利用丝胶蛋白原位绿色合成纳米银的方法及其产品与流程

本发明属于生物材料领域，具体涉及利用丝胶蛋白原位绿色合成丝胶-纳米银的方法，还涉及利用该方法制得的产品及其产品。

背景技术：

纳米技术是近年来的研究热点之一。纳米材料因其表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应在光学、电子学和生物学领域具有广泛的应用前景。纳米银作为一种广为人知的纳米材料，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌和病毒均具有良好的抑制活性，在生物医学如创伤修复等领域得到了广泛的应用。目前已有纳米银产品应用于临床医学，如纳米银水凝胶、纳米银创伤帖、纳米银喷剂等。

纳米银主要通过化学和物理的方法合成，这些方法一般步骤繁琐，条件苛刻，且易引入有毒有害试剂。纳米银在空气中易于被氧化和聚集，从而失去抗菌活性，这些缺点使得纳米银材料在实际运用中受到一定的限制。利用有机或者无机材料制备纳米银复合材料，虽然可以增加纳米银的稳定性，然而通常方法复杂，成本较高，且伴随有生物相容性的问题。通过绿色合成制备纳米银复合材料，以便用于生物医学领域，越来越受到人们的关注。

丝胶蛋白由蚕的中部丝腺细胞分泌，是包裹在丝素纤维表层的一种天然大分子粘性蛋白，对丝素起到保护和黏连的作用。丝胶含有18种天然氨基酸，其中8种是人体必须的氨基酸，还有高含量的甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸以及酪氨酸。丝胶蛋白具有多种良好的生物活性，如抗氧化性、抗菌性、抗交联、促进细胞增殖和分化等功能，并且丝胶蛋白亲水，具有良好的生物可反应性和生物降解性，因此在再生医学领域受到了越来越多的关注。丝胶常通过共聚、交联或与其他聚合物混合制备各种支架，从而提高材料的特性使其更好的适应生物医学的各种需求，如表皮再生等。除了与其他生物材料复合外，人们也尝试了用纯丝胶蛋白制备生物支架，如二维膜、三维海绵支架等。丝胶易溶于热水，低浓度的丝胶在常温时呈溶液状态，高浓度时为凝胶状态。不同提取方法制备的丝胶粉溶解状态有一定差别，总的来说，低分子量的丝胶更易溶解。但是，目前并未公开利用丝胶蛋白制备纳米银材料的报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供利用丝胶蛋白原位绿色合成丝胶-纳米银的方法，该方法满足绿色制备纳米银的环境可接受的溶剂系统、生态环境友好的还原剂和稳定剂三个要素；本发明的目的之二在于提供利用丝胶蛋白原位绿色合成丝胶-纳米银的方法制得的产品，制得的产品具有较好的分散性和稳定性，对金黄色葡萄球菌具有很好的杀菌作用，且细胞毒性低。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、利用丝胶蛋白原位绿色合成丝胶-纳米银的方法，具体步骤如下：向丝胶溶液中加入硝酸银溶液，然后在自然光照条件下反应至溶液成黄色，制得丝胶-纳米银。

本发明利用天然蛋白丝胶具有良好的生物相容性和生物可降解性，以丝胶蛋白为生物模板，利用其酪氨酸具有的还原性，可原位制备丝胶-纳米银复合材料。

优选的，所述丝胶溶液浓度为2～16mg/ml。

优选的，所述丝胶溶液由以下方法制备：将蚕茧剪碎后在120℃、0.1Mpa条件下处理至少30min，固液分离收集溶液，然后冷冻干燥，加温度为60℃以上的热水溶解制得。

更优选的，所述固液分离为先将蚕丝拧干，溶液利用纱布过滤。

更优选的，所述冷冻干燥为将丝胶溶液在-80℃条件下冷冻，然后置于冷冻干燥机中干燥至少24h。

优选的，所述硝酸银溶液浓度为2～16mg/ml。

优选的，所述反应的时间为24～36h。

2、利用丝胶蛋白原位绿色合成丝胶-纳米银的方法制得丝胶-纳米银。

本发明的有益效果在于：本发明公开了利用丝胶蛋白原位绿色合成丝胶-纳米银的方法，利用酪氨酸的酚羟基具有还原性，可以在溶液中还原银离子，因此在丝胶溶液中加入硝酸银，然后在自然光照条件下反应制得。该方法操作简单，条件温和，绿色环保；制得的纳米银具有良好的分散性和稳定性，对金黄色葡萄球菌具有很好的杀菌作用，且细胞毒性低，具有良好的生物相溶性，制得的丝胶-纳米银具有很好的应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为丝胶-纳米银制备流程图及结果；A表示丝胶-纳米银制备流程图；B表示UV-vis检测纳米银。

图2为硝酸银浓度对丝胶-纳米银生成的影响；A表示UV-vis检测不同硝酸银浓度制得的丝胶-纳米银；B表示荧光检测硝酸银浓度对酪氨酸内源荧光的影响。

图3为丝胶/硝酸银反应动力学检测；A表示不同反应时间丝胶中酪氨酸的UV-Vis吸收光谱；B表示不同反应时间丝胶中酪氨酸的内源荧光光谱。

图4为丝胶-纳米银中纳米银的形态；A表示纳米银的TEM形貌观察；B表示纳米银粒径大小分析；C表示单个纳米银的高分辨率观察；D表示单个纳米银的衍射图谱。

图5为丝胶-纳米银成分检测结果；A表示XRD检测丝胶-纳米银的生成和结晶度；B表示FT-IR检测丝胶-纳米银的生成。

图6为纳米银稳定性检测及光照必要性实验(A表示稳定性检测结果，a为刚反应完后制备的丝胶-纳米银；b为制备好的丝胶-纳米银在光照下放置50天后结果；c为制备好的丝胶-纳米银在黑暗条件下放置50天后结果；B表示丝胶与硝酸银混合后置于黑暗条件50天后光照检测纳米银随光照时间的生成量变化情况。

图7为丝胶-纳米银对金黄色葡萄球菌的抑菌实验；A表示丝胶-纳米银最低抑菌浓度；B表示丝胶-纳米银最低杀菌浓度检测。

图8为3T3细胞在添加了不同浓度丝胶-纳米银溶液的培养基中培养12h后的细胞活性检测。

图9为3T3细胞在添加了不同浓度丝胶-纳米银溶液的培养基中培养12h后的细胞形态观察。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

利用丝胶蛋白原位绿色合成纳米银的方法，制备流程如图1中A所示，具体如下：

1)丝胶的提取：取10g蚕茧剪成小碎片，按浴比为1:30放置在高压灭菌锅中，在120℃、0.1Mpa条件下处理30min，然后将蚕丝拧干，用纱布过滤收集滤液即得到丝胶提取液；

2)丝胶粉末的制备：将步骤1)制得的丝胶提取液在-80℃条件下冷冻2小时，然后置于冷冻干燥机中干燥24h，得到丝胶粉末；

3)丝胶溶液的制备：将步骤2)制得的丝胶粉末按0.1％(wt)加入60℃以上的热水重溶，制得丝胶溶液；

4)丝胶-纳米银的制备：向步骤3)制得的丝胶溶液中加入4mg/mL的硝酸银，制得丝胶-硝酸银溶液，然后将丝胶-硝酸银溶液置于自然光照条件下反应24小时，观察到反应液由无色逐渐变为黄色，制得丝胶-纳米银。

制得的丝胶-纳米银UV-vis检测结果如图1中B所示。

实施例2

利用丝胶蛋白原位绿色合成纳米银的方法，制备流程如图1中A所示，具体如下：

1)丝胶的提取：取10g蚕茧剪成小碎片，按浴比为1:30放置在高压灭菌锅中，在120℃、0.1Mpa条件下处理30min，然后将蚕丝拧干，用纱布过滤收集滤液即得到丝胶提取液；

2)丝胶粉末的制备：将步骤1)制得的丝胶提取液在-80℃条件下冷冻2小时，然后置于冷冻干燥机中干燥24h，得到丝胶粉末；

3)丝胶溶液的制备：将步骤2)制得的丝胶粉末按0.1％(wt)加入60℃以上的热水中重溶，制得丝胶溶液；

4)丝胶-纳米银的制备：向步骤3)制得的丝胶溶液中加入8mg/mL的硝酸银，制得丝胶-硝酸银溶液，然后将丝胶-硝酸银溶液置于自然光照条件下反应24小时，观察到反应液由无色逐渐变为黄色，制得丝胶-纳米银。

制得的丝胶-纳米银UV-vis检测结果如图1中B所示。

实施例3

利用丝胶蛋白原位绿色合成纳米银的方法，制备流程如图1中A所示，具体如下：

1)丝胶的提取：取10g蚕茧剪成小碎片，按浴比为1:30放置在高压灭菌锅中，在120℃、0.1Mpa条件下处理30min，然后将蚕丝拧干，用纱布过滤收集滤液即得到丝胶提取液；

2)丝胶粉末的制备：将步骤1)制得的丝胶提取液在-80℃条件下冷冻2小时，然后置于冷冻干燥机中干燥24h，得到丝胶粉末；

3)丝胶溶液的制备：将步骤2)制得的丝胶粉末按0.1％(wt)加入60℃以上的热水中重溶，制得丝胶溶液；

4)丝胶-纳米银的制备：向步骤3)制得的丝胶溶液中加入16mg/mL的硝酸银，制得丝胶-硝酸银溶液，然后将丝胶-硝酸银溶液置于自然光照条件下反应36小时，观察到反应液由无色逐渐变为黄色，制得丝胶-纳米银。

制得的丝胶-纳米银UV-vis检测结果如图1中B所示。

为研究硝酸银浓度对纳米银生成的影响，使用浓度分别为2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、12mg/ml和16mg/ml的硝酸银溶液制备丝胶-纳米银，然后检测纳米银的生成情况，结果如图2中A所示。结果显示，随着硝酸银浓度的增加，纳米银的生成量逐渐增加；当硝酸银浓度超过4mg/ml，纳米银的增加不是很显著。因此，4mg/ml的硝酸银能与大多数的丝胶反应生成纳米银。为进一步证实UV-vis的实验结果，利用酪氨酸的内源荧光分析了2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、12mg/ml和16mg/ml的硝酸银对纳米银生成的影响，结果如图2中B所示。结果显示，随着硝酸银浓度的增加，酪氨酸的内源荧光强度逐渐下降，表明丝胶溶液中的酪氨酸逐渐被硝酸银氧化；当硝酸银浓度超过4mg/ml，酪氨酸的内源荧光强度变化不再明显。结果表明，4mg/ml的硝酸银能与大多数的丝胶反应生成纳米银，这与UV-vis的检测结果一致。

为研究丝胶与硝酸银的反应动力学，检测反应时间分别为2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h和32h酪氨酸吸光强度的改变，结果如图3所示；其中图3中A表示丝胶/硝酸银反应动力学检测结果，图3中B表示反应时间对纳米银生成的影响，内插图显示了随着反应时间的进行，比色皿中丝胶-硝酸银混合溶液颜色的改变。结果表明，随着反应时间的增加，酪氨酸的吸光强度逐渐增加，反应持续进行，纳米银的生成量逐渐增加；当反应时间超过24h，酪氨酸的吸光强度增加不再明显，表明24h的反应时间已经足以让体系中大多数的丝胶和硝酸银反应生成纳米银。

接着利用透射电子显微镜TEM观察丝胶-纳米银复合材料中纳米银的形态，结果如图4所示。其中图4中A表示利用TEM观察纳米银的形貌；图4中B表示纳米银粒径大小分析；图4中C表示单个纳米银的高分辨率观察；图4中D表示单个纳米银的衍射图谱。结果显示，利用这种方法制备的纳米银颗粒具有很好的分散性，大多数纳米银的粒径位于4-20nm，中位值为12nm，生成的纳米银具有较好的结晶度和抗菌活性。然后利用X射线衍射XRD和傅立叶变换红外光谱FT-IR检测丝胶-纳米银的生成，结果如图5所示。其中图5中A表示利用XRD检测纳米银的生成和结晶度，B表示利用FT-IR检测纳米银的生成。结果表明，利用这种方法成功地在丝胶上原位生成纳米银，并且生成的纳米银具有很好的结晶度，这与之前TEM的观察结果基本一致。

丝胶-纳米银稳定性与光照条件必要性分析：

利用UV-Vis光谱检测刚制备好的丝胶-纳米银、反应后分别放置在光照和黑暗条件50天下的丝胶-纳米银，结果如图6中A所示。结果显示，三种条件下，酪氨酸的最大吸收光谱的峰位和吸收强度基本一致，表明一旦丝胶和硝酸银充分反应生成了纳米银，纳米银今后将不再会发生变化。该实验证明了利用此法制备的纳米银在常温下具有高度的稳定性。接下来验证光照为纳米银生成的必要条件。将丝胶与硝酸银混合后置于黑暗条件下50天后光照，分别检测不同光照时间下纳米银生成的变化情况，结果如图6中B所示。内插图反应了随着反应时间的增加，丝胶-纳米银混合溶液颜色的改变。结果显示，随着反应时间的增加，酪氨酸的吸光值不断增加，表明不断有硝酸银被酪氨酸还原，内插图的颜色变化也反映了纳米银随着反应时间增加不断合成。这一结果表明了光照是丝胶还原硝酸银生成纳米银的必要条件。

丝胶-纳米银的抑菌实验：

1、最低抑菌浓度实验

本发明通过等倍稀释法进行最低抑菌浓度检测(MIC)，从而确定丝胶-纳米银对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度，具体方法为：

1)取金黄色葡萄球菌的单菌落接种于灭菌的100mL LB液体培养基(pH 7.4)中，在转速为220rpm、温度为37℃条件下培养12小时；

2)用LB培养基稀释细菌至浓度为2×10⁵CFU/mL，将其分发到12个试管中，第一管1.6mL，其余每管1mL；

3)向第一管中加入0.4mL制备好的浓度为4mg/mL的丝胶-纳米银，混匀后向下一管中加入1mL第一管的混合溶液，依次类推，控制丝胶-纳米银的终浓度范围为1.5625mg/L～800mg/L，同时设立不加丝胶-纳米银和不加细菌的空白对照；

4)将菌液于37℃培养24h，肉眼观察到无细菌生长、同时检测OD₆₀₀的吸光值不再变化的丝胶-纳米银最小浓度即为MIC，结果如图7中A所示。结果显示，丝胶和低浓度的纳米银对金黄色葡萄球菌的生长几乎没有影响；当纳米银浓度为25mg/L时，菌液变得澄清，观察不到细菌的生长，且OD₆₀₀的吸光值也明显降低，和不加细菌的对照组基本持平，表明丝胶-纳米银的最低抑菌浓度为25mg/L。

2.最低杀菌浓度实验

为进一步确定丝胶-纳米银溶液的杀菌作用，利用最低杀菌浓度(MIC)的检测方法测试丝胶-纳米银的杀菌效果。具体方法如下：

1)取MIC浓度以上的试管中每管取100μL，涂布于2YT固体培养基上；

2)放置于37℃恒温培养箱培养24h，每个平板中单克隆数目小于5个的丝胶-纳米银浓度为最低杀菌浓度，结果如图7中B所示。结果显示，随着纳米银浓度的增加，平板中的金黄色葡萄球菌数目明显的减少，当纳米银的浓度为100mg/L时观察不到细菌菌落的存在，表明100mg/L的纳米银完全杀死了金黄色葡萄球菌，所以丝胶-纳米银的最低杀菌浓度为100mg/L。

丝胶-纳米银细胞毒性实验

为了确定丝胶-纳米银的生物相容性，对丝胶-纳米银进行细胞毒性实验，所选细胞为小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)，具体方法为：

1)将NIH/3T3细胞培养于含有10％(v/v)胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM培养基中，在含5％CO₂，37℃培养箱中培养；

2)收集生长至96％汇合度的NIH/3T3细胞，按500/100μL/孔平铺到96孔细胞培养板中，在含5％CO₂，37℃培养箱中继续培养12h；

3)将质量分数为0.1％的丝胶溶液和不同浓度的丝胶-纳米银溶液添加到96孔板中，控制纳米银的终浓度为5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L、35mg/L、40mg/L。在含5％CO₂、37℃培养箱中继续培养12h；

4)向96孔板中按照10μL/孔的剂量加入CCK-8试剂，在含5％CO₂、37℃条件继续培养4h，在450nm波长下测定孔内的细胞吸光值，结果如图8所示。结果显示，丝胶和低浓度的纳米银对细胞的生长几乎没有影响，当纳米银的浓度增加到30mg/L时，对细胞的生长有明显的抑制作用。

然后在光学显微镜下观察不同浓度纳米银处理后的细胞形态，结果如图9所示。结果显示，丝胶溶液和低浓度纳米银溶液处理对细胞的形态几乎没有影响，当纳米银的浓度为35mg/L时，能观察到有明显细胞破裂的情况发生。

最后需要说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。