶转变温度介于 4_40°C之间，本发明的一个实施例中，优选聚合物水体系的溶胶-凝胶转变温度介于 20-37Γ，本发明的另一个实施例中，更优选聚合物水体系的溶胶-凝胶转变温度介于 30-37 cC 〇
[0017] 本发明的热致凝胶药物制剂的嵌段共聚物中：
[0018] 1)所述亲水性的聚乙二醇嵌段A的平均分子量为400-8000,含量为10-90wt% ;
[0019] 2)所述疏水性的聚酯嵌段或聚氨基酸嵌段B的平均分子量为500-40000,含量 为90-10wt % ;其中，疏水聚酯嵌段选自聚DL-丙交酯、聚D-丙交酯、聚L-丙交酯、聚乙交 酯、聚原酸酯、聚ε-己内酯、聚ε-烷基取代己内酯、聚δ-戊内酯、聚1，4,8_三氧杂螺 [4. 6] -9-十一烷酮、聚对二氧六环酮、聚酰胺酯、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、聚醚酯或上述各聚 酯中的两种以上的聚酯形成的共聚物；
[0020] 其中，疏水性的聚氨基酸嵌段选自聚丙氨酸、聚苯丙氨酸、聚亮氨酸、聚赖氨酸、聚 谷氨酸、聚天冬氨酸或上述各聚氨基酸中的两种以上的聚氨基酸形成的共聚物；
[0021] 3)所述嵌段共聚物可以为ABA或BAB型的三嵌段共聚物、AB型的两嵌段共聚物、 A-g-B或B-g-A型的接枝共聚物、（A-B)nS (B-A) "的星形嵌段共聚物以及A(BA) "或B(AB) n构型的多嵌段共聚物，其中η为2至10的整数；
[0022] 4)所述嵌段聚合物部分或全部末端接有功能端基，端基是亲水的羟基、氨基、羧 基、咪唑基、醛基、氰基、硝基中的任何一种；或者是疏水的烷基、固醇、烷氧基、芳香基、芳杂 环基、酰胺酯基、卤素原子、三氯甲基、酯基、巯基中的任何一种。
[0023] 本发明的热致水凝胶药物制剂中，其聚合物可以为单一的两亲性嵌段共聚物，也 可为两种或两种以上不同分子结构的两亲性嵌段共聚物的组合物。
[0024] 本发明的热致凝胶药物制剂中包载的药物为降糖多肽，包括利拉鲁肽、阿必鲁肽、 利司那肽、杜拉鲁肽、索玛鲁肽中的一种或多种。
[0025] 本发明中，药物的含量占热致凝胶药物制剂的0. 01-5%，较佳的为0. 1-2%。
[0026] 本发明中的热致凝胶药物制剂，聚合物在制剂中的含量为3_50wt %。
[0027] 本发明中的热致凝胶药物制剂，聚合物溶液中的溶媒是纯水、生理盐水、缓冲溶 液、组织培养液、细胞培养液、动植物或人体的体液、或者为其它水溶液和不以有机溶剂为 主体的介质。
[0028] 本发明通过下述方法制备热致凝胶制剂：首先在低温溶解聚合物于水溶液中，然 后在-20°C或以下储存备用，使用前复溶并直接加入所述的降糖多肽，混匀后成为溶液注射 剂。
[0029] 以上所述低温指低于聚合物的溶液-凝胶转变温度；所制备的热致凝胶药物制剂 在温度高于溶液-凝胶转变温度时能够形成热可逆水凝胶。
[0030] 本发明中的热致凝胶药物制剂，所述热致凝胶药物制剂通过注射针可在皮下或肌 肉等组织进行注射。
[0031] 上述方法中，嵌段共聚物通过PEG大分子和可降解聚酯单体或聚氨基酸单体的开 环聚合得到。
[0032] 本发明的热致凝胶材料具有很好的生物相容性和可降解性，该材料可在一定时间 内完全降解为无毒的α-醇酸和其他相应单体。
[0033] 本发明的热致凝胶药物制剂可以控制降糖多肽缓慢持续地释放。
[0034] 本发明的热致凝胶药物制剂不仅有长效降糖作用，还可作为长效减肥药物制剂。
[0035] 本发明的优点在于：利用热致水凝胶材料直接包裹多肽类药物，在不添加各种药 用辅料或进行化学修饰的情况下，仅仅通过药物与水凝胶材料在分子层面的相互自组装作 用调节药物的缓释行为，解决水凝胶递送多肽、蛋白药物过程中的常见初期突释和后期释 药不完全的问题。
[0036] 本发明对于利用多肽类药物-材料相互作用制备药物长效缓释制剂具有很好的 参考价值和实用意义。
【附图说明】
[0037] 图1为实施例25配制的利拉鲁肽水溶液、Copolymer-I以及Copolymer-I/利拉 鲁肽混合物水溶液动态光散射图。
[0038] 图2为实施例26配制的利拉鲁肽水溶液、Copolymer-4以及Copolymer-4/利拉 鲁肽混合物水溶液动态光散射图。
[0039] 图3为实施例10制备的Copolymer-I热致水凝胶和实施例18制备的热致水凝胶 药物制剂的储能模量和粘度随温度变化图。
[0040] 图4为实施例11制备的Copolymer-4热致水凝胶和实施例19制备的热致水凝胶 药物制剂的储能模量和粘度随温度变化图。
[0041] 图5为实施例18制备的Copolymer-I热致水凝胶药物制剂体外释放曲线图。
[0042] 图6为实施例19制备的Copolymer-4热致水凝胶药物制剂体外释放曲线图。
[0043] 图7为实施例20制备的Copolymer-5热致水凝胶药物制剂体外释放曲线图。
[0044] 图8为实施例18制备的热致水凝胶药物制剂与单一药物水溶液对ICR小鼠血糖 的影响关系图。
[0045] 图9为实施例18制备的热致水凝胶药物制剂一次皮下注射对ICR小鼠第0天时 血糖的影响关系图；"*"Φ < 0.05，"**" ：p < 0.01，"***" ：p <0· OOlvs NaCl。
[0046] 图10为实施例18制备的热致水凝胶药物制剂一次注射对ICR小鼠第1天时血糖 的影响关系图；"*"Φ < 0.05，"**" ：p < 0.01，"***" ：p <0· OOlvs NaCl。
[0047] 图11为实施例18制备的热致水凝胶药物制剂一次注射对ICR小鼠第2天时血糖 的影响关系图；"*"Φ < 0.05，"**" ：p < 0.01，"***" ：p <0· OOlvs NaCl。
[0048] 图12为实施例18制备的热致水凝胶药物制剂一次注射对ICR小鼠第3天时血糖 的影响关系图；"*"Φ < 0.05，"**" ：p < 0.01，"***" ：p <0· OOlvs NaCl。
[0049] 图13为实施例18制备的热致水凝胶药物制剂一次注射对ICR小鼠第4天时血糖 的影响关系图；"*"Φ < 0.05，"**" ：p < 0.01，"***" ：p <0· OOlvs NaCl。
[0050] 图14为实施例18制备的热致水凝胶药物制剂一次注射对ICR小鼠第5天时血糖 的影响关系图；"*"Φ < 0.05，"**" ：p < 0.01，"***" ：p <0· OOlvs NaCl。
[0051 ] 图15为实施例18制备的热致水凝胶药物制剂一次注射对ICR小鼠第6天时血糖 的影响关系图；"*"Φ < 0.05，"**" ：p < 0.01，"***" ：p <0· OOlvs NaCl。
[0052] 图16为实施例18制备的热致水凝胶药物制剂一次注射对ICR小鼠第7天时血糖 的影响关系图；"*"Φ < 0.05，"**" ：p < 0.01，"***" ：p <0· OOlvs NaCl。
[0053] 图17为实施例18制备的热致水凝胶药物制剂一次注射对ICR小鼠第8天时血糖 的影响关系图；"*"Φ < 0.05，"**" ：p < 0.01，"***" ：p <0· OOlvs NaCl。
[0054] 图18为实施例18制备的热致水凝胶药物制剂一次注射对ICR小鼠第9天时血糖 的影响关系图；"*"Φ < 0.05，"**" ：p < 0.01，"***" ：p <0· OOlvs NaCl。
[0055] 图19为实施例18制备的热致水凝胶药物制剂一次注射对ICR小鼠体重变化影响 关系图；"*'，：p < 0.05，"**'，：p <0· 01，"***'，：p <0· OOlvs NaCl。
【具体实施方式】
[0056] 下面通过实例进一步描述本发明，但不因此将本发明限制在这些实施例中。
[0057] 实施例1
[0058] 取30g PEG(1500)于在250mL三口烧瓶中，150°C搅拌下抽真空3h以除去PEG中 残留的水分。然后，加入65. 6g ε -己内酯（CL)、7. 4g乙交酯（GA)以及0.1 wt%辛酸亚锡， 在KKTC以下抽真空30min以将其中甲苯除去。升温至160°C，待单体全部熔融后，在氩气 气氛下反应12h。反应结束后，真空抽滤3h以除去未反应的单体和低沸点产物，趁热将反应 产物倒出，水洗数次后冷冻干燥，得到三嵌段共聚物，产率约为80 %。通过凝胶渗透色谱仪 (GPC)(采用聚苯乙烯作为标样）测定所述BAB嵌段共聚物（PCGA-PEG-PCGA，Copolymer-1) 的数均与重均分子量（Mn，Mw)分别为7530和10010,分子量分布系数（Mw/M n)为I. 33。此 共聚物的水体系具有热致凝胶化的特性。
[0059] 实施例2
[0060] 取30g PEG(1500)于250mL三口烧瓶中，150°C搅拌下抽真空3h以除去PEG中残 留的水分。然后，加入36. 7g DL-丙交酯（LA)、34. 5g乙交酯（GA)以及0. lwt%辛酸亚锡， 在150°C、氩气气氛下反应12h。反应结束后，真空抽滤3h以除去未反应的单体和低沸点产 物。把粗产物溶于二氯甲烷溶液中，乙醚沉淀，产率约为85%。通过GPC测定所述BAB嵌段 共聚物（PLGA-PEG-PLGA，Copolymer-4)的数均与重均分子量（M n，Mw)分别为6650和8050， 分子量分布系数（Mw/M n)为1.21。此共聚物的水体系具有热致凝胶化的特性。
[0061] 实施例3
[0062] 取30g PEG(1500)于250mL三口烧瓶中，150°C搅拌下抽真空3h以除去其中残留 的水分。然后，加入75.6ge_己内酯（CL)以及0. lwt%辛酸亚锡，在150°C、氩气气氛下反 应12h。反应结束后，真空抽滤3h以除去未反应的单体和低沸点产物。趁热将反应产物倒 出，水洗数次后冷冻干燥，得到三嵌段共聚物，产率约为80%。通过凝胶渗透色谱仪（GPC) (采用聚苯乙烯作为标样）测定所述BAB嵌段共聚物（PCL-PEG-PCL，Copolymer-5)的数均 与重均分子量（M n，Mw)分别为8750和12090,分子量分布系数（Mw/Mn)为1. 38。此共聚物 的水体系具有热致凝胶化的特性。
[0063] 实施例4
[0064] 取22. 5g单甲氧基封端的聚乙二醇（MPEG 750)于250mL三口烧瓶中，130°C搅拌 下抽真空3h以除去MPEG中残留的水分。然后，加入45g DL-LA、6g GA以及0. lwt%辛酸亚 锡，在100°C以下抽真空30min以将其中甲苯除去。升温至150°C，待单体全部熔融后，在氩 气气氛下反应12h。反应结束后，真空抽滤3h以除去未反应的单体和低沸点产物，趁热将 反应产物倒出，水洗数次后冷冻干燥，得到两嵌段共聚物材料，产率约为75 %。通过GPC测 定所述BA两嵌段共聚物（MPEG-PLGA，Copolymer-6)的数均与重均分子量（Mn，M w)分别为 3580和4760,分子量分布系数（Mw/Mn)为1. 33。此共聚物的水体系具有热致凝胶化的特性。
[0065] 实施例5
[0066] 取11. Og MPEG (550)溶于80mL甲苯，蒸馏至30mL已除去聚合物中残余水分。加入 21.0g CL以及0. 3wt%辛酸亚锡，在120°C下回流24h。随后加入HDMI 1.62mL，在60°C下反 应7h。接着在上述溶液中加入乙醚，沉淀得到初产物。所得初产物溶于30mL二氯甲烷，缓 慢加入乙醚以使其沉淀，产物中残余溶剂通过抽真空除去，得到PEG-PCL-PEG三嵌段共聚 物材料，产率约为65%。通过GPC测定所述ABA嵌段共聚物（PEG-PCL-PEG，Copolymer-10) 的数均与重均分子量（M n，Mw)分别为5260和6260,分子量分布系数（Mw/Mn)为1. 19。此共 聚物的水体系具有热致凝胶化的特性。
[0067] 实施例6
[0068] 取8. 5g PEG(1000 )于250mL三口烧瓶中，130°C搅拌下抽真空3h以除去PEG中残 留的水分。然后，加入CL 16.9g、三亚甲基碳酸酯7.6g以及0. lwt%辛酸亚锡，在120°C、 氩气气氛下反应24h。反应结束后，真空抽滤3h以除去未反应的单体和低沸点产物。把初 产物溶于二氯甲烷溶液中，乙醚沉淀，产率约为85%。通过GPC测定所述BAB嵌段共聚物 (PCTC-PEG-PCTC，Copolymer-11)的数均与重均分子量（Mn，Mw)分别为4940和6520,分子 量分布系数（Mw/Mn)为1.32。此共聚物的水体系具有热致凝胶化的特性。
[0069] 实施例7
[0070] 取8. 8g MPEG (550)溶于80mL甲苯，蒸馏至30mL以除去聚合物中残余水份。加入 48g三亚甲基碳酸酯以及0. lwt%辛酸亚锡，在120°C下回流24h。接着在上述溶液中加入 乙醚，沉淀得到初产物。所得初产物溶于30mL二氯甲烷，缓慢加入乙醚以使其沉淀，产物中 残余溶剂通过抽真空除去，得到MPEG-PTMC两嵌段共聚物材料，产率约为65 %。通过GPC测 定所述BA两嵌段共聚物（MPEG-PTMC，Copolymer-12)的数均与重均分子量（Mn，M w)分别为 5610和7850,分子量分布系数（Mw/Mn)为1. 40。此共聚物的水体系具有热致凝胶化的特性。
[0071] 实施例8
[0072] 取5g-端为甲氧基另外一端为氨基的PEG(1000 )溶于80mL甲苯，蒸馏至15mL已 除去聚合物中残余水份。加入体积比为2/1的无水氯仿和DMF溶剂50mL以及4. 2g L-丙 氨酸-N-羧酸酐，在40°C下反应24h。接着在上述溶液中加入乙醚，沉淀得到初产物。所得 初产物溶于30mL二氯甲烷，缓慢加入乙醚以使其沉淀，产物中残余溶剂通过抽真空除去， 得到MPEG-L-PA两嵌段共聚物材料，产率约为70 %。通过GPC测定所述BA两嵌段共聚物 (MPEG-L-PA，Copolymer-16)的数均与重均分子量（Mn，M w)分别为1100和1320,分子量分 布系数（Mw/Mn)为1. 20。此共聚物的水体系具有热致凝胶化的特性。
[0073] 实施例9
[0074] 按照实施例1给出的基本步骤，用不同分子量的PEG和不同单体合成其他各种嵌 段共聚物，其表征结果如表1和表2所示：
[0075] 表 1

[0078] 上述表1中嵌段共聚物均具有热致凝胶化的性能，将共聚物Sd成一定浓度的水溶 液，其在温度低于凝胶转变温度时为溶液状态，随温度上升逐渐形成凝胶，且该过程为可逆 过程；
[0079] 表 2

[0085] 上述表3中嵌段共聚物均不具有热致凝胶化的性能，共聚物均不能溶解于水中或 只能部分溶解于水中；
[0086] 本实施例进一步可以取表1所示的一种或多种嵌段共聚物按一定比例混合，在温 度低于凝胶转变温度以下溶解于水，当温度高于凝胶转变温度时，聚合物混合物的溶液形 成凝胶；或，取表1所示的一种或多种嵌段共聚物和/或表2中的一种或多种嵌段共聚物和 /或表3中的一种或多种嵌段共聚物按一定比例混合，在温度低于凝胶转变温度以下溶解 于水，当温度高于凝胶转变温度时，聚合物混合物的溶液形成凝胶；或，取表2中一种或多 种嵌段共聚物与表3中的一种或多种嵌段共聚物按一定比例混合，在温度低于凝胶转变温 度以下溶解于水中，当温度高于凝胶转变温度时，聚合物混合物的溶液形成凝胶。
[0087] 实施例10
[0088] 称取适量嵌段共聚物Copolymer-I，加入一定量的磷酸盐缓冲溶液，配制得 25wt%的溶液，该溶液具有热致凝胶化特性，当温度高于溶胶-凝胶相转变温度时，能够自 发形成凝胶，通过试管倒置法测定其溶胶-凝胶相转变温度，即将载有样品的试管在水浴 中平衡IOmin后180°倒置，若30s内观察不到样品明显流动，则判断为凝胶状态，结果显示 其凝胶转变温度为32 °C。
[0089] 实施例11
[0090] 称取适量嵌段共聚物Copolymer-4,加入一定量的生理盐水，配制得25wt%的溶 液，该溶液具有热致凝胶化特性，当温度高于溶胶-凝胶相转变温度时，能够自发形成凝 胶，通过试管倒置法测定其溶胶-凝胶相转变温度，结果显示其凝胶转变温度为34°C。
[0091] 实施例12
[0092] 称取适量嵌段共聚物Copolymer-6,加入一定量的去离子水，配制得15wt%的溶 液，该溶液具有热致凝胶化特性，当温度高于溶胶-凝胶相转变温度时，能够自发形成凝 胶，通过试管倒置法测定其溶胶-凝胶相转变温度，结果显示其凝胶转变温度为40°C。
[0093] 实施例13
[0094] 称取等质量的嵌段共聚物Copolymer-I和Copolymer-6,加入一定量的去离子水， 配制得30wt %的溶液，该溶液具有热致凝胶化特性，当温度高于溶胶-凝胶相转变温度时， 能够自发形成凝胶，通过试管倒置法测定其溶胶-凝胶相转变温度，结果显示其凝胶转变 温度为36°C。
[0095] 实施例14
[0096] 称取质量比为3/1的嵌段共聚物Copolymer-16和Copolymer-19,加入一定量的细 胞培养液，配制得IOwt %的溶液，该溶液具有热致凝胶化特性，当温度高于溶胶-凝胶相转 变温度时，能够自发形成凝胶，通过试管倒置法测定其溶胶-凝胶相转变温度，结果显示其 凝胶转变温度为25 °C。
[0097] 实施例15
[0098] 称取质量比为2/1的嵌段共聚物Copolymer-4和Copolymer-23,加入一定量的磷 酸盐缓冲，配制得20wt %的溶液，该溶液具有热致凝胶化特性，当温度高于溶胶-凝胶相转 变温度时，能够自发形成凝胶，通过试管倒置法测定其溶胶-凝胶相转变温度，结果显示其 凝胶转变温度为28 °C。
[0099] 实施例16
[0100] 称取适量嵌段共聚物Copolymer-19和Copolymer-23按质量比1/1混合，加入一 定量的生理盐水，配制得25wt %的溶液，该溶液具有热致凝胶化特性，当温度高于溶胶-凝 胶相转变温度时，能够自发形成凝胶，通过试管倒置法测定其溶胶-凝胶相转变温度，结果 显示其凝胶转变温度为30°C。
[0101] 实施例17
[0102] 称取适量嵌段共聚物Copolymer-4、Copolymer-19和Copolymer-23按质量比 1/1/1混合，加入一定量的去离子水，配制得25wt %的溶液，该溶液具有热致凝胶化特性， 当温度高于溶胶-凝胶相转变温度时，能够自发形成凝胶，通过试管倒置法测定其溶胶-凝 胶相转变温度，结果显示其凝胶转变温度为33°C。
[0103] 实施例18
[0104] 取适量聚合物Coplymer-I溶解于磷酸盐缓冲溶液中，配制成25wt%的水溶液，过 0. 22 μ m滤膜灭菌备用，精密秤取利拉鲁肽干粉10mg，溶解于5mL上述聚合物溶液中，搅拌 使药物溶解，制备得到热致水凝胶药物制剂。
[0105] 实施例19
[0106] 取适量聚合物Coplymer-4溶解于磷酸盐缓冲溶液中，配制成25wt%的水溶液，过 0. 22 μ m滤膜灭菌备用，精密秤取利拉鲁肽干粉15mg，溶解于7. 5mL上述聚合物溶液中，搅 拌使药物溶解，制备得热致水凝胶药物制剂。
[0107] 实施例20
[0108] 取适量聚合物Coplymer-5溶解于磷酸盐缓冲溶液中，配制成25wt%的水溶液，灭 菌后备用，精密秤取利拉鲁肽干粉20mg，溶解于IOmL上述聚合物溶液中，搅拌使药物溶解， 制备得热致水凝胶药物制剂。
[0109] 实施例21
[0110] 取适量聚合物Coplymer-I溶解于磷酸盐缓冲溶液中，配制成23wt%的水溶液，过 0. 22 μ m滤膜灭菌备用，精密秤取杜拉鲁肽干粉15mg，溶解于5mL上述聚合物溶液中，搅拌 使药物溶解，制备得热致水凝胶药物制剂。
[0111] 实施例22
[0112] 取质量比为2/1的嵌段共聚物Copolymer-4和Copolymer-23溶解于磷酸盐缓冲 溶液中，配制成20wt %的水溶液，过0. 22 μ m滤膜灭菌备用，精密秤取阿必鲁肽干粉lOOmg， 溶解于5mL上述聚合物溶液中，搅拌使药物溶解，制备得热致水凝胶药物制剂。
[0113] 实施例23
[0114] 取质量比为3/1的嵌段共聚物Copolymer-16和Copolymer-19溶解于细胞培养液 中，配制成IOwt %的水溶液，过0. 22 μ m滤膜灭菌备用，精密秤取利司那肽干粉2. 5mg，溶解 于5mL上述聚合物溶液中，搅拌使药物溶解，制备得热致水凝胶药物制剂。
[0115] 实施例24
[0116] 取质量比1/1的嵌段共聚物Copolymer-19和Copolymer-23溶解于磷酸盐缓冲溶 液中，配制成25wt %的水溶液，过0. 22 μ m滤膜灭菌备用。精密秤取索玛鲁肽干粉50mg，溶 解于5mL上述聚合物溶液中，搅拌使药物溶解，制备得热致水凝胶药物制剂。
[0117] 实施例25
[0118] 称取IOmg利拉鲁肽干粉，溶解于磷酸盐缓冲溶液中，配制成500 μ g/mL溶液，采 用动态光散射仪测定利拉鲁肽的流体力学尺寸，称取适量嵌段共聚物Copolymer-Ι和利 拉鲁肽干粉，加入一定量的磷酸盐缓冲溶液，配制成一系列聚合物浓度固定为0. 5wt %，药 物浓度分别为〇、40、500、1000 μ g/mL的溶液，采用动态光散射仪测定上述体系的流体力 学尺寸，结果表明（如图1所示），利拉鲁肽在水溶液中呈现两个流体力学尺寸分布，分别 为7nm和200nm左右的尺寸，分别对应于利拉鲁肽单链和利拉鲁肽自组装形成的胶束，而 Copolymer-I在水溶液中能自组装形成胶束，胶束尺寸大约为40nm，当Copolymer-I与利 拉鲁肽混合之后，两者发生了共组装，表现为在利拉鲁肽的加入下，Copolymer-Ι的强度峰 发生了变化，分裂为约25nm和150nm大小的两个峰，且随着利拉鲁肽浓度从40 μ g/mL增 加至1000 μ g/mL，流体力学尺寸分布并未发生显著变化；动态光散射结果表明利拉鲁肽与 Copolymer-I水凝胶能在水溶液状态下发生共组装行为。
[0119] 实施例26
[0120] 称取IOmg利拉鲁肽干粉，溶解于磷酸盐缓冲溶液中，配制成500 μ g/mL溶液，采 用动态光散射仪测定利拉鲁肽的流体力学尺寸；称取适量嵌段共聚物Copolymer-4和利 拉鲁肽干粉，加入一定量的磷酸盐缓冲溶液，配制成一系列聚合物浓度固定为0. 5wt %，药 物浓度分别为〇、40、500、1000 μ g/mL的溶液，采用动态光散射仪测定上述体系的流体力 学尺寸，结果表明（如图2所示），利拉鲁肽在水溶液中呈现两个流体力学尺寸分布，分别 为7nm和200nm左右的尺寸，分别对应于利拉鲁肽单链和利拉鲁肽自组装形成的胶束，而 Copolymer-4在水溶液中能自组装形成胶束，胶束尺寸大约为50nm，当Copolymer-4与利拉 鲁肽混合之后，两者发生了共组装，表现为在利拉鲁肽加入后与Copolymer-4融合成为一 个单峰，随着利拉鲁肽浓度从40 μ g/mL增加至1000 μ g/mL，流体力学尺寸分布并未发生显 著变化；动态光散射结果表明利拉鲁肽与Copolymer-4水凝胶能在水溶液状态下发生共组 装行为。
[0121] 实施例27
[0122] 取适量实施例10制备的嵌段共聚物溶液，采用旋转流变仪测量聚合物水体系的 模量、粘度等流变学性质随温度的变化，在固定剪切频率（w = lOrad/s)下，以0. 5°C /min 的升温速率进行温度扫描，取适量实施例18制备的热致水凝胶药物制剂，采用旋转流变仪 测量聚合物水体系的模量、粘度等流变学性质随温度的变化，在固定剪切频率（w = IOrad/ s)下，以0. 5°C /min的升温速率进行温度扫描；结果表明（如图3所示），其中，图3(a) 显示，25wt %的Copolymer-I水凝胶溶液在室温下储能模量较小，体系具有很好的流动性， 而在30°C附近储能模量急剧上升，溶液-凝胶的相转变点为32°C，当加入利拉鲁肽之后， 体系相转变后的最大储能模量未发生显著变化，相转变温度也未发生变化；图3(b)显示， 25wt%的Copolymer-Ι水凝胶溶液在室温下具有较小的粘度，在相转变点附近体系粘度急 剧上升，当加入利拉鲁肽之后，体系相转变后的粘度发生显著的增加；流变学性质研究结果 表明，利拉鲁肽的加入引起了 Copolymer-I热致凝胶宏观性质上的变化，也验证了在分子 层面上，利拉鲁肽与聚合物发生了共组装行为。
[0123] 实施例28
[0124] 取适量实施例11制备的嵌段共聚物溶液，采用旋转流变仪测量聚合物水体系的 模量、粘度等流变学性质随温度的变化，在固定剪切频率（w = lOrad/s)下，以0. 5°C /min 的升温速率进行温度扫描，取适量实施例19制备的热致水凝胶药物制剂，采用旋转流变仪 测量聚合物水体系的模量、粘度等流变学性质随温度的变化，在固定剪切频率（w = IOrad/ s)下，以0.5°C/min的升温速率进行温度扫描。结果显示（如图4所示），其中，图4(a) 显示，25wt %的Copolymer-4水凝胶溶液在室温下储能模量较小，体系具有很好的流动性， 而在30°C附近储能模量急剧上升，溶液-凝胶的相转变点为34°C，当加入利拉鲁肽之后， 体系相转变后的最大储能模量未发生显著变化，相转变温度也未发生变化；图4(b)显示， 25wt%的Copolymer-4水凝胶溶液在室温下具有较小的粘度，在相转变点附近体系粘度急 剧上升，当加入利拉鲁肽之后，体系相转变后的粘度发生了显著的增加；流变学性质研究结 果表明，利拉鲁肽的加入引起Copolymer-4热致凝胶宏观性质上的变化，也验证了在分子 层面上，利拉鲁肽与聚合物发生了共组装行为。
[0125] 实施例29
[0126] 取0. 5mL实施例18中制备的热致水凝胶水溶液置于IOmL试管（内径14mm)底部， 于37°C恒温水浴中放置15min使其形成凝胶后，上方加入5mL同温的PBS缓冲溶液（pH = 7. 4)作为释放介质，释放面积为I. 5cm2,放入恒温水浴摇床，水浴摇床转速为50rpm，每天定 时将凝胶上方PBS缓冲液全部置换，并采用HPLC检测释放介质中利拉鲁肽的释放量，平行 操作3份，最后以累计药物释放量对时间作图，制得释放曲线（如图5所示）；
[0127] 采用下述方法测定利拉鲁肽的HPLC :高效液相色谱仪：Waters (e2695_2489)包括 四元栗、紫外检测器、柱温箱、自动进样器和在线脱气机；色谱柱：Phenomenex? C18(5 μπι IOOA 4. 6*150mm)流动相A :0.1 %三氟乙酸水溶液，流动相B :乙腈；采用梯度洗脱在0~ 2〇11^11:流动相4由52%降到48%;2〇1^11~3〇1^11 :流动相4从48%升至52%;检测波长： 220nm，柱温：30°C，流速：1.0mL/min，进样量：50yL ;
[0128] 测定结果显示（（如图5所示），实施例18的热致水凝胶药物制剂对药物具有很好 的缓释效果，降糖药物利拉鲁肽在热致凝胶药物制剂中，首日突释量仅为22. 13%，药物有 效平稳释放长达9天，第9天累计有效释放达87. 64%。
[0129] 实施例30
[0130] 取0. 5mL实施例19中制备的热致水凝胶水溶液置于IOmL试管（内径14mm)底 部，于37°C恒温水浴中放置15min使其形成凝胶后，上方加入5mL同温的PBS缓冲溶液（pH =7. 4)作为释放介质，释放面积为I. 5cm2,放入恒温水浴摇床，水浴摇床转速为50rpm，每 天定时将凝胶上方PBS缓冲液全部置换，并采用上述HPLC检测释放介质中利拉鲁肽的释放 量，平行操作3份，最后以累计药物释放量对时间作图，得到释放曲线（如图6所示），结果 显示，本发明的实施例19的热致水凝胶药物制剂对药物具有很好的缓释效果，降糖药物利 拉鲁肽在热致凝胶药物制剂中，首日突释量仅为16. 46 %，药物有效平稳释放长达9天，第9 天累计有效释放达55. 97%。
[0131] 实施例31
[0132] 取0. 5mL实施例20中制备的热致水凝胶水溶液置于IOmL试管（内径14mm)底部， 于37°C恒温水浴中放置15min使其形成凝胶后，上方加入5mL同温的PBS缓冲溶液（pH = 7. 4)作为释放介质，释放面积为I. 5cm2,放入恒温水浴摇床，水浴摇床转速为50rpm，每天定 时将凝胶上方PBS缓冲液全部置换，并采用上述HPLC检测释放介质中利拉鲁肽的释放量， 平行操作3份，最后以累计药物释放量对时间作图，得到释放曲线（如图7所示），
[0133] 结果显示，本发明的实施例20的热致水凝胶药物制剂对药物具有很好的缓释效 果，降糖药物利拉鲁肽在热致凝胶药物制剂中，首日突释量仅为19. 02%，药物有效平稳释 放长达9天，第9天累计有效释放达69. 66 %。
[0134] 实施例32
[0135] 基于GLP-I类似物降糖多肽具有显著的葡萄糖浓度依赖性降糖的特点，本实施例 中采用ICR小鼠作为动物模型进行糖耐量测定，通过给药后灌胃给予葡萄糖，动态检测动 物血糖变化，考察热致凝胶药物制剂降低血糖的效果和持续时间；
[0136] 采用正常雄性ICR小鼠24只，体重30±2g，实验动物随机分为4组（n = 6):分别 为：Blank组（正常对照组，不注射任何溶液）；NaCl组（空白对照生理盐水组）；S〇luti 〇n 组（阳性对照利拉鲁肽溶液组）；Gel组（利拉鲁肽凝胶组）；
[0137] Solution组：将利拉鲁肽溶于PBS缓冲溶液中，配制成lmg/mL母液，使用前稀释 10倍；
[0138] Gel组：实施例18制得的产品；
[0139] 将各组动物禁食4h(自由饮水），次日尾尖采血（20 μ L)测定血糖，之后皮下注射 给药（7. 5mL/kg)，15min后灌胃给予葡萄糖（3g/10mL/kg)，并于糖负荷30min和60min后尾 尖采血（20 μ L)测定血糖（血糖测定采用葡萄糖氧化酶法，下同），实验结果如图8所示；
[0140] 之后，各组动物分别在给药后第1、2、3、4、5、6、7、8和9天早晨9:00开始禁食（自 由饮水）4h，然后尾尖采血，并灌胃给予葡萄糖（同上），分别在糖负荷后30min、60min尾尖 采血，测定血糖，实验结果如图9至图18所示；
[0141] 于第0~9天早晨测量小鼠体重并记录，结果如图19所示；
[0142] 实验小鼠的口服糖耐量实验结果显示，各组小鼠皮下注射给药15min后灌胃葡萄 糖的血糖随时间的变化，与NaCl组相比，Solution组和Gel组在口服葡萄糖后30min和 60min各个时间点均能显著降低小鼠血糖，由于利拉鲁肽在动物体内半衰期约为12h，在小 鼠体内很快被降解，因此在注射给药次日Solution组小鼠血糖明显上升，与NaCl组小鼠的 血糖未见显著性差异，而Gel组小鼠血糖在注射给药后被有效降低，与NaCl组小鼠血糖呈 显著性差异（P < 〇. 05);连续9天观察各组小鼠每天糖负荷后血糖变化结果显示，相比于 NaCl组，Gel组单次给药后的ICR小鼠血糖在糖负荷后得到有效控制，血糖含量低于NaCl 组（P < 0. 05,有显著性差异），体内降糖作用可持续一周，证实实施例18的产品在体内具 有很好的缓释效果，达到了缓释降糖一周的预期目标，并且体内药效结果同体外释放动力 学结果相一致；各组ICR小鼠在实验期间的体重变化如图18所示，与Blank组和NaCl组相 比，9天内Gel组的ICR小鼠体重明显下降，证实实施例18的产品具有减轻体重的功效，且 动物实验期间小鼠无任何不良反应，由此证明了本发明的热致凝胶药物制剂的安全性好。
【主权项】
1. 一种热致水凝胶降糖药物制剂，其特征在于，含有药物和可注射的聚合物热致水凝 胶； 所述的药物为降糖多肽； 所述的热致水凝胶由两亲性嵌段聚合物和溶媒组成，其中两亲性嵌段共聚物的亲水嵌 段为聚乙二醇（PEG)，疏水嵌段为可降解聚酯或聚氨基酸；所述的热致水凝胶其凝胶体系 在室温或低温下处于溶液状态，在人体温度下自发转变为凝胶。2. 根据权利要求1所述的热致水凝胶降糖药物制剂，其特征在于，所述聚合物热致水 凝胶其聚合物水体系的溶胶-凝胶转变温度介于4-40°C之间。3. 根据权利要求1所述的热致水凝胶降糖药物制剂，其特征在于，所述的两亲性嵌段 共聚物中： 1) 亲水性的聚乙二醇嵌段A的平均分子量为400-8000,含量为10-90wt% ; 2) 疏水性的聚酯嵌段或聚氨基酸嵌段B的平均分子量为500-40000,含量为 90-10wt% ； 其中，疏水聚酯嵌段选自聚DL-丙交酯、聚D-丙交酯、聚L-丙交酯、聚乙交酯、 聚原酸酯、聚ε-己内酯、聚ε-烷基取代己内酯、聚δ-戊内酯、聚1，4,8_三氧杂螺 [4. 6] -9-十一烷酮、聚对二氧六环酮、聚酰胺酯、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、聚醚酯或上述各聚 酯中的两种以上的聚酯形成的共聚物； 其中，疏水性的聚氨基酸嵌段选自聚丙氨酸、聚苯丙氨酸、聚亮氨酸、聚赖氨酸、聚谷氨 酸、聚天冬氨酸或上述各聚氨基酸中的两种以上的聚氨基酸形成的共聚物； 3) 所述嵌段共聚物为ΑΒΑ或ΒΑΒ型的三嵌段共聚物、ΑΒ型的两嵌段共聚物、A-g-B或 B-g-A型的接枝共聚物、（A-B)j (B-A) "的星形嵌段共聚物以及A(BA) n构型的 多嵌段共聚物，其中η为2至10的整数； 4) 所述嵌段聚合物部分或全部末端接有功能端基，端基是亲水的羟基、氨基、羧基、咪 唑基、醛基、氰基、硝基中的任何一种；或者是疏水的烷基、固醇、烷氧基、芳香基、芳杂环基、 酰胺酯基、卤素原子、三氯甲基、酯基、巯基中的任何一种。4. 根据权利要求1所述的热致水凝胶降糖药物制剂，其特征在于，所述聚合物为单一 的两亲性嵌段共聚物，或为两种或两种以上不同分子结构的两亲性嵌段共聚物的组合物。5. 根据权利要求1所述的热致水凝胶降糖药物制剂，其特征在于，所述的降糖多肽选 自利拉鲁肽，阿必鲁肽，利司那肽，杜拉鲁肽，索玛鲁肽中的一种或多种。6. 根据权利要求1所述的热致水凝胶降糖药物制剂，其特征在于，所述的药物的含量 占热致水凝胶药物制剂的0. 01~5%。7. 根据权利要求1所述的热致水凝胶降糖药物制剂，其特征在于，所述聚合物在制剂 中的含量为3-50wt%。8. 根据权利要求1所述的热致水凝胶降糖药物制剂，其特征在于，所述聚合物溶液中 的溶媒是纯水、生理盐水、缓冲溶液、组织培养液、细胞培养液、动植物或人体的体液、或者 为其它水溶液和不以有机溶剂为主体的介质。9. 一种根据权利要求1-8所述的热致水凝胶降糖药物制剂的制备方法，其特征在于， 其包括：首先在低温溶解聚合物于水溶液中，然后在_20°C或以下储存备用，使用前复溶并 直接加入所述的降糖多肽，混匀后制成为溶液注射剂； 所制备的药物制剂在温度高于溶胶-凝胶转变温度时形成热可逆水凝胶； 所述低温指低于聚合物的溶胶-凝胶转变温度。10.根据权利要求1所述的热致水凝胶降糖药物制剂，其特征在于，采用皮下或肌肉组 织注射方式使用。
【文档编号】A61K38/26GK105982845SQ201510087571
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月17日
【发明人】俞麟, 陈奕沛, 丁建东
【申请人】复旦大学