专利名称：一株苯酚降解真菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于环境微生物领域，具体的是涉及一株苯酚降解真菌，该菌株可在 PH5. 0-8. 0，温度10°C -40°C的条件下，对苯酚进行生物降解。
背景技术：
苯酚做为防腐剂在油漆、皮革和纺织品工业中广泛地使用，同时也用在酚树脂、消毒剂、药物，己内酰胺和双酚A的生产中(Rana Kidak et al. Ultrasonics Sonochemistry. 2006, 13:195-199)。水环境中存在的苯酚能对水生生物造成重大危害， 5 to 25 mgL-1的低浓度苯酚至对鱼来说，都是致死的(P. R. Gogate, et al. Environ. Res. 8 (2004) 501 - 551. ) ;Kumar等报道，苯酚对人类具有致癌作用，所以，含苯酚的废水必须处理才能排放。同理化处理方法相比，生物法处理苯酚因其成本低，无二次污染而更具优势，苯酚生物降解是由细菌、真菌、放线菌等微生物活动的结果。目前的研究多集中于细菌，而真菌对苯酚的生物降解报道的较少，已发现能降解苯酚的真菌有镰孢霉属 Fusarium floccieferum (Anselmo et al. Water Sci Technol 1992,25161 - 168),烟曲霉Aspergillus fumigatus (Jones et al. Arch Microbiol 1995，163:176 - 181)，粘束孢属 Graphium sp. (Santos et al. J Basic Microbiol. 2003,43:238 - 248)，皮肤毛孢子菌 trichosporon cutaneumhave (Gaal A et al. Arch Microbiol. 1981, 130 54 - 58 and Godjevargova T et al. Process Biochem . 2003, 38:915 - 20),青霉属Penicillium sp. (Leitao. Int J Environ Res Public Health .2009, 6:1393 - 1417. Sumaya Ferreira Guedes et al. Biodegradation. 2011，22:409 - 419)，多变拟青霉 Paecilomyces variotii (Wang et al. J Hazard Mater. 2010, 183:366 - 371),热带酵母 Candida tropicalis(Jiang Y et al. Biochem Eng J. 2005, 24:243 - 247),丝状真菌filamentous fungi (Santos V L & Linardi V R. Process Biochem. 2004，39:1001—1006)，白腐菌 white rot fungi (Sanin S. et al. Bull Environ. Contam Toxicol. 2005, 75:466 - 473),这些真菌已被证实具有苯酚降解的潜力。真菌较细菌具有更强的环境耐受力，可以在更宽的温度、PH及更为苛刻的条件下生长繁殖，因而受到越来越多的关注。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术而筛选一株苯酚降解真菌，并提供该苯酚降解真菌在苯酚生物降解中的应用。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是一株苯酚降解真菌，其特征在于该真菌菌株为黄曲霉(Aspergillus真菌菌株PHDE-4，已于2011年8月31号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 5189 ；其生物学特性真菌株PHDE-4在普通PDA培养基生长的菌落为凸起呈圆形、黄绿色，菌落大、质地紧密， 表面干而粗糙，边缘清晰，在以苯酚为唯一碳源的筛选培养基中生长的菌落为成片凸起，呈浅咖啡色，菌落较小、薄而疏松，表面干而粗糙，边缘清晰；菌株PHDE-4的显微结构如下分生孢子呈圆形，黄绿色，带有双层小梗的分生孢子头，分生孢子梗单生，直立，无横隔，淡褐色；菌株PHDE-4在PDA培养基和筛选培养基上的显微结构有差异，在筛选培养基上由于苯酚的抑制作用，孢子和孢子头明显变小，菌丝变细。按上述方案，所述的苯酚降解真菌，其rDNA的ITS全序列含608bp，具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。本发明的另外一个目的是提供苯酚降解真菌在有氧降解苯酚中的应用。按上述方案，在pH5. 0-8. 0条件下对苯酚进行有氧降解。按上述方案，在温度15_40°C条件下对苯酚进行有氧降解。本发明的优点是本发明的苯酚降解真菌株PHDE-4，具有较强的环境耐受力，可以在宽的温度、PH及较为苛刻的环境条件下，以苯酚为唯一碳源和能源生长繁殖，具有较好地清除环境中苯酚污染的能力。
图1为本发明的PHDE-4菌株的ITS序列；
图2为本发明的PHDE-4菌株的基因组DNA，其中泳道3: PHDE-4 ； 图3为本发明的PHDE-4菌株的r DNA的ITS扩增序列，其中泳道1、2: PHDE-4 ； 图4为本发明的PHDE-4菌株的系统发育树；
图5本发明的PHDE-4菌株在PDA培养基和以苯酚为唯一碳源的培养基上的生长状况， 其中左以苯酚为唯一碳源的培养基；右PDA培养基；
图6为本发明的PHDE-4菌株在PDA培养基中的1000X显微结构； 图7本发明的PHDE-4菌株在以苯酚为唯一碳源和能源的培养基中的1000X显微结
构；
图8本发明的PHDE-4菌株对不同起始浓度苯酚的生物降解； 图9为pH对本发明的PHDE-4菌株降解苯酚的影响； 图10为温度对本发明的PHDE-4菌株的降解苯酚的影响。
具体实施例方式
下面结合附图对本发明做进一步详细的说明。一株苯酚降解真菌，该真菌菌株为黄曲霉(Aspergillus fIavus)真菌菌株 PHDE-4，已于2011年8月31号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 5189 ；其生物学特性真菌株PHDE-4在普通PDA培养基生长的菌落为凸起呈圆形、黄绿色，菌落大、质地紧密，表面干而粗糙，边缘清晰，在以苯酚为唯一碳源的筛选培养基中生长的菌落为成片凸起，呈浅咖啡色，菌落较小、薄而疏松，表面干而粗糙，边缘清晰(见图5所示)；菌株PHDE-4的显微结构如下分生孢子呈圆形，黄绿色，带有双层小梗的分生孢子头，分生孢子梗单生，直立，无横隔，淡褐色(见图6所示);菌株PHDE-4在PDA培养基和筛选培养基上的显微结构有差异，在筛选培养基上由于苯酚的抑制作用，孢子和孢子头明显变小，菌丝变细(见图7所示)。所述的苯酚降解真菌，其rDNA的ITS全序列含608bp，具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。分别与从GenBank获取的20个相似序列后经DNAMAN软件进行比对分析)并构建系统发育树(见图4所示)，结合PHDE-4形态学特征，初步鉴定为As/^rpVAAs fIavus0本发明的真菌株PHDE-4在有氧降解苯酚中的应用，真菌株PHDE-4在模拟废水中苯酚含量小于1200 mg/L时，10天后苯酚降解率均能达到95% ；当苯酚含量超过1600 mg/L 时，真菌株PHDE-4受到苯酚的强烈抑制，10天苯酚的降解率只有14% (见图7所示)。在pH5. 0-8. 0条件下对苯酚进行有氧降解。真菌株PHDE-4在较宽的pH范围对苯酚具有降解能力，在PH8. 0时，苯酚的降解率大于60% ；在pH5. 5-6. 5的范围内PHDE-4对苯酚的降解率大于90% (见图9所示)。在温度10_40°C条件下对苯酚进行有氧降解。真菌株PHDE-4在较宽的温度范围对苯酚具有降解能力，如在温度为15°C时，对浓度为800 mg/L苯酚的降解率大于60 %，而在温度为20-35°C范围内，苯酚的降解率大于80%;达到苯酚最佳降解率对应的温度范围为 28 0C -32 0C (见图 10 所示)。实施例1
苯酚降解真菌株的筛选及鉴定
无机培养介质(mg/L) NaNO3 2. 000 g, K2HPO4 1. 000 g, KCl 0. 500 g, MgSO4. 7H20 0. 500 g, FeSO4. 7H20 0. 010 g ；
筛选平板介质(mg/L) NaNO3 2. 000 g, K2HPO4 1. 000 g, KCl 0. 500 g, MgSO4. 7H20 0.500 g, FeSO4. 7H20 0.010 g,苯酚 0.200 g，agar 18.000 g, H2OlOOO mL ；
储存介质(mg/L) 土豆 200.0 g,蔗糖 20. 0 g,苯酚 0. 100 g,琼脂 18. 00 g，H2O 1000
mL ；
PDA 培养介质(mg/L) 土豆 200. 0 g,蔗糖 20. 0 g,琼脂 18. 00 g, H2O 1000 mL。取宁波附近的中国东海(经度125-128°，纬度32-35° )海水样品，先将0.22 μπι 微孔滤膜过滤器灭菌，然后取海水样液通过无菌的微孔滤膜过滤，使样液中的微生物被截留在滤膜上。取出滤膜剪碎后放入灭菌后的锥形瓶中，浸入一定量的无菌水。玻璃珠振荡锥形瓶使附着在滤膜上的微生物溶入无菌水中，即得到含大量样液微生物的浓缩原菌液。将处理好的水样5.0 mL转移至45 mL含苯酚(100 mg/L)的无机介质中，将锥形瓶置于、150rpm无光条件下振摇培养48 h ；再移取5 mL混合菌液到新配制的45 mL 含相同浓度苯酚的无机培养介质中，继续富集培养，如此驯化培养约10次。移取经过10次驯化培养的混合菌液0. 1 mL,涂布筛选培养介质上，于无光环境中培养10天，挑取生长良好的菌落，在筛选培养介质上，采用连续稀释分离法分离出单菌落，最终获得6株纯培养物，接种在储存介质上4°C保存。其中一株编号PHDE-4的通过菌落形态和显微结构观察，初步鉴定为真菌。采用液氮和氯化节法(Fredrieks DN et al. J Clin Microbiol. 2005, 435122-5128)提取 PHDE-4的基因组DNA (参见附图2)，以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增PHDE-4 rDNA 的ITS全序列(真菌鉴定PCR试剂盒，TaKaRa Code:D317，宝生物大连生物技术有限公司)。50 μ L的PCR扩增体系包括模板DNA1-2 μ L, PCR premix 25 μ L,正向引物 forward primer 0. 5 μ L,反向引物perverse primer lor perverse primer 2 0. 5 μ L, 16SrRNA-free ddH20 up to 50 μ L。PCR扩增程序采用94°C预变性5 min后开始循环94° C 变性lmin, 55° C退火lmin，72° C延伸1. 5 min，循环30次，最后72° C延伸5 min 结束，4° C保藏。PCR扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离(参见附图3)，回收目标片段，送宝生物大连生物技术有限公司测序，结果(参见附图1)表明PHDE-4菌株的ITS序列有608bp，序列如SEQ ID NO 1所示。将测得的序列提交到美国NCBI 的 GenBank (http//blast, ncbi. nlm. nih. gov/ Blast, cgi),利用Blast程序进行序列同源性检索，获取对比指标靠前的20个相似序列，通过Blast和DNAMAN软件进行比对分析并构建系统发育树(参见附图4)。根据系统发育树并结合比对指标同源性和遗传距离进行分析表明PHDE-4为黄曲霉U^argiBM /7an )，是一株新的苯酚降解菌。该真菌菌株于2011年8月31号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 5189。菌株PHDE-4的培养、菌落形态和显微结构菌株PHDE-4可以在pH5. 0-8. 0，温度 IO0C -40°c的PDA培养基、查氏培养基、筛选培养基等中生长，最佳培养条件为PH5. 0-6. 0， 温度-32°C的PDA培养基、查氏培养基、筛选培养基等。菌株PHDE-4在PDA培养基和筛选培养基上生长的菌落形态总结在表1中(参见附图5)，在1000X显微镜观察菌株PHDE-4，分生孢子呈圆形，黄绿色，带有双层小梗的分生孢子头，分生孢子梗单生，直立，无横隔，淡褐色，(参见图6、图7)；菌株PHDE-4在PDA培养基和筛选培养基上的显微结构有差异，在筛选培养基上由于苯酚的抑制作用，孢子和孢子头明显变小，菌丝变细。表1菌株PHDE-4在不同平板上的菌落形态特征
培养基厚/薄大/小松/密表面边缘形状颜色PDA培养基厚大密粗糙、干清晰圆、凸黄绿筛选培养基薄小松粗糙、干不清晰成片、凸浅咖啡
PHDE-4菌株对不同起始浓度的苯酚的生物降解模拟苯酚废水的组成(mg/L) =NaNO3 2.000 g, K2HPO4 1.000 g，KCl 0.500 g, MgSO4. 7H20 0.500 g, FeSO4. 7H20 0.010 g，苯酚。 将PHDE-4菌株接种于无菌的模拟废水中，于，150 rpm振摇培养，每天取样，采用4-氨基安替吡啉作显色剂，510 nm比色法定量测定模拟废水中苯酚含量的变化(参见附图8)。苯酚的降解率采用公式(1)计算。
芣酚降解率U) = ^^ χ 100%....................... (1)
. “ ω0公式(1)中ω 0 苯酚的起始浓度(mg/L)，ω 降解t时苯酚的浓度(mg/L)。取宁波附近的中国东海(经度125-128°，纬度32_35° )海水，按前述发明内容中降解菌株的筛选与鉴定操作，分离出一株新的降解苯酚的真菌，通过形态学和分子生物学鉴定，该菌为黄曲霉(As/^r^/BM /7aras)，是一株新的苯酚降解菌。该菌与2011年8 月30号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 5189
实施例2
菌株PHDE-4对苯酚的生物降解
将菌株PHDE-4接种到100 mL无菌含苯酚100 mg/L的筛选培养介质中，于^°C，150 rpm振摇培养2天至生长对数期作为种子液。取上述种子液8XlmL，分别接种至100 mL无菌含苯酚200 mg/L,400 mg/L,600 mg/L,800 mg/LU000 mg/L、1200 mg/L、1400 mg/L、1600 mg/L 的模拟废水中，于 ，150
rpm振摇培养，每天取样，采用4-氨基安替吡啉作显色剂，510 nm比色法定量测定残留苯酚的浓度，结果表明在附图8中。模拟废水中苯酚含量小于800 mg/L时，10天后苯酚能完全降解；而苯酚含量为 1000 mg/L、1200 mg/L时，10后苯酚的降解率达95% ；苯酚含量为1400 mg/L时，由于菌株 PHDE-4受高浓度苯酚的抑制作用，10后苯酚的降解率只达61%，；苯酚含量超过1600 mg/L 时，菌株PHDE-4受到苯酚的强烈抑制，10天苯酚的降解率只有14%。实施例3
菌株PHDE-4在不同pH下对苯酚的生物降解
将菌株PHDE-4接种到100 mL无菌含苯酚100 mg/L的筛选培养介质中，于^°C，150 rpm振摇培养2天至生长对数期作为种子液。取上述种子液6XlmL，分别接种至100 mL无菌含苯酚(1000 mg/L)、pH分别为 5. 0、5. 5、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0的模拟废水中，于28°C，150 rpm振摇培养10天，采用4-氨基安替吡啉作显色剂，510 nm比色法定量测定残留苯酚的浓度，结果表明在附图9中。菌株PHDE-4能在较宽的pH范围对苯酚进行生物降解，但降解率受pH的影响，在 PH为5. 0-7. 0，菌株PHDE-4对苯酚的降解可达到最大降解率。实施例4
菌株PHDE-4在不同温度下对苯酚的生物降解
将菌株PHDE-4接种到100 mL无菌含苯酚100 mg/L的筛选培养介质中，于^°C，150 rpm振摇培养2天至生长对数期作为种子液。取上述种子液6 X ImL,分别接种至6 X 100 mL无菌含苯酚(1000 mg/L)的模拟废水中，分别于 10°C、15°C、20°C、25°C、30°C、35°C、40°C，150 rpm 振摇培养 10 天，采用 4-氨
基安替吡啉作显色剂，510 nm比色法定量测定残留苯酚的浓度，结果表明在附图10中。菌株PHDE-4可在较宽的温度范围对苯酚进行生物降解，但降解率受温度的影响， 在温度为-32°C，菌株PHDE-4对苯酚的降解可达到最大降解率。
权利要求
1.一株苯酚降解真菌，其特征在于该真菌菌株为黄曲霉(A^arpVAz1S /Yara1S)真菌菌株PHDE-4，已于2011年8月31号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC No. 5189。
2.按权利要求1所述的苯酚降解真菌，其特征在于其生物学特性是真菌株PHDE-4 在普通PDA培养基生长的菌落为凸起呈圆形、黄绿色，菌落大、质地紧密，表面干而粗糙，边缘清晰，在以苯酚为唯一碳源的筛选培养基中生长的菌落为成片凸起，呈浅咖啡色，菌落较小、薄而疏松，表面干而粗糙，边缘清晰；菌株PHDE-4的显微结构如下分生孢子呈圆形，黄绿色，带有双层小梗的分生孢子头，分生孢子梗单生，直立，无横隔，淡褐色；菌株PHDE-4在 PDA培养基和筛选培养基上的显微结构有差异，在筛选培养基上由于苯酚的抑制作用，孢子和孢子头明显变小，菌丝变细。
3.按权利要求2所述的苯酚降解真菌，其特征在于所述的苯酚降解真菌，其rDNA的 ITS全序列含608bp，具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。
4.权利要求1或2或3所述的苯酚降解真菌在有氧降解苯酚中的应用。
5.按权利要求4所述的苯酚降解真菌的应用，其特征在于在pH5.0-8. 0条件下对苯酚进行有氧降解。
6.按权利要求4或5所述的苯酚降解真菌的应用，其特征在于在温度15-40°C条件下对苯酚进行有氧降解。
全文摘要
本发明涉及一株苯酚降解真菌，该真菌菌株为黄曲霉(Aspergillusflavus)真菌菌株PHDE-4，已于2011年8月31号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.5189；本发明的苯酚降解真菌株PHDE-4，具有较强的环境耐受力，可以在宽的温度、pH及较为苛刻的环境条件下，以苯酚为唯一碳源和能源生长繁殖，具有较好地清除环境中苯酚污染的能力。
文档编号A62D101/28GK102399701SQ20111035303
公开日2012年4月4日 申请日期2011年11月9日 优先权日2011年11月9日
发明者户业丽, 程波 申请人:武汉工程大学