制造具有固定化双链核酸探针的微阵列的方法

专利名称：制造具有固定化双链核酸探针的微阵列的方法
技术领域：
日J
链核酸探针的微阵列的方法<
背景技术：
使用光刻法制造核酸阵列的方法(也称为光引导合成法)是公知的。这些 方法包括将基底的预先限定的区域活化，然后使基底与预先选定的单体溶液 接触。可通过光源，典型地经过掩模，将预先限定的区域活化。基底的剩余 部分被掩模阻挡不受光源的作用并且被化学保护，因而是惰性的。因而，可 根据基底的哪个区域被光图案照射来确定基底的哪个区域与单体发生反应。 重复进行预先限定的区域的活化以及基底与另外的单体溶液的接触以在基 底上形成多种核酸阵列。如果有必要，可进行其它过程，包括从基底洗掉未 反应的单体溶液。
现在更详细地描述使用光引导合成法制造核酸阵列的方法的实例。通过 光刻掩模照射固体载体的表面，由此将照射的区域中的反应性基团(通常为
羟基)曝光，其中所述固体载体的表面用具有对光不稳定的保护基团如6-硝 基藜芦基氧羰基(NVOC)或甲基-6-硝基胡椒基氧羰基(MeNPOC)的间隔体选 择性地改性。然后，将在5'-羟基用对光不稳定的基团保护的3'-0-亚磷酰胺 活化的脱氧核香提供到固体载体表面上，并且在曝光的位点处发生化学偶 联。在封端(capping)和氧化之后，清洗固体载体，并经过第二掩模照射固体 载体的表面以将另外的幾基曝光用于偶联。将第二5'-保护的3'-0-亚磷酰胺 活化的脱氧核苦提供到固体载体表面上。重复进行选择性的光去保护和偶联 循环直至获得所需核酸组。光引导合成法的另一实例公开了，使用对光不稳 定的保护基团和光刻法来实现核酸阵列的光引导的可空间寻址的平行化学 合成。在该方法中，可使用计算机工具来帮助形成阵列。
在核酸阵列的这种光引导合成中，可在可空间寻址的预先限定的区域中 平行地合成多个核酸探针。由于预先限定的区域是通过光限定的，因此可通
4过将预先限定的区域之间的间隔变窄，即增加预定区域的密度，来合成核酸 阵列。然而，该方法包括为基底的每一次循环制备新的掩模，因而就合成效
率而言对可合成的核酸的长度有限制。具有25nt或更短长度的核酸的合成在 商业上是已知的。
另外，使用点样法制造核酸阵列的方法是已知的。在点样法中，将反应 物如预先合成的核酸或核酸单体转移到基底上的选定区域，使得相对少的量 的反应物直接沉积在选定区域上。可通过使用分配器在选定区域之间移动来 进行沉积。分配器的实例包括用于将单体溶液转移到基底上的微量移液器和 用于控制微量移液器相对于基底的位置的自动系统、或喷墨印刷机。另外， 分配器可为一系列的管、歧管、以及移液器阵列，其容许将多种试剂同时转 移到反应区域。在该方法中，将外来合成的核酸固定在基底上，因而可将相 对长的核酸固定在基底上。然而，固定是通过直接沉积进行的，并且样点密 度低。

发明内容
本发明的示例性实施方式包括有效地制造具有高的样点密度和其上固 定有长的探针的微阵列的方法。
其它方面将在随后的说明中部分阐述，部分可从该说明中明晰，或者可 通过所提供的实施方式的实践而获知。
固定化双链核酸探针的微阵列的方法，该方法包括使用光刻法在固体基底 表面上的多个样点区上合成核酸以将多个第 一单链核酸固定在所述多个样 点区上；和将所述多个第一单链核酸中的每一个与第二单链核酸杂交以将所 述多个第一单链核酸转化为包括双链区域和单链区域的双链核酸探针，所述 第二单链核酸包括与所述多个第一单链核酸互补的第一区域和与所述多个
第一单链核酸不互补的第二区域，其中当所述第一单链核酸的5'端与所述基 底的表面连接时，所述第二区域位于所述第一区域的上游，和当所述第一单 链核酸的3'端与所述基底的表面连接时，所述第二区域位于所述第一区域的下游。

图1A和IB是说明在根据本发明实施方式的制造具有固定化双链核酸
探针的微阵列的方法中制造单链微阵列的方法的图。
图2是说明将图1中制备的单链微阵列转化为双链微阵列的方法的图。
具体实施例方式
现在详细介绍实施方式，其实例图解于附图中，在附图中相同的附图标 记始终表示相同的元件。在这点上，本实施方式可具有不同的形式并且不应 解释为限于本文中所阐述的说明内容。因此，下面通过参考附图描述实施方 式仅用于解释本说明的各方面。
—明买施方式的制造具有包抬^又链区i或和竿《连区i或的固定4b只又
链核酸
多个样
汰巴孑左、aj
点区上合成核酸以将多个第 一单链核酸固定在样点区上。
术语"光刻法，，包括将光敏表面选择性地暴露于光束以在该表面上形成 曝光区域和未曝光区域的图案和使分子与曝光区域反应以使该分子与曝光 区域结合。该光敏表面可包括用可光除去基团保护的化学反应性基团，当该 光敏表面曝光时，该表面可由于可光除去基团的除去而变为反应性。该反应 物分子可包括在3'羟基或5'羟基处用可光除去基团保护的活化的核苷、活化 的核苷酸、活化的寡核苷酸或活化的多核苷酸。可通过将物理光掩模置于用 于光活化的光的路径中而将光敏表面选择性地暴露于光束。其也可不使用物 理光掩模进行，例如，通过使用无掩模的光刻系统进行。无掩模的光刻系统 是本领域技术人员已知的并且可包括使用与数字微镜阵列结合的离轴 (off-axis)光源的系统。
"使用光刻法在基底上合成核酸"的操作意指基底上的仅一些区域被光 照射，由此在所述基底的仅一些区域上引入或产生活性反应基团，所述活性 反应基团与活化分子如核酸单体、寡聚体或多聚体反应以在基底上延伸核酸 的核苷酸。其可包括通过在基底上一个一个地延伸核苷酸来合成单链多核苷 酸。核酸在基底上的光引导合成方法是本领域中公知的。例如，这些方法公 开于美国专利No. 5,143,854、 No. 5,744,305和No. 5,908,926中，将这些专利 的公开内容全部？ 1入本文中作为参考。双链核酸探针的双链区域位于基底表 面上即邻近基底表面，其单链区域位于距基底表面的远端。所述双链区域可 包括第一单链核酸和第二单链核酸，所述单链区域可仅包括第二单链核酸。第二单链核酸可包括两个区域，即通过和第一单链核酸杂交而形成双链核酸 的区域及不参与和第一单链核酸的杂交并由此可保持为单链形式的区域。双 链核酸探针可为其中双链区域邻近基底而单链区域在基底远端的部分双链 核酸。双链核酸探针的单链区域可与具有互补序列的輩巴核酸杂交，由此用作探针。
在"使用光刻法在基底上合成核酸"的操作中，可在基底上的多个预先 限定的区域(在下文中称为"样点")上平行地同时合成多个不同核酸序列。
本文中使用的术语"样点"是指表面上被活化、被预先活化、或期望被 活化以用于形成聚合物的一些区域，即"预先限定的区域"。所述样点可具 有方便的形状，例如，圆形、四边形、椭圆形、或楔状形状。
本文中使用的术语"基底"是指具有固体或半固体表面的材料。尽管基 底的表面可基本上是平坦的，但至少基底表面的一部分可作为合成区域通过
阱(well)、升高的区域、或蚀刻槽等相对于其它核酸合成区域物理隔离。
本文中使用的"光，，可为y射线、X射线、紫外线、可见光线、或红外 线，并且可根据所用可光除去的保护基团的类型适当选择。
操作(a)包括用光经过图案化的掩模选择性地照射基底表面、选择性地活 化基底表面上的一些区域、以及使活化的区域与核酸单体反应，由此在基底 表面上延伸核苷酸。当在基底表面上活性基团被可光除去的保护基团保护 时，可通过光照射进行基底表面上的所述一些区域的选择性活化。另外，可 通过用于除去可光除去的保护基团的化学物质进行该活化过程。
操作(a)可包括用光经过掩模照射连接有可光除去的保护基团的基底表 面以从该表面选择性地除去该保护基团，由此形成反应性区域和光保护区域
单体反应，由此将核酸单体延伸到基底上的反应性区域。可从被光照射的照 射区域的表面除去可光除去的保护基团，由此暴露出活性反应基团。因而，
单体可为核苷或核苷酸。
体。例如，连接体可为聚乙二醇、或核酸单体如核苷和核苷酸。本文中使用的术语"保护基团"是指与单体单元化学结合并且可通过选 择性地暴露于活化剂如电磁辐射而除去的基团。本文中使用的术语"可光除 去的保护基团"是指可通过光除去的保护基团。可光除去的保护基团是本领
域技术人员公知的。可光除去的保护基团的实例可包括，但不限于，6-硝基 藜芦基氧羰基(NVOC)、 6-硝基胡椒基(NP)、 6-硝基胡椒基氧羰基(NPOC)、 6-硝基藜^基(NV)、曱基-6-硝基藜芦基(MeNV)、曱基-6-硝基藜,基氧羰基 (MeNVOC)、曱基-6-硝基胡椒基(MeNP)和曱基-6-硝基胡椒基氧羰基 (MeNPOC)。
如下式1所示，可光除去的保护基团可在5'-羟基上连接到活化的核苷
酸
OPR (1)
其中B是结合到糖环上的碱基；当该糖为脱氧核糖时R为氢原子，或 者当该糖为核糖时R为羟基；P为活化磷酸基团；和X为可光除去的保护基 团。可光除去的保护基团X可为如上所述的NV、 NP、 MeNV或MeNP。活 化磷酸基团P可为具有高的偶联效率的反应性衍生物，如磷酸三酯或亚磷酰 胺。反应条件和其它活化磷酸基团是公知的(参见例如美国专利No. 5,143,854、 No. 5,744,305和No. 5,卯8，926)。另夕卜，该碱基的反应性基团被保 护基团遮蔽，碱基的遮蔽和非遮蔽是本领域中已知的。该碱基可为尿嘧啶、 腺嘌呤、鸟。票呤、胸腺嘧啶、胞嘧咬或肌苷。
另外，如下式2所示，可光除去的保护基团可在3'-羟基上连接到活化核 香酸。其中3'-羟基被可光除去的保护基团遮蔽的活化的核苷酸可为由下式2 表示的化合物
YO R (2)
其中，B为其中结合到糖环上的活性基团被遮蔽的碱基；当该糖为脱氧核糖时R为氢原子，或者当该糖为核糖时R为羟基；Y包括安息香基碳酸 酯(benzoinyl carbonate)如二烷氧基安息香基碳酸酯、二(C广C4)烷氧基安息香 基碳酸酯、或者3'，5'-二曱氧基安息香基碳酸酯或2',3'-二曱氧基安息香基碳 酸酯；和Z为亚磷酰胺。该碱基可为尿嘧啶、腺噪呤、鸟。票呤、胸腺嘧啶、 胞嘧啶或肌苷。
连接体可选自核苷和核苷酸，其中核苷和核苷酸之一的3'-端与基底连接 且核苷和核香酸之一的5'-端与可光除去的保护基团连接，或者5'-端与基底 连接且3'-端与可光除去的保护基团连接。另外，核苷酸包括在在前过程中合 成的或者外来引入的多核苷酸。
可重复进行图案的形成和核酸单体的延伸。在这种情况下，可在图案的 形成与核酸单体的延伸之间以及在核酸单体的延伸与图案的形成之间进行 一般的洗涤过程。另外，在图案的形成中，可根据在各样点中待引入的核苷 酸的类型形成彼此相同或不同的图案。在该过程中， 一个掩模可用于一个核 脊酸。因而，当合成25聚体(mer)核酸时，可使用最多达100个掩模。因此， 利用IOO次的如下循环制备掩模、照射光、分离可光除去的保护基团、添 加具有可光除去的保护基团的活化的单体和偶联反应。
第一单链核酸可选自DNA、 RNA、 PNA和其杂合分子。当第一单链核 酸为PNA时，杂交产物的离解常数低，因而双链区域是稳定的。
第一单链核酸的长度可为可提供第一单链核酸与第二单链核酸之间的 结合力的长度，其通过将第一单链核酸与第二单链核酸的第一区域杂交而获 得。例如，该长度可为约4nt~约25nt、约5nt 约10nt、或约10nt~约25nt。
第一单链核酸在其上延伸的样点的密度可为150,000样点/cm"或更大。 核酸的光引导合成法利用通过使用图案化的光例如在光的路径中使用光掩 模的表面的选择性活化，由此可以高密度排列样点。然而，使用大量的掩模 和许多步骤，因此对待合成的长度存在限制。
制造具有包括双链区域和单链区域的固定化双链核酸探针的微阵列的 方法进一步包括存储第 一单链核酸的序列和其上固定所述序列的样点在基 底上的位置。第一单链核酸的序列是已知的，并且鉴定其在基底上的位置， 由此可确认第二单链核酸杂交的位置。由此，可鉴定双链核酸探针的位置， 并且可对每一个样点分析由微阵列分析所得到的杂交结果。
根据本发明的实施方式，操作(a)可进一步包括(a-l)选择性地用光照射基底表面上的样点区的第一区域和不用光照射该表面上的样点区的第二区
域，由此形成亮暗区域的图案，其中基底表面具有可光除去的保护基团；(a-2) 使基底表面样点区的第 一 区域和第二区域与第 一核苷酸接触以使所述第一 核苷酸与第 一 区域的多核苷酸连接且不使所述第 一核苷酸与第二区域连接， 其中所述第一核苷酸具有可光除去的保护基团；(a-3)选择性地用电磁辐射照 射选自以下的至少一部分基底表面的第一区域的至少一部分和基底表面的 第二区域的至少一部分，以从那里除去可光除去的保护基团；和(a-4)使基底 表面的第一区域和第二区域与第二核苷酸接触以使所述第二核苷酸与除去 可光除去的保护基团的部分的多核苷酸连接。
根据本发明的实施方式，操作(a)可包括(a-l)将包括可光除去的3'羟基 保护基团的核苷与载体连接，其中该连接是经由该核苷的5'羟基；(a-2)照射 所获得的与载体结合的核苦，使得除去可光除去的保护基团和由此使3'羟基 自由；和(a-3)使与载体结合的核苷与包括5'亚磷酰胺的核苷酸接触以使5'亚 磷酰胺与该自由3'羟基反应，从而形成二核苷酸。
另外，制造具有包括双链区域和单链区域的固定化双链核酸探针的微阵 列的方法包括(b)将第 一单链核酸各自与第二单链核酸杂交以将所述第 一单 链核酸转化为包括双链区域和单链区域的双链核酸探针，所述第二单链核酸 包括与所述第 一单链核酸互补的第 一 区域和与所述第 一单链核酸不互补的 第二区域。当所述第一单链核酸的5'端与基底表面连接时，所述第二区域位 于所述第一区域的上游，和当所述第一单链核酸的3'端与基底表面连接时， 所述第二区域位于所述第一区域的下游。术语"上游"或"下游"是指在核 酸中对于参比位置的相对位置。例如，当序列对于参比位置位于5'羟基侧时， 该序列位于上游位置，和当序列对于参比位置位于3'羟基侧时，该序列位于 下游位置。
在操作(b)中，杂交可在本领域中已知的条件下进行，例如，在緩沖液中 在4。C下进行14小时。
第二单链核酸的第 一 区域与第 一单链核酸互补，因而第二单链核酸可因 杂交而固定在第一单链核酸上。本文中使用的术语"互补"是指核酸之间85% 或更多、90%或更多、95%或更多、或者100%的序列彼此互补。另外，第二 单链核酸的第二区域包括与第 一单链核酸非互补的序列。本文中使用的术语 "非互补，，意指第二区域基本上与第一单链核酸不互补，因而不干扰第一区
10域与第一单链核酸之间的杂交。第二区域可包括与第一单链核酸互补的5个
核苷酸或更少、4个核苷酸或更少、3个核苷酸或更少、或者2个核苷酸或 更少的邻接序列(contiguous sequence)。第二单链核酸的第一区域可以100% 的同一性与第一单链核酸互补，第二单链核酸的第二区域可不含有与第一单 链核酸互补的序列。
第二单链核酸可在与其中合成第 一单链核酸的固体基底不同的介质中 合成或者得自天然核酸。在不同介质中第二单链核酸的合成是本领域中公知 的。
结合到固体基底上的寡聚体的5'羟基偶联。可使用两种化学方法诱导该偶联 反应磷酸三酯法和亚磷酰胺法(Gait, "Oligonucleotide Synthesis": A practical Approach", 1984， IRL， Press, London)。
可在不使用光刻法的情况下在固体介质中合成第二单链核酸。另外，第 二单链核酸可为cDNA或得自通过核酸扩增方法例如PCR扩增的核酸。由 于第二单链核酸可不在多个位置上例如经过掩模平行合成，因此可以高效率 合成相对长的核酸。第二单链核酸可具有50nt或更大、约50nt~约3000nt、 或者约50nt 约1000nt的长度。另外，第二单链核酸可使用细胞合成，或 者通过用限制酶消化天然核酸而获得。第二单链核酸的第二区域可具有25nt 或更大、约25nt~约2975nt、或者约25nt ~约975nt的长度。
操作(b)可进一步包括设定双链核酸探针在基底上的位置以对应于与第 二单链核酸的第 一 区域互补的第 一单链核酸的位置和存储该双链核酸探针 的位置。该存储过程可在计算机可读的介质中进行。因而，可使用计算机确 认和分析探针的位置和/或靶核酸与探针之间的杂交结果。即，可将第一单链 核酸或第二单链核酸的第一区域的序列用作可确认探针的位置或杂交的分 析结果的易得到的信息。
第二单链核酸的第 一 区域和第 一单链核酸之一可为PNA,它们中的另一 个可为DNA或RNA。 PNA与DNA或RNA之间的杂交强度相对强于DNA 之间、RNA之间或DNA与RNA之间的杂交强度，由此第二单链核酸可稳 定地固定在第 一单链核酸上。
方法可进一 步包括(c)使双链核酸探针和与该双链核酸探针的双链区域特异性结合的物质反应，由此增强第二单链核酸与第 一单链核酸之间的杂交结 合。
该双链特异性结合嵌入剂可为SYBR Green I。双链特异性结合嵌入剂更好地 稳定双键，由此降低在分析双链核酸探针的过程中单链核酸离解的可能性。 另夕卜，基底表面上第二单链核酸的近端可通过共价键或非共价键固定在第一 单链核酸或基底上。
图IA和IB是说明根据本发明实施方式制造具有固定化双链核酸探针 的单链核酸微阵列的方法的图。在图1A和1B中，M1 M7表示掩模，10 表示基底，20表示固定在基底IO表面上的可光除去的保护基团。参照图1A 和1B，在掩模M1 M7中，亮的部分为光透射穿过的区域，阴影线部分为 光未透射穿过的区域。可光除去的保护基团20可连接到连接体、核酸单体、 或寡聚体上。另外，x-G、 x-A、 x-C和x-T中的x表示其中G、 A、 C和T 分别为碱基鸟。票呤、腺。票呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的可光除去的保护基团。首 先，参照图1A，当用光经过掩模M1照射基底10时，固定于基底10上的 可光除去的保护基团20从被光照射的预先限定的区域除去，结果，暴露出 活性基团。然后，使具有暴露的活性基团的基底10的表面与具有可光除去 的保护基团的第一活化的核酸单体反应以使第一活化的核酸单体与基底10 的表面连接。通过洗涤除去未反应的第一活化的核酸单体，然后用光经过掩 模M2照射基底IO表面上的预先限定的区域，并且使基底IO的表面与具有 可光除去的保护基团的第二活化的核酸单体反应，由此将第二活化的核酸单 体与第一活化的核酸单体连接。通过使用掩模M3 M7重复进行这样的过 程，制得单链核酸微阵列，在该微阵列上四个不同的单链核酸探针分别固定 在四个样点区上。在具有可光除去的保护基团的第一和第二活化的核酸单体 中，可光除去的保护基团可如上式1或2所示在5'-羟基或3'-羟基上连接到 活化的核苷酸。参照图1A和图1B,可光除去的保护基团在5'-羟基上连接 到活化的核苷酸。如图1A和图1B中所示，当通过经过掩模M1-M7活化 基底10进行在多个预先限定的区域上的单链核酸的光引导合成时，可使预 先限定的区域之间的间隔变窄。就是说，可增加预先限定的区域(样点)的密 度。然而，在该情况中制备的多个掩模使制造过程变复杂。
图2是说明根据本发明实施方式将图1中制备的单链微阵列 化为双链微阵列的方法的图。在图2中，S1 S4表示基底上的样点区。将不同序列 的单链核酸分別固定在样点区S1 S4上。另外，在图2中，R1和R2分别 表示双链核酸探针的双链区域和单链区域。参照图2,在基底上以3' —5'的 方向合成双链核酸探针的第 一单链核酸，由此该双链核酸探针的包括与第一 单链核酸互补的序列的第二单链核酸从基底以5' —3'的方向排列。然而，相 反的情况也是可能的，其中在基底上以5' —3'的方向合成第一单链核酸，并 且包括与第一单链核酸互补的序列的第二单链核酸从基底以3' —5'的方向排 列。第二单链核酸可在不使用掩模的情况下通过已知的固相核酸合成获得或 者通过用限制酶消化天然核酸获得，由此第二单链核酸可相对地长。例如， 单链区域R2可具有约30nt~约lOOOnt的长度。另夕卜，尽管未图解于图2中， 但可用与双链区域R1特异性结合的物质处理双链区域R1以增强杂交结合。 例如，该物质可为双链特异性结合嵌入剂化合物如SYBR Green I。另外，基 底上第二单链核酸的近端可通过共价键或非共价键固定在第一单链核酸或 基底上。
如上所述，根据本发明的上述示例性实施方式，通过使用制造其上固定
备具有高的样点密度且其上固定长的双链核酸探针的微阵列。
应理解，本文中所述的示例性实施方式应仅在描述性的意义上考虑并且 不用于限制的目的。本发明各实施方式中的特征或方面的描述通常应认为可 用于本发明其它实施方式中的其它类似特征或方面。
权利要求
1.制造具有包括双链区域和单链区域的固定化双链核酸探针的微阵列的方法，该方法包括使用光刻法在固体基底表面上的多个样点区上合成核酸以将多个第一单链核酸固定在所述多个样点区上；和将所述多个第一单链核酸各自与第二单链核酸杂交以将所述多个第一单链核酸转化为双链核酸探针，所述第二单链核酸包括与所述多个第一单链核酸互补的第一区域和与所述多个第一单链核酸不互补的第二区域，所述双链核酸探针各自包括双链区域和单链区域，其中当所述第一单链核酸的5′端与所述基底的表面连接时，所述第二区域位于所述第一区域的上游，和当所述第一单链核酸的3′端与所述基底的表面连接时，所述第二区域位于所述第一区域的下游。
2. 权利要求1的方法，其中所述核酸的合成包括用光经过掩模照射连接有可光除去的保护基团的基底表面以从所述表面选择性地除去所述保护基团，由此形成反应性区域和光保护区域的图案，以及使所述反应性区域的表面与具有可光除去的保护基团的活化的核酸单体反应，由此使所述核酸单体延伸至所述基底上的反应性区域。
3. 权利要求2的方法，其中所述与基底连接的可光除去的保护基团通过连接体与所述基底连接，所述连接体的距所述基底表面远端的活性基团被所述可光除去的保护基团保护。
4. 权利要求2的方法，其中所述连接体选自核苷和核苷酸，所述核苷和核苷酸的3'-端与所述基底连接且5'-端与所述可光除去的保护基团连接、或者所述核苷和核苷酸的5'-端与所述基底连接且3'-端与所述可光除去的保护基团连接。
5. 权利要求2的方法，其中重复进行所述合成和反应。
6. 权利要求2的方法，其中所述核酸单体为核苷或核苷酸。
7. 权利要求1的方法，其中所述多个第一单链核酸选自DNA、 RNA、PNA及其杂合分子。
8. 权利要求l的方法，其中所述多个第一单链核酸各自具有约4nt 约25nt的长度。
9. 权利要求1的方法，其中，其上固定所述多个第一单链核酸的样点区 的密度大于或等于约150,000个样点/cm2。
10. 权利要求1的方法，进一步包括存储所述多个第一单链核酸的序列 和其上固定所述序列的样点在所述基底上的位置。
11. 权利要求l的方法，其中，在所述多个第一单链核酸各自的杂交中， 在与在其上合成所述多个第一单链核酸的所述固体基底不同的介质中合成 所述第二单链核酸。
12. 权利要求11的方法，其中所述第二单链核酸是在不使用光刻法的情 况下在固体介质中合成的。
13. 权利要求11的方法，其中所述第二单链核酸包括cDNA或得自通 过核酸扩增获得的核酸的DNA。
14. 权利要求11的方法，其中所述第二单链核酸具有50nt或更大的长度。
15. 权利要求14的方法，其中所述第二单链核酸具有约50nt~约lOOOnt的长度。
16. 权利要求l的方法，其中所述多个第一单链核酸各自的杂交进一步 包括设定所述双链核酸探针在所述基底上的位置以对应于与所述第二单链 核酸的第一区域互补的所述多个第一单链核酸的位置和存储所述双链核酸 探针的位置。
17. 权利要求1的方法，其中所述多个第一单链核酸和所述第二单链核 酸的第一区域之一为PNA,且它们中的另一个为DNA或RNA。
18. 权利要求1的方法，进一步包括使所述双链核酸探针和与核酸的双 链区域特异性结合的物质反应，由此增强所述第二单链核酸与所述多个第一 单链核酸之间的杂交结合。
19. 权利要求18的方法，其中所述与核酸的双链区域特异性结合的物质 包括双链特异性结合嵌入剂。
20. 权利要求19的方法，其中所述嵌入剂包括SYBR Green I。
全文摘要
本发明涉及制造具有固定化双链核酸探针的微阵列的方法，包括通过使用光刻法合成核酸而固定核酸和使核酸杂交。可制备具有高样点密度和固定化长探针的微阵列。
文档编号C40B50/18GK101660211SQ20091016963
公开日2010年3月3日 申请日期2009年8月27日 优先权日2008年8月27日
发明者李周远 申请人:三星电子株式会社