专利名称：新的眼镜蛇神经毒素亲和层析介质和纯化方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和生物医药领域，更具体地，本发明涉及一类新的针对眼镜蛇神经毒素的亲和层析介质及其制备方法。本发明还涉及用这类新的亲和层析介质纯化生产眼镜蛇神经毒素的新方法。
在中国的传统医学中，眼镜蛇的毒液可以用于逐痹、镇痛。逐痹、镇痛的有效成份是眼镜蛇神经蛇毒素。这种神经毒素是短于100个氨基酸残基的多肽，它结合和作用于神经肌肉接头处N-型乙酰胆碱受体(Nicotic acetylcholinereceptor,AchR)。乙酰胆碱受体(AchR)介导着化学神经递质转化为电位的变化，导致离子通道的开放，对阳离子通透性增加，而导致运动终板去极化，最终引起肌肉的收缩。眼镜蛇神经毒素与乙酰胆碱受体(AchR)的作用，阻遏了其与化学神经递质乙酰胆碱结合，引起肌肉松弛性麻痹。
蛇毒在中药中用于镇静、止痛已经具有相当长的历史，其中神经毒素是主要的有效成分。中国科学院昆明动物所1993年申请的中国专利(CN 93121051.8)描述了蛇毒神经毒与其它物质组成的复方在戒毒和治疗老年痴呆方面的应用。国际上，1981年和1988年的美国专利(US 4341762,US 4741902)描述了蛇毒中突触后和突触前神经毒素在治疗神经系统疾病方面的应用。1998年的美国专利(US 5714468)描述了利用肉毒素(Botulinum toxin)，尤其是肉毒素A(Botulinumtoxin A)在医学方面的应用。
在医疗方面，神经毒素的止痛效果明显，没有成瘾性，特别是晚期癌症患者。在癌症晚期，肿瘤的快速扩张，引起疼痛的强度越来越大。用一般止痛药，如吗啡，由于其成瘾性，用量需要越来越多，而且效果不明显，难于解除患者的痛苦。而神经毒素用于止痛则没有相应的缺点。随着医疗条件的改善，癌症患者的存活时间越来越长，减轻他们的痛苦，提高其生活质量成为相当重要的社会需要。
此外，经济的发展和生活水平的提高，全球一体化的进展，使一部分意志薄弱者染上毒瘾。吸毒对社会稳定和人们的健康都有很大的危害。由于毒品吸食后的成瘾性，使吸食者很难断戒。而国内外至今均采用以美沙酮为代表的一种药物代替另一种成瘾药物，在医生控制下以小毒替大毒的强制治疗方案。虽有一定效果，由于毒品使用者精神依赖性高，而替代药物本身存在一定的成瘾性，吸毒者戒断后复吸率也高。因此，戒毒是社会和一些家庭相当重要的挑战。神经毒素是一种不成瘾性戒毒药物的主要成份(CN 93121051.8)，实验证明效果很好。同时，已经有报道，抑制乙酰胆碱(Ach)的数量可以延缓和治疗老年痴呆(Dtsch Med Wochenschr.1998 Nov 27；123(48 Suppl):1-4)。眼镜蛇神经毒素能够抑制过多的乙酰胆碱(Ach)信号的传递，对老年痴呆可能具有一定的的治疗效果。
研究表明，眼镜蛇毒液含有数十种复杂的蛋白和多肽成分。这类神经毒素是具有60到80多个氨基酸残基的多肽类物质，占在眼镜蛇毒液的10～20％。而其它的成分如磷酸二酯酶，则具有溶血能力，是引起副作用的物质。从医药的角度来看应该尽量除去。因为眼镜蛇神经毒素相当稳定，因此在实验室规模上分离纯化的主要方法是重复用离子交换，分子筛凝胶层析，和反相层析(Karlsson,E.et al.Eur.J.Biochem.1971,21:1-16；Cooper,D.& Reich,E.J BiolChem 1972,247:3008-13 Vogel,C.W.,et al.J Immunol Methods.1984,73:203-20；Chang,L.S.et al.J Biochem(Tokyo),1997,122:1252-9)。然而，用离子交换和凝胶过滤层析制备的神经毒素常常仍然含有少量的其它成分。这些成分可以严重干扰药学实验。高压反相层析是去除这些微量杂质成分不可缺少的手段。此外，反复用用离子交换，分子筛凝胶层析，和反相层析这些操作，会降低神经毒素的回收率，增加生产的成本。从而降低经济性。这些可能是眼镜蛇神经毒素至今未能大规模生产的原因。
因此，本领域迫切需要开发高效率、低成本、步骤简便的大规模分离和或生产眼镜蛇神经毒素的生产技术和工艺。
本发明的一个目的是提供一类新的亲和层析介质，该亲和介质可与眼镜蛇神经毒素高度专一的结合，因而可用于眼镜蛇神经毒素的分离纯化。
本发明的另一目的是提供这类亲和层析介质的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种低成本、高效率、步骤简便的大规模生产眼镜蛇神经毒素的亲和技术工艺。
在本发明的第一方面，提供了一种亲和层析介质，它包括固相载体以及偶联在固相载体上的式Ⅰ所示的亲和配位体 式中，R1是选自下组的碱性基团氨基，单取代氨基，双取代氨基，三取代氨基，脒基；R2是选自下组的酸性基团羧基，磺酸基，磷酸基；m1为1或2；m2为1或2；n1为1,2,3，或4n2为1,2,3，或4。
较佳地，式Ⅰ所示的亲和配位体选自下组对氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、间氨基苯磺酸、3-氨基环己烷羧酸、4-氨基环己烷羧酸。
在本发明的第二方面，提供了一种分离纯化眼镜蛇神经毒素的方法，它包括步骤(a)将含眼镜蛇神经毒素的原料上样于装有亲和介质的亲和层析柱，从而使眼镜蛇神经毒素吸附于亲和中；(b)洗去亲和层析柱未吸附的杂质；(c)对吸附于亲和层析介质上的眼镜蛇神经毒素进行洗脱，从而获得纯化的眼镜蛇神经毒素；其中，该亲和层析柱中含有一亲和层析介质，该亲和层析介质包括固相载体以及偶联在固相载体上的式Ⅰ所示的亲和配位体
式中，R1是选自下组的碱性基团氨基，单取代氨基，双取代氨基，三取代氨基，脒基；R2是选自下组的酸性基团羧基，磺酸基，磷酸基；m1为1或2；m2为1或2；n1为1,2,3，或4n2为1,2,3，或4。
较佳地，在步骤(a)中，亲和介质吸附眼镜蛇神经毒素的条件为盐浓度为0.005-0.03M,pH条件为pH5.0-9.0；在步骤(c)中，眼镜蛇神经毒素的洗脱条件为pH为pH2.0-5.0或pH 9.5-11.0的缓冲液，其中盐浓度为0.005-2.0M。
在一个优选例中，该方法还包括还包括步骤(d)对步骤(c)中获得的纯化的眼镜蛇神经毒素进行分子筛凝胶过滤，从而进一步纯化眼镜蛇神经毒素。
在本发明的一个优选例中，亲和配位体的通过环氧氯丙烷固定于琼脂糖层析介质上，并装入一层析柱中。神经毒素样品经过交换缓冲液处理，上于亲和层析柱中，经过冲洗未吸附的杂质，再专一洗脱眼镜蛇神经毒素。该眼镜蛇神经毒素还可通过分子筛凝胶层析，在交换为合适的缓冲液的同时，眼镜蛇神经毒素得到进一步的精制。
本发明的发明点在于，发现了一种新颖的高亲和力的眼镜蛇神经毒素亲和层析介质，并以眼镜蛇神经毒素的亲和层析为基础，提供了一种新的大规模生产眼镜蛇神经毒素的分离纯化生产工艺。
该工艺的特点是低成本、高效率和步骤简便。这种亲和技术工艺，成本和生产效率远高于其他常规分离方法，产品的纯度达到95％以上，产品回收率90％。
此外，本发明的亲和纯化工艺具有生产快速、工艺稳定的特点，所用的亲和配位体可以耐受医药生产中必需的现场在线清洗和消毒，方便地满足药品生产管理规范(GMP,Good Manufacturing Practice)。
亲和层析，又称为生物选择性吸附层析，已经成为纯化生物大分子活性物质不可缺少的分离技术。随着对生物制品中活性成分的纯度和需求量的增加，杂质含量的降低，传统分离技术如凝胶过滤和离子交换层析技术再也不能满足工业生产和学术研究的要求。
与其它方法相比，亲和层析方法具有以下几个明显的特点。亲和层析介质允许对生物分子选择地吸附和解离，可以取得很高的纯化倍数，常常为1000多倍。此外，蛋白在纯化过程中不仅得到浓缩，当结合到亲和配位体上时，蛋白的性质也更加稳定；其结果又提高了目标产品的活性回收率。因此，亲和分离技术非常适用于处理体积大，浓度低的生物活性物质。
在大规模生产的纯化工艺中，采用亲和层析技术可以大大减少纯化过程的步骤，从而减少了合格产品的生产时间和成本。当下游生产成本占总生产成本的80％时显得更加重要。在纯化过程的任何环节都可以使用亲和层析技术，但采用的越早，获得的经济效益越大。J.Bonnerjea(Biotechnology,4,954-958,1986)对生物制品生产工艺调查的结果显示，在所有被考察的工艺中，一步纯化效果最佳的单元操作中，有45％是利用亲和步骤获得的。
亲和分离介质的关键是亲和配位体(也可称为“亲和配位体”)。亲和配位体必须能够选择性地和可逆地吸附生物大分子。传统的亲和配位体为亲和介质的成功使用奠定的基础。然而，在工业生产中，天然的亲和配位体，如抗体、辅酶、氨基酸、多肽、蛋白、凝集素，具有不可克服的缺点最突出的因素是成本昂贵，生物和化学性质不稳定，生产中难于维持结合活性，也不能经受在线清洁和消毒，因此，还可能被其它物质，如病毒和内毒素污染。
针对根据眼镜蛇神经毒素的结构和性质，本发明人筛选发现了一种成本低，亲和力高的亲和配位体。将该类亲和配位体固定于固相载体后形成的层析介质，不仅能够提供高效的纯化倍数、重复性的结果，而且配位体极少脱落。更适合工业化、大规模生产医用和试剂用眼镜蛇神经毒素。
本发明人通过综合利用计算机辅助分子模拟、分子设计和有机合成等方法，设计和合成了可以专一结合眼镜蛇神经毒素的小分子亲和配基。在Brookhaven蛋白数据库中，眼镜蛇神经毒素的结构数据有数种，其中1cod.pdb(Yu,C.et al.Biochem.1993,32:2131)为台湾眼镜蛇神经毒素的结构，与中国华南地区比较接近。该神经毒素的一级结构为Leu Glu Cys His Asn GlnGln Ser Ser Gln Thr Pro Thr Thr Thr Gly Cys Ser Gly Gly Glu Thr Asn CysTyr Lys Lys Arg Trp Arg Asp His Arg Gly Tyr Arg Thr Glu Arg Gly Cys GlyCys Pro Ser Val Lys Ash Gly Ile Glu Ile Ash Cys Cys Thr Thr Asp Arg CysAsn Asn。
利用TRIPOS公司的分子模拟软件SYBYL(version6.2)在SGI Indigo zl4000工作站上进行分子的空间结构研究，结果发现了一个比较有特征的位点由氨基酸残基Lys27,Glu38,Tyr25组成。Tyr25的侧链苯环基团处于一个凹陷的中心，Lys27,Glu38的带电侧链位于该凹陷的边缘。用苯作溶剂使神经毒素溶剂化时，有一个苯分子的位置正好可以放入该位点的凹陷中。因此，随后的亲和配基设计主要以该苯环作为出发点，以该凹陷区域为结合部位。
通过综合考虑以下几方面的因素，本发明人设计出了式Ⅰ所示的亲和配位体空间表面，疏水表面，电荷和氢键几个方面的配合和互补。具体地，选择的结合部位的中心部分是Tyr25的侧链苯环基团，该基团是疏水性的。用苯环溶剂化时放入该位置的苯环也是疏水性的。从疏水的角度看，这两个疏水基团已经相配。从电荷的角度看，作为溶剂的苯环周围带电基团有Lys27的侧链氨基和Glu38的侧链羧基。因此，可以直接在苯环上接一个带负电荷的羧基与带正电荷的Lys27的侧链氨基相配；接一个带正电荷的氨基与带负电荷Glu38的侧链羧基相配；该氨基同时还能够用于固定化。由于Lys27的侧链氨基和Glu38的侧链羧基都处于分子的表面，这两个基团在溶液环境下并不是静止的，而是具有一定的活动范围。因此，根据氨基和羧基在苯环上的可能分布，设计出式[所示的亲和配位体 式中，R1是选自下组的碱性基团氨基，单取代氨基，双取代氨基，三取代氨基，脒基；R2是选自下组的酸性基团羧基，磺酸基，磷酸基；m1为1或2；m2为1或2；n1为1,2,3，或4n2为1,2,3，或4。
在结构上，式Ⅰ化合物具有以下特征围绕环状中心，一个碱性和酸性基团以间位或对位连接于中心环上。R1可以是任何碱性基团，较佳地是氨基，单取代氨基，双取代氨基，三取代氨基，脒基等；R2可以是任何的酸性基团，如羧基，磺酸基，磷酸基等。较佳地，该中心环是五元环或六元环，构成的环的原子选自下组碳原子、氮原子、氧原子和硫原子。更佳地，该中心环选自苯环和环己烷环。
一些代表性的可用于本发明的亲和配位体例子包括(但并不限于)对氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、间氨基苯磺酸、3-氨基环己烷羧酸、4-氨基环己烷羧酸。它们大多是已知的化合物，可用常规方法合成或购得。
可用于本发明的固相载体可以是亲和层析领域中任何具有活性连接基团(如羟基、氨基、羧基、环氧基、卤素等)的固相载体。本发明的新颖的亲和层析配位体还可通过桥连分子而连接于常用的固相载体上。代表性的固相载体包括(但并不限于)葡聚糖凝胶如Sephadex，交联的葡聚糖珠如PDX，烯丙基葡聚糖和N,N’-亚甲基双(丙烯酰胺)的交联共聚物如Sephacryl，琼脂糖凝胶如Sepharose、Sepharose CL、Sepharose FF，琼脂糖和葡聚糖的交联共聚物如Superdex、高度交联的琼脂糖和葡聚糖如Superose,N-三[羟甲基]甲基丙烯酰胺和羟基化交联接头的共聚物珠如Trisacryl、Trisacryl plus，琼脂糖珠如Ultrogel A，聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠如Ultrogel AcA，纤维素珠如高孔隙度的再生纤维素珠、涂有聚合物的硅胶，或它们的混合物。
将本发明的亲和配位体偶联于或固定于固相载体的方法可选用本领域常规的方法，这取决于所用的固相载体种类。例如用环氧氯丙烷作为交联剂或马来酸酐等进行偶联。对固定化技术的一般综述，可参见Turkova,J.(1993)＂Bioaffinity Chromatography＂,Elsevier Science,London,U.K(该文献在此全部引用作为参考)。
在本发明的新工艺中，可用本发明方法分离纯化的含眼镜蛇神经毒素的原料可以是任何含眼镜蛇神经毒素的原料，例如采集的眼镜蛇粗毒、基因工程表达产物。
通常，可先将含眼镜蛇神经毒素的原料作适当稀释，例如配成1-12％(较佳地2-10％，最佳地4-8％)的溶液。
为了提高亲和层析的效率，可以对含眼镜蛇神经毒素的原料或其稀释液进行换缓冲液处理。例如经过Sephadex G-25凝胶过滤层析柱，将缓冲液交换为结合缓冲液，如磷酸缓冲液(20mM,pH6.0)。
之后，对于经过换缓冲液处理之后的样品，进行亲和层析，从而获得纯化的眼镜蛇神经毒素。具体地，眼镜蛇神经毒素的亲和层析可以包括上样(吸附)、洗涤和洗脱步骤。此外，对于亲和层析后的眼镜蛇神经毒素洗脱液，还可用阴离子交换、阳离子交换或凝胶过滤层析以及超滤等方法对眼镜蛇神经毒素进行进一步纯化。
在眼镜蛇神经毒素的亲和层析步骤中，一种结合条件是使用如下结合缓冲液缓冲液的盐浓度为0.005-0.03M,pH5.0-9.0；更佳地，0.01-0.02M,pH5.5-7.0；最佳地，是柠檬酸(5mM)、Na2HPO4(20mM)缓冲液(pH6.0-7.2)。一种常用的盐是氯化钠、氯化钾。
一种洗脱条件是使用如下的洗脱缓冲液缓冲液的盐浓度为0.005-2.0M,pH2.0-5.0或9.5-11.0；较佳地，盐浓度为0.01-0.50M,pH3.5-4.8；最佳地是15mM醋酸缓冲液(pH4.6)或含NaCl 0.5M的甘氨酸缓冲液(50mM,pH9.6)(如果需对眼镜蛇神经毒素进行再纯化，这样就不必再换缓冲液)。
在本发明的一个具体优选例中，将原料用装有亲和层析介质的亲和层析柱，在柠檬酸(5mM)、Na2HPO4(20mM)缓冲液(pH6.5-7.2),NaCl(0.01-0.03M)的条件下吸附眼镜蛇神经毒素。用足够量的柠檬酸(5mM)、Na2HPO4(20mM)缓冲液(pH6.5-7.2),NaCl(0.01-0.03M)洗去未吸附的杂质后，再含NaCl 0.5M的甘氨酸缓冲液(50mM,pH9.6)专一洗脱眼镜蛇神经毒素。再用Sephadex G-25凝胶过滤层析柱将眼镜蛇神经毒素的缓冲液再换成可以直接制剂的生理盐水。这个工艺制备的眼镜蛇神经毒素半成品的纯度大于96％。产品回收率大于85％。
在说明书附图中，
图1是用12％SDS-PAGE(Tricine-Gly缓冲液系统)检测亲和层析后眼镜蛇神经毒素的电泳图。图中，左侧为标准分子量蛋白标记物；中间的泳道NT是经过亲和层析纯化的眼镜蛇神经毒素；右侧的泳道SP1是眼镜蛇粗毒样品。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1制备亲和层析介质SK1将30 ml Sepharose 6B在玻璃砂漏斗中和真空泵的抽滤下用蒸馏水(200ml)充分洗涤，然后加入NaOH(4N,8ml)，环氧氯丙烷(0.5ml)和2-氧六环(5ml),60℃摇振2小时后取出用蒸馏水(200ml)充分洗涤，装入螺口带盖的试管中。再称取邻氨基苯甲酸0.3g溶解于l0ml Na2CO3(0.5M,pH11)中，再加入装有活化的Sepharose 6B的试管中，60℃摇振过夜。在最后停止之前，每管中加入0.2ml的乙醇胺，保温2小时。取出试管中Sepharose 6B经0.5M醋酸(50ml),0.1MNaOH(50ml)和蒸馏水(200ml)分别洗涤后，得到亲和层析介质，命名为SK1，加入20％乙醇储存待用。
实施例2制备亲和层析介质SK2化合物间氨基苯甲酸(20g)，溶解于50-400ml Na2CO3(0.2-0.8M,pH8.0-12.0)，加入到盛环氧基珠状纤维素(又称为纤维素珠)(1000ml左右)的可密封瓶中，40-60℃摇振过夜。在停止之前，加入10ml的乙醇胺，保温振荡2小时。最后取出反应瓶中珠状纤维素，经0.5M醋酸(1000ml),0.1MNaOH(1000ml)和蒸馏水(1000ml×5)分别洗涤后，得到所需的纤维素基质的亲和层析介质SK2，加入用20％乙醇储存待用。
实施例3制备亲和层析介质SK3将化合物间氨基苯磺酸(18g)，溶解于50-400ml Na2CO3(0.2-0.8M,pH8.0-12.0)，加入到盛环氧基Trisacryl(1000ml左右)的可密封瓶中，40-60℃摇振过夜。在停止之前，加入10ml的乙醇胺，保温振荡2小时。最后取出反应瓶中Trisacryl，经0.5M醋酸(1000ml),0.1M NaOH(1000ml)和蒸馏水(1000ml×5)分别洗涤后，得到所需的Trisacryl基质的亲和层析介质SK3，加入用20％乙醇储存待用。
实施例4(1)换缓冲液处理取5g眼镜蛇神经毒素粗品溶解于20ml的，过滤除去沉淀。上样到已经用柠蒙酸(5mM)、Na2HPO4(20mM)缓冲液(pH6.5-7.2)平衡的Sephadex G-25柱(5×20cm)上，继续用磷酸缓冲液(20mM,pH6.0)洗脱。收集280nm的吸收峰，得到30ml样品。
(2)亲和层析取亲和层析介质SK1(1ml)装入一次性聚丙烯层析柱(0.5×6.0cm)中，用15ml柠檬酸(5mM)、Na2HPO4(20mM)缓冲液(pH6.5-7.2),NaCl(0.01-0.03M)平衡柱后，加入0.2ml眼镜蛇粗毒(10mg/ml)样品，用20ml平衡液洗去未吸附的物质后，再用含NaCl 0.5M的甘氨酸缓冲液(50mM,pH9.6)10ml洗脱层析柱上的吸附的神经毒素成份，然后用SDS-PAGE检测结果。
结果表明，神经毒素回收率达到眼镜蛇粗毒的25％。一步亲和纯化的神经毒素回收率可达到94％以上，纯度为90.4％，而再经一步Superdex分子筛精制后可达到95.6％。测定纯化后的神经毒素等电点pI值为9.468，与文献值(9.5)相符合；用质谱(ESI)测得的分子量为6700-6800之间，为短链神经毒素。
实施例5亲和层析在该实施例中，对重组表达的眼镜蛇神经毒素进行分离。
取亲和层析介质SK1(1ml)装入一次性聚丙烯层析柱(0.5×6.0cm)中，用15ml柠檬酸(5mM)Na2HPO4(20mM)缓冲液(pH6.5-7.2),NaCl(0.01-0.03M)平衡柱后，加入0.2ml大肠杆菌表达的眼镜蛇神经毒素与蛋白A的融合蛋白的溴化氰裂解液(20mg/ml)样品，20ml平衡液洗去未吸附的物质后，再用含NaCl0.5M的甘氨酸缓冲液(50mM,pH9.6)，洗脱层析柱上的吸附成份，和SDS-PAGE检测结果。结果一步亲和纯化的神经毒素回收率可达到80％以上，纯度为92％，而再经一步Superdex分子筛后，纯度可达到97％。
实施例6对亲和层析中结合条件和洗脱条件的优化在该实施例中，分别对亲和层析中结合条件和洗脱条件(盐浓度和pH值)进行优化。选用实施例1制备SKl亲和层析介质，在中性条件下进行结合条件的盐浓度优化→在缓冲液电导率不变情况下进行结合酸碱度条件优化→在缓冲液电导率不变情况下进行洗脱酸碱度条件优化→在缓冲液电导率不变情况下进行洗脱盐浓度条件优化。
结果表明，在眼镜蛇神经毒素的结合的盐浓度宜为0.005-0.03M，更佳地0.01-0.02M,pH条件为pH5.0-9.0更佳地pH5.5-7.0。
洗脱条件是洗脱缓冲液的盐浓度为0.005-2.0M，较佳地，盐浓度为0.01-0.50M。pH条件为pH2.0-5.0或pH9.5-11.0，较佳地，pH3.5-4.8。
实施例7在该实施例中，用实施例2中制备的亲和层析介质SK2对眼镜蛇神经毒素进行分离纯化。
如实施例4那样，将原料用装有亲和层析介质SK2的亲和层析柱，在柠檬酸(5mM)、Na2HPO4(20mM)缓冲液(pH6.5-7.2),NaCl(0.01-0.03M)的条件下吸附眼镜蛇神经毒素。用足够量的柠檬酸(5mM)、Na2HPO4(20mM)缓冲液(pH6.5-7.2),NaCl(0.01-0.03M)洗去未吸附的杂质后，再用含NaCl 0.5M的甘氨酸缓冲液(50mM,pH9.6)专一洗脱眼镜蛇神经毒素。再用Sephadex G-25凝胶过滤层析柱将眼镜蛇神经毒素的缓冲液再换成可以直接制剂的生理盐水。这个工艺制备的眼镜蛇神经毒索半成品的纯度大于96％。产品回收率大于85％。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1．一种亲和层析介质，其特征在于，它包括固相载体以及偶联在固相载体上的式Ⅰ所示的亲和配位体 式中，R1是选自下组的碱性基团氨基，单取代氨基，双取代氨基，三取代氨基，脒基；R2是选自下组的酸性基团羧基，磺酸基，磷酸基；m1为1或2；m2为1或2；n1为1,2,3，或4n2为1,2,3，或4。
2．如权利要求1所述的亲和层析介质，其特征在于，所述的固相载体选自葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N,N’-亚甲基双(丙烯酰胺)的交联共聚物、琼脂糖凝胶、琼脂糖和葡聚糖的交联共聚物、高度交联的琼脂糖和葡聚糖、N-三[羟甲基]甲基丙烯酰胺和羟基化交联接头的共聚物珠、琼脂糖珠、聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠、纤维素珠、和涂有聚合物的硅胶。
3．如权利要求1所述的亲和层析介质，其特征在于，所述的固相载体选自Sephadex、PDX、Sephacryl、Sepharose、Sepharose CL、Sepharose FF、Superdex、Superose、Trisacryl、Trisacryl plus、UltrogelA、Ultrogel AcA、高孔隙度的再生纤维素珠。
4．如权利要求1所述的亲和层析介质，其特征在于，式Ⅰ所示的亲和配位体选自下组对氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、间氨基苯磺酸、3-氨基环己烷羧酸、4-氨基环己烷羧酸。
5．一种分离纯化眼镜蛇神经毒素的方法，它包括步骤(a)将含眼镜蛇神经毒素的原料上样于装有亲和介质的亲和层析柱，从而使眼镜蛇神经毒素吸附于亲和中；(b)洗去亲和层析柱未吸附的杂质；(c)对吸附于亲和层析介质上的眼镜蛇神经毒素进行洗脱，从而获得纯化的眼镜蛇神经毒素；其特征在于，该亲和层析柱中含有一亲和层析介质，该亲和层析介质包括固相载体以及偶联在固相载体上的式Ⅰ所示的亲和配位体 式中，R1是选自下组的碱性基团氨基，单取代氨基，双取代氨基，三取代氨基，脒基；R2是选自下组的酸性基团羧基，磺酸基，磷酸基；ml为1或2；m2为1或2；nl为l,2,3，或4n2为1,2,3，或4。
6．如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，亲和介质吸附眼镜蛇神经毒素的条件为盐浓度为0.005-0.03M,pH条件为pH5.0-9.0；在步骤(c)中，眼镜蛇神经毒素的洗脱条件为pH为pH2.0-5.0或pH9.5-11.0的缓冲液，其中盐浓度为0.005-2.0M。
7．如权利要求5所述的方法，其特征在于，该方法还包括步骤(d)对步骤(c)中获得的纯化的眼镜蛇神经毒素进行分子筛凝胶过滤，从而进一步纯化眼镜蛇神经毒素。
8．如权利要求5所述的方法，其特征在于，式Ⅰ所示的亲和配位体选自下组对氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、间氨基苯磺酸、3-氨基环己烷羧酸、4-氨基环己烷羧酸。
全文摘要
本发明涉及一类新的针对眼镜蛇神经毒素的亲和层析介质及其制备方法。本发明还涉及用这类新的亲和层析介质纯化生产眼镜蛇神经毒素的新方法。
文档编号C07K1/22GK1318553SQ0011540
公开日2001年10月24日 申请日期2000年4月17日 优先权日2000年4月17日
发明者李荣秀, 蔡勤, 肖齐世, 李燕玲, 王继武 申请人:中国科学院上海生物工程研究中心, 上海源东生物工程有限公司