专利名称：毛细管微包被法控制细胞空间分布、形状和大小及其应用的制作方法
技术领域：
本发明为交叉领域技术发明，涉及半导体工业微加工技术、生物材料学和细胞生物学。具体地说，是在支持细胞粘附的材料表面上，选择性地引入抑制细胞粘附材料如poly-HEMA包被层，细胞因而只能在未被包被的区域粘附生长。该技术在生物医学工程领域如组织工程、细胞生物传感器、生物芯片和生物微机电系统(BioMEMs)中有广泛的应用前景。
背景技术：
细胞的粘附依赖于蛋白质的介导，即支持细胞粘附的材料表面上，必须先吸附一层蛋白分子(通常是胞外基质蛋白分子)，随后通过配体-受体结合，细胞才能在材料表面上粘附、铺展并生长。聚羟乙基异丁烯酸(Poly-HEMA)是一种特殊的高分子材料，其乙醇溶液在常用的细胞培养器皿表面干燥后，形成牢固的包被层，该包被层可以抑制胞外基质蛋白分子的吸附，因而抑制细胞的粘附。在支持细胞粘附的材料表面选择性地包被Poly-HEMA，就可以将细胞的粘附局限在无包被区域。Poly-HEMA曾被用来粗略控制细胞的铺展面积，其原理是，不同厚度的Poly-HEMA包被层，其抑制细胞粘附的能力不同，越厚的包被层，细胞越不易粘附，所以，一系列不同厚度的Poly-HEMA包被可以用来控制细胞群体的大致铺展面积。然而，这种用途不能控制细胞的空间分布，也不能在单细胞水平上精确控制细胞的形状和铺展面积。其主要原因就是，单纯的Poly-HEMA包被层不具备空间分辨能力。
本发明利用高弹体印章技术、结合毛细管作用和Poly-HEMA抑制细胞粘附的特性，在支持细胞粘附的材料表面上引入模式化的poly-HEMA包被层，模式的尺度为几十个微米。这种模式化表面具备空间分辨能力，用来接种细胞时，细胞的空间分布、形状和大小可以得到完美的控制。
高弹体印章技术系由哈佛大学化学系Whitesides教授研究小组研发而来，主要用于微接触印刷技术(micro-contact printing)，即作为印章蘸取烷硫醇分子，扣在金表面，借助烷硫醇分子的巯基和金原子间的配位作用，在金表面形成烷硫醇分子的模式化自组装单层。本发明的高弹体印章是作为Poly-HEMA聚合的模具，因此，与Whitesides教授的方法截然不同。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用高弹体印章技术、结合毛细管作用和Poly-HEMA抑制细胞粘附的特性，在支持细胞粘附的材料表面上制作模式化的poly-HEMA包被层的方法，模式的尺度为几十个微米，同时，提供一种在模式化表面接种细胞，可以完美的控制细胞的空间分布、形状和大小的方法。本发明的另外一个目的是提供该方法在生物医学工程领域如组织工程、细胞生物传感器、生物芯片和生物微机电系统(BioMEMs)中得以广泛的应用。
本发明利用半导体工业微加工技术的空间分辨能力，结合poly-HEMA抑制细胞粘附的特性，在支持细胞粘附的材料表面上经过工艺处理后，成功地控制细胞空间分布、形状及大小。其技术要点是，在细胞可粘附材料表面上引入抑制细胞粘附的聚羟乙基异丁烯酸Poly-HEMA，或者与其功能相同的材料的模式化包被。其技术流程是，首先借助微电子工业的微制作技术，制作出表面含有微米尺度凹凸图案的模具，然后在该模具表面聚合一种具有弹性的材料聚二甲基硅氧烷(PDMS)，或者与聚二甲基硅氧烷(PDMS)具有相同功能的材料，聚合完成后，揭下PDMS，其表面上即含有于模具表面相反的凹凸图案，类似于印章。由于PDMS是一种高弹体，当扣在平滑的细胞可粘附材料表面上，并施加适宜压力时，印章凸起处即与平滑表面致密接触，而印章凹下的地方则与平滑表面间形成空隙。图案的设计过程中，使印章凹下区域相互连接，即可以在平滑表面上形成连续的毛细管通道。在印章一端滴加Poly-HEMA的乙醇溶液，溶液可借助毛细作用自发充填毛细管通道。乙醇挥发完毕后，揭下印章，即留下Poly-HEMA模式化包被层。接种细胞时，细胞不能在Poly-HEMA模式化包被层上，而只在无包被区域即原来印章突起遮盖区域黏附生长。
图1、Poly-HEMA毛细管微包被法控制细胞空间分布、形状及大小技术流程示意图。图中PDMS为聚二甲基硅氧烷。
图2、PDMS高弹体印章显微图谱。图中较亮的图案为印章的凸起部分，而暗背景区域为凹入部分。放置在平滑表面时，凸起部分与表面紧密接触。而凹入部分与表面间的缝隙形成连续的毛细管通道。
图3、模式化poly-HEMA包被显微图谱。左图长方形为15×40μm，右图正方形边长25μm。细胞培养皿上模式化poly-HEMA包被图4、细胞培养结果。AB为牛关节软骨细胞，CD为人成纤维细胞。细胞分布于无poly-HEMA包被区，细胞的形状和大小与无poly-HEMA包被区域一致。A图长方形边长20×30μm，B图正方形边长25μm，C图直径30μm，D图直径40μm。
具体实施例方式
为了更好的理解本发明，下列实施例将予以进一步说明，但并非对本发明的限制。
实施例(一)1、 高弹体印章的制作干净单晶硅片上离心涂布厚约1微米的光刻胶(S-9912，Shipley公司出产)，80℃烘烤25分钟，然后通过掩模以相应光源(200W高压汞灯照射90秒)曝光，并以2％四甲基氢氧化铵水溶液显影除去曝光光刻胶，即可在硅片表面上形成未曝光光刻胶的模式化包被层。然后120℃再次烘烤20分钟，以使光刻胶牢固粘贴在硅片上。按照1∶10的比例混合聚二甲基硅氧烷(Dow Coming公司产品，Sylgard 184)，倒在硅片上聚合，聚合完毕后揭下，即得高弹体印章。印章表面上含有凹凸图案，图案尺度和高度与硅片上光刻胶相同，图形相反。印章整体厚度4-5毫米。
2、poly-HEMA毛细管微包被层制作将PDMS高弹体印章图案一面向下扣在细胞培养皿表面，施加适宜压力，使得印章凸起部分与培养皿表面紧密接触(此时可见接触面上出现虹彩)，在印章一端滴加1滴10％poly-HEMA溶液(溶解于95％乙醇)，溶液借助毛细作用自发充填印章与培养皿间形成的毛细管通道。室温放置30分钟后乙醇即可挥发完毕，揭下印章，培养皿表面上即留下poly-HEMA的模式化包被层。poly-HEMA模式化包被层的凹凸与印章相反。poly-HEMA的模式包层具备空间的分辨能力，可以限制细胞的空间分布和大小。
实施例(二)在poly-HEMA的模式包层上细胞培养细胞接种及培养按照常规细胞生物学技术操作。我们培养了2种细胞，分别是牛关节软骨细胞和人成纤维细胞。两种细胞的粘附和生长均局限在无包被区，细胞的形状和大小与包被图案相同。表明该技术可成功地用于细胞的空间分布、形状及大小控制。
权利要求
1.一种利用高弹体印章技术，在支持细胞粘附的材料表面上引入模式化的抑制细胞粘附的包被层，以控制细胞的空间分布、形状和大小的方法，该方法包括如下步骤(1)高弹性印章的制作采用微电子制作技术，制作表面含有微米尺度凹凸图案的模具，然后在该模具表面聚合一种具有弹性的材料聚二甲基硅氧烷(PDMS)，聚合完成后，揭下PDMS，即成为含有于模具表面相反的凹凸图案的高弹性印章；(2)Poly-HEMA模式化毛细管微包被层的制作将揭下的PDMS印章扣在平滑的细胞可粘附材料表面上，使印章凸起处与平滑表面致密接触，印章凹下的地方则与平滑表面间形成相互连续的毛细管空隙；在印章一端滴加Poly-HEMA的乙醇溶液，溶液借助毛细作用自发充填毛细管通道，乙醇挥发完毕后，揭下印章，即留下Poly-HEMA模式化包被层(3)在Poly-HEMA模式化包被层接种细胞，能有效的控制细胞的空间分布、形状和大小，使细胞不能在Poly-HEMA模式化包被层上，而只能在无包被区域即原来印章突起遮盖区域黏附生长。
2.根据权利要求1所述的方法，高弹体印章的制作，是在干净单晶硅片上离心涂布厚约1微米的光刻胶，80℃烘烤25分钟，然后通过掩模曝光，用2％四甲基氢氧化铵水溶液显影除去曝光光刻胶，即可在硅片表面上形成未曝光光刻胶的模式化包被层。然后120℃再次烘烤20分钟，以使光刻胶牢固粘贴在硅片上。按照1∶10的比例混合固化剂和聚二甲基硅氧烷(PDMS)，倒在硅片上聚合，聚合完毕后揭下，即得高弹体印章。印章表面上含有凹凸图案，图案尺度和高度与硅片上光刻胶相同，图形相反。
3.根据权利要求1所述的方法，Poly-HEMA模式化毛细管微包被层的制作，是将PDMS高弹体印章图案一面向下扣在细胞培养皿表面，施加适宜压力，使得印章凸起部分与平滑的培养皿表面紧密接触，在印章一端滴加10％的溶解于95％乙醇的poly-HEMA溶液，溶液借助毛细作用自发充填印章与培养皿间形成的毛细管通道，室温放置，乙醇挥发完毕，揭下印章，培养皿表面上即留下poly-HEMA的模式化包被层，poly-HEMA模式化包被层的凹凸与印章相反。poly-HEMA的模式包层具备空间的分辨能力，可以限制细胞的空间分布和大小。
4.根据权利要求1所述的方法，在Poly-HEMA模式化包被层接种细胞，能有效的控制细胞的空间分布、形状和大小的尺度为微米水平。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，聚二甲基硅氧烷(PDMS)能用与其功能相同的材料取代。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，Poly-HEMA能用与其功能相同的材料取代。
7.根据权利要求1所述的方法，在生物医学工程领域的组织工程、细胞生物传感器、生物芯片和生物微机电系统(BioMEMs)中的应用。
全文摘要
本发明为交叉领域技术发明，涉及半导体工业微加工技术、生物材料学和细胞生物学。具体地说，是在支持细胞粘附的材料表面上，选择性地引入抑制细胞粘附材料如poly－HEMA包被层，细胞因而只能在未被包被的区域粘附生长。该技术在生物医学工程领域如组织工程、细胞生物传感器、生物芯片和生物微机电系统(BioMEMs)中有广泛的应用前景。
文档编号G03F7/00GK1490400SQ02147588
公开日2004年4月21日 申请日期2002年10月17日 优先权日2002年10月17日
发明者陶祖莱, 张毅奕, 高宇欣, 胡渊 申请人:中国科学院力学研究所