专利名称：一种微藻油脂膜基原位萃取的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程和生物能源领域，尤其涉及一种将微藻培养、膜技术和微藻油脂萃取技术整合而成的微藻油脂提取方法。
背景技术：
生物柴油是生物能源的重要产品，但因原料不足使产业发展受到严重制约。在制备生物柴油的原料中(油料作物、林木及产油微藻)，微藻生长快，油脂含量高，是一种极具前景的生物柴油大宗原料。目前微藻生产生物柴油的瓶颈问题在于成本过高，导致其经济性得不到保障，特别是微藻油脂提取约占生物柴油成本的50%。常规微藻油脂提取技术包括有机溶剂萃取法、超临界流体萃取、热裂解等，这些方法要求藻体为干燥粉末，而藻液中干物质含量通常低于1 %，浓缩干燥的预处理不仅延长生物柴油生产周期，还影响油脂提取效率。原位萃取法是指建立生物相容性有机溶剂与藻液共混的两相体系，使藻体油脂不断萃取至溶剂相，规避藻体脱水干燥处理步骤，实现油脂在线提取和提高产量的双重目标。目前对微藻油脂的提取方法主要有有机溶剂萃取、超临界和亚临界流体萃取等方法。例如双溶剂体系萃取(Mixing co-solvent extraction)是指由一种极性溶剂与一种非极性溶剂组成单相体系提取藻体油脂。Bligh和Dyer于1959年(Bligh EG, Dyer WJ. A rapid method of total lipid extractionand purification “——禾中总月旨^ !禾口纯化方法”.Canadian Journal ofBiochemistry and Physiology《加拿大生物化学与生理学杂志》，1959，37 (8) :911-917)提出的甲醇/氯仿体系仍是最常用的微藻油脂提取方法。基于“相似相溶”原理，藻体与甲醇/氯仿混合溶剂充分接触，极性溶剂甲醇与细胞膜的极性脂结合，从而破坏脂质与蛋白质分子间的氢键和静电作用，使非极性溶剂氯仿进入细胞并溶解胞内疏水的中性脂成分，充分萃取后在体系中加入水，甲醇即溶于水相而与含油脂的氯仿相分层，氯仿挥发后得到粗脂提取物。然而因氯仿有神经致毒作用，一些低毒双溶剂体系也尝试用于油脂提取，例如正己烷/异丙醇，DMSO/石油醚，正己烷/乙醇等。1996 ip,Richter ^ (Richter BE,Jones ΒΑ,Ezzell JL,Porter NL. Accelerated solvent extraction :a technique for sample preparation "力口速溶剂萃取——禾中样品制备技术”.Analytical Chemistry《分析化学》，1996，68 (6) :1033-1039)提出快速溶剂提取法(Accelerated solvent extraction, ASE)，这是一种在较高温度(50 200°C )和较大压力(10. 3 20. 6MPa)条件下用溶剂萃取固体或半固体样品的处理方法。该方法用于萃取微藻油脂的原理是，高温高压有助于增加传质速率使溶剂快速渗入藻细胞，同时降低溶剂介电常数使其极性接近油脂，从而提高溶剂的萃取效率，常用溶剂体系有甲醇/氯仿， 异丙醇/正己烷等。与双溶剂萃取法相比，ASE法具有作用时间短(5 IOmin)，溶剂消耗量少，油脂提取率高的优点。例如，传统的i^olch方法(氯仿/甲醇，2 lv/v))对绿藻 Rhizoclonium hieroglyphicum的油脂提取率为44 55%，而用等量溶剂在压力10. 3MPa, 120°C时仅提取5min即可达到85 95%的油脂提取率。
超临界流体萃取(Supercritical fluid extraction)是一种新兴的提取技术， 它是指超出临界温度和压力时，流体介于气态和液态之间，同时具有气体的扩散传质性能和液体的溶解性能，对藻体油脂的提取效率远高于普通的有机溶剂。(X)2由于临界条件温和(压力7. 4MPa,温度31. 1 V )、无毒、化学惰性等优势，使用最为广泛，此外甲醇、乙醇、水、二氧化氮、六氟化硫等使用也有所报道。超临界CO2萃取(Supercritical carbon dioxideextraction, SCCO2)微藻油脂的作用条件为40 50°C，24. 1 37. 9MPa，提取后油脂溶解在超临界液态(X)2中，回收时只需控制温度和压力使(X)2恢复气态即可分离油脂。超临界萃取是环境友好的绿色提取技术，但是因涉及到温度和压力控制，使得处理工艺能耗高，经济性较差，不适于大宗化学品的提取。亚临界水萃取(Subcritical water extraction, SffE)是指水在略低于临界温度时其极性降低，因此具有类似有机溶剂的性质，对油脂的溶解性也大大提高，同时利用高压使水维持在液态，高温促使水快速进入细胞，使胞内脂质萃取至水相，当体系冷却至室温时，水的极性升高，溶解在水相的油脂与水迅速分层便于收集。此外，亚临界乙醇也可用来于萃取色素，如Haematococcus pluvialis禾口 Dunaliella salina中的古月萝卜素。该方法的优势在于可以对藻液直接处理，在体系中无需加入有机溶剂，但是因温度压力等高能耗步骤的存在，此法工业应用也有所限制。上述微藻油脂不同提取方法包括藻体干燥、高温高压控制等高能耗处理步骤。目前藻体干燥主要方法有日光晾晒法、喷雾干燥和冷冻干燥等，处理大量藻体时，以晾晒法最具经济性，但对摊晒面积和时间有一定要求，因此在干燥，温度压力控制等环节的技术改进能有效降低油脂提取能耗。膜技术的研究自80年代初开展以来，己经成为新型分离技术研究领域的重要组成部分。基于微孔膜的分散萃取过程兼具膜技术与萃取过程的优点，膜介质本身对待处理的混合物无分离作用，主要利用膜的多孔性，亲水性或疏水性，为两相传递提供较大而稳定的相接触面，可克服常规分离中的液泛、返混等影响，近十年来深受关注。利用中空纤维膜促进有机溶剂在藻液中的分散效果，同时使微藻培养和油脂提取过程偶联，是实现微藻油脂连续合成及在线萃取的新方法。
发明内容
本发明结合微孔膜技术，使生物相容性萃取溶剂均勻分散至藻液，促进溶剂对微藻油脂的萃取效率，提出了一种全新的微藻连续培养及油脂原位萃取的集成技术。一种微藻油脂膜基原位萃取的方法，包括以下步骤(1)微藻连续培养将产油藻种在适宜培养基中培养至生长稳定期，产油藻种的细胞内逐渐积累油脂；(2)原位萃取油脂将积累油脂后的藻液输入萃取体系，同时输入萃取溶剂，利用原位萃取法建立萃取溶剂与藻液共混的两相体系，藻体油脂不断萃取至溶剂相；萃取溶剂与藻液逐渐分层，上层萃取溶剂循环使用，下层藻液循环至连续培养步骤；通过调节萃取溶剂与藻液泵入泵出萃取模块的流速，保持萃取体系内萃取溶剂的体积比例不超过总体积的 10%。(3)实时检测萃取溶剂中的油脂含量，若油脂浓度无显著增加，则油脂萃取趋于饱和，移除油脂饱和的萃取溶剂，加入新的萃取溶剂。作为一种优选方案，在所述的萃取体系内设置一中空纤维膜组件，藻液沿中空纤维膜组件的壳层流动，萃取溶剂进入末端封死的中空纤维膜管内，再通过中空纤维膜管壁的微孔分散成微小液滴进入壳程的藻液，并与藻液充分混合，使藻体油脂不断萃取至溶剂相。所述的萃取溶剂为生物相容性有机溶剂，一般为log P >5. 5的疏水性有机溶剂， 其中特别以碳链长度为C12 C16的烷烃类溶剂生物相容性良好。本发明中膜分散原位萃取微藻油脂的方法兼具膜技术与萃取过程的优点，是新的高效传质过程，具有以下主要特点及优点(1)萃取溶剂通过膜微孔以极微小的液滴形态分散进入藻液中，萃取溶剂与藻液充分混合，显著提高萃取效率。( 该方法无需破碎微藻细胞，微藻培养可以连续进行。产油藻种选用耐有机溶剂的藻种时，由于微藻细胞和有机溶剂具有较好的亲和性，则有机溶剂在用膜分散进行油脂原位萃取的过程中，微藻活性几乎不受影响。(3)当控制微藻培养处于稳定期内，此时微藻油脂合成旺盛，可以实现微藻生长和油脂提取的同时进行，油脂进行在线原位提取。该方法可以突破微藻采收、干燥、破碎和提取的冗长工艺，从而显著降低生产成本。
图1为用于实现本发明方法的实施例1使用的膜分散有机溶剂萃取装置的示意图，图示说明①萃取溶剂储液罐②萃取层③死端中空纤维膜组件④藻液储瓶⑤气升式光生物反应器⑥蠕动泵⑦空气压缩泵。图2为本发明实施例1中藻液及萃取剂中油脂含量随时间变化结果。图3为本发明实施例1中膜分散有机溶剂萃取Botryococcus braunii油脂的细胞活性变化趋势。
具体实施例方式实施例1 (1)在容积为7L的气升式光生物反应器⑤中培养产油藻Botryococcus braunii, BGll培养基(淡水藻通用培养基)，在25士 1°C，连续光照(光强池lux)条件下培养3周
至稳定期。(2)气升式光生物反应器⑤内藻液经蠕动泵通入死端PES中空纤维膜组件③的壳层，藻液体积控制为400ml。Botryococcus braunii生物相容性溶剂十四烷以10ml mirT1 的流量通入死端(膜纤维一端封死的组件)PES中空纤维膜组件③的管层，十四烷通过PES 膜孔分散成微小液滴进入藻液，密集的溶剂液滴因密度较小逐渐上浮，在上升过程中与藻细胞充分接触并萃取藻体油脂。萃取层中的十四烷溶剂与藻液分层，上层的溶剂相通过蠕动泵以10ml mirT1的流量抽回入有机溶剂储液罐①进行循环使用，为降低溶剂的细胞毒性，保持萃取层内的溶剂体积比不超过总体积的10%。
(3)萃取过程中检测溶剂相的油脂含量，若油脂浓度无显著增加，则油脂萃取趋于饱和，移除油脂饱和的萃取溶剂，加入新的萃取溶剂维持一定的油脂提取率。对比例除步骤O)中的萃取剂十四烷是直接泵入藻液当中、不通过膜组件外，其余与实施例1相同。油脂含量测定部分的具体的操作方式为胞内油脂含量的测定藻液按比例稀释并用紫外分光光度计(GS-54，上海棱光)测定其在680nm处吸光度，0D680保持在0. 5左右，取稀释藻液3ml加入3 μ 1的尼罗红染液(浓度Img πιΓ1，溶剂丙酮)，于37°C水浴中避光染色lOmin，荧光分光光度计(F96-PR0，上海棱光)测定其荧光强度，激发波长480nm，发散波长580nm，增益10档。荧光强度/0D680代入下式计算藻体油
脂含量。Y = O. 16X+12. 49 (X 荧光强度，Y 油脂含量％ )有机溶剂(十四烷)中油脂含量测定以十四烷(Aladdin，USA)为溶剂，三油精triolein (Aladdin，USA)为标准品配制不同浓度溶液，各取3!111分别加入5 4 1的尼罗红染液(lmgml-1，溶于丙酮)，于37°C水浴中避光染色lOmin，用荧光分光光度计测定其荧光强度，激发波长480nm，发散波长570nm，增益1档，得到标准曲线对应方程如下Y = O. 06X+30. 07 (Y 荧光强度，X 油脂浓度 mg L-1)测定萃取后十四烷中的油脂含量时，取3ml十四烷加入5μ1的尼罗红染液(Img πιΓ1，溶于丙酮)，于37°C水浴中避光染色lOmin，用荧光分光光度计测定其荧光强度，激发波长480nm，发散波长570nm，增益1档。将测得的数据代入标准曲线方程，即可求得其油脂浓度。流式细胞仪测定细胞存活率双醋酸荧光素(FDA)作为活细胞荧光染料用于表征油脂萃取过程中的细胞存活率。当活性细胞具有完整细胞膜时，FDA水解的荧光素会不断在细胞内积累，使细胞在蓝色激发光下发出绿色荧光。当细胞膜受损，细胞失去活性时，FDA水解的荧光素无法在细胞内累积，而使细胞无法发出荧光。活性高的细胞发出强烈的绿色荧光，活性弱的细胞发光较弱。当荧光物质充满整个细胞时，会使细胞发出亮绿色。Botryococcus braunii藻液经300目细胞筛去除杂质和细胞团块，取Iml藻液离心弃上清，PBS缓冲液(phosphate buffered saline)清洗藻体三次，取适量PBS缓冲液悬浮藻体使藻细胞密度不小于IO6个πιΓ1，加入FDA (Sigma，USA)终浓度为IOOyg πιΓ1室温下避光染色7min，流式细胞仪分析(Beckman FC 500MCL，USA)，流速100-400细胞sec—1，数据采集时总细胞数大于1000，或者时间大于2min，测试完成后，保存分析结果并作图。如图2所示为萃取过程中有机溶剂相与Botryococcus braunii胞内油脂含量的变化(藻液400ml，十四烷40ml，藻液和有机溶剂循环速度均为10ml mirT1)，实验结果显示， 实施例1萃取进行2天后萃取剂十四烷中油脂浓度已经达到最大值520mg L—1，对油脂的提取率达到了 50. 15%,而对照组提取率为38. 05%。2天之后十四烷中油脂含量变化不大，而藻液中油脂含量逐渐恢复。从实验结果分析可以得出，膜孔分散能有效促进溶剂与藻液的混合，增加了藻体与溶剂的接触面积，提高了油脂提取率。 如图3所示为膜鼓泡有机溶剂萃取葡萄藻油脂细胞活性检测(IOOugmr1FDA染色 IOmin, C2象限为FDA染色的活细胞区。实施例1中流式细胞仪检测原位萃取过程中， 细胞存活率保持在90%以上，结果说明在体系中引入PES有机膜对细胞活性无影响，适用于油脂的连续萃取过程。
权利要求
1.一种微藻油脂膜基原位萃取的方法，包括以下步骤(1)微藻连续培养将产油藻种在培养基中培养至生长稳定期，产油藻种的细胞内逐渐积累油脂；(2)原位萃取油脂将经连续培养积累油脂后的藻液输入萃取体系，同时输入萃取溶剂与藻液共混形成两相体系，藻体油脂不断萃取至溶剂相；萃取溶剂与藻液逐渐分层，上层萃取溶剂循环使用，下层藻液循环至连续培养步骤；(3)实时检测萃取溶剂中的油脂含量，若油脂浓度无显著增加，则油脂萃取趋于饱和， 移除油脂饱和的萃取溶剂，加入新的萃取溶剂。
2.如权利要求1所述的微藻油脂膜原位萃取的方法，其特征在于所述的产油藻种为耐有机溶剂的藻种。
3.如权利要求1所述的微藻油脂膜原位萃取的方法，其特征在于所述的溶剂为生物相容性有机溶剂。
4.如权利要求3所述的微藻油脂膜原位萃取的方法，其特征在于所述的生物相容性有机溶剂为疏水值IogP > 5. 5的烷烃类。
5.如权利要求4所述的微藻油脂膜原位萃取的方法，其特征在于其所述的生物相容性有机溶剂为C12 C16的烷烃类溶剂。
6.如权利要求1所述的微藻油脂膜原位萃取的方法，其特征在于所述的萃取体系内含有的溶剂体积不超过总体积的10%。
全文摘要
本发明公开了一种微藻油脂膜基原位萃取的方法，将产油藻种在适宜培养基中培养至生长稳定期，积累油脂后的藻液输入萃取层，利用原位萃取法建立萃取溶剂与藻液共混的两相体系，使藻体油脂不断萃取至溶剂相，萃取溶剂与藻液逐渐分层澄清，上层有机溶剂循环使用，萃取层内的藻液循环回连续培养步骤。本发明将微藻连续培养技术、膜技术与微藻油脂提取技术相结合，提出了一种微藻油脂原位萃取的集成化方法，规避了收集、干燥和破碎微藻细胞等流程，与常规的微藻油脂提取技术相比，本发明工艺具有程简单、油脂提取率高、过程成本低、环境友好等特点。
文档编号C11B1/10GK102505026SQ201110350428
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月8日 优先权日2011年11月8日
发明者周成, 张芳, 徐新华, 程丽华, 陈欢林 申请人:浙江大学