专利名称：紫杉醇的多羟基水溶性衍生物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种紫杉醇的多羟基水溶性衍生物及其制备方法。具体说是具有抗肿瘤活性的2’-O-酰基酸丙三醇酯紫杉醇及其制备方法。
紫杉醇是双萜类天然产物，它具有作为抗癌药物的巨大潜效而被应用。并且在许多肿瘤系统中具有活性。紫杉醇的分离及其结构鉴定最早由Wani等人载于“Plant Aati-Tumor Agents．Ⅵ．The Isolation And Structure of Taxol，A Novel Anti-Leukemic And Anti-Tumor Agent From Taxus brevifolia，”，J．Am．Chem．Soc．，1971，93，2325。在多种紫杉属中，如Taxus brevifolia、T．yunanansis、T．Baccata和T Cuspidata等茎、叶、树皮中均有紫杉醇发现。
紫杉醇的生物活性与它对细胞分裂的作用有关。紫杉醇促进细胞分裂期间形成丝状分裂纺锤的微管的形成。但是，紫杉醇阻碍形成丝状分裂纺锤微管的小管之解聚作用，该小管是发生细胞分裂的要素。由此，紫杉醇导致细胞分裂停止。紫杉醇的机制是独特的，Schiff等人(Nature，1979，277，665)确认紫杉醇促进微管蛋白聚合成微管的形成，而其它抗癌药物(如长春花碱及秋水仙素)则阻碍微管的形成。
紫杉醇具有很低的水溶性(0．03mg／ml)，必须在其配方中加入50％的聚乙氧基蓖麻油(Cremophor EL)乳化剂和50％的乙醇，然后用生理盐水稀释后给药。其最大的缺点是Cremophor EL会导致严重的过敏反应，甚至致人死亡。该种剂型的紫杉醇是不受欢迎的(Science，1992，256，311)。因此，制备留有抗肿瘤及抗癌活性的紫杉醇水溶性衍生物的新药是必然途径(Science，1994，263，911)。
Nicolaou等(Nature，1993，364，464)报道了12种C-2’和C-7位置上水溶性紫杉醇衍生物的合成及抗肿瘤生物活性，所得化合物比紫杉醇水溶性大大增加，但是抗肿瘤活性比紫杉醇有所下降。
Magri等报道了及C-2’和C-7位置上经取代以使其更易溶于水的紫杉醇的生物活性，见于“Modified Taxols，4．1 Synthesis And Biological Activity of Taxol；Modified In The Side Chain”，Journal of Natural Products 1998，51，298。合成的2’-(叔丁基二甲基甲硅烷基)紫杉醇，发现基本上为无活性的；这说明紫杉醇侧链的2’的位置上需为游离羟基，才具有生物活性。2’-乙酰基紫杉醇和2’，7’-二乙酰基紫杉醇的2’位置上的酰基取代基在体内条件下易于水解，且在细胞培养生物分析中均具有活性。2’位置上的酰基取代基的不稳定性意味着2’-乙酰基紫杉醇可作为紫杉醇的前体药物形式。
Dentsch等人(“Synthesis of Congeners and Prodrugs．3．1 Water-soluble Prodrugsof Taxol with Potent Antitumor Activity”，J．Med．Chem．1989，32，788)论及2’-乙酰基紫杉醇和2’-戊二酰基紫杉醇的盐类具有优于游离酸的改良抗肿瘤活性。它们认为由不同负离子制备而成的盐类应当具有不同的性质，所以合成并测试了多种2’取代的紫杉醇盐类，这些衍生物一般具有更大的水溶性和更大的活性。Peter等(中国发明专利1991)报道2’-乙酰基乙二醇紫杉醇的合成，但其水溶性较低。
Nicolaou等(Angew．Chem．Iht．Ed．Engl．，1994，33，15)认为除了提高紫杉醇的溶解度及生物活性外，所生成的紫杉醇衍生物还需要具有较高的稳定性以增长其使用期限。紫杉醇酯的盐类极易于产生碱水解，而水溶性基团(诸如羧酸盐或铵盐)易成为碱性。因此，需要合成具有改进或相等于紫杉醇活性的中性水溶性紫杉醇衍生物。
本发明的目的在于提供一中水溶性好，且保留抗肿瘤活性和稳定性的紫杉醇衍生物及其制备方法。
本发明提出的紫杉醇衍生物属于紫杉醇的多羟基水溶性衍生物，是在分析研究现有紫杉醇及其衍生物的性能特点和存在问题的基础上加以改进而获得。该紫杉醇衍生物名称为2’-O-酰基酸丙三醇酯紫杉醇，该化合物的化学结构式为 式中n=2，3
2，-O-酰基酸丙三醇酯紫杉醇(也记为2’-酰基酸丙三醇酯紫杉醇，下同)的属于中性化合物，具有改进的稳定性；又因为其结构上增加了羟基，即增加了整个分子的极性，从而增加了它的水溶性；同时其依然保有2’-O-酰基，易于在体内血液中分解酶的作用下，将酯键断裂释放出紫杉醇，故仍具有与紫杉醇类似的作用机理及活性，体外及体内的抗肿瘤活性均得到了实验证实。
本发明还提出了上述紫杉醇的多羟基水溶性衍生物-2’-O-酰基酸丙三醇紫杉醇的制备方法，其工艺流程见图4。各步骤的具体过程为步骤1，在通入氩气条件下，将紫杉醇、酰基酸酐和N，N-二甲基砒啶溶于砒啶中，在室温下反应，制得2’-O-琥珀酸紫杉醇；步骤2，在通入氩气条件下，将2’-O-醇基醇紫杉醇和三乙胺完全溶于四氢呋喃中，形成第一溶液，并将冷却0℃；步骤3，在前述第一溶液中加入氯甲酸异丁酯，形成第二溶液，将其温热至室温，然后加入丙三醇，形成2’-O-酰基酸丙三醇酯紫杉醇溶液；步骤4，在步骤3得到的溶液进行过滤、浓缩、纯化及干燥处理，得到2’-O-酰基酸丙三醇酯紫杉醇。
在本发明的制备方法中，其步骤1的制备中间产物2’-O-酰基酸紫杉醇的过程中，混合溶液在室温下反应时，需进行搅拌，时间2-3小时，反应终止；然后将砒啶在真空中蒸发至干，用稀盐酸洗涤产物，再用乙酸乙酯萃取；将萃取溶液用饱和食盐水洗涤产物至中性，将产物减压浓缩后，真空加热干燥。
按以上制备途径，步骤1在通入氩气下，将1～4g紫杉醇、250～1000mg酰基酸酐和15～60mg N，N-二甲基吡啶溶于2～10mL吡啶中，形成完全溶解的溶液；将前述溶液在室温下，搅拌2～3小时，反应终止；将吡啶在一定温度和真空中蒸发至干，用10～30mL稀盐酸(2％)洗涤产物后，用25～50mL乙酸乙酯萃取；将萃取溶液用适量饱和食盐水洗涤产物至中性，将产物减压浓缩后，真空加热干燥。按步骤2，在通入氩气下将5～20μL三乙胺和130～520mg 2’-酰基酸紫杉醇完全溶于1～4mL四氢呋喃中，形成第一溶液；冷却前述第一溶液至约0℃。按步骤3，加入38～150μL氯甲酸异丁酯于前述第一溶液，形成第二溶液；再温热前述第二溶液至约室温；将丙三醇加至前述温热的第二溶液中而形成所述2’-酰基酸丙三醇酯紫杉醇溶液。按步骤4，过滤、浓缩、纯化及干燥前述(4)溶液得到127～382mg 2’-酰基酸丙三醇酯紫杉醇。
2’-O-酰基酸紫杉醇是有机酸，与吡啶很难彻底分离得到自由酸的形式，而这又是进行下一步反应的关键。本发明除了利用甲苯与吡啶共沸而彻底蒸发去除吡啶之外，又在后续步骤中使用1％的HCl水溶液洗涤产物，从而保证了产物完全脱除，以自由酸的形式存在。在制备2’-O-酰基酸丙三醇酯紫杉醇的反应中，使用了氯甲酸异丁酯作为活化试剂，与2’-O-酰基酸紫杉醇形成混合酸酐，作为氧亲核试剂进攻丙三醇，而丙三醇的一个伯羟基显示了高活性，有选择性地生成了单酯。
本发明使用分析型HPLC跟踪反应，其中反相液相色谱分析柱使用C18填料，使用甲醇乙腈水(HAc)作为流动相，于227nm记录色谱图，同时使用二极管阵列检测器从190nm至290nm进行瞬时扫描。反应时间需准确控制才能达到最高产率并简化后续分离纯化步骤。此检测方法，较其他先前技术中使用之检测方法(薄层层析法，即TLC方法等)，具有不可替代之优势。
本发明使用制备型HPLC分离纯化反应中间体及产物，使用商品化的C18填料的HPLC制备柱，与自制玻璃层析柱及正相硅胶填料相比，柱效提高100倍以上，重现性好，而且用廉价的水与甲醇作为流动相，替代了昂贵的有机试剂如正己烷和乙酸乙酯等正相流动相，降低了成本。同时，可以使用紫外检测器，在波长227nm处监测分离过程，缩短了分离时间、提高了可靠性。
紫杉醇是由本实验室从云南红豆杉(Taxus yunnannsis)树皮提取物中纯化制备所得，其纯度达到99．8％(经上海药检所及中国生物制品检定所检定)。NMR是由Varian inova 600MHz光谱仪测得；化学位移在H-NMR中均基于0ppm的TMS位移。样品均溶解于CDCl3中，在室温下记录。质谱是使用Finegan Mat 95Q质谱仪(装置有数据系统，FAB源及EI／CI源)。NMR和质谱数据在紫杉醇及其衍生物的研究中最为有用，而其他方法(如IR和UV)则提供额外的结构确认资料。
使用其他的分析检测仪器包括Nicolet Avatar 360红外光谱仪和CVI，SM240(附光纤)紫外-可见光光谱仪。分析型HPLC系统包括Beckman 110B泵，168二极管阵列检测器，Phenomenex LUNATM(2)(4．6mmX150mm，5 μm)C18色谱柱。制备型HPLC系统是购自美国Waters公司的PrepLCTM 4000型高效液相色谱制备系统，其包括Waters 500泵，Waters 2487双波长紫外检测器，Nova-pakTM(50mmX300mm，6μm)C18制备型色谱柱及NEC-586计算机(Millennium32操作软件)。
本发明公开了水溶性高于未修饰之紫杉醇的具有全新结构的紫杉醇的多羟基酯类衍生物，较某些具有较高水溶性的先前紫杉醇的衍生物在更长时间内具有稳定性。这些化合物系由产生高产率的纯化合物的新颖方法制成。由特征数据和二维NMR研究证明了本发明紫杉醇衍生物的结构。除了具有高水溶性及改良的稳定性，这些化合物仍保有作为抗肿瘤、抗白血病和抗癌药物之生物活性及用途。
图1 2’-O-琥珀酰基酸丙三醇酯紫杉醇的1H-1H同核化学位移相关二维核磁共振波谱。
图2 2’-O-琥珀酰基酸丙三醇酯紫杉醇的质谱图。
图3 2’-O-琥珀酰基酸丙三醇酯紫杉醇的红外光谱图。
根据HPLC检测结果，在原料峰完全消失，第二产物尚未出现时，用1mL甲醇中止反应，并加入5mL乙酸乙酯稀释，将反应溶液在50℃水浴加热下，旋转蒸发至粘稠，加入10mL甲苯后继续旋转蒸发以最大可能除去吡啶，待蒸发至白色固体时，加入20mL乙酸乙酯溶解，置于分液漏斗中，分别用20mLHCl水溶液(1％)，20mL饱和食盐水洗涤有机相，有机相合并旋转蒸发至干，置于恒温真空干燥箱中，于50℃下抽真空干燥5小时，称重，产率为98％。
按照实例1中的方法用HPLC跟踪反应进程。在反应的初始阶段，会在23min左右出现一个主要的色谱峰，据反应机理推测应该是氯甲酸异丁酯与2′-0-琥珀酰基酸紫杉醇生成的混合酸酐；反应进行约1小时后，色谱图显示在13min左右出现一个色谱峰，随著时间的的增加此色谱峰所占比例亦随之增加。在反应4小时后，应加入少量甲醇终止反应，加入乙酸乙酯稀释反应体积，将反应溶液经过滤后将溶液减压旋转蒸发至干。
将产品溶解于100mL甲醇中，作为样品从Waters LC4000TM型，制备型HPLC泵三通阀进样，流动相为甲醇∶乙腈∶水=30∶30∶40，于227nm紫外波长下进行检测，约在80min左右出现AU＞4的色谱峰，且延续8～10min，收集该部分产品，减压旋转蒸发至干后，在50°真空加热干燥5小时，称重得255mg，(0．248mM)，产率为91％。
产品的核磁共振谱图在3．7-4．7ppm之间出现5个新的质子信号，1H-1H同核相关二维谱见图1，所有质子归属见表1。
产品的质谱图见图2，存在于m／z 1028(M+)、1051(MNa+)和1067(MK+)处的尖峰指出分子量为1028。
依如上所述之相同方法测定经比较计算2’-琥珀酰基酸丙三醇酯紫杉醇相对于紫杉醇的水溶性，结果约为紫杉醇的110倍。
权利要求
1．一种紫杉醇的多羟基水溶性衍生物，其特征在于该衍生物的化学通式为 式中n=2，3
2．一种紫杉醇的多羟基水溶性衍生物的制备方法，其特征在于具体步骤如下(1)在通入氩气条件下，将紫杉醇、酰基酸酐和N，N-二甲基砒啶溶于砒啶中，在室温下反应，制得2’-O-琥珀酸紫杉醇；(2)在通入氩气条件下，将2’-O-醇基醇紫杉醇和三乙胺完全溶于四氢呋喃中，形成第一溶液，并将冷却0℃；(3)在前述第一溶液中加入氯甲酸异丁酯，形成第二溶液，将其温热至室温，然后加入丙三醇，形成2’-O-酰基酸丙三醇酯紫杉醇溶液；(4)在步骤3得到的溶液进行过滤、浓缩、纯化及干燥处理，得到2’-O-酰基酸丙三醇酯紫杉醇。
3．根据权利要求2所述的紫杉醇衍生物的制备方法，其特征在于步骤聚(1)制备2‘-0-琥珀酸紫杉醇过程中(1)将紫杉醇、酰基酸酐和N，N-二甲基吡啶的吡啶溶液，将前述溶液在室温下，搅拌2～3小时；(2)将吡啶蒸发至干，用稀盐酸洗涤产物后，再用乙酸乙酯萃取；(3)将萃取溶液用饱和食盐水洗涤产物至中性，将产物减压浓缩后，真空加热干燥。
4．根据权利要求2所述的紫杉醇衍生物的制备方法，其特征在于用分析型HPLC跟踪反应，其中反相液相色谱分析柱使用C18填料，使用甲醇乙腈水(HAc)作为流动相，于227nm记录色谱图，同时使用二极管阵列检测器从190nm至290nm进行瞬时扫描。
5．根据权利要求2所述的紫杉醇衍生物的制备方法，其特征在于用商品化的C18填料的HPLC制备柱分离纯化反应中间体及产物，使用紫外检测器，在波长227nm处监测分离过程。
全文摘要
本发明涉及一种紫杉醇的多羟基水溶性衍生物及其制各方法。本发明使用氯甲酸异丁酯作为活化试剂,与2’－O－酰基酸紫杉醇形成混合酸酐,作为氧亲核试剂进攻丙三醇,高活性、高选择性地生成单酯。本发明还使用分析型HPLC跟踪反应,使用制备型HPLC分离纯化反应中间体及产物。重现性好、降低了生产成本。同时,缩短了分离时间、提高了可靠性。
文档编号C07D305/14GK1283619SQ0011542
公开日2001年2月14日 申请日期2000年4月20日 优先权日2000年4月20日
发明者陈建民, 薛军, 张黎, 吴蓓莉, 卜海山, 王康跃, 鲍余钦 申请人:复旦大学