专利名称：一种赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)GY32及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种赖氨酸芽孢杆菌(Lysinikicillus sp.)GY32及其在降解十溴联苯醚中的应用。
背景技术：
多溴联苯醚(polybrominateddiphenyl ethers, PBDEs)是一种持久性有机污染物，因具有优良的阻燃性能而被广泛应用于电子电器产品中。近年来随着电子电器行业的迅猛发展，大量电子垃圾的无序拆解，具有生态生理毒性和生物积蓄毒性的PBDh释放到水体土壤环境中，对生态环境和生物体健康都造成了严重的影响和危害。面对多溴联苯醚污染造成的生态环境问题，人们积极探索各种解决方法。合适的微生物处理法可以实现污染物的彻底无毒化，是较为理想的污染物处理途径。具有多溴联苯醚降解功能的微生物的获得无疑给这些污染问题的解决带来了曙光。Lysinibacillus属是2007年从Bacillus属分离出来的新属，仅有三个分类种。 该属的菌种革兰氏染色阳性，能形成椭圆或圆形芽孢。氧化酶和过氧化氢酶试验阳性，硝酸盐还原、产H2S和吲哚试验阴性。主要脂肪酸类型为is0-C15:Q，主要醌型为MK-7，细胞壁肽聚糖含 Lys 和 Asp，DNA 中(G+C)mol%为；35_38%。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)GY32，该菌于2011年9月7日保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO =M 2011307。本发明的赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp. )GY32是通过对广东汕头某电子垃圾集中处理区的河床底泥进行富集培养、分离、纯化，得到Lysinikicillus属的一个新种。赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp. )GY32的形态学和生理生化特征该菌24h平板培养物菌落圆形、乳黄色，突出培养基，不透明，边缘有一圈半透明刺突状，直径2-3mm，放大12倍观察菌落呈半圆结晶状。菌体革兰氏阳性，能形成椭圆或圆形芽孢，周生鞭毛。对数生长期及稳定期前期会呈现出宽0. 8-1. 34 μ m、长大于29. 87 μ m长线状或大于5 μ m的长杆状菌体形态，至今尚未发现其他多溴联苯醚降解微生物具有如此特殊的形态特征，24h后与普通杆状细胞无明显差异。氧化酶和过氧化氢酶阳性，V-P试验阴性。该菌能在好氧和兼性厌氧条件下生长，生长PH6. 0 9. 0，生长温度15 45°C。赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp. )GY32的分子分类学地位按照常规方法提取赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp. )GY32的总DNA。采用 16S rRNA通用引物27F和1492R扩增其16S rRNA基因，将PCR产物直接测序，获得16S rRNA基因序列，其序列如SEQ ID NO. 1所示。将该序列与NCBI的GenBank中序列进行比对，进行BLAST分析，结果发现赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)GY32的16S rRNA基因序列与Lysinikicillus属的已有模式菌株具有较高的相似性，其中与Lysinikicillus sphaericus的序列相似性为98%。再扩增其gyrB基因，将PCR产物直接测序，获得gyrB 基因序列，其序列如SEQ ID NO. 2所示，经BLAST分析，与其相似性最大的已公开发表序列为Lysinikicillussphaericus C3-41，但相似度仅为81 %，文献资料显示同一菌种的gyrB 基因序列的同源性应大于95%。综合上述形态学、生理生化特征和分子分类学结果，认为赖氨酸芽孢杆菌 (Lysinibacillussp.)GY32属于Lysinikicillus属的一个新种，定名为赖氨酸芽孢杆菌 (Lysinibacillus sp. )GY32，于2011年9月7日保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)， 地址中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO =M 2011307。经实验发现，本发明的赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp. )GY32具有降解多溴联苯醚BDE209的能力。因此本发明的第二个目的是提供赖氨酸芽孢杆菌(Lysinikicillus sp.)GY32在降解多溴联苯醚BDE209中的应用。本发明提供了一种具有降解多溴联苯醚BDE209能力的新种赖氨酸芽孢杆菌 (Lysinibacillus sp.)GY32，为多溴联苯醚BDE209的治理提供了降解菌。本发明的赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp. )GY32于2011年9月7日保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO =M 2011307。
图1是赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)GY325小时培养物的普通光学显微镜照片(1000X)；图2是赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp. )GY3223小时培养物的透射电镜照片。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。一、赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)GY32的分离和鉴定实施例1 取20g广东汕头某电子垃圾集中处理区的河床底泥，加入SOmL无菌水搅勻打散后，过筛去掉植物残渣及大颗粒物；滤液再经过2000X g，常温，离心2min，去掉小颗粒物； 得到的上清液经过6000X g，常温，离心lOmin，收集沉淀物；沉淀物加入SOmL无菌水，洗涤、离心处理三次。最后获得的沉淀物作为种源，接种到无机盐培养基中(Na2HP045. 7mM， KH2P043. 3mM, NH4Cl 18. OmM,酵母抽提物lg/L，琥珀酸钠20mM，甲酸钠20mM，乳酸钠20mM， 微量元素和维生素，微量元素1.01mmol/L MgS04、0. 5g/L MnS04、0. lg/L ZnS04、0. Olg/ LCuSO4,0. Olg/L AlK(SO4)2U. Og/L NaCl、0. lg/L FeCl2、0. lg/L CaCl2 禾口 CoCl2O. lg/L。维生素2mg/L生物素、2mg/L叶酸、lOmg/L维生素B6、5mg/L维生素B2、5mg/L维生素Bl、5mg/ L烟酸、5mg/L泛酸、0. lmg/L维生素B12、5mg/L对氨基苯甲酸和5mg/L硫辛酸《参考文献 Wolin et al.，1963》)，培养基中同时加入1 μ mol/L BDE209。固体培养基中加入20g/L琼脂。培养物置于30°C静置避光培养，每月经过6000 X g，常温，离心lOmin，收集沉淀物，重新转入新的培养基进行培养。连续培养6个月以后，将富集培养物在固体培养基上划线培养， 得到单菌落。由此获得菌株GY32。将菌株GY32进行形态学和生理生化鉴定，其形态学和生理生化特征如下该菌24h平板培养物菌落圆形、乳黄色，突出培养基，不透明，边缘有一圈半透明刺突状，直径2-3mm，放大12倍观察菌落呈半圆结晶状。菌体革兰氏阳性，能形成椭圆或圆形芽孢，周生鞭毛。对数生长期及稳定期前期会呈现出宽0. 8-1. 34 μ m、长大于29. 87 μ m长线状或大于5 μ m的长杆状菌体形态，至今尚未发现其他多溴联苯醚降解微生物具有如此特殊的形态特征，24h后与普通杆状细胞无明显差异。氧化酶和过氧化氢酶阳性，V-P试验阴性。该菌能在好氧和兼性厌氧条件下生长，生长PH6. O 9. 0，生长温度15 45°C。按照常规方法提取菌株GY32的总DNA。采用16S rRNA通用引物27F和1492R扩增其16S rRNA基因，引物27F :5，AGAGTTTGATCATGGCTCAG 3'1492R 5' GGTACCTTGTTACGACTT 3'选择如下PCR 反应体系和 PCR 反应程序=IOxbuffer 5 μ L，dNTP 1 μ L，27F 1 μ L， 1492R 1 μ L, DNA 模板 0. 5 μ L，Taq 酶 0. 5 μ L，去离子水 41 μ L, 94 "C 5min, 94 "C lmin, 57°C lmin，72°C 2min，72°C lOmin，34 个反应循环扩增其 16S rRNA 基因。将PCR产物直接测序，获得的16S rRNA基因序列，其序列如SEQ ID NO. 1所示。将该序列与NCBI的GenBank中序列进行比对，进行BLAST分析，结果发现菌株GY32 的16SrRNA基因序列与Lysinikicillus属的已有模式菌株具有较高的相似性，其中与 Lysinibacillussphaericus 的序列相似性为 98%。采用引物UP-I 5‘ GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA3 ‘；UP-2r :5，AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT3 ‘，并选择如下 PCR 反应体系和 PCR 反应程序IOx buffer 5 μ L, dNTP 1 μ L, UP-I 1 μ L, UP-2r 1 μ L, DNA 模板 1 μ L，Taq 酶 0· 5 μ L,去离子水 40. 5 μ L, 94°C 3min, 94°C lmin, 60°C lmin, 72°C 2min, 72°C 10min,34个反应循环扩增其gyrB基因，将PCR产物直接测序，获得的gyrB基因序列，其序列如SEQ ID NO. 2所示，经BLAST分析，与其相似性最大的已公开发表序列为 Lysinibacillus sphaericus C3-41，但相似度仅为81 %，文献资料显示同一菌种的gyrB基因序列的同源性应大于95 %。综合上述形态学、生理生化特征和分子分类学结果，认为菌株GY32属于 Lysinibacillus属的一个新种，定名为赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp. )GY32，于 2011年9月7日保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉市武汉大学，保藏编号为 CCTCC NO :M 2011307。二、赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)GY32 降解 BDE209实施例2 赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp. )GY32兼性厌氧条件下对 5 μ mol/LBDE209脱溴降解实验。培养体系组成5.7mmol/L Na2HPO4. 12H20, 3. 3mmol/LKH2PO4,18. Ommol/LNH4C1, 20mmol/L 甲酸钠，20mmol/L 乳酸钠，40mmol/L 琥珀酸钠，0. 1 %酵母汁，5 μ mol/L BDE209, 余量为水，PH7.0。将赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.) GY32菌液按5 %的接种量接入上述培养体系，避光摇床培养21d后，用离子色谱仪DIONEX ICS-1500测定BDE209 脱溴量。培养体系中检测到的溴离子浓度平均达351. 9 μ g/L，由此说明赖氨酸芽孢杆菌 (Lysinibacillussp. )GY32 具有降解 BDE209 的能力。实施例3 赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp. )GY32厌氧条件下对5 μ mol/ LBDE209脱溴降解实验。培养体系组成5.7mmol/L Na2HP0412H20, 3. 3mmol/L KH2PO4,18. Ommol/L NH4Cl, 20mmol/L 甲酸钠，20mmol/L 乳酸钠，40mmol/L 琥珀酸钠，0. 1 %酵母汁，5 μ mol/L BDE209, 余量为水，PH7.0。将赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)GY32菌液按5%的接种量接入上述培养体系，铝盖封口，避光静置培养21d后，用离子色谱仪DIONEX ICS-1500测定 BDE209脱溴量。培养体系中检测到的溴离子浓度平均达观.7μ g/L，由此说明赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)GY32 具有降解 BDE209 的能力。实施例4 赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp. )GY32在兼性厌氧条件下对 5. 49mg/LBDE209脱溴降解实验。培养体系组成5.7mmol/L Na2HPO4. 12Η20，3· 3mmol/L KH2PO4,18. Ommo 1/L NH4Cl, 20mmol/L 甲酸钠，20mmol/L 乳酸钠，40mmol/L 琥珀酸钠，0. 1 %酵母汁，5. 49mg/L BDE209, 余量为水，PH7. 0。将赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.) GY32菌液按5%的接种量接入上述培养体系，避光摇床培养，每隔4d在无菌条件下从培养体系取出4mL培养液，同时补加等量新鲜培养基进入体系中，20d后用二氯甲烷萃取所有培养液中的BDE209，二氯甲烷和培养液的体积比约1 2，经离心后收集含BDE209的有机相，浓缩，定容至1. 5mL，0. 22 μ m 有机相膜过滤后进行HPLC测定，培养体系中BDE209降解率达37. 2%。由此说明赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)GY32具有降解BDE209的能力实施例5 赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp. )GY32在厌氧条件下对2. 74mg/ LBDE209脱溴降解实验。培养体系组成5.7mmol/L Na2HPO4. 12Η20，3· 3mmol/L KH2PO4,18. Ommo 1/L NH4Cl, 20mmol/L 甲酸钠，20mmol/L 乳酸钠，40mmol/L 琥珀酸钠，0. 酵母汁，2. 74mg/L BDE209, 余量为水，PH7.0。将赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp. )GY32菌液按5%的接种量接入上述培养体系，铝盖封口，避光静置培养，每隔4d在无菌条件下从培养体系取出4mL培养液，同时补加等量新鲜培养基进入体系中，20d后用二氯甲烷萃取所有培养液中的BDE209， 二氯甲烷和培养液的体积比约1 2，经离心后收集含BDE209的有机相，浓缩，定容至 1. 5mL，0. 22 μ m有机相膜过滤后进行HPLC测定，培养体系中BDE209降解率达43. 0%，由此说明赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)GY32具有降解BDE209的能力。上述试验表明，赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)GY32能降解BDE209，具有十溴联苯醚脱溴能力，为环境中多溴联苯醚的处理提供了新型的降解微生物。
权利要求
1.一种赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)GY32，其保藏编号为CCTCC NO =M 2011307。
2.权利要求1所述的赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussp.)GY32在降解多溴联苯醚 BDE209中的应用。
全文摘要
本发明公开一种赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)GY32及其应用。该菌于2011年9月7日保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NOM 2011307。本发明提供了一种具有降解多溴联苯醚BDE209能力的新种赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)GY32，为多溴联苯醚BDE209的治理提供了降解菌。
文档编号A62D3/02GK102363756SQ20111030090
公开日2012年2月29日 申请日期2011年10月8日 优先权日2011年10月8日
发明者孙国萍, 朱春节, 许玫英, 郭俊, 陈杏娟 申请人:佛山市环保技术与装备研发专业中心, 广东省微生物研究所