使用磁性二氧化硅颗粒的测定方法和该测定方法用试剂的制作方法
【专利摘要】本发明的测定对象物质测定方法的特征在于，使用磁性二氧化硅颗粒来测定试样中的测定对象物质，在所述磁性二氧化硅颗粒中，在含有60重量%～95重量%的平均粒径为1nm～15nm的超顺磁性金属氧化物的二氧化硅颗粒的表面，固定化有测定对象物质、测定对象物质的类似物质或者与测定对象物质特异性结合的物质。
【专利说明】使用磁性二氧化硅颗粒的测定方法和该测定方法用试剂
【技术领域】
[0001] 本发明涉及使用磁性二氧化硅颗粒的测定对象物质测定方法和该方法中所用的试剂。更详细地说，本发明涉及在辅助诊断、辅助确认治疗效果、确认蛋白质精制时和细胞分离时的精制度等中应用的测定方法和试剂。
【背景技术】
[0002]以外，作为对含有生物物质的试样、例如生物样品中的蛋白质等进行测定或精制的方法，已知有下述方法:为了使生物样品中的蛋白质等结合在蛋白质所能够结合的颗粒表面、并除去生物样品中的目标蛋白质等以外的杂质，对颗粒进行清洗，回收结合了蛋白质等的颗粒，对蛋白质的结合量进行测定；或使其在蛋白质解离溶液中解离来进行精制。
[0003]此外，由于利用磁力能够容易地进行分离、回收，因而使用了具有磁性的颗粒，例如在专利文献I中记载了一种磁性二氧化硅颗粒，其是通过在由氧化铁构成的芯颗粒表面形成二氧化硅覆膜而成的。但是，该磁性颗粒的磁性体为强磁性，即使消除回收时的磁场，由于强磁性的作用，磁性体本身也会显示出一过性磁场，颗粒彼此发生自体缔合，因此存在清洗性差和/或会对接下来的操作(例如免疫反应)带来不良影响的问题。
[0004]进一步地，出于解决强磁性所致的磁性体自身的自体缔合的目的，例如在专利文献2中公开了磁性体使用超顺磁性的磁性体的磁性二氧化硅颗粒。但是，对于该磁性颗粒来说，在粒径小的情况下，磁性体的含量低，利用磁力对颗粒进行回收时要花费时间；在粒径大的情况下，由于比表面积小，因而存在所结合的蛋白质等的量少的问题。
[0005]【现有技术文献】
[0006]【专利文献】
[0007]专利文献1:日本特开2000-256388号公报
[0008]专利文献2:日本特开2000-40608号公报
【发明内容】
[0009]【发明所要解决的课题】
[0010]本发明的目的在于提供一种使用磁性二氧化硅颗粒的测定对象物质测定方法以及该测定法用试剂，该磁性二氧化硅颗粒在负载测定对象物质、测定对象物质的类似物质或者与测定对象物质特异性结合的物质时的结合性优异，并且基于磁力的回收性和除去磁力的状态下的分散性优异，即使进行短时间的清洗工序，在免疫测定中也能够表现出优异的灵敏度。
[0011]【解决课题的手段】
[0012]本发明人为了达成上述目的进行了深入研究，结果完成了本发明。即，本发明涉及一种测定对象物质测定方法，其特征在于，使用磁性二氧化硅颗粒来测定试样中的测定对象物质,在所述磁性二氧化硅颗粒中，在含有60重量％~95重量％的平均粒径为Inm~15nm的超顺磁性金属氧化物的二氧化硅颗粒的表面，固定化有测定对象物质、测定对象物质的类似物质或者与测定对象物质特异性结合的物质；以及涉及上述测定方法用的试剂，其特征在于，该试剂含有磁性二氧化硅颗粒，该磁性二氧化硅颗粒中，在含有60重量％~95重量％的平均粒径为Inm~15nm的超顺磁性金属氧化物的二氧化硅颗粒的表面上，固定化有测定对象物质、测定对象物质的类似物质或者与测定对象物质特异性结合的物质。
[0013]【发明的效果】
[0014]在本发明的测定方法和试剂中，通过使用磁力回收磁性二氧化硅颗粒能够进行简便的B/F分离。此外，由于磁性二氧化硅颗粒含有超顺磁性金属氧化物，因而该磁气特性使磁选后的颗粒的再分散性优异，其结果，能够在短时间内高灵敏度地进行测定对象物质的测定(检测)。
【具体实施方式】
[0015]作为本发明中的测定对象物质，只要为通常在该领域中进行测定的对象物质就没有特别限定，例如可以举出血清、血液、血浆、尿等生物体体液、淋巴液、血球、各种细胞类等生物体来源的试样中所含有的蛋白质、脂蛋白、核酸、免疫球蛋白、凝血相关因子、抗体、酶、激素、癌标志物、心脏疾病标志物和各种药物等作为代表性的对象物质。更具体地说，可以举出:例如白蛋白、血红蛋白、肌红蛋白、转铁蛋白、蛋白A、C反应性蛋白(CRP)等蛋白质；例如高比重脂蛋白(HDL)、低比重脂蛋白(LDL)、超低比重脂蛋白等脂蛋白；例如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)等核酸；例如碱性磷酸酶、淀粉酶、酸性磷酸酶、Y-谷氨酰转移酶(Y-GTP)、脂肪酶、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷氨酸草酰乙酸转移酶(GOT)、谷氨酸丙酮酸转移酶(GPT)、肾素、蛋白激酶(PK)、酪氨酸激酶等酶；例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等免疫球蛋白(或它们的例如Fe部、Fab部、F(ab)2部等片段)；例如纤维蛋白原、纤维蛋白分解产物(FDP)、凝血酶原、凝血酶等凝血相关因子；例如抗链球菌素O抗体、抗人B型肝炎病毒表面抗原抗体(HBs抗原)、抗人C型肝炎病毒抗体、抗风湿因子等抗体；例如甲状腺刺激激素(TSH)、甲状腺激素(FT3、FT4、T3、T4)、副甲状腺激素(PTH)、人绒毛膜性腺激素(hCG)、雌二醇(E2)等激素；例如α-胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、CA19-9、前列腺特异抗原(PSA)等癌标志物；例如肌钙蛋白T(TnT)、人脑利尿钠肽前体N端片段(NT-proBNP)等心脏疾病标志物；例如抗癫痫药、抗生素、茶碱等药物；等等。上述物质中，优选抗体、激素、癌标志物、心脏疾病标志物等。
[0016]对于本发明中的测定对象物质的类似物质(模拟物)，只要为能够与下述键合部位结合的物质，即可为任意物质，该键合部位为与测定对象物质特异性结合的物质(测定对象物质结合物质)所具有的、与测定对象物质的键合部位；换言之，只要具有测定对象物质所具有的与测定对象物质结合物质的键合部位即可；进而换言之，只要为在测定对象物质与测定对象物质结合物质的反应时若共存则能与该反应竞争的物质，则可为任意物质。
[0017]本发明中，作为与测定对象物质特异性结合的物质(测定对象物质结合物质)，可以举出例如通过“抗原“ 抗体”间反应、“糖链“蛋白质”间反应、“糖链“凝聚素”间反应、“酶“抑制剂”间反应、“蛋白质“肽链”间反应、“染色体或核苷酸链“核苷酸链”间反应或者“核苷酸链“蛋白质”间反应等相互反应而与测定对象物质或其类似物质结合的物质等，在上述各组合中，在任意一方为测定对象物质或其类似物质的情况下，另一方为该测定对象物质结合物质。例如，在测定对象物质或其类似物质为“抗原”时，测定对象物质结合物质为“抗体”;在测定对象物质或其类似物质为“抗体”时，测定对象物质结合物质为“抗原”(下文中在其它上述各组合中也是同样的)。
[0018]具体地说，可以举出例如:核苷酸链(低聚核苷酸链、多核苷酸链)；染色体；肽链(例如C-肽、血管紧张素I等)；蛋白质〔例如前降钙素、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白E (IgE)、免疫球蛋白G (IgG)、免疫球蛋白M (IgM)、免疫球蛋白D (IgD)、β 2-微球蛋白、白蛋白、它们的分解产物、铁蛋白等血清蛋白〕；酶〔例如淀粉酶(例如胰型、唾液腺型、X型等)、碱性磷酸酶(例如肝性、骨性、胎盘性、小肠性等)、酸性磷酸酶(例如PAP等)、Y-谷氨酰转移酶(例如肾性、胰性、肝性等)、脂肪酶(例如胰型、胃型等)、肌酸激酶(例如CK-1、CK-2、mCK等)、乳酸脱氢酶(例如LDHl?LDH5等)、谷氨酸草酰乙酸转移酶(例如ASTm、ASTs等)、谷氨酸丙酮酸转移酶(例如ALTnuALTs等)、胆碱酯酶(例如ChEl?ChE5等)、亮氨酸氨基肽酶(例如C-LAP、AA、CAP等)、肾素、蛋白激酶、酪氨酸激酶等〕和这些酶的抑制剂；激素(例如PTH、TSH、胰岛素、LH、FSH、催乳素等)；受体(例如针对雌激素、TSH等的受体)；配体(例如雌激素、TSH等)；例如细菌(例如结核菌、肺炎球菌、白喉菌、脑膜炎双球菌、淋菌、葡萄球菌、链球菌、肠内细菌、大肠菌、幽门螺杆菌等)、病毒(例如风疹病毒、疱疫病毒、肝炎病毒、ATL病毒、AIDS病毒、流行性感冒病毒、腺病毒、肠道病毒、脊髓灰质炎病毒、EB病毒、HAV、HBV、HCV、HIV、HTLV等)、真菌(例如念珠菌、隐球菌等)、螺旋体(例如钩端螺旋体、梅毒螺旋体等)、衣原体、支原体等微生物；来自该微生物的蛋白质或肽或糖链抗原；作为支气管哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮肤炎等的过敏原因的各种过敏原(例如来自下述物质的过敏原等:屋尘；例如美洲尘螨(2 f t 3々f 二)、欧洲尘螨(\ > t 3々F、等螨类；例如杉、柏、雀稗、豚草、猫尾草、黄花茅、黑麦等花粉；例如猫、狗、蟹等动物；例如米、蛋白等食物；真菌、昆虫、木材、药齐U、化学物质等)；脂质(例如脂蛋白等)；蛋白酶(例如胰岛素、纤维蛋白溶酶、丝氨酸蛋白酶等)；肿瘤标志物蛋白抗原(例如PSA、PG1、PGII等);糖链抗原〔例如AFP(例如LI至L3等)、hCG(hCG家族)、转铁蛋白、IgG、甲状腺球蛋白、粗衰变因子(DAF)、癌胚抗原(例如CEA、NCA、NCA-2、NFA等)、CA 19-9, PIVKA-1 I,CA125、前列腺特异抗原、癌细胞产生的具有特殊糖链的肿瘤标志物糖链抗原、ABO糖链抗原等〕；糖链(例如透明质酸、葡聚糖、上述糖链抗原等所具有的糖链等)；与糖链结合的蛋白质(例如透明质酸结合蛋白、β葡聚糖结合蛋白等)；磷脂质(例如心磷脂等)；脂多糖(例如内毒素等)；化学物质(例如Τ3、Τ4、例如三丁基锡、壬基苯酚、4-辛基苯酚、邻苯二甲酸二正丁酯、邻苯二甲酸二环己酯、二苯甲酮、八氯苯乙烯、邻苯二甲酸二-2-乙基己酯等环境激素)；施用.接种至人体的各种药剂和它们的代谢物；适体；核酸结合性物质；以及针对它们的抗体等。需要说明的是，本发明中使用的抗体也包括木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等蛋白质分解酶、或通过化学分解而产生的Fab、F(ab’)2片段等分解产物。
[0019]作为如上所述的测定对象物质结合物质，优选通过“抗原“抗体”间反应或“糖链-蛋白质”间反应与测定对象物质或其类似物质结合。具体地说，优选为针对测定对象物质或其类似物质的抗体、测定对象物质或其类似物质所结合的抗原、或者与测定对象物质或其类似物质结合的蛋白质，更优选为针对测定对象物质或其类似物质的抗体、或者与测定对象物质或其类似物质结合的蛋白质。
[0020]对于本发明中的磁性二氧化硅颗粒而言，在二氧化硅基体中分散有平均粒径为Inm?15nm且具有超顺磁性的金属氧化物。[0021]本发明中的超顺磁性金属氧化物的平均粒径是利用扫描型电子显微镜对任意200个超顺磁性金属氧化物进行观察而测定出的粒径的平均值。
[0022]超顺磁性金属氧化物的平均粒径可通过对后述超顺磁性金属氧化物制作时的金属离子浓度进行调节来控制。并且，利用通常的分级等方法也可使超顺磁性金属氧化物的平均粒径为所期望的值。
[0023]超顺磁性是指，在外部磁场的存在下物质的各原子磁矩排列而被诱发出的一过性磁场；若去除外部磁场，则部分排列受损，表示不出磁场。
[0024]作为平均粒径为Inm?15nm且示出超顺磁性的超顺磁性金属氧化物，可以举出铁、钴、镍和它们的合金等的氧化物，出于对磁场的感应性优异的原因，特别优选氧化铁。超顺磁性金属氧化物可以单独使用I种，也可以合用2种以上。
[0025]在平均粒径小于Inm的情况下，难以进行合成；在平均粒径超过15nm的情况下，所得到的磁性二氧化硅颗粒的磁气特性为强磁性，在实际用途方面，即使去除磁场，磁性体本身也显示出一过性磁场，颗粒彼此发生自体缔合，存在清洗性差和/或对免疫反应等带来不良影响的问题。
[0026]作为氧化铁，可以使用公知的各种氧化铁。氧化铁中，出于化学稳定性特别优异的原因，优选磁铁矿、Y-红铁矿、磁铁矿-α-红铁矿中间体氧化铁(中間酸化鉄)和Y-红铁矿-α -红铁矿中间体氧化铁；出于具有较大的饱和磁化度、对外部磁场的感应性优异的原因，更优选磁铁矿。
[0027]磁性二氧化硅颗粒中，超顺磁性金属氧化物的含量下限通常为60重量％、优选为65重量％，上限通常为95重量％、优选为80重量％。超顺磁性金属氧化物的含量小于60重量％的情况下，所得到的磁性二氧化硅颗粒的磁性不充分，因而在实际用途方面，在分离操作中需要花费时间；若该含量超过95重量％，则难以合成。
[0028]超顺磁性金属氧化物的制造方法没有特别限定，可以通过以Massart所报告的方法为基础的使用水溶性铁盐和氨的共沉淀法(R.Massart，IEEE Trans.Magn.1981，17，1247)、或者通过使用水溶性铁盐在水溶液中的氧化反应的方法进行合成。
[0029]磁性二氧化娃颗粒的平均粒径优选为I μ m?5 μ m、进一步优选为I?3 μ m。平均粒径小于Iym的情况下，具有分离回收时需要花费时间的倾向；若超过5 μ m，则表面积减小，具有所负载的物质(对象物质、测定对象物质的类似物质或与测定对象物质特异性结合的物质)的结合量低、结合效率降低的倾向。
[0030]本发明中的磁性二氧化硅颗粒的平均粒径为利用扫描型电子显微镜(日本电子株式会社制造的“JSM-7000F”)对任意200个磁性二氧化硅颗粒进行观察而测定出的粒径的平均值。
[0031]对于磁性二氧化硅颗粒的平均粒径，可通过调节后述的水包油型乳液制作时的混合条件(剪切力等)来调整水包油型乳液的粒径，由此来进行控制。此外，也可通过在磁性二氧化硅颗粒的制造时变更水洗工序的条件或通过通常的分级等方法使平均粒径为所期望的值。
[0032]作为本发明中的磁性二氧化硅颗粒的制造方法，可以举出例如下述方法:将分散液(Al)或分散液(A2)与溶液(B)混合，制作水包油型乳液，进行(烷基)烷氧基硅烷的水解反应和缩合反应，制造得到在二氧化硅中包含超顺磁性金属氧化物的颗粒；其中，所述分散液(Al)含有平均粒径为Inm?15nm的超顺磁性金属氧化物颗粒、相对于上述超顺磁性金属氧化物颗粒100重量％为30重量％?500重量％的(烷基)烷氧基硅烷和分散剂，所述分散液(A2)在分散液(Al)的基础上进一步含有非水溶性有机溶剂；所述溶液(B)含有水、水溶性有机溶剂、非离子型表面活性剂和(烷基)烷氧基硅烷的水解用催化剂。
[0033]在(烷基)烷氧基硅烷的水解反应和缩合反应后，利用离心分离和磁石进行固液分离，利用水或甲醇进行清洗、并进行干燥，从而得到磁性二氧化硅颗粒。
[0034]在上文和下文中，(烧基)烧氧基娃烧意味着烧基烧氧基娃烧或烧氧基娃烧。
[0035]作为上述分散剂，可以举出在分子内具有I个以上羧基的有机化合物、具有I个以上磺基的有机化合物以及具有I个以上羧基和I个以上磺基的有机化合物等。具体地说，可以举出以下示例出的(a-Ι)?(a-5)的有机化合物等，它们可以单独使用I种，也可以将2种以上合用。
[0036](a-1)具有2个以上羧基的有机化合物:
[0037]碳原子数为2?30的脂肪族多元羧酸(草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、丙烷-1，2，3-三羧酸、柠檬酸和十二烷二酸等饱和多元羧酸以及马来酸、富马酸和衣康酸等不饱和多元羧酸等)、碳原子数为8?30的芳香族多元羧酸(邻苯二甲酸、间苯二甲酸、对苯二甲酸、偏苯三酸和苯均四酸等)和碳原子数为5?30的脂环式多元羧酸(环丁烯-1，2- 二羧酸、环戊烯-1，2- 二羧酸、呋喃-2，3- 二羧酸、双环[2，2, I]七-2-烯-2，3- 二羧酸和双环[2，2, I]七-2，5- 二烯-2，3- 二羧酸等)等。
[0038](a-2)具有2个以上磺基的有机化合物:
[0039]碳原子数为I?30的脂肪族聚磺酸(甲二磺酸、1，1-乙二磺酸、1，2-乙二磺酸、1，1-丙二磺酸、1，3-丙二磺酸和聚乙烯基磺酸等)、碳原子数为6?30的芳香族多磺酸(间苯二磺酸、1，4-萘磺酸、I, 5-萘二磺酸、I, 6-萘二磺酸、2，6-萘二磺酸、2，7-萘二磺酸和磺化聚苯乙烯等)、双(氟磺酰基)酰亚胺和碳原子数为2?10的双(全氟链烷烃磺酰基)酰亚胺[双(三氟甲烷磺酰基)酰亚胺、双(五氟乙烷磺酰基)酰亚胺、双(九氟丁烷磺酰基)酰亚胺、五氟乙烷磺酰基三氟甲烷磺酰亚胺、三氟甲烷磺酰基七氟丙烷磺酰亚胺、九氟丁烷磺酰基三氟甲烷磺酰亚胺等]等。
[0040](a-3)分别具有I个以上的羧基与磺基的有机化合物:
[0041]碳原子数为2?30的磺基羧酸(磺基乙酸和磺化琥珀酸等)和碳原子数为7?30的磺基芳香族单羧酸或多元羧酸(邻、间或对磺基苯甲酸、2，4-二磺基苯甲酸、3-磺基邻苯二甲酸、3，5-二磺基邻苯二甲酸、4-磺基间苯二甲酸、2-磺基对苯二甲酸、2-甲基-4-磺基苯甲酸、2-甲基-3，5- 二磺基苯甲酸、4-丙基-3-磺基苯甲酸、4-异丙基-3-磺基苯甲酸、2，4，6-三甲基-3-磺基苯甲酸、2-甲基-5-磺基对苯二甲酸、5-甲基-4-磺基间苯二甲酸、5-磺基水杨酸和3-氧-4-磺基苯甲酸等)等。
[0042](a-4)具有I个羧基的有机化合物:
[0043]碳原子数为I?30的脂肪族饱和单羧酸(甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、月桂酸、十四酸、硬脂酸和山嵛酸等)、碳原子数为3?30的脂肪族不饱和单羧酸(丙烯酸、甲基丙烯酸、油酸等)、碳原子数为3?30的羟基脂肪族单羧酸(乙醇酸、乳酸和酒石酸等)、碳原子数为4?30的脂环式单羧酸(环丙烷羧酸、环戊烷羧酸和环己烷羧酸等)、碳原子数为7?30的芳香族单羧酸(苯甲酸、肉桂酸和萘甲酸等)、碳原子数为7~20的羟基芳香族单羧酸(水杨酸和苯乙醇酸等)和碳原子数为2~20的全氟羧酸(三氟乙酸、十一氟己酸、十三氟庚酸、全氟辛酸、十五氟辛酸、十七氟壬酸和十九氟癸酸等)等。
[0044](a-5)具有I个磺基的有机化合物:
[0045]碳原子数为I~30的脂肪族单磺酸(甲基磺酸、乙烷磺酸、丙烷磺酸、丁烷磺酸、己烷磺酸、癸烷磺酸、十一烷磺酸和十二烷磺酸等)、碳原子数为6~30的芳香族单磺酸(苯磺酸、对甲苯磺酸、邻甲苯磺酸、间甲苯磺酸、4-十二烷基苯磺酸、4-辛基苯磺酸和萘磺酸等)和碳原子数为I~20的全氟链烷烃磺酸(三氟甲基磺酸等)等。
[0046]它们之中，从与(烷基)烷氧基硅烷的相容性的方面出发，优选(a_4)中的碳原子数为10~30的有机化合物。
[0047]对于分散剂的用量，以超顺磁性金属氧化物的重量为基准优选为100重量％~2000重量％、特别优选为250重量％~1000重量％。分散剂小于100重量％的情况下，有超顺磁性金属氧化物不易分散在(烷基)烷氧基硅烷溶液中的倾向；若超过2000重量％，则在后述工序中向水溶液中进行分散时，有不易形成乳液的倾向。
[0048]作为所使用的(烷基)烷氧基硅烷，可以举出有下述通式(I)所表示的化合物。
[0049]R1i4^Si(OR2)n(I)
[0050]通式(I)中，R1和R2表示被氨基、羧基、羟基、巯基或环氧丙氧基取代或未被取代的碳原子数为I~10的I价烃基。
[0051]作为碳原子数为I~10的烃基，可以举出:碳原子数为I~10的脂肪族烃基(甲基、乙基、正丙基或异丙基、正丁基或异丁基、正戊基或异戊基和乙烯基等)、碳原子数为6~10的芳香族烃基(苯基等)和碳原子数为7~10的芳香脂肪族基(苄基等)等。
[0052]通式(I)中的η表示I~4的整数。其中，在使用η为I的烷基烷氧基硅烷的情况下，需要与η为2~4的(烷基)烷氧基硅烷合用。从反应后的颗粒强度和颗粒表面的硅烷醇基量的方面出发，优选η为4。
[0053]作为通式⑴所表示的化合物的具体例，可以举出:四甲氧基硅烷、四乙氧基硅烧、四异丙氧基硅烷和四丁氧基硅烷等烷氧基硅烷;甲基二甲氧基硅烷和甲基二乙氧基娃烧等烷基烷氧基硅烷；3_氛基丙基二甲氧基硅烷、3_氛基丙基二乙氧基硅烷、Ν_2(氛基乙基)3-氨基丙基三甲氧基硅烷和Ν-2 (氨基乙基)3-氨基丙基三乙氧基硅烷等具有被氨基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷；7_羧基-庚基三乙氧基硅烷和5-羧基-戊基三乙氧基硅烧等具有被竣基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷；3_羟基丙基二甲氧基硅烷和3_羟基丙基二乙氧基硅烷等具有被羟基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷；3_疏基丙基二甲氧基硅烷和3-疏基丙基二乙氧基硅烷等具有被疏基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷；3_环氧丙氧基丙基二甲氧基硅烷和3_环氧丙氧基丙基二乙氧基硅烷等具有被环氧丙氧基取代的烷基的烧基烷氧基硅烷等。
[0054](烷基)烷氧基硅烷可以单独使用一种，也可以合用2种以上。
[0055]相对于超顺磁性金属氧化物100重量％，(烷基)烷氧基硅烷的用量通常为30重量％~500重量％、优选为40重量％~200重量％。(烷基)烷氧基硅烷小于30重量％的情况下，超顺磁性金属氧化物的表面不易被均匀被覆；若超过500重量％，则超顺磁性金属氧化物的含有率减小，基于磁力的回收时间变长。[0056]相对于超顺磁性金属氧化物100重量％，水的用量优选为500重量％?3000重量％、特别优选为800重量％?2000重量％。
[0057]作为非水溶性有机溶剂，可以举出在25°C的水中的溶解度为0.1g/水IOOg以下的、碳原子数为6?16的芳香族烃溶剂(甲苯和二甲苯等)和碳原子数为5?16脂肪族烃溶剂(正庚烷、正己烷、环己烷、正辛烷、癸烷和十氢化萘等)等。它们可以单独使用一种，也可以合用2种以上。
[0058]相对于超顺磁性金属氧化物100重量％，非水溶性有机溶剂的用量优选为200重量％?1000重量％、特别优选为250重量％?500重量％。有机溶剂的用量若小于200重量％，则有超顺磁性金属氧化物的分散性变差的倾向；若超过1000重量％，则有磁性二氧化硅颗粒的粒径不均匀的倾向。
[0059]作为水溶性有机溶剂，可以举出在25°C的水中的溶解度为IOOg/水IOOg以上的、碳原子数为I?3的醇(甲醇、乙醇和正丙醇或异丙醇等)、碳原子数为2?9的二醇(乙二醇和二甘醇等)、酰胺(N-甲基吡咯烷酮等)、酮(丙酮等)、环状醚(四氢呋喃和四氢吡喃等)、内酯(Y-丁内酯等)、亚砜(二甲基亚砜等)和腈(乙腈等)等。
[0060]它们中，从磁性二氧化硅颗粒粒径均匀性的方面出发，优选碳原子数为I?4的醇。
[0061]水溶性有机溶剂可以单独使用一种，也可以合用2种以上。
[0062]相对于水100重量％，水溶性有机溶剂的用量优选为100重量％?500重量％。
[0063]作为非离子型表面活性剂，可以举出下述的非离子型表面活性剂:高级醇环氧烷(下文中简称为A0)加成物；碳原子数为8?24的高级醇(癸基醇、十二烷基醇、椰子油烷基醇、十八烷基醇和油烯基醇等)的环氧乙烷(下文中简称为E0) I摩尔?20摩尔和/或环氧丙烷(下文中简称为PO) I摩尔?20摩尔加成物(包括嵌段加成物和/或无规加成物。以下相同)、具有碳原子数为6?24的烷基的烷基苯酚的AO加成物；辛基或壬基苯酚的EOl摩尔?20摩尔和/或POl摩尔?20摩尔加成物、聚丙二醇EO加成物和聚乙二醇PO加成物；普朗尼克型表面活性剂等脂肪酸AO加成物；碳原子数为8?24的脂肪酸(癸烷酸、月桂酸、十四酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸和椰子油脂肪酸等)的EOl摩尔?20摩尔和/或POl摩尔?20摩尔加成物等和多元醇型非离子型表面活性剂；碳原子数为3?36的2元?8元多元醇(甘油、三羟甲基丙烷、季戊四醇、山梨糖醇和山梨糖醇酐等)的EO和/或PO加成物；上述多元醇的脂肪酸酯及其EO加成物[TWEEN(注册商标)20和TWEEN(注册商标)80等];烷基葡糖苷(N-辛基-β -D-麦芽糖苷、正十二酰基蔗糖和正辛基-β -D-吡喃葡萄糖苷等)；砂糖的脂肪酸酯、脂肪酸烷醇酰胺和它们的AO加成物(聚氧乙烯脂肪酸烷醇酰胺等)；等等。它们可以单独使用一种，也可以合用2种以上。
[0064]相对于超顺磁性金属氧化物100重量％，非离子型表面活性剂的用量优选为100重量％?1000重量％、特别优选为300重量％?500重量％。若小于100重量％或超过1000重量％，则乳液不稳定，存在所生成的颗粒的粒度分布变宽的倾向。
[0065]相对于超顺磁性金属氧化物100重量％，含有非离子型表面活性剂的水溶液的用量优选为1000重量％?10000重量％、特别优选为1500?4000重量％。若小于1000重量％或超过10000重量％，则乳液不稳定，存在所生成的颗粒的粒度分布变宽的倾向。
[0066]作为(烷基)烷氧基硅烷的水解用催化剂，可以使用路易斯酸或盐酸等，具体地说，可以使用盐酸等无机酸、乙酸等有机酸、氨等无机碱化合物、乙醇胺等胺化合物。
[0067]相对于(烷基)烷氧基硅烷的重量，水解用催化剂的用量优选为0.01重量％?100重量％、特别优选为0.2重量％?50重量％。
[0068]分散液(Al)或分散液(A2)与溶液⑶的混合方法没有特别限定，可以使用后述的设备一次性混合，从磁性二氧化硅颗粒粒径均匀性的方面出发，优选一边搅拌溶液(B)一边滴加分散液(Al)或分散液(A2)的方法。
[0069]作为分散液(Al)或分散液(A2)与溶液⑶混合时的设备，只要为通常作为乳化机、分散机而市售的设备就没有特别限定，可以举出例如:均质器(IKA社制造)、P0LYTR0N (Kinematica社制造)和TK自动均相混合机(特殊机化工业社制造)等分批式乳化机；Ebara milder (甚原制作所社制造)、TK Filmix、TK管道均相混合机(特殊机化工业社制造)、胶体磨机(Shinko pantec 社制造)>CLEARMIX (M Technique 社制造)>Thrasher>Trigonal湿式微粉碎机(三井三池化工机社制造)、CAPITRON(々Y 卜口 > ) (Eurotec社制造)和精细流动研磨机(太平洋机工社制造)等连续式乳化机；微射流机(Mizuho工业社制造)、Nanomaizer (Nanomaizer社制造)和APV GAULIN (Gaulin社制造)等高压乳化机；膜乳化机(冷化工业社制造)等膜乳化机；Vibro Mixer (冷化工业社制造)等振动式乳化机；超声波均质器(Branson社制造)等超声波乳化机等,从粒径均勻化的方面出发,优选APV GAULIN、均质器、TK自动均相混合机、Ebara milder、TKFilmix、TK管道均相混合机和 CLEARMIX。
[0070](烷基)烷氧基硅烷的水解反应和缩合反应的温度优选为25°C?100°C、进一步优选为45°C?60°C。此外，反应时间优选为0.5小时?5小时、进一步优选为I小时?2小时。
[0071]本发明的磁性二氧化硅颗粒中，由于超顺磁性金属氧化物包含在二氧化硅中、而并不存在于颗粒表面，因而可在其表面进行许多测定对象物质、测定对象物质的类似物质、或者与测定对象物质特异性结合的物质的固定化。
[0072]作为在本发明中的磁性二氧化硅颗粒上进行测定对象物质、测定对象物质的类似物质或者与测定对象物质特异性结合的物质(以下有时将它们统一简称为负载用物质)的固定化的方法，可以举出使负载用物质物理吸附至上述磁性二氧化硅颗粒的方法；从效率更为良好地对负载用物质进行固定化的方面考虑，优选使选自由戊二醛、白蛋白、碳化二亚胺、链酶亲和素、生物素和具有官能团的烷基烷氧基硅烷组成的组中的至少一种有机化合物结合在磁性二氧化硅颗粒表面，藉由它们使负载用物质固定于磁性二氧化硅颗粒。这些有机化合物中，从结合特定负载用物质的方面考虑，更优选具有官能团的烷基烷氧基硅烷。
[0073]作为上述烧基烧氧基娃烧所具有的官能团，可以举出氣基、竣基、轻基、疏基和环氧丙氧基等，在I分子烧基烧氧基娃烧中也可以具有不同种类的官能团。
[0074]作为使具有官能团的烷基烷氧基硅烷结合在磁性二氧化硅颗粒的表面的方法，可以举出:使用上述的具有被氨基、羧基、羟基、巯基或环氧丙氧基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷作为制作磁性二氧化硅颗粒时的(烷基)烷氧基硅烷的方法；或者在使用不具有这些取代基的(烷基)烷氧基硅烷制作磁性二氧化硅颗粒后，利用具有被氨基、羧基、羟基、巯基或环氧丙氧基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷对磁性二氧化硅颗粒进行处理的方法；等等。
[0075]作为后者方法的具体例，可以举出下述方法:将磁性二氧化硅颗粒按照其浓度为I重量％?50重量％分散在溶剂中，向该分散液中添加具有被氨基、羧基、羟基、巯基或环氧丙氧基取代的烧基的烧基烧氧基娃烧的溶液，在室温下进行I小时以上的水解反应和缩合反应。
[0076]该方法中的溶剂可根据所使用的烷基烷氧基硅烷的溶解性进行适宜选择，在使用可溶于水的具有被氨基、羧基、羟基或巯基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷的情况下，优选使用水或水-醇的混合溶剂等；在使用不易溶解于水的具有被环氧丙氧基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷的情况下，优选使用乙酸丁酯等。
[0077]相对于处理前的磁性二氧化硅颗粒，具有被氨基、羧基、羟基、巯基或环氧丙氧基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷的用量优选为0.1重量％?5重量％。若小于0.1重量％，则所导入的官能团数可能不充分；若超过5重量％，则存在进一步增加颗粒表面官能团量的效果减少的倾向。
[0078]在磁性二氧化硅颗粒的表面结合戊二醛、白蛋白、碳化二亚胺、链酶亲和素或生物素的方法没有特别限定，例如可如下进行结合。
[0079]对于具有醛基的戊二醛和具有羧基的生物素，可通过使其与在表面结合了具有氨基的烷基烷氧基硅烷的磁性二氧化硅颗粒发生反应而结合在磁性二氧化硅颗粒的表面。此夕卜，对于具有氨基的白蛋白和链酶亲和素以及具有碳化二亚胺基的碳化二亚胺，可通过使其与在表面结合了具有羧基的烷基烷氧基硅烷的磁性二氧化硅颗粒发生反应而结合在磁性二氧化硅颗粒的表面。
[0080]对于本发明的测定对象物质测定方法，除了使用上述本发明中的磁性二氧化硅颗粒来进行以外，只有按照该领域中通常进行的、文献[例如，酶免疫测定法第2版(石川荣治等编集、医学书院)1982年]中所记载的三明治法、竞争法和日本特开平6-130063号公报中记载的测定法来进行即可。
[0081]三明治法例如是如下进行的:使含有测定对象物质的试样、在表面进行了与测定对象物质特异性结合的物质(测定对象物质结合物质)的固定化的磁性二氧化硅颗粒、以及利用标记物质进行了标记的测定对象物质结合物质(标记测定对象物质结合物质)进行接触，在磁性二氧化硅颗粒上形成测定对象物质结合物质与测定对象物质以及标记测定对象物质结合物质的复合体(标记复合体)，对负载了该标记复合体的磁性二氧化硅颗粒进行B/F分离，测定标记复合体中的标记物质量，基于该结果测定试样中的测定对象物质。
[0082]具体地说，例如，使含有测定对象物质的试样与在表面固定化有测定对象物质结合物质的磁性二氧化硅颗粒接触，在磁性二氧化硅颗粒表面形成测定对象物质结合物质与测定对象物质的复合体，进一步使该复合体与标记测定对象物质结合物质接触，形成负载于磁性二氧化硅颗粒的测定对象物质结合物质与测定对象物质以及标记测定对象物质结合物质的复合体(标记复合体)，对负载了该标记复合体的磁性二氧化硅颗粒进行B/F分离，测定标记复合体中的标记物质量，基于该结果测定试样中的测定对象物质即可。在该方法中，使测定对象物质与固定化有测定对象物质结合物质的磁性二氧化硅颗粒反应后再使标记测定对象物质结合物质发生反应，但也可以使标记测定对象物质结合物质与测定对象物质反应后再与固定化有测定对象物质结合物质的磁性二氧化硅颗粒反应，还可使它们3个同时反应。
[0083]上述三明治法中的B/F分离意味着上述标记复合体与未参与标记复合体的形成的标记测定对象物质结合物质的分离，具体地说，其意味着负载于磁性二氧化硅颗粒的测定对象物质结合物质、负载于磁性二氧化娃颗粒的测定对象物质结合物质与测定对象物质的复合体、以及上述标记复合体与其它成分(试样中的测定对象物质以外的成分、未参与标记复合体的形成的标记测定对象物质结合物质等)的分离。
[0084]此外，B/F分离工序为标记复合体形成后的必要工序，其也可在磁性二氧化硅颗粒表面形成测定对象物质结合物质与测定对象物质的复合体后进行实施。
[0085]作为竞争法的一个方式是如下进行的:使含有测定对象物质的试样、与利用标记物质进行了标记的测定对象物质特异性结合的物质(标记测定对象物质结合物质)以及在其表面进行了测定对象物质或测定对象物质的类似物质的固定化的磁性二氧化硅颗粒进行接触，在磁性二氧化硅颗粒上形成测定对象物质或其类似物质与标记测定对象物质结合物质的复合体(标记复合体)，对负载了该标记复合体的磁性二氧化硅颗粒进行B/F分离，测定标记复合体中的标记物质量，基于该结果测定试样中的测定对象物质。
[0086]具体地说，例如，使含有测定对象物质的试样与标记测定对象物质结合物质以及负载有测定对象物质或其类似物质的磁性二氧化硅颗粒进行接触，使标记测定对象物质结合物质与试样中的测定对象物质以及磁性二氧化硅颗粒上的测定对象物质或其类似物质进行竞争反应，在磁性二氧化硅颗粒上形成测定对象物质或其类似物质与标记测定对象物质结合物质的复合体(标记复合体)，对负载有该标记复合体的磁性二氧化硅颗粒进行B/F分离，测定标记复合体中的标记物质量，基于该结果测定试样中的测定对象物质即可。在该方法中，使测定对象物质、标记测定对象物质结合物质以及负载有测定对象物质或其类似物质的磁性二氧化硅颗粒同时进行竞争反应，但也可以使测定对象物质与负载有测定对象物质或其类似物质的磁性二氧化硅颗粒接触后再加入标记测定对象物质结合物质从而进行竞争反应，还可以使测定对象物质与标记测定对象物质结合物质接触后再加入负载有测定对象物质或其类似物质的磁性二氧化硅颗粒从而进行竞争反应。
[0087]上述竞争法中的B/F分离意味着上述标记复合体与未参与标记复合体的形成的其它成分(标记测定对象物质结合物质以及标记测定对象物质结合物质与测定对象物质的复合体)的分离，具体地说，其意味着负载有测定对象物质或其类似物质的磁性二氧化硅颗粒以及负载有测定对象物质或其类似物质的磁性二氧化硅颗粒与标记测定对象物质结合物质的复合体(标记复合体)与其它成分(试样中的测定对象物质以外的成分、标记测定对象物质结合物质、测定对象物质的复合体等)的分离。
[0088]此外，作为竞争法的其它方式是如下进行的:使含有测定对象物质的试样与利用标记物质进行了标记的测定对象物质或其类似物质(标记测定对象物质或其类似物质)以及负载有测定对象物质结合物质的磁性二氧化硅颗粒进行接触，在磁性二氧化硅颗粒上形成测定对象物质结合物质与标记测定对象物质或其类似物质的复合体(标记复合体)，对负载有该标记复合体的磁性二氧化硅颗粒进行B/F分离，测定标记复合体中的标记物质量，基于该结果测定试样中的测定对象物质。
[0089]具体地说，例如，使含有测定对象物质的试样与标记测定对象物质或其类似物质以及负载有测定对象物质结合物质的磁性二氧化硅颗粒进行接触，使磁性二氧化硅颗粒上的测定对象物质结合物质与试样中的测定对象物质以及标记测定对象物质或其类似物质进行竞争反应，在磁性二氧化硅颗粒上形成测定对象物质结合物质与标记测定对象物质或其类似物质的复合体(标记复合体)，对负载有该标记复合体的磁性二氧化硅颗粒进行B/F分离，测定标记复合体中的标记物质量，基于该结果测定试样中的测定对象物质即可。在该竞争法中，使测定对象物质、标记测定对象物质或其类似物质以及负载有测定对象物质结合物质的磁性二氧化硅颗粒同时进行竞争反应，但也可以使测定对象物质与负载有测定对象物质结合物质的磁性二氧化硅颗粒进行接触后加入标记测定对象物质或其类似物质从而进行竞争反应，还可以使标记测定对象物质或其类似物质与负载有测定对象物质结合物质的磁性二氧化硅颗粒进行接触后加入测定对象物质从而进行竞争反应。
[0090]上述竞争法中的B/F分离意味着上述标记复合体与未参与标记复合体的形成的其它成分(标记测定对象物质或其类似物质)的分离，具体地说，其意味着负载有测定对象物质结合物质的磁性二氧化硅颗粒、负载有测定对象物质结合物质的磁性二氧化硅颗粒与测定对象物质的复合体、以及负载有测定对象物质结合物质的磁性二氧化硅颗粒与标记测定对象物质或其类似物质的复合体与其它成分(试样中的测定对象物质以外的成分、未参与标记复合体的形成的标记测定对象物质或其类似物质等)的分离。
[0091]此外，在测定对象物质为酶的情况下，也可通过上述三明治法和竞争法以外的使用酶活性方法的方法进行测定，例如可通过下述方法进行测定:使含有测定对象物质的试样与在表面固定化了负载有测定对象物质结合物质(例如，抗体等可与酶结合的物质)的磁性二氧化硅颗粒的磁性二氧化硅颗粒进行接触，在磁性二氧化硅颗粒上形成酶与测定对象物质结合物质的复合体，对负载了复合体的磁性二氧化硅颗粒进行B/F分离后，根据酶的种类添加底物、或者根据酶的种类添加底物和显色剂、根据需要进一步添加共轭酶，基于该底物的变化或显色剂的显色结果测定试样中的酶量。需要说明的是，底物、显色剂、共轭酶使用公知的物质即可，例如在酶为过氧化物酶的情况下，可以使用过氧化氢与鲁米诺发光试剂等。它们的用量为通常在该领域中使用的范围即可。上述方法中的B/F分离意味着测定对象物质与负载有测定对象物质结合物质的磁性二氧化硅颗粒的复合体与其它成分(试样中的测定对象物质以外的成分等)的分离。
[0092]本发明的测定对象物质测定方法中，作为使试样、磁性二氧化硅颗粒、标记的测定对象物质结合物质、标记测定对象物质或其类似物质等进行接触的方法，可以通过通常所进行搅拌、混合等处理使磁性二氧化硅颗粒分散。反应时间根据测定对象物质、所使用的测定对象物质结合物质、三明治法、竞争法等的不同来适宜设定即可，通常为I分钟?10分钟、优选为I分钟?5分钟。
[0093]本发明的测定对象物质测定方法中的B/F分离例如是如下进行的:利用磁性二氧化硅颗粒的磁性，利用磁石等从反应槽的外侧等收集磁性二氧化硅颗粒、排出反应液，加入清洗液后，拿走磁石，对磁性二氧化硅颗粒进行混合使其分散，并进行清洗，由此来进行B/F分离。上述操作可反复进行I?3次。作为清洗液，只要为通常在该领域中使用的清洗液就没有特别限定。
[0094]作为为了对测定对象物质结合物质、测定对象物质或其类似物质等进行标记而使用的标记物质，可以举出:例如在酶免疫测定法(EIA)中使用的碱性磷酸酶、半乳糖苷酶、过氧化物酶、微过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、荧光素酶、酪氨酸酶、酸性磷酸酶等酶类；例如在放射免疫测定法(RIA)中使用的99mTc、1311、1251、14C、3H、32P等放射性同位素；例如在荧光免疫测定法(FIA)中使用的荧光素、Dansyl、荧光胺、香豆素、萘胺或它们的衍生物、绿荧光蛋白质(GFP)等荧光性物质；例如虫荧光素、异鲁米诺、鲁米诺、双(2，4，6-三氟苯基)草酸酯等发光性物质；例如苯酚、萘酚、蒽或它们的衍生物等在紫外部具有吸收的物质；例如以4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基、3-氨基-2，2, 5, 5-四甲基卩比咯烧-1-氧自由基、2，6- 二叔丁基-α - (3，5- 二叔丁基-4-氧代_2，5-环己二烯-1-亚基)-对三氧自由基等具有氧基的化合物为代表的具有作为自旋标记化剂的性质的物质等。
[0095]它们中，从灵敏度等方面出发，优选酶、荧光性物质，更优选碱性磷酸酶、过氧化物酶和葡萄糖氧化酶，特别优选过氧化物酶。
[0096]为了如上所述使标记物质与测定对象物质结合物质、测定对象物质或其类似物质等结合，可利用通常在该领域中使用的方法，例如可利用在本身公知的EIA、RIA或FIA等中通常进行的本身公知的标记方法[例如:医化学実験講座(医药化学实验讲座)、第8卷、山村雄一监修、第I版、中山书店、1971 ;図説蛍光抗体(图说荧光抗体)、川生明著、第I版、(株)Soft Science社、1983 ;酵素免疫測定法(酶免疫测定法)、石川荣治、河合忠、室井潔编、第2版、医学书院、1982等中记载的戊二醛法、高碘酸法、马来酰亚胺法或吡啶基二硫化物法等]等。
[0097]标记物质的用量根据所用标记物质种类的不同而不同，因而不能一概而论；例如在使用过氧化物酶作为标记物质的情况下，使测定对象物质结合物质与标记物质按照例如通常为1:1?20的摩尔比、优选为1:1?10的摩尔比、进一步优选为1:1?2的摩尔比含有在例如Tris缓冲液、磷酸缓冲液、凡罗那缓冲液、硼酸缓冲液、Good’ s缓冲液等通常在该领域中使用的缓冲液中来进行使用即可。需要说明的是，作为该缓冲液，可以举出通常在该领域中使用的例如Tris缓冲液、磷酸缓冲液、凡罗那缓冲液、硼酸缓冲液、Good’ s缓冲液等，其PH为不会抑制抗原抗体反应的范围即可，通常为5?9。此外，在这样的缓冲液中，只要不会阻碍目标抗原抗体反应，也可以含有例如白蛋白、球蛋白、水溶性明胶、聚乙二醇等稳定化剂、表面活性剂、糖类等。
[0098]作为标记物质或其活性的测定方法，可以举出放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(EIA)、荧光免疫测定法(FIA)和化学发光免疫测定法(CLIA和CLEIA)，从短时间内的免疫测定中的灵敏度的方面出发，优选EIA、CLIA和CLEIA，更优选CLEIA。
[0099]对于本申请发明的测定方法，例如在利用三明治法测定AFP的情况下，可如下进行。
[0100]即，例如，可将含有AFP的试样10 μ L?25 μ L与例如含有0.lmg/mL?lmg/mL的抗AFP抗体负载至本发明的磁性二氧化硅颗粒而成的物质的磷酸缓冲液等缓冲液(含有磁性二氧化硅颗粒的试剂)40 μ L?50 μ L添加至反应槽中，对该反应溶液进行搅拌，使磁性二氧化硅颗粒分散，使负载在磁性二氧化硅颗粒上的抗AFP抗体与AFP接触、进行反应，形成复合体。接下来，利用磁石等由例如反应槽的外侧收集磁性二氧化硅颗粒，排出反应液，添加生理食盐水等清洗液。其后去除磁石，使该磁性二氧化硅颗粒分散、进行清洗。该操作可以反复进行I?3次。需要说明的是，对于该清洗操作，在残留有试样或含有磁性二氧化硅颗粒的试剂的情况下添加由来自辣根等的过氧化物酶(下文简称为P0D)标记的抗AFP抗体(下文简称为标记试剂)进行反应时，也可省略该清洗操作。其后例如加入标记试剂，对该反应溶液进行搅拌，使磁性二氧化硅颗粒分散，使POD标记的抗AFP抗体与上述复合体进行反应结合。接下来，与上述清洗同样地加入生理食盐水等清洗液使其分散、进行清洗。最后加入例如鲁米诺和过氧化氢，利用化学发光计测定I秒的化学发光积分量，基于该测定值计算出试样中的AFP量。需要说明的是，在这种情况下，以预先规定的含有AFP的溶液为试样，利用与上述同样的操作制作出显示AFP量与I秒化学发光积分量的关系的校正曲线等，通过使用该校正曲线可容易地计算出试样中的AFP量。
[0101 ] 本发明的试剂含有上述本发明的磁性二氧化硅颗粒，其用于上述测定方法中。具体地说，例如可以举出含有本发明中的磁性二氧化硅颗粒的缓冲液等，作为该缓冲液，优选可以举出通常在免疫测定等中使用的缓冲液，可以举出例如1，4-哌嗪二乙烷磺酸/氢氧化钠缓冲液、MOPS[3-(N-吗啉代)丙烷磺酸]/氢氧化钠缓冲液、三乙醇胺/盐酸缓冲液和PBS (磷酸缓冲液)等。
[0102]这些缓冲液中的缓冲剂的浓度优选为ImM?500mM、进一步优选为5mM?300mM、特别优选为IOmM?200mM。
[0103]上文和下文中，mM表示25°C下的浓度(毫摩尔/升)。
[0104]磁性二氧化硅颗粒的量没有特别限定，可根据所使用的测定对象物质结合物质或测定对象物质的类似物质的种类、测定对象物质的种类等进行适宜选择。
[0105]本发明的试剂优选为本发明中的磁性二氧化硅颗粒分散在缓冲液中的形态。
[0106]本发明的试剂除了为含有本发明中的磁性二氧化硅颗粒的试剂以外，还可以含有与利用标记物质进行了标记的测定对象物质特异性结合的物质、或利用标记物质进行了标记的含有测定对象物质或其类似物质的试剂(下文中有时简称为标记试剂)。该标记物质可以举出与上述本发明的测定方法项中所记载相同的物质，优选物也相同。
[0107]在标记试剂中，除了与利用标记物质进行了标记的测定对象物质特异性结合的物质、或利用标记物质进行了标记的测定对象物质或其类似物质以外，还可以含有缓冲液等。作为标记试剂中使用的缓冲液，优选在免疫测定中通常使用的缓冲液，可以举出例如与上述含有磁性二氧化硅颗粒的试剂中使用的缓冲液同样的物质，缓冲液中的缓冲剂的浓度也与在上述含有磁性二氧化硅颗粒的试剂中使用的情况相同。
[0108]本发明的试剂除了含有本发明中的磁性二氧化硅颗粒的试剂以及标记试剂以外，也可以含有化学发光试剂，该化学发光试剂可基于上述标记物质进行选择，例如，在标记物质为POD的情况下，本发明的试剂含有以2，3- 二氢-1，4-酞嗪二酮化合物和化学发光增强剂为必要构成成分的化学发光试剂第I液以及以氧化剂和水为必要构成成分的化学发光试剂第2液。
[0109]作为2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮化合物，例如可使用日本特开平2-291299号公报、日本特开平10-319015号公报和日本特开2000-279196号公报等中记载的公知的2，3- 二氢-1，4-酞嗪二酮化合物和它们的混合物等。
[0110]它们之中，优选鲁米诺、异鲁米诺、N-氨基己基-N-乙基异鲁米诺(AHEI)、N_氨基丁基-N-乙基异鲁米诺(ABEI)和它们的金属盐(碱金属盐等)，更优选鲁米诺及其金属盐，特别优选鲁米诺的钠盐。
[0111]化学发光试剂中的2，3- 二氢-1，4-酞嗪二酮化合物的含量根据其种类和应用的测定方法、测定条件等进行适宜设定，从化学发光增强效果和保存稳定性等方面出发，优选为0.5mM?80mM、进一步优选为1.8mM?40mM、特别优选为3.5mM?21mM。[0112]作为化学发光增强剂，可使用例如日本特表昭59-500252号公报、日本特开昭59-171839号公报和日本特开平2-291299号公报等中记载的公知的化学发光增强剂和它们的混合物等。
[0113]它们之中，从化学发光增强效果等方面出发，优选苯酚，更优选P-碘苯酚、4_(氰基甲硫基)苯酚和4-氰基甲硫基-2-氯苯酚，特别优选4-(氰基甲硫基)苯酚。
[0114]化学发光试剂中的化学发光增强剂的含量根据其种类和应用的测定方法、测定条件等进行适宜设定，从化学发光增强效果和保存稳定性等方面出发，优选为0.1mM?15mM、进一步优选为0.3mM?7.0mM、特别优选为0.6mM?3.4mM。
[0115]在化学发光试剂第I液中，除了 2，3- 二氢-1，4-酞嗪二酮化合物和化学发光增强剂以外，还可以含有缓冲液和/或螯合剂等。
[0116]作为缓冲液，可使用例如日本特开平10-319015号公报和日本特开2003-279489号公报等中记载的公知的缓冲液等。
[0117]它们之中，从化学发光增强效果和保存稳定性等的方面出发，优选3-[4-(2_羟基乙基)-1-哌嗪基]丙烷磺酸/氢氧化钠缓冲液、2-羟基-3-[4- (2-羟基乙基)-1-哌嗪基]丙烷磺酸.I水合物/氢氧化钠缓冲液和哌嗪基-1，4-双(2-羟基-3-丙烷磺酸).2水合物/氢氧化钠缓冲液，更优选3-[4-(2-羟基乙基)-1_哌嗪基]丙烷磺酸/氢氧化钠缓冲液和2-羟基-3-[4- (2-羟基乙基)-1-哌嗪基]丙烷磺酸.I水合物/氢氧化钠缓冲液，特别优选3-[4-(2_羟基乙基)-1_哌嗪基]丙烷磺酸/氢氧化钠缓冲液。
[0118]从化学发光增强效果和保存稳定性等方面出发，这些缓冲液中的缓冲剂的含量优选为ImM?500mM、进一步优选为5mM?300mM、特别优选为IOmM?200mM。
[0119]作为螯合剂，例如可使用日本特开平9-75099号公报和日本特开2003-279489号公报等中记载的公知的螯合剂等。
[0120]它们之中，从化学发光增强效果和保存稳定性等的方面出发，优选四配位螯合齐U，更优选乙二胺四乙酸(EDTA)及其盐(乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钠、乙二胺四乙酸四钠、乙二胺四乙酸二钾和乙二胺四乙酸三钾等)以及反式-1，2环己二胺-N，N，N’，N’ -四乙酸(CyDTA)，特别优选乙二胺四乙酸(EDTA)及其盐。
[0121]在含有螯合剂的情况下，从化学发光增强效果和保存稳定性的方面出发，以2，3- 二氢-1，4-酞嗪二酮化合物的重量为基准，其含量优选为0.001重量％?4重量％、进一步优选为0.01重量％?2重量％、特别优选为0.05重量％?I重量％。
[0122]化学发光试剂第I液优选为液体，并且从酶的荧光强度的方面出发，优选为碱性。第I液的pH优选为7?11、进一步优选为8?10。需要说明的是，pH以JISK0400-12-10:2000为基准进行测定(测定温度25°C )。
[0123]化学发光试剂第I液可通过将2，3- 二氢-1，4-酞嗪二酮化合物、化学发光增强剂以及必要时的缓冲液和/或螯合剂均匀混合而容易地得到。
[0124]作为化学发光试剂第2液所含有的氧化剂，可以举出例如日本特开平8-261943号公报和日本特开2000-279196号公报等中记载的公知的氧化剂等[无机过氧化物(过氧化氢、过硼酸钠和过硼酸钾等)、有机过氧化物(二烷基过氧化物和酰基过氧化物等)、过氧酸化合物(过氧硫酸和过氧磷酸等)等]的水溶液。
[0125]它们之中，从保存稳定性等的方面出发，优选双氧水溶液、过硼酸钠水溶液和过硼酸钾水溶液，更优选双氧水溶液。
[0126]化学发光试剂第2液中的氧化剂的浓度根据其种类和所应用的测定方法、测定条件等进行适宜设定，从化学发光增强效果等方面出发，优选为0.5mM~40mM、进一步优选为1mM~20mM、特别优选为2.5mM~10mM。
[0127]作为化学发光试剂第2液所含有的水，可以举出蒸馏水、反渗透水和去离子水等。它们之中，从化学发光增强效果和保存稳定性等方面出发，优选蒸馏水和去离子水，更优选去离子水。
[0128]化学发光试剂第2液中，除氧化剂和水以外，还可含有螯合剂等。
[0129]作为螯合剂，可以举出与作为能够包含在上述第I液中的螯合剂而示例出的螯合剂同样的物质，优选物也相同。
[0130]在含有螯合剂的情况下，从化学发光增强效果和保存稳定性的方面出发，以氧化剂的重量为基准，其含量优选为0.2重量％~100重量％、进一步优选为0.5重量％~20重
量％、特别优选为1重量％~10重量％。
[0131]化学发光试剂第2液可通过将氧化剂、水和必要时的螯合剂均匀混合而容易地得到。
[0132]【实施例】
[0133]下面通过实施例进一步说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。下文中，只要没有特别限定，%表示重量％、份表示重量份。
[0134]制造例1
[0135]在反应容器中加入氯化铁(111)6水合物2.7份、氯化铁(11)4水合物1.0份和水375份，使其溶解并升温至50°C，在搅拌下将温度保持在50°C~55°C，同时利用I小时滴加将25%氨水3.8份与水100份混合而成的溶液，滴加后搅拌I小时，加入油酸10.5份，继续搅拌2小时。冷却至室温后，通过倾滗进行固液分离，利用水50份对吸附了油酸的磁铁矿颗粒进行清洗，该操作进行3次。将所得到的吸附了油酸的磁铁矿颗粒投入到容器中，加入癸烷5.7份和四乙氧基硅烷2.2份进行混合，制备分散液(A2-1)。
[0136]向反应容器中加入25%氨水溶液39.0份、异丙醇55.4份、山梨糖醇酐单油酸酯
2.9份(三洋化成工业社制造的“ IONET S-80” )和聚氧乙烯(加成摩尔数20摩尔)烷基(C16~18)醚(三洋化成工业社制造的“EMULMIN200”)2.0份，使用CLEARMIX (MTechnique社制造)进行混合，升温至50°C后，一边在CLEARMIX的转速6000rpm下进行搅拌一边利用I小时滴加上述分散液(A2-1)，之后在50°C反应I小时。反应后，在2000rpm下离心分离5分钟，除去有微粒存在的上清。在所得到的固相中加入水50份使颗粒分散，在1000rpm下离心分离10分钟后，除去有微粒存在的上清，进行10次该操作。接下来，向所得到的固相中加入水50份使颗粒分散，以500rpm离心分离5分钟，使大粒径的颗粒沉降，回收含有具有目标粒径的颗粒的上清(1)。在余下的固相中加入水50份，在500rpm下离心分离5分钟后回收上清(2)，该操作进行2次，对固相中存在的具有目标粒径的颗粒进行回收。接下来，使用磁石对上清(1)和(2)进行颗粒的磁选，将磁选后的颗粒在80°C下干燥8小时，得到磁性二氧化硅颗粒(SI)。
[0137]制造例2
[0138]除了将乳化时的CLEARMIX的转速由6000rpm变为7500rpm以外，与制造例I同样地得到磁性二氧化硅颗粒(S2)。
[0139]制造例3
[0140]除了将四乙氧基硅烷的投料量由2.2份变为0.5份以外，与制造例I同样地得到磁性二氧化硅颗粒(S3)。
[0141]制造例4
[0142]除了将乳化时CLEARMIX的转速由6000rpm变为7500rpm以外，与制造例3同样地得到磁性二氧化硅颗粒(S4)。
[0143]制造例5
[0144]在磁铁矿颗粒制作时，将与25%氨水3.8份混合的水量由100份变为33.8份，除此以外，与制造例I同样地得到磁性二氧化硅颗粒(S5)。
[0145]制造例6
[0146]除了将乳化时CLEARMIX的转速由6000rpm变为7500rpm以外，与制造例5同样地得到磁性二氧化硅颗粒(S6)。
[0147]制造例7
[0148]除了将四乙氧基硅烷的投料量由2.2份变为0.5份以外，与制造例5同样地得到磁性二氧化硅颗粒(S7)。
[0149]制造例8
[0150]除了将乳化时的CLEARMIX的转速由6000rpm变为7500rpm以外，与制造例7同样地得到磁性二氧化硅颗粒(S8)。
[0151]制造例9
[0152]在磁铁矿颗粒制作时，将与25%氨水3.8份混合的水量由100份变为55份，将四乙氧基硅烷的投料量由2.2份变为1.2份，除此以外，与制造例2同样地得到磁性二氧化硅颗粒(S9)。
[0153]比较制造例I
[0154]除了将四乙氧基硅烷的投料量由0.5份变为8.0份以外，与制造例4同样地得到磁性二氧化硅颗粒(Hl)。
[0155]比较制造例2
[0156]除了将四乙氧基硅烷的投料量由1.2份变为12.5份以外，与制造例9同样地得到磁性二氧化硅颗粒(H2)。
[0157]比较制造例3
[0158]将四乙氧基硅烷的投料量由1.2份变为8.0份，将乳化时CLEARMIX的转速由7500rpm变为6000rpm，除此以外，与制造例9同样地得到磁性二氧化硅颗粒(H3)。
[0159]比较制造例4
[0160]将100份的硫酸亚铁溶解在1000份的水中，搅拌下利用I小时滴加将氢氧化钠28.8份溶解在水500份中得到的水溶液，之后一边搅拌一边升温至85°C，将空气吹入到悬浮液中，进行8小时氧化，进行离心分离，将由此得到的磁铁矿颗粒2.2份与癸烷5.7份和四乙氧基硅烷2.2份混合，得到分散液(R-1)。除了将分散液(A2-1)变为分散液(R-1)以夕卜，与制造例2同样地得到磁性二氧化硅颗粒(H4)。
[0161]比较制造例5[0162]除了将四乙氧基硅烷的投料量由2.2份变为12.5份以外，与比较制造例4同样地得到磁性二氧化硅颗粒(H5)。
[0163]比较制造例6
[0164]将平均粒径50nm的磁铁矿颗粒(Sigma Aldrich Japan社制造)2.2份与癸烧5.7份和四乙氧基硅烷2.2份混合，得到分散液(R-2)。除了将分散液(Α2-1)变为分散液(R-2)以外，与制造例I同样地得到磁性二氧化硅颗粒(Η6)。
[0165]实施例1
[0166]通过下述操作得到由含有磁性二氧化硅颗粒的试剂(抗AFP抗体结合磁性二氧化娃颗粒试剂)、标记试剂(P0D标记抗AFP抗体试剂)、化学发光试剂第I液和化学发光试剂第2液构成的本发明的试剂。
[0167]含有磁性二氧化硅颗粒的试剂的制作:
[0168]在加入了含有I重量％ Y-氨基丙基三乙氧基硅烷的丙酮溶液40mL的带盖聚乙烯瓶中加入制造例I中制作的磁性二氧化硅颗粒(Sl)40mg，在25°C反应I小时，利用钕磁石进行磁性二氧化硅颗粒的磁选后，利用抽吸装置吸引除去液体。接下来加入去离子水40mL，盖上盖子，将聚苯乙烯瓶缓慢地倒置搅拌2次后，利用钕磁石进行磁性二氧化硅颗粒的磁选，之后利用抽吸装置吸引除去液体，对磁性二氧化硅颗粒进行清洗。该清洗操作进行3次。接下来，将该清洗后的磁性二氧化硅颗粒加入到装入含有2重量％戊二醛的水溶液40mL的带盖聚乙烯瓶中，在25°C反应I小时。接着加入去离子水40mL盖上盖子，将聚苯乙烯瓶缓慢地倒置搅拌2次后，利用钕磁石进行磁性二氧化硅颗粒的磁选，之后利用抽吸装置吸引除去液，对磁性二氧化硅颗粒进行清洗。该清洗操作进行3次。进一步将该清洗后的磁性二氧化硅颗粒加入到带盖的聚乙烯瓶中，该瓶中加入有以20μ g/mL的浓度含有抗AFP单克隆抗体(由DAKO Japan社购入)的0.02M磷酸缓冲液(pH8.7) 40mL，在25°C反应I小时。反应后利用钕磁石进行磁性二氧化硅颗粒的磁选，之后除去含抗AFP抗体的磷酸缓冲液，制作抗AFP抗体结合磁性二氧化硅颗粒。将其利用含有1%牛血清白蛋白的0.02M磷酸缓冲液(PH7.0)稀释至以抗AFP抗体结合磁性二氧化硅颗粒浓度计为0.5mg/mL的浓度，制备得到含有磁性二氧化硅颗粒的试剂，冷蔵(2°C?10°C )保存。
[0169]标记试剂的制作:
[0170]使用抗AFP多克隆抗体(由DAKO Japan社购入)、来自辣根的POD (东洋纺社制造)，利用文献(S.Y0SHITAKE，M IMAGAWA，E.1SHIKAWA，et.al.;J.Biochem.，Vol.92，1982，1413-1424)所记载的方法制备POD标记抗AFP抗体。将其利用含有1%牛血清白蛋白的0.02M磷酸缓冲液(pH7.0)稀释至以POD标记抗AFP抗体浓度计为200nM的浓度，制备标记试剂，冷蔵(2°C?10°C )保存。
[0171]化学发光试剂第I液的制备:
[0172]将鲁米诺的钠盐[Sigma Aldrich Japan社制造]0.7g和4_(氰基甲硫基)苯酹
0.1g装入到IOOOmL量瓶中。投入3-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]丙烷磺酸/氢氧化钠缓冲液(10mM、pH8.6)使溶液的容量为IOOOmL,在25°C均匀混合，制备化学发光试剂第I液。进行冷蔵(2°C?10°C )保存直至用于测定。
[0173]化学发光试剂第2液的制备:
[0174]将过氧化氢[和光纯药工业社制造、试剂特级、浓度30重量％]6.6g装入到IOOOmL量瓶中。投入去离子水使溶液的容量为IOOOmL,在25°C均匀混合，制备化学发光试剂第2液。进行冷蔵(2°C?10°C )保存直至用于测定。
[0175]实施例2?9和比较例I?6
[0176]除了将磁性二氧化硅颗粒(SI)换为磁性二氧化硅颗粒(S2)?(S9)或(Hl)?(H6)以外，与实施例1同样地得到由含有本发明或比较用磁性二氧化硅颗粒的试剂、标记试剂、化学发光试剂第I液和化学发光试剂第2液构成的本发明的试剂。
[0177]使用所得到的试剂，按下述方法评价短时间内免疫测定中的清洗性和灵敏度，结果列于表I。此外，对于所使用的磁性二氧化硅颗粒(SI)?(S9)和(Hl)?(H6)，按以下所示的方法测定超顺磁性金属氧化物的平均粒径、磁性二氧化硅颗粒的平均粒径、超顺磁性金属氧化物的含量，对磁选性、再分散性和再凝聚性进行评价，结果一并列于表I。
[0178]<使用本发明试剂的短时间内免疫测定中的清洗性和灵敏度的评价方法>
[0179]将含有磁性二氧化硅颗粒的试剂0.025mL与利用含有I重量％的牛血清白蛋白的磷酸缓冲液制备的AFP浓度为2ng/mL的标准AFP液0.025mL加入到试验管中进行混合，在试验管中于37°C反应3分钟，形成抗AFP抗体结合磁性二氧化硅颗粒/AFP复合体。反应后，利用钕磁石由试验管的外侧收集磁性二氧化硅颗粒10秒，利用抽吸装置除去试验管中的液体，使钕磁石由侧面充分远离，加入生理食盐水0.5mL使磁性二氧化硅颗粒分散，磁选后利用抽吸装置除去液体，进行3次清洗操作。
[0180]接着，将标记试剂0.025mL注入到试验管中，在试验管中在37°C反应3分钟，形成抗AFP抗体结合磁性二氧化硅颗粒/AFP/P0D标记抗AFP抗体复合体。反应后，利用钕磁石由试验管的外侧收集磁性二氧化硅颗粒10秒，利用抽吸装置除去试验管中的液体，使钕磁石由侧面充分远离，加入生理食盐水0.5mL使磁性二氧化硅颗粒分散，磁选后利用抽吸装置除去液体，进行2次清洗操作。
[0181]最后，同时加入化学发光试剂第I液0.07mL与化学发光试剂第2液0.0lmL,在37°C进行43秒发光反应,利用发光检测器[Lumat LB9507 (Berthold Japan社制造)]测定添加化学发光试剂43?45秒后的平均发光量。需要说明的是，使用AFP浓度为Ong/mL的标准AFP液来替换AFP浓度为2ng/mL的标准AFP液，进行与上述同样的操作，用作背景。
[0182]关于清洗性，按下述基准由使用AFP浓度为Ong/mL的标准溶液进行免疫测定的情况下的平均发光量进行判定。
[0183]O:小于 lOOOOcps
[0184]Δ: lOOOOcps 以上且小于 30000cps
[0185]X:30000cps 以上
[0186]关于灵敏度，按下述基准由使用AFP浓度为Ong/mL与2ng/mL的标准溶液进行免疫测定的情况下的发光量的差进行判定。
[0187]O:25000cps 以上
[0188]Δ: lOOOOcps 以上且小于 25000cps
[0189]X:小于 lOOOOcps
[0190]<超顺磁性金属氧化物的平均粒径的测定方法>
[0191]对于任意200个超顺磁性金属氧化物，利用扫描型电子显微镜进行观察、测定粒径，将其平均值作为平均粒径。[0192]<磁性二氧化硅颗粒的平均粒径的测定方法>
[0193]对于任意200个磁性二氧化硅颗粒，利用扫描型电子显微镜进行观察、测定粒径，将其平均值作为平均粒径。
[0194]<磁性二氧化硅颗粒中的超顺磁性金属氧化物的含量的测定方法>
[0195]对于任意20个磁性二氧化硅颗粒，利用扫描型电子显微镜进行观察，利用能量分散型X射线分光装置测定超顺磁性金属氧化物的含量，将其平均值作为含量。
[0196]<磁性二氧化硅颗粒的磁选性的评价方法>
[0197]使1.0mg的磁性颗粒二氧化硅颗粒分散在2mL的离子交换水中，装入到口内径X股抒X t: ι'ι'?'^φ丨0_3mm X φ12_0mm X 35mm的玻璃容器中，在侧面放置IcmX IcmX Icm的
钕磁石，测定直至初期吸光度为20%为止的时间，按下述基准进行判定。[0198]〇:小于15秒
[0199]Δ:15秒以上且小于30秒
[0200]X:30 秒以上
[0201 ] <磁性二氧化硅颗粒的再分散性的评价方法>
[0202]使1.0mg的磁性颗粒二氧化硅颗粒分散在2mL的离子交换水中，装入到口内径
X X yI"I1I ilJ=Cp 10.3mm X φ 12.0mm X 35mm 的玻璃容器中，在侧面放置 IcmX IcmX Icm 的
钕磁石，对磁性二氧化硅颗粒进行完全磁选，除去上清，使钕磁石由侧面充分远离，将2mL的离子交换水喷出同时施加在磁性二氧化硅颗粒上，通过3次吸液进行混合后，在10秒以内利用显微镜进行观察，计算出凝聚颗粒数相对于视野内全部颗粒数的比例，按下述基准判定再分散性。
[0203]O:凝聚颗粒小于5%
[0204]Δ:凝聚颗粒为5%以上且小于20%
[0205]X:凝聚颗粒为20%以上
[0206]<磁性二氧化硅颗粒的再凝聚性的评价方法>
[0207]通过3次吸液进行混合后，将直至利用显微镜观察为止的时间由10秒以内换为5分钟，除此以外，与上述再分散性的评价方法同样地计算出凝聚的颗粒数相对于视野内全部颗粒数的比例，按下述基准进行判定。
[0208]O:凝聚颗粒小于5%
[0209]Δ:凝聚颗粒为5%以上且小于20%
[0210]X:凝聚颗粒为20%以上
【权利要求】
1.一种测定对象物质测定方法，其特征在于，使用磁性二氧化硅颗粒来测定试样中的测定对象物质，在所述磁性二氧化硅颗粒中，在含有60重量％~95重量％的平均粒径为Inm~15nm的超顺磁性金属氧化物的二氧化娃颗粒的表面，固定化有测定对象物质、测定对象物质的类似物质或者与测定对象物质特异性结合的物质。
2.如权利要求1所述的测定方法，其中，所述磁性二氧化硅颗粒为在其表面固定化有与测定对象物质特异性结合的物质(测定对象物质结合物质)的颗粒，使含有所述测定对象物质的试样与所述磁性二氧化硅颗粒以及利用标记物质进行了标记的测定对象物质结合物质(标记测定对象物质结合物质)进行接触，在所述磁性二氧化硅颗粒上形成所述测定对象物质结合物质与所述测定对象物质以及所述标记测定对象物质结合物质的复合体(标记复合体)，对负载有所述标记复合体的磁性二氧化硅颗粒进行B/F分离，测定所述标记复合体中的标记物质量，基于其结果测定所述试样中的测定对象物质。
3.如权利要求1所述的测定方法，其中，所述磁性二氧化硅颗粒为在其表面固定化有测定对象物质或测定对象物质的类似物质的颗粒，使含有所述测定对象物质的试样、和与利用标记物质进行了标记的测定对象物质特异性结合的物质(标记测定对象物质结合物质)以及所述磁性二氧化硅颗粒进行接触，在所述磁性二氧化硅颗粒上形成所述测定对象物质或测定对象物质的类似物质与所述标记测定对象物质结合物质的复合体(标记复合体)，对负载有所述标记复合体的磁性二氧化硅颗粒进行B/F分离，测定所述标记复合体中的标记物质量，基于其结果测定试样中的测定对象物质。
4.如权利要求1所述的测定方法，其中，所述磁性二氧化硅颗粒为在其表面固定化有与测定对象物质特异性结合的物质(测定对象物质结合物质)的颗粒，使含有所述测定对象物质的试样与利用标记物质进行了标记的测定对象物质或测定对象物质的类似物质(标记测定对象物质或其类似物质)与所述磁性二氧化硅颗粒进行接触，在所述磁性二氧化硅颗粒上形成所述测定对象物质结合物质与所述标记测定对象物质或其类似物质的复合体(标记复合体)，对负载有所述标记复合体的磁性二氧化硅颗粒进行B/F分离，测定所述标记复合体中的标记物质量，基于其结果测定试样中的测定对象物质。
5.如权利要求2~4 的任意一项所述的测定方法，其中，所述B/F分离是利用磁性二氧化硅颗粒的磁性进行的。
6.如权利要求1~5的任意一项所述的测定方法，其中，所述磁性二氧化硅颗粒的平均I立 1-- I μ m ~5 μ m。
7.如权利要求1~6的任意一项所述的测定方法，其中，所述超顺磁性金属氧化物为氧化铁。
8.如权利要求7所述的测定方法，其中，所述氧化铁为选自由磁铁矿、Y-红铁矿、磁铁矿-α -红铁矿中间体氧化铁和Y -红铁矿-α -红铁矿中间体氧化铁组成的组中的至少一种氧化铁。
9.如权利要求1~8的任意一项所述的测定方法，其中，在进行所述测定对象物质、所述测定对象物质的类似物质或者所述与测定对象物质特异性结合的物质的固定化之前的所述磁性二氧化硅颗粒的表面上，结合有选自由戊二醛、白蛋白、碳化二亚胺、链酶亲和素、生物素和具有官能团的烷基烷氧基硅烷组成的组中的至少一种有机化合物。
10.如权利要求9所述的测定方法，其中，所述烷基烷氧基硅烷所具有的官能团为选自由氨基、羧基、羟基、巯基和环氧丙氧基组成的组中的至少一种官能团。
11.如权利要求1~10的任意一项所述的测定方法，其中，所述与测定对象物质特异性结合的物质为针对测定对象物质或测定对象物质的类似物质的抗体、测定对象物质或测定对象物质的类似物质所结合的抗原、或与测定对象物质或测定对象物质的类似物质结合的蛋白质。
12.—种权利要求1~11的任意一项所述的测定方法用试剂，其特征在于，该试剂含有磁性二氧化硅颗粒,该磁性二氧化硅颗粒中,在含有60重量％~95重量％的平均粒径为Inm~15nm的超顺磁性金属氧化物的二氧化娃颗粒的表面，固定化有测定对象物质、测定对象物质的类似物质或者与测定对象物质特异性结合的物质。
13.如权利要求12所述的试剂，其中，所述磁性二氧化硅颗粒的平均粒径为Ιμπι~5 μ m0
14.如权利要求12或13所述的试剂，其中，所述超顺磁性金属氧化物为氧化铁。
15.如权利要求14所述的试剂，其中，所述氧化铁为选自由磁铁矿、Y-红铁矿、磁铁矿-α -红铁矿中间体氧化铁和Y -红铁矿-α -红铁矿中间体氧化铁组成的组中的至少一种氧化铁。
16.如权利要求12~15的任意一项所述的试剂，其中，在进行测定对象物质、测定对象物质的类似物质或者与测定对象物质特异性结合的物质的固定化之前的所述磁性二氧化硅颗粒的表面上，结合有选自由戊二醛、白蛋白、碳化二亚胺、链酶亲和素、生物素和具有官能团的烷基烷氧基硅烷组成的组中的至少一种有机化合物。
17.如权利要求16所述的试剂，其中，所述烷基烷氧基硅烷所具有的官能团为选自由氨基、羧基、羟基、巯基和环氧丙氧基组成的组中的至少一种官能团。
18.如权利要求12~17的 任意一项所述的试剂，其中，所述与测定对象物质特异性结合的物质为针对测定对象物质或测定对象物质的类似物质的抗体、测定对象物质或测定对象物质的类似物质所结合的抗原、或与测定对象物质或测定对象物质的类似物质结合的蛋白质。
【文档编号】C01B33/12GK103597353SQ201280028852
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年5月31日 优先权日:2011年6月15日
【发明者】水野雄介, 宫森将光, 松田真次郎, 橹曜 申请人:三洋化成工业株式会社, 和光纯药工业株式会社