专利名称：汉族人群线粒体dna单倍型检测引物阵列及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种引物阵列，尤其涉及一种汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列(Primer Array)及制备方法和应用。
背景技术：
线粒体通过氧化磷酸化(OXPHOS)产生人体用于工作的ATP和维持体温的热量，处于新陈代谢和生物能量转换的中心地位。线粒体DNA (mtDNA)是细胞内除nDNA外唯一存在的遗传物质。其中，mtDNA编码区所编码的13个多肽是电子传递链的重要组成成分。近年来的研究证明，线粒体不仅为机体提供能量，其遗传结构和生理功能的缺陷又与机体的多种疾病的发生密切相关(即线粒体疾病)，并且，定义线粒体DNA单倍型的“非致病性”DNA 遗传变异与人类的多种疾病的易感性密切相关。目前，对绝大多数线粒体遗传病尚无有效的治疗方法，而许多线粒体遗传病又具有致残性，病人生活质量差，而社会、家庭不但要支付其生活费、医疗费，还要安排专人料理其生活，给社会、家庭以沉重的经济负担。基因芯片又称DNA芯片、DNA微探针阵列等等，它是将半导体工业的微型制造技术与分子生物学结合起来，在玻璃、陶瓷、金属片或尼龙膜、硝酸纤维素膜等基片物质表面上产生二维DNA探针阵列，然后将待测定未知目标DNA与芯片上已知DNA探针“杂交”，以确定未知DNA分子。Real-Time PCR技术是在PCR反应体系中添加荧光物质或含荧光基团的探针，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR的过程，以达到对未知样品的定性或定量分析的目的，与常规PCR技术和芯片技术比较，其快速、精确、定量、无污染及高通量等优点成为国际公认的核酸分子定量的标准方法。目前，检测线粒体DNA单倍型的技术是基于PCR的 RFLP(restriction fragment length polymrphism)以及测序等技术。但这些技术对于大样本人群来说，在不同程度上存在程序复杂、工作量大、繁琐、费时和设备要求高等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列，它具有灵敏度高、特异性好、操作简单、快速、精确、定量、无污染及高通量等优点，适合临床实验室和科研开展。本发明的技术方案是一种汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列，包括固相载体、滴加在该固相载体上的Q-PCR(Real-time Quantitative PCR，Q-PCR)特异性引物以及在PCR反应体系中添加荧光物质，所述滴加在所述固相载体上的Q-PCR特异性引物具有SEQ ID NO=I-SEQ ID NO: 16所示的寡核苷酸序列。所述的汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列，还包括滴加在该固相载体上的 Q-PCR特异性引物作为阴性对照，其中，阴性对照Q-PCR特异性引物具有SEQ ID NO =I-SEQ ID NO :16所示的寡核苷酸序列。由于引物阵列制备时已滴加有Q-PCR特异性引物，因此，用本发明所述引物阵列检测时仅滴加Q-PCR反应液和基因组DNA模版。
所述固相载体为96孔PCR反应板。所述荧光物质为SYBR Green I。本发明的另一个目的是提供上述的汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列的制备方法，其有如下步骤1)采用亚磷酰胺三酯法合成SEQ ID NO =I-SEQ ID NO 16所示的Q-PCR特异性引物；2)将步骤1)中合成的Q-PCR特异性引物按浓度为100_300ηΜ滴加到Q-PCR反应板中，阴性对照点为仅含引物而后续实验时不加任何基因组DNA模板的点样液，制得所述的汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列。采用汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列的检测方法，有步骤1) Q-PCR反应混合液量的准备根据96孔Q-PCR反应板的孔数来确定Q-PCR反应数，一般1个96孔PCR反应板需要准备100次Q-PCR反应的2 X Q-PCR混合液(含荧光染料SYBR Green I，北京天根生化科技有限公司)，依次类推。2)将步骤1)制得的Q-PCR反应液滴加到本发明所述引物阵列的待测标本区；3) DNA样品操作前的准备工作为避免外源DNA对待测DNA样品的污染，所有实验要严格遵守DNA操作的要求。在实验操作中，需戴口罩和一次性橡胶手套；4) DNA样品准备高质量的DNA是基因精确检测的首要条件，对于抽提的DNA必须保证DNA无降解、无蛋白质污染。DNA是否有降解可通过琼脂糖凝胶电泳检测，DNA的质量还可以通过紫外分光光度法检测，质量合格的DNA，其OD26tZOD28tl应在1. 8 2. 0范围内；5) Q-PCR引物阵列采用Real-time PCR检测仪进行实时定性PCR检测。步骤1)中所述Q-PCR反应液为Q-PCR特异性引物的溶液，所述Q-PCR特异性引物的寡核苷酸序列如SEQ ID NO =I-SEQ ID N0:16所示。汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列在检测汉族人群线粒体DNA单倍型中的应用。本发明涉及的汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列是采用SYBRGreen I染料法检测的Real-Time PCR技术，对不同样品的线粒体DNA单倍型进行分析的系统。其已把优化并通过实验验证的16对不同的Q-PCR引物按使用浓度滴加到96孔Q-PCR反应板中， 工作人员仅需加入Q-PCR混合液、DNA及ddH20，即可上机反应，并且所得结果可通过在线数据分析系统(采用△ ACt分析方法)立即进行分析。因此，本发明涉及的汉族人群线粒体 DNA单倍型检测引物阵列相对传统PCR-PRLPs分析方法和碱基序列测定，不仅可以快速、简便、准确地确定个体的线粒体DNA单倍型，并且可以分析个体患线粒体疾病的风险性。本发明所述的汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列可以用于汉族人群线粒体DNA单倍型的确定。本发明所述的汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列具有灵敏度高、特异性好、操作简单、快速、精确、定量、无污染及高通量等优点，适合临床实验室和科研开展。本发明所述的荧光物质SYBR Green I用于在检测时发光(最大激发波长497nm， 最大发射波长是520nm)，便于观察和分析PCR进展和结果。SYBR GreenI是一种DNA结合染料，可以与双链DNA非特异性结合。在游离状态下，SYBRGreen I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，其荧光增加1000倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与PCR扩增所获得的双链DNA量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。该染料的优点包括仅需要2 个引物，无需设计多个探针即可以快速检验多个基因，低成本，且能够进行熔点曲线分析检验扩增反应的特异性。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例， 并配合附图，作详细说明如下。
图1是本发明的汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列的 示意图，其中1、固相载体；2、阳性对照区；3、阴性对照区；4、待测标本区。图2-1 图2-8为是本发明的汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列分析汉族人群线粒体DNA单倍型的示意图，其中图2-1 线粒体DNA单倍型A，图2_2 线粒体DNA单倍型B，图2-3 线粒体DNA单倍型C，图2-4 线粒体DNA单倍型D，图2_5 线粒体DNA单倍型F，图2-6 线粒体DNA单倍型G，图2_7 线粒体DNA单倍型M7，图2_8 线粒体DNA单倍型M9。图3-1 图3-8为应用本发明的汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列进行汉族人群线粒体DNA单倍型的检测结果，其中图3-1 线粒体DNA单倍型A，图3_2 线粒体 DNA单倍型B，图3-3 线粒体DNA单倍型C，图3_4 线粒体DNA单倍型D，图3_5 线粒体DNA 单倍型F，图3-6 线粒体DNA单倍型G，图3_7 线粒体DNA单倍型M7，图3_8 线粒体DNA单倍型M9。
具体实施例方式实施例1待测样品的制备(采用天根公司基因组DNA提取试剂盒)1.标本的处理静脉外周血(来源广泛，可来自于各医院、科研单位的患者或研究对象，本发明所述的静脉外周血来自于中国人民解放军第三军医大学第二附属医院)取300 μ 1外周血标本置无菌的1. 5ml EP管中，加900 μ 1红细胞裂解液，颠倒混勻，室温放置5分钟，期间再颠倒几次。10，OOOrpm离心2分钟。弃上清，沉淀加200 μ 1缓冲液GA,震荡混勻。2.加入20μ 1蛋白酶K，混勻。3.加入200 μ 1缓冲液GB，充分颠倒混勻，70°C放置10-15分钟，溶液变清亮，简单
离心以去除管盖内壁的水珠。4.加入200 μ 1无水乙醇，充分混勻15秒，简单离心以去除管盖内壁的水珠。5.将上一步所得溶液和絮状沉淀加入一个吸附柱CB3中，12，OOOrpm离心30秒， 倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。6.向吸附柱CB3中加入700 μ 1漂洗液⑶，12，OOOrpm离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7.向吸附柱CB3中加入700 μ 1漂洗液PW，12，OOOrpm离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8.向吸附柱CB3中加入500 μ 1漂洗液GD, 12，OOOrpm离心1分钟，倒掉废液。
9.将吸附柱CB3放入收集管中，12，OOOrpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3 置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10.将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50-100 μ 1洗脱缓冲液ΤΕ，室温放置2-5分钟，12，OOOrpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。-20°C保存备用。 实施例2Q-PCR特异性PCR弓丨物的设计人类mtDNA是一个含16，569个碱基对的双链闭环分子，负责编码2种rRNA、22种 tRNA,以及13种参与线粒体呼吸链电子传递的多肽。
1.在www. mitomap. org网站上下载线粒体DNA剑桥序列(rCRS)全序列。2.利用Primer 5. 0软件设计引物。引物设计原则1)引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性；2)引物长度一般在15 30碱基之间；3)引物GC含量在40% 60% 之间，Tm值最好接近72°C ；4)引物3'端要避开密码子的第3位；5)引物3'端不能选择 A，最好选择T;6)扩增产物的单链不能形成二级结构；7)引物自身不能有连续4个碱基的互补；8)引物的5'端可以修饰，而3'端不可修饰；9)引物5'端和中间AG值应该相对较高，而3'端AG值较低；10)引物具有特异性；11)避免发夹结构和自身二聚体的形成； 12)避免单一碱基的重复出现(不能多于4个)。3.将备选引物序列提交Genbank，利用BLAST程序进行特异性分析。4.将筛选出的引物进行合成。实施例3检测监控系统的设计为保证检测的可靠性，设置完善的检测监控系统，包括“是”和“非” Q-PCR特异性弓丨物、阳性对照、阴性对照。Q-PCR特异性引物序列来自于人线粒体DNA全序列，采用已知的汉族线粒体DNA单倍型基因组DNA(来源于第三军医大学第二附属医院)作为阳性对照，仅含引物但不加任何DNA模板的点样液作为阴性对照，阳性对照用于检测Q-PCR荧光信号是否正确，阴性对照用于检测引物阵列制备是否正常，阳性、阴性对照与样品并行处理，用于监测待检样品的检测。实施例4引物阵列的制备1.点样用无菌去离子水配置浓度为1 μ mol/L的引物溶液。参见图1，本发明所述的固相载体1采用96孔Q-PCR反应板1，在阳性对照区2、阴性对照区3以及待测标本区 4分别滴加5微升(μ 1)引物溶液。一般1个96孔PCR反应板需要准备100次Q-PCR反应的2 X Q-PCR混合液(含荧光染料SYBRGreen I，北京天根生化科技有限公司)。参见图2， 在用微量移液器取引物溶液滴加于96孔Q-PCR反应板相应位置，包括阳性对照区、阴性对照区以及待测标本区4。其中，线粒体DNA单倍型A引物阵列具有SEQ ID NO :1和2引物组合(图2-1)；线粒体DNA单倍型B引物阵列具有SEQ ID NO 3和4引物组合(图2-2)； 线粒体DNA单倍型C引物阵列具有SEQ ID NO :5和6引物组合(图2_3)；线粒体DNA单倍型D引物阵列具有SEQ ID NO :7和8引物组合(图2_4)；线粒体DNA单倍型F引物阵列具有SEQ ID NO 9和10引物组合(图2_5)；线粒体DNA单倍型G引物阵列具有SEQ ID NO 11和12引物组合(图2-6)；线粒体DNA单倍型Μ7引物阵列具有SEQ ID Ν0:13和14引物组合(图2-7)；线粒体DNA单倍型Μ9引物阵列具有SEQ ID NO 15和16引物组合(图 2-8)。
2.短 暂离心，使引物溶液置于96孔PCR反应区的底部。3.用Q-PCR反应板封膜密封上述96孔PCR反应板。4.制备所得的引物阵列保存于+2°C +8°C备用。实施例5弓丨物阵列的检测a.融解2 X Q-PCR混合液，上下轻微颠倒混勻，短暂离心后放置冰上待用。同时取出96孔Q-PCR反应板，擦去表面水份并短暂离心后待用。再次确认所使用的Real-time PCR 仪是否与本引物阵列所使用的96孔Q-PCR反应板是否相匹配，即96孔PCR反应板能否放入PCR仪。b.冰上进行Q-PCR反应液的配制(每个96孔PCR反应板量)
权利要求
1.一种汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列，其特征在于包括固相载体、滴加在该固相载体上的Q-PCR特异性引物以及在PCR反应体系中添加荧光物质，所述滴加在所述固相载体上的Q-PCR特异性引物具有SEQ ID NO=I-SEQ IDNO 16所示的寡核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列，其特征在于还包括滴加在该固相载体上的Q-PCR特异性引物作为阴性对照。
3.根据权利要求1所述的汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列，其特征在于所述固相载体为96孔PCR反应板。
4.根据权利要求1所述的汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列，其特征在于所述荧光物质为SYBR Green I。
5.权利要求1-4任一所述的汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列的制备方法，其特征在于包含步骤1)采用亚磷酰胺三酯法合成SEQID NO =I-SEQ ID NO 16所示的Q-PCR特异性引物；2)将步骤1)中合成的Q-PCR特异性引物按浓度为100-300nM滴加到Q-PCR反应板中， 制得所述的汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列，其阴性对照孔含有Q-PCR特异性引物。
6.采用权利要求1-4任一所述的汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列的检测方法，其特征在于有步骤1)制备Q-PCR的反应液；2)将步骤1)制得的Q-PCR反应液滴加到本发明所述引物阵列的待测标本区；3)DNA样品准备抽提无降解、无蛋白质污染的DNA或通过紫外分光光度法检测的DNA， 其 0D26Q/0D28Q 为 1. 8 2. 0 ；4)Q-PCR引物阵列的实时定量PCR检测。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于步骤1)中所述Q-PCR反应液为Q-PCR 特异性引物的溶液，所述Q-PCR特异性引物的寡核苷酸序列如SEQ IDNO=I-SEQ ID NO 16 所示。
8.权利要求1-4任一所述的汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列在检测汉族人群线粒体DNA单倍型中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列(Primer Array)，包括固相载体、滴加在该固相载体上的“是”和“非”实时定量PCR(Real-time Quantitative PCR，Q-PCR)特异性引物以及在PCR反应体系中添加荧光物质，其中滴加在所述固相载体上的Q-PCR特异性引物具有SEQ ID NO1-SEQ IDNO16所示的寡核苷酸序列；本发明还涉及上述汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列的制备方法和使用方法，本发明所述的汉族人群线粒体DNA单倍型检测引物阵列可快速、简便地确定大量人群的线粒体DNA单倍型，具有灵敏度高、特异性好、操作简单，不需要特殊仪器设备等特点，适合临床实验室和科研开展。
文档编号C40B50/06GK102277442SQ201110266160
公开日2011年12月14日 申请日期2011年9月8日 优先权日2011年9月8日
发明者吴国明, 戢福云, 李福祥, 王长征, 贺武峰, 郑世珍, 钱桂生, 陈琰 申请人:中国人民解放军第三军医大学第二附属医院