专利名称：全细胞水平高效捕获染色质转录调控区的新方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医学分子生物学领域，涉及全细胞水平高效捕获染色质转录调控区的新方法。
背景技术：
染色质是真核细胞遗传信息的载体，它的高级结构是以核小体为基本结构单位的一级结构经过进一步的盘绕、折叠而形成。真核基因的表达调控与核小体的定位及染色质的空间结构密切相关，研究染色质的结构及其在基因表达调控中的作用，对于揭示真核生物基因表达调控的机理有重要意义[1-3]。真核基因的表达调控主要发生在转录过程中，转录因子(TF)与靶基因调控区的启动子、增强子、沉默子等顺式作用元件(cis-acting elemeat)相互作用，引起染色质构象变化并影响聚合酶作用，从而调节基因表达的强度，控制靶基因的时空特异性表达[4]。鉴别转录因子结合的靶基因调控区，确定转录因子与靶基因间的调控关系是理解转录调控机制的核心问题[5，6]。。DNase I^ (DNase I hypersensitive sites， DHSs) 可以反映大段染色质的密集程度，而高敏感区域通常是潜在的转录调控区或与染色质变构相关的调控元件结合的区域，这些区域的重要特点是无核小体结合，已经证实活性染色质 DHSs区包括核小体空缺区(NFR) [7-10]。真核生物基因组DNA序列本身为我们鉴别转录因子结合的靶基因提供了比较少的信息。然而，DNase I高敏感位点(DHSs)可以作为特殊标志，帮助我们识别染色质上特定基因的调控序列_顺式反应元件，为研究转录因子与结合位点间的相互作用、以及各种活性基因的顺式反应元件在染色质上的分布特征提供有力的支持[11，12]。随着新一代高通量DNA测序技术的快速发展，Crawford等人将DNase I高敏感位点检测与生物芯片和高通量测序技术相结合，开发了 DNase-Chip [13]和DNase-seq技术[14]。两种技术都是先将活性染色质的DNase I酶切产物进行纯化，构建全基因组DHSs 文库；然后将富集得到的DNA片段与芯片杂交或进行高通量测序。通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内转录因子的靶基因分布情况信息。活性染色质在合适浓度的DNase I酶切反应后得到大量的DNA片段，其中长片段产物占了很大的比例。而目前高通量单端测序的读长一般为20-75bp，DNase I酶切产物中的长片段DNA不能直接用于高通量测序，还需要进一步酶切或超声打断成短片段然后进行相应的PCR扩增构建文库。本研究以人HeLaS3细胞为模型，应用本发明全细胞水平高效捕获染色质转录调控区的新方法，选择活性染色质上DNase I (10U/ml)酶切产物中的短DNA片段 (100-300bp)构建的DHSs文库，可以直接利用高通量全基因组深度测序技术捕捉染色质高敏感位点区域，分析其分布特征。为全基因组范围内更精确的定位活性染色质转录调控区域、染色质变构相关的调控元件结合区域的研究提供新的方法。可以用来研究真核细胞转录调控的染色质区域，为基因组学研究提供了一个有效方法
发明内容
本发明提供一种全细胞水平高效捕获染色质转录调控区的新方法。本发明中使用的细胞HeLa S3是本领域技术人员熟知的人宫颈癌细胞系。在优选的实施方案中，使用的工具酶是脱氧核糖核酸酶I(DNase I)。最优选的方法是本发明中的采用DNase I酶切细胞核内染色质得到的100_300bp的短DNA片段构建文库的方法，以及通过该方法构建的HeLa S3细胞活性染色质DHSs文库。本发明涉及全细胞水平高效捕获染色质转录调控区新方法。它在基因组相关研究中有潜在的用途。附图表说明
图1为DNase I酶切细胞核染色质DNA琼脂糖凝胶电泳Mrl Ikb DNA ladderMr2 IOObp DNA ladder1、DNase I酶切的基因组DNA2UOU/ml DNase I 酶切的细胞核 DNA3、5U/ml DNase I 酶切的细胞核 DNA4、无DNase I酶切的细胞核DNA.图2为DHSs文库DNA加PE接头电泳图Mr IOObp DNA Ladderl-4DHSs 文库 DNA 加 PE 接头图3为PE接头引物PCR扩增DHSs文库DNA电泳图Mr IOObp DNA Ladder1、DHSs文库未加PE接头对照
2-4加PE接头的DHSs文库5、PCR无引物阴性对照6、PCR无模板阴性对照图4为DHSs文库验证PCR电泳图Mr IOObp DNA Ladderl-5DHSs 文库 DNA PCR 产物 1、N8 引物 2、N9 引物 3、SlO 引物 4、S115、S12 引物 6-10无PE接头DHSs文库DNA PCR产物6、N8引物7、N9引物8、SlO引物9、Sll引物10、 S12引物11、PCR无引物阴性对照12, PCR无模板阴性对照图5为全细胞水平高效捕获染色质转录调控区新方法A. DNase I酶切染色质转录调控区示意图B.全细胞水平高效捕获染色质转录调控区新方法示意6为胶回收DNase I酶切100_300bp DNA电泳图Mr IOObP DNA Ladder1-3 DNase I 酶切 100_300bp DNA图7为高通量测序结果进行生物信息学分析流程图8为Peak在基因功能元件上的分布特征比较
图9为Peak相关基因GO功能聚类分析比较图10为三个样品与peak相关基因进行差异分析文氏11为Peak特有基因Reads在基因功能元件上的分布特征图12为Real time PCR验证DHSs文库构建方法特异性
具体实施例方式在本发明的具体实施方案中，以人HeLaS3细胞为模型，应用本发明的全细胞水平高效捕获染色质转录调控区的新方法，捕捉活性染色质经DNase I (10U/ml)酶切产物中的短DNA片段(100-300bp)构建DHSs文库，直接利用高通量全基因组深度测序技术捕捉染色质高敏感位点区域，分析其分布特征。为全基因组范围内更精确的定位活性染色质转录调控区域、染色质变构相关的调控元件结合区域的研究建立了新的方法。通过多聚酶链式反应(PCR)对DHSs文库构建方法进行了可靠性验证。将活性染色质经DNase I (10U/ml)酶切产物中的短DNA片段(100-300bp)构建的DHSs文库，送华大基因公司，Illumina公司的Solexa基因组分析平台(Genome Analyzer platform)进行高通量测序。通过高通量测序获得HeLaS3细胞染色质高敏感位点相关序列14284385条 (Reads)，其中有10505670条高质量序列能精确比对到人类基因组上的唯一位置(Unique mapped reads)。利用本发明的方法构建的HeLa S3 DHSs文库捕捉到的Peak (Unique mapped reads富集区)通过全基因组信息统计和分布分析，在基因功能元件coding， 5 ’ UTR, upstream20k区的分布比例；Peak相关基因的GO功能聚类基因数量；HeLaS3 DHSs Reads在全基因组不同染色体上的分布比例等方面的指标均优于发表在UCSC网站 (http://genome, ucsc. Edu/cgi-bin/hgTrackUi ？ Db = hgl9&g = wgEncodeUwDNase)上的两个独立HeLaS3细胞全基因组DHSs分析结果(使用Crawford等人的文库构建方法构建文库)。进一步通过Real time PCR验证本发明捕获细胞活性染色质上DNase I酶切产物中100-300bp短DNA片段构建文库方法的特异性和灵敏性。本发明所述全细胞水平高效捕获染色质转录调控区的新方法，包括DNase I酶切细胞核中染色质DNA、DNase I酶切基因组DNA、酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、琼脂糖凝胶回收、 PCR反应等6个步骤。以下通过实施例来进一步阐明本申请的内容。应当理解，实施例仅用于示例性说明申请的技术方案的具体实施方式
，而不是以任何方式限定本申请的范围。实施例1步骤一、裂解细胞，提取细胞核培养HeLa S3细胞生长达80%融合后换无血清培养基，血清饥饿24小时[15，16] 后，弃培养液。用冰预冷的PBS洗细胞两次，再加Iml PBS在冰上用细胞刮刮细胞，4°C， 3000rpm离心3分钟，收集细胞。用PBS缓冲液悬浮细胞，并对细胞进行计数。再次离心收集细胞。加入含0. 2% NP-40的RSB裂解液，轻柔混勻，使细胞终浓度为5 X 106/ml，冰浴10 分钟。4°C，3000rpm离心10分钟，收集细胞核。用无NP40的RSB缓冲液洗涤细胞核，洗去多余的NP40，4°C，3000rpm离心10分钟。上述实验均4°C完成。步骤二、DNase I酶切细胞核中染色质DNA1、将细胞核悬浮于1 X DNase I消化缓冲液中，使其终体积为400 μ 1。加入DNaseI (5U/ml、10U/ml、20U/ml)，37°C反应 lOmin，EDTA 灭活。同时做无 DNase I 酶切的对照。2、基因组DNA纯化(酚/氯仿抽提，乙醇沉淀)上述反应终止后，加入蛋白酶K至终浓度为100 μ g/ml，50°C反应过夜。加入等体积酚，冰上放置lOmin，IOOOOrpm离心lOmin。取上清，加入等体积酚/氯仿(1:1)，冰上放置lOmin，IOOOOrpm离心lOmin。再次取上清，加入等体积氯仿，冰上放置lOmin，IOOOOrpm 离心lOmin。取上清，加入1/10体积的3M NaAc和2. 5倍体积的无水乙醇，_20°C沉淀Ih以上，4°C，12000rpm离心15min，沉淀用70 %乙醇洗一遍，室温放置待乙醇挥发干净后，加入 50 μ 1 ddH20溶解，用紫外分光光度计检测DNA样品的浓度，DNA于_20°C保存备用。步骤三、DNase I酶切基因组DNA取纯化后的无DNase I酶切样品提取的基因组DNA，加1 XDNase I消化缓冲液中， 使其终体积为400μ1。加入DNase I (10U/ml)，37°C反应10min，EDTA灭活。酶切产物乙醇沉淀回收，加入1/10体积的3M NaAc和2. 5倍体积的无水乙醇，-20°C沉淀Ih以上，4°C， 12000rpm离心15min，沉淀用70 %乙醇洗一遍，室温放置待乙醇挥发干净后，加入50 μ 1 ddH20溶解，用紫外分光光度计检测DNA样品的浓度，DNA于-20°C保存备用。作为DNase I 酶切基因组DNA对照。步骤四、胶回收DNase I酶切产物1、配制1. 5 %琼脂糖凝胶称取0. 3g琼脂糖，加0. 5 X TBE 20ml，微波炉内融化，冷却至65°C，加入Goldview 0. 7μ 1灌入制胶槽，避光室温放置30min。2、电泳用扩口枪头吸取DNA样品，包括DNase I酶切的细胞核染色质DNA ；未经DNase I 酶切的细胞核染色质DNA对照；DNase I酶切的细胞基因组DNA对照，上样。5V/cm的电压， 进行DNA琼脂糖胶分离，电泳结果如(图1)所示，切取100-300bp范围的片段，置于1.5ml EP管内。同时从胶上切取> 300bp的所有片段，置于1.5ml EP管内作为对照。3、DNase I酶切产物的胶回收纯化采用Qiagen公司的QIAquick Gel Extraction Kit，称量胶重量，加入3倍体积 QG结合液，55°C，IOmin将胶融化；将试剂盒中的硅胶膜型离心纯化管柱放入2ml的收集管； 将样品分次转移至离心管柱中，13，OOOXg离心Imin ；弃去离心得到的液体，再将柱子放回原收集管；在柱内加入750 μ 1 PE buffer，13，000Xg离心Imin洗涤柱子；弃去离心得到的液体，再将柱子放回原收集管，13，OOOXg离心2min，尽量除去残余的乙醇；将离心管柱放入1. 5ml的干净Eppendorf管中；在柱子中央加入60 μ 1 H2O,静置2min，13，000 X g离心 Imin 洗脱 DNA。步骤五、DHSs文库扩增1、DNase I酶切产物末端修复反应体系体积(μ )DNA (胶回收纯化)30dNTP8T4 DNA Ligase buffer6T4 DNA Polymerase3T4PNK3Klenow3Add ddH20 up to60混勻上述反应物，20°C，30min。加ddH20，将反应液体积补足至500μ 1，酚/氯仿抽提纯化，乙醇沉淀(方法同上)，用42 μ 1 ddH20溶解DNA。2、DNA片段3，末端加A
反应体系体积DNA (末端修复纯化)42IOXKlenow buffer5dATP(lOmM)1Klenow (exo")2Total volume5037°C，温浴 30min。75°C，灭活 2min。3、加接头，用于DHSs文库扩增
反应体系体积(μ )1 (adaptor)2 (no adaptor)Template DNA505010XT4 Ligase buffer6.56.5PE adaptor 12—PE adaptor22—T4 DNA Ligase33Add CidH2O up to656516°C水浴，连接过夜。此步骤，做不加接头的对照。反应结束，加ddH20，将反应液体积补足至500 μ 1，酚/氯仿抽提纯化，乙醇沉淀(方法同上)，用35 μ 1 ddH20溶解DNA。4、胶回收加接头DNA样品配制1.5%琼脂糖凝胶，上样，电泳，电泳结果如(图2)所示。从胶上切取 150-350bp 的 DNA 片段，采用 Qiagen 公司的 QIAquick Gel Extraction Kit 回收 DNA 样品 (方法同上)。
5、DHSs文库扩增
PCR反应体系体积(μΟTemplate DNA2IOXEx taq buffer5dNTP4PEl primer2PE2 primer2Ex taq DNA polymerase0.25Add ddH20 up to5094 V，3min 预变性；94 V，30sec ；64 V，30sec ；72 °C，30sec ；30 次循环；72 V， IOmin ；4°C。取10 μ 1 PCR产物，加6Χ上样缓冲液，1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如(图 3)所示。步骤六、DHSs文库的验证选取五对引物对DNase I文库实验操作进行可靠性验证。选取随机引物2对(Ν8， Ν9)和具有DNase I高敏感区域的2对引物(S10，Sll)以及本实验室筛选到的一对egfr 启动子区的DNase I高敏感区域的引物(S12)进行验证。以不加接头的样品为对照。取 IOul PCR产物，加6Χ上样缓冲液，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如(图4)所示。PCR 引物及接头序列如表1所示。表IPCR引物及接头序列
PrimerSequence(5， — 3，)PE adapterl-sACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTPE adapterl-asGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-NH2PE adapter2-sCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTPE adapter2-asGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG-NH2PE primer1ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTPE primer2CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTN8 primer1CCAGCATTGGCACCATACCTACCN8 primer2CCTCCATAACAGGCACTGATAACACTT
8
权利要求
1.全细胞水平高效捕获染色质转录调控区的新方法。
2.权利要求1捕获染色质转录调控区的新方法，其中选择DNaseI酶切细胞核内染色质得到的100-300bp短DNA片段进行文库构建。
3.权利要求2的所述的细胞主要指真核细胞。
全文摘要
全细胞水平高效捕获染色质转录调控区的新方法及其用途本发明涉及全细胞水平高效捕获染色质转录调控区的新方法。所述新方法能在全基因组范围内更精确、更敏感地定位染色质转录调控区。这种方法可以用来寻找真核细胞转录调控的染色质区域，是功能基因组研究的有效手段。
文档编号C40B50/06GK102534814SQ20121001522
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者周萍, 张玉祥, 王雅梅 申请人:首都医科大学