识别潜在的免疫优势乙酰胆碱受体α亚基肽的制作方法

专利名称：识别潜在的免疫优势乙酰胆碱受体α亚基肽的制作方法
背景技术：
自身免疫性疾病是特别重要的一类有害的免疫反应，它影响9,000,000多人口，构成美国的一个主要健康问题。在自身免疫性疾病中，机体缺失自我耐受，免疫系统把自身组织当作外来目标攻击。这些疾病在缺少治疗时，一般发展为慢性疾病，许多情况下导致患者死亡。
原始的治疗自身免疫性疾病的方法一般为免疫抑制。这种方法明显的弊端在于削弱机体对真正外来物质激发免疫反应的反应能力。仅稍微成熟的治疗方法依赖于移除目标组织中的免疫复合物。这种方法也有副作用并且难于实现。除了使用含有害副作用的免疫抑制剂，任何的自身免疫性疾病几乎没有有效的治疗方法。现有30多种发病率各不相同的器官特异和全身形式的自身免疫性疾病。那些有相对较多患者的疾病，例如，类风湿性关节炎、I型糖尿病和多发性硬化，由于明显的经济原因被经常锁定为开发新治疗方法的目标。
对于T淋巴细胞在保持免疫耐受和自身免疫性病理中作用认识的加深，触发了许多抗原特异的治疗方法的发展，这些方法拟于抑制或消除自身反应性T细胞，同时保持保护性免疫反应。这些方案依赖于自身免疫性疾病中自身抗原和自身抗原肽表位的识别。对于许多自身免疫性疾病，包括那些有较多患者的疾病，这方面的信息是未知的、不完全的或有争议的。
重症肌无力(MG)是影响神经肌肉接头并可威胁生命的一种自身免疫性疾病。患者人数约在25,000至100,000间波动(Drachman(1994)N.Eng.J.Med.3301797-1810；MG Foudation，1997)，患者人数预期随着平均人口年龄的增长而增长。MG以乙酰胆碱受体(AChR)自身抗体为特征。动物体内模型和免疫抑制药物实验说明，这些自身抗体的产生依赖于CD4+T细胞。在MG的情况下，自身抗体与神经肌肉接头肌膜表面的乙酰胆碱受体(AChR)结合，引起AChR的内吞和补体介导的损伤。AChR的丢失减少了肌肉做功的效率，产生从疲劳到呼吸衰竭的症状。
MG为抗原特异疗法的发展和临床检测提供许多便利，包括一个明确鉴定的自身抗原AChR的存在。AChR被普遍认为是自身反应性T和B细胞的靶位，不像在多发性硬化等疾病中可以是多种髓磷脂蛋白(包括髓磷脂碱性蛋白、蛋白脂质蛋白、髓磷脂少突细胞糖蛋白、髓磷脂相关糖蛋白、αB-晶体蛋白、CNPase和热休克蛋白)。而且也可方便获得明确的临床参数。例如，检测由于胆碱酯酶阻断造成肌肉受损而使功能暂时减退的拉力试验，抗AChR抗体的检测是MG的诊断工具。早期发病患者的疾病与HLA-DR3相关，晚期发病与HLA-DR2相关。而且，肌电图可以方便地检测肌肉功能，ELISA及其它相对简单的分析可以得到抗AChR抗体的水平，所以MG的临床检测得益于疾病活动度的简单的和明确的替代标记物。除了这些优点，在MG的治疗方面还没有实验其它方案。
开发MG抗原特异治疗方法的最大困难是目前缺少关于免疫优势AChR表位的特性的一致意见。
AChR是一个五聚体离子通道，在成人受神经支配的肌肉中由α2βεδ组成，在胚胎和去神经支配的肌肉中及胸腺肌样细胞中由α2βγδ组成。AChRα亚基既是乙酰胆碱的结合位点，其67-76的结构域位点又是与自身抗体结合的(Tzartos等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852899-2903)主要免疫原区(MIR)，即自身抗原结合的优势位点。虽然有许多关于优势AChR T细胞表位的文献报道，其中许多研究并不确定，所以并没有明确一致的意见(见综述，例如，Manfredi等，(1992)J.Lab.Clin.Med.113-21；Hawke等，(1996)Immunol.Today 17307-311)。这些实验中的大多数没有检验HLA-DR限制。另外，一些研究基于对合成AChR肽具有反应性的T细胞系的产生鉴定了免疫优势肽，但在许多情况下，这些T细胞不能对天然AChR产生反应(Matsuo等，(1995)J.Immunol.1553683-3692；Hawke等，supra)。这样就不明确是否这些T细胞是分析系统中的假象。
以往的研究检验了MG患者外周血单核细胞对一组AChR肽的反应(见Harcourt等，(1988)J.Clin.Invest.821894；和Newsom-Davis等，(1989)J.Autoimmun.2101)。然而这些研究或者检验了一组不完全的AChR肽，或者检验了连续肽的重叠限于几个氨基酸的一组肽，可能错过某些相关表位。其它情况下，HLA-DR对T细胞反应的限制并无测定。另一些可能对MG有重要意义的研究识别了结合HLA-DR等位基因的免疫优势肽，但T细胞对这些肽的反应仍未被证实。除了这些进展，该技术缺乏对HLA-DR相关免疫优势AChR肽的一致意见。
目前对MG的治疗并非特异，许多情况下存在有害的副作用。例如，移除抗体的血液透析是一项昂贵的操作，抗体滴度在透析结束后可以迅速回升，并超过透析前标准。类固醇和其它免疫抑制剂(例如，ACTH、咪唑硫嘌呤和环胞霉素A)有时也被使用，但经常引发肾毒性、高血压或其它健康危险。胸腺切除有时有疗效，但经常失败，并需要术后五年以上才见效，对儿童及老年患者禁忌。
因此，该领域需要没有主要副作用且不影响整个免疫系统的治疗自身免疫性疾病特别是MG的有效方法。本发明即着手于这些和其它需求。
发明概述本发明涉及可用于抑制重症肌无力时免疫系统自身免疫反应的组合物。本发明组合物的作用靶点设计为识别与MHC成分相联系的特异抗原的辅助T细胞。本发明组合物结合T细胞且引起靶T细胞的无反应性，提供了较前副作用更少的特异性疗法。
本发明提供了识别与HLA-DR2和HLA-DR3有较高亲和力的AChR亚基肽，HLA-DR2和HLA-DR3在具有这些单倍型的患者中可能代表免疫优势T细胞表位。这些肽可被用于诱导靶位T细胞的无反应性并用于MG的治疗。
在一个实施方案中，本发明提供了所述肽。其它实施方案中，该肽被用于药物组合物治疗MG，或与MHC分子结合用于药物组合物。另一方案中，本发明提供了一种治疗MG的方法。
附图简述

图1表示HLA-DR2和HLA-DR3亲和力DELFIA分析中检测到的重叠AChR肽位置。
图2列出结合HLA-DR2和HLA-DR3的每个AChR肽的IC50值。大于100,000nM的IC50值以“＞”表示。
图3表示AChRα肽1/IC50值的柱状图，说明了肽与HLA-DR2和HLA-DR3的相对亲和力。
图4表示对HLA-DR2具有高亲和力的AChRα肽的可能的DRB1*1501基序排列。与公开的HLA-DR2基序最适的AChRα肽顺序和IC50值共同标出。
图5表示对HLA-DR3具有高亲和力的AChRα肽的可能的DRB1*0301基序排列。与公开的HLA-DR3基序最适的AChRα肽顺序和IC50值共同标出。
图6列出HLA-DR2和HLA-DR3的候选免疫优势AChR肽。那些IC50值≤10,000nM的肽被列出。
图7表示正常健康个体样本PBMCs的ELISPOT测定结果。特定抗原的反应指数为2或大于2时认为是阳性。
图8表示MG患者样本PBMCs的ELISPOT测定结果。如果特定抗原的反应指数大于2则T细胞反应鉴定为阳性。
图9表示正常健康个体(“正常”)或MG患者(“患者”)对不同AChR肽阳性反应性的百分比对比。
图10表示DR2+正常健康个体(“正常”)或DR2+MG患者(“患者”)对AChR肽反应性的百分比对比。
具体实施方案的说明I.前言本发明提供可用于调节T细胞功能的肽。例如，该肽可与MHC分子结合，并抑制T细胞介导的有害免疫反应，特别是重症肌无力。而且该肽自身可诱导无反应性并应用于疾病治疗。
以下分别描述该肽和可与之形成复合物的MHC成分，并且说明该肽和复合物的制备、评价和使用方法。适于制备和使用本发明MHC肽复合物的一般方法由美国专利5,468,481和PCT专利申请WO96/40944公布。
本发明特别提供了新的乙酰胆碱受体(AChR)肽、MHCII类多肽和MHCII类多肽AChR肽复合物。本发明提供分离的(从天然来源)、合成的和重组产生的AChR肽和MHCII类多肽形式。这些肽和蛋白可在体外或体内重组表达。使用本领域任何已知的方法可以制备和分离本发明的肽、多肽和复合物，本发明提供一些示例性的制备这些蛋白的方法。而且，制备MHCII类肽复合物的方法在以下文献有说明，例如，美国专利5,194,425，公布于1993年3月16日；5,130,297，公布于1992年7月14日；5,284,935，公布于1994年2月8日；5,260,422，公布于1993年11月9日；和5,468,481，公布于1995年11月21日；和PCT专利申请NO.WO96/40944。
本发明的核酸操作和编码AChR肽、MHCII类分子和AChR肽MHCII类肽复合物基因的重组表达技术在科学和专利文献(见，例如，Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual(2nd Ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，(1998)；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.New York(1997)；和Tijssen等，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular BiologyHybridization WithNucleic Acid Probes，Part I.Theory and Nucleic AcidPreparation，Elsevier，N.Y.(1993))中描述。使用各种本领域专业人员熟知的方法在核酸内引入突变。例如，快速实施定点诱变的有效方法是聚合酶链反应延伸的重叠(Urban(1997)Nucleic Acids Res.252227-2228)。证实感兴趣的核酸序列的测序方法多选用双脱氧测序法(Sequenase，U.S.Biochemica1)，或本领域专业人员熟知的其它试剂盒和方法。可以使用各种本领域专业人员熟知的转化原核和真核细胞的方法和体内表达系统(见，例如，Weising(1988)Ann.Rev.Gene t.22421-477；Sambrook等；和Tijssen等，均同上)。
本发明中的AChR肽、MHCII类分子和MHCII类肽肽复合物可使用本领域熟知的化学方法全部或部分合成(见，例如，Caruthers(1980)Nucleic Acids Res.Symp.Ser.215-223；Horn(1980)NucleicAcids Res.Symp.Ser.225-232；和Banga，Therapeutic Peptidesand Proteins，Formulation，Processing and Delivery SystemsTechnomic Publishing Co.，Lancaster，PA(1995))。例如，可以使用不同的固相技术(见，例如，Roberge(1995)Science 269-202；和Merrifield(1997)Methods Enzymol.2893-13)合成肽，也可遵照制造者提供的使用说明利用ABI431A肽合成仪(Perkin Elmer)自动合成肽。II.定义在此使用的“肽”或“寡肽”是指一系列残基，尤其是两者之间典型地通过α-氨基和邻近氨基酸的羰基之间的肽键连接的L-氨基酸。只要保持正确的表位，肽的长度并不是关键。典型的肽长度少于约30个氨基酸，通常由约10-25个残基，优选14-20个残基组成。
“AChR寡肽”是具有来源于AChR的一部分的序列，特异地结合MHC分子并诱导重症肌无力相关的T细胞免疫反应。寡肽可以包括来源于AChR的序列(例如，7-22或36-49位残基)，或与之基本相似的序列。该术语在以下介绍中也包括这些序列的各种类似物。
术语“残基”指通过酰胺键或酰胺键模拟物插入寡肽的氨基酸(D或L)或氨基酸模拟物。本发明中的肽键模拟物包括本领域技术人员熟知的变异肽主链。
在此使用的“氨基酸模拟物”是天然存在的氨基酸以外的部分，在结构和功能上当作本发明肽中氨基酸的替代物。如果这种部分基本不干扰肽结合AChR的能力，即可当作氨基酸残基的替代物。氨基酸模拟物包括非蛋白氨基酸，例如，β-γ-δ氨基酸、β-γ-δ亚氨基酸(例如哌啶-4-羧基酸)和许多L-α氨基酸的衍生物。本领域技术人员已获知许多合适的氨基酸模拟物，包括环己基丙氨酸、3-环己基丙酸、L-金刚烷丙氨酸，金刚烷乙酸等。适用于本发明的肽类似物见Morgan和Gainor(1989)Ann.Repts.Med.Chem.24243-252。
如果两个多肽的氨基酸残基序列在最大相关比对时相同，它们被称为“相同”的多肽。
“序列同一性百分比”是通过在对比窗口中对比两个最优比对的序列而判断，其中在两个序列间进行最优比对时，对比窗口中的多核苷酸或氨基酸序列部分通过与参考序列(不包括添加或删除)比较有无添加或删除(即空位)。百分比的计算是用两个序列中相同核苷酸碱基或氨基酸残基的位点数得到匹配位点数，用匹配位点数除以对比窗口中全部的位点数再乘以100，既是序列同一性百分比。
对于氨基酸或核苷酸序列所使用的术语“基本上相同”，一般指序列至少有60％相同。优选的多肽或多核苷酸的同一性百分比可以是60％至100％间的任何整数。更优选的实施方案包括至少80％、85％、90％、95％或99％。“基本上相似的”多肽包含以上提及的序列，除了不相同的残基位点可以因为保守的氨基酸变化而不同。“保守的氨基酸替代物”是指有相似侧链残基的可交换性。例如，含脂肪侧链的氨基酸组是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；含脂肪-羟基侧链的氨基酸组是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组是天冬酰胺和谷氨酰胺；含芳香侧链的氨基酸组是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。含碱性侧链的氨基酸组是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸组是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸替代物组是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、天冬氨酸-谷氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
最佳的序列比对可以使用Smith和Waterman(1981)Add.APL.Math.2482的局部同一性运算法则，Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443的同一性比对运算法则，Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)852444的相似性搜索方法，计算机实现的这些运算法则(GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA和TFASTA，Wisconsin Genetics，Genetics Compute Group(GCG)，575 ScienceDr.，Madison，WI)或检查。
适用于确定序列相同和相似百分比的优选运算法则是BLAST和BLAST2.0，该运算法则分别见Altschul等(1977)Nuc.Acids.Res.253389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-410。BLAST和BLAST2.0同此处描述的参数一起使用，确定本发明核苷酸序列和氨基酸序列同一性百分比。运行BLAST分析的软件可以从国家生物技术信息中心(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。对于氨基酸序列使用评分矩阵计算累积分值。字命中在各方向的延伸在遇到以下情况时中断累积比对分值从最大获得值中降低了量X；由于累积一个或更多的得分为负值的残基比对，累积分值达到0或0以下；或达到任一序列的末端。BLAST运算法则的参数W、T和X决定了运算的敏感性和速度。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认字长为3，期望值(E)为10，和BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915)比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4和两链的对比。
短语“分离的”指基本上或本质上没有其天然状态下通常与之伴随的成分的物质。
此处使用的术语“免疫优势”或“免疫优势肽”是指作为免疫反应主要靶位的肽或肽表位。代表性的免疫优势肽是较其它存在的表位召集更大量的抗体并与抗体有更高的亲和力的表位。这些位点的识别因被靶定为对抗自身免疫性疾病的靶位而重要。免疫优势是复合抗原(或表位内某些残基)中某些表位的特征，这使得它们在免疫原性或抗原性上非常关键。
此处使用的术语“分离的MHC成分”是指MHC糖蛋白或MHC糖蛋白的有效部分(即包括抗原结合的一个或多个位点和被恰当的T细胞受体识别所必须的序列)，它们不处在天然状态，例如，与正常表达MHC的细胞的细胞膜无关。如下面的详细描述，MHC成分可以重组产生，由适当的细胞源溶解产生或与脂质体相关。对于人类MHC分子，特别优选人类淋巴母细胞。
术语“重组的”用于例如，细胞、核酸、蛋白或载体时，指该细胞、核酸、蛋白或载体已被异源核酸或蛋白的引入或天然核酸或蛋白的改变而修饰，或该细胞来源于如此修饰过的细胞。因此，例如，重组细胞表达天然(非重组)形式细胞没有的基因，或使天然基因表达异常，低表达或根本不表达。
术语“异源的”用于指核酸的部分时，是指该核酸包含天然状态中互相不处于相同关系中的两个或更多亚序列。例如，该核酸一般是重组产生，具有来源于无关基因的两个或更多序列，它们的排列产生一个新的功能性核酸，比如一种来源的启动子和另一来源的编码区。相似的是，异源蛋白是指天包含然状态中互相不处于相同关系中的两个或更多亚序列的蛋白(例如融合蛋白)。
术语“可操作性连接”是指核酸表达控制序列(例如启动子、或转录因子结合位点的排列)和另一核酸序列之间的功能性连接，其中表达控制序列指导对应于第二个序列的核酸的转录。III.MHC成分编码MHC的糖蛋白在人类和鼠系统中已被深入研究。MHC基因复合物在小鼠被称为H-2复合物，在人类被称为HLA复合物。MHC糖蛋白被分为I类糖蛋白，发现于所有细胞表面，主要被细胞毒性T细胞识别；II类糖蛋白，发现于包括例如巨噬细胞等辅助细胞的一些细胞表面，参与向辅助T细胞呈递抗原。一些组织相容性蛋白已被分离并鉴定。对于MHC糖蛋白结构和功能的概括性综述见Paul，FundamentalImmunology，2nd Ed.，Ravens Pres s N.Y.(1989)和Albert等，Molecular Biology of the Cell，2nd Ed.，Garland Publishing，Inc.，N.Y.& London(1989)。
本发明中MHCII类分子尤为有用。由伸展出细胞膜双层的两个II类链的N-末端结构域部分构成一个II类MHC分子。一条链的N-末端部分的两个结构域与MHCI类抗原序列的α1和α2区同源。MHCII类分子的抗原结合袋由α1和β1结构域组成。II类分子两端的结合袋开放所以能容纳长的肽。HLA-DR1的三维结构已有描述(Brown等(1993)Nature 36433)。II类基因的克隆允许II类MHC结合结构域进行以下所述的操作。
本发明复合物的MHC糖蛋白部分可通过从淋巴细胞分离并筛选其结合所需肽抗原的能力而获得。淋巴细胞来源于用复合物处理的个体物种。例如，它们可以从患目标自身免疫性疾病个体的人B细胞中分离，该细胞通过用本领域已知技术转染复制缺陷的Epstein-Barr病毒而永生。
纯化II类组织相容性蛋白的方法是本领域所熟知的。可以使用不同的技术从多种细胞中分离得到。例如，该糖蛋白在蛋白酶处理、3MKCL处理或去污剂处理后溶解。优选的方法是用去污剂从淋巴细胞抽提II类蛋白后，再进行亲和层析(见例如，Turkewitz等，(1983)MolecularImmunology 201139-1147。不同的方法已被开发用于生产不呈递内源性抗原的所需MHCII类组织相容性异源二聚体(Stern和Wiley(1992)Cell 68465-77；Ljunggren等(1990)Nature 346476-80；和Schumacher等(1990)Cell 62563-67)。
做为选择，MHC成分也可使用本领域技术人员熟知的技术重组表达。一些II类蛋白的每个氨基酸序列已获知，其基因或cDNAs也已克隆。因此，这些核酸可被用于表达MHC多肽。如果不能获得所需的MHC基因或cDNA，可使用本领域技术人员熟知的克隆方法分离基因。可被使用的方法是纯化所需MHC多肽，获得部分氨基酸序列，根据该氨基酸序列合成核苷酸探针，使用该探针识别具有来自于cDNA或基因组文库的所需基因的克隆。可以将截短和全长的核酸与指导所需宿主中基因表达的信号进行可操作性连接，从而用克隆的编码MHC多肽的核苷酸序列表达MHC多肽。可选用许多适当的和本领域技术人员熟知的宿主。
然后可以使用本领域技术人员熟知的方法使MHC多肽在细胞内表达或通过细胞分泌。
用于转染宿主细胞的核苷酸序列可根据标准方法修饰，而产生具有多种所需特性的MHC多肽。许多技术都是本领域技术人员熟知的。例如，MHC多肽可通过氨基酸插入、取代、缺失等改变天然存在序列的一级结构水平。也可使用蛋白融合技术给予MHC多肽新的活性或新活性的组合。可以利用这些修饰方法的一些组合产生最终经修饰的MHC多肽。
可以根据多种所需目的制备氨基酸序列变体，包括重组多肽的简易纯化和制备。修饰后的多肽可有效的使用于调整治疗半衰期、提高疗效和减少治疗时副作用的严重性或发生。氨基酸序列变体通常为天然不存在的预定变体，但它们显示与天然序列MHC同样的肽结合和T细胞结合能力。例如，可以产生包括仅仅一部分(通常至少约60-80％，代表性的是90-95％)一级结构的多肽片段。在某些实施方案中，MHC多肽基本上由来源于全长多肽的α1或β1结构域组成。这些片段代表性地包括约50-100个氨基酸，优选约60-90个，更优选约70-80个。另外，可以选用合成法制备多肽(见，例如，Merrifield(1986)Science 232341-347；Atherton等，Solid Phase PeptideSynthesisA Practical Approach，IRL Press，Oxford)。可以使用氨基酸分析或测序(例如，the Edman degradation procedure；见，例如，Creighton Proteins，Structures and MolecularPrinciples，Freeman and Co.，New York NY(1983)或者使用其它本领域技术人员熟知的适当的方法证实合成肽的组成。
一般来说，编码MHC多肽的序列的修饰可通过多种熟知的技术，例如定点诱变(见，Gillman和Smith(1979)Gene 881-97；和Roberts等(1987)Nature 328731-734)而容易地完成。可以通适当的分析方法中的常规筛选对大多数修饰进行所需特征的评估。例如，使用以下描述的分析方法可以轻易评估多种修饰对多肽结合肽或影响T细胞增殖的能力的影响。其它特性的修饰，例如氧化还原作用或热稳定性、疏水性、蛋白质水解易受性或聚集倾向，都可根据标准技术分析。
某些应用中，修饰了MHC cDNA编码序列，使之缺失跨膜结构域并表达得到的可溶MHC多肽。例如可以使用寡核苷酸指导的缺失诱变或聚合酶链反应截短MHC cDNA。寡核苷酸指导的体外突变可见Kunkel等(1987)Meth.Enzymol.154367-382(亦见，Ausubel等，supra)。IV.肽可以认为，抗原呈递细胞(APCS)表面的MHC糖蛋白呈递抗原发生在抗原蛋白水解成小的肽单位之后。认为这些片段长度为8-18个残基，包括限制位(由MHC分子识别)和表位(由辅助性T细胞上的T细胞受体识别)。表位自身是识别辅助性T细胞的抗原特异受体的连续的或非连续的5-6个氨基酸的序列。限制位是负责联系肽和MHC糖蛋白的连续或非连续的序列。
例如，可以通过筛选与HLA-DR2和HLA-DR3结合的一组重叠的AChR肽，而识别MG中重要的肽。可以使用本领域技术人员熟知的多种结合分析检测肽与MHC复合物的结合亲和力。适当结合分析的实例是基于铕的竞争性结合分析(见，例如，Tompkins等，J.Immunol.Methods 163209-216)。而且，本发明的肽诱导T细胞反应的能力可以使用多种以下描述的本领域技术人员熟知的标准方法测定。
典型地，本发明的肽将包含对应于AChR的氨基酸序列，或与其基本相同或相似的氨基酸序列。本发明的肽可以使用本领域技术人员熟知的技术从天然来源分离、合成或重组表达。
具有所需活性的肽为了提供某些需要的特性而必须加以修饰，所述特性例如，在提高或至少基本保持未修饰肽结合所需MHC分子和诱导适当T细胞的无反应性的所有生物学活性同时，改进药理学特性。例如，肽可以有多种变化，例如保守或非保守的取代，这些变化在使用时提供某些优势，例如改进MHC的结合。单氨基酸取代的效应也可使用D-氨基酸探测。这些修饰可以使用已熟知的肽合成过程达到，描述见，例如，Merrifield(1986)Science 232341-347；Barany和Merrifield，The Peptides，Gross and Meienhofer，eds.(N.Y.，Academic Press)，pp.1-284(1979)；及Stewart和Young，SolidPhase Peptide Synthesis，(Rockford，I11.，Pierce)，2nd Ed.(1984)。
通过延伸或减少肽氨基酸序列，例如，通过添加或删除氨基酸修饰肽。本发明的肽也可通过改变某些残基的顺序或组成而修饰，容易理解，在不对生物学活性产生不良影响的条件下，一般不应改变那些生物学活性关键的氨基酸残基，例如，关键的接触位点或保守残基。非关键的氨基酸不限定于天然存在于蛋白中的氨基酸，例如L-α-氨基酸或它们的D-异构体；而是也包括非天然氨基酸，例如β-γ-δ-氨基酸和许多L-α-氨基酸的衍生物。
典型地，一系列具有单氨基酸取代的肽被用于检测静电、疏水性对结合等的作用。例如，在沿着肽长度的一系列正电荷(例如，Lys或Arg)或负电荷(例如Glu)氨基酸的取代，揭示了对于各种MHC分子和T细胞受体的不同敏感性模式。而且，可以使用具有小的，相对中性的部分，例如，Ala、Gly、Pro或可利用的相似残基的多个取代。取代可为同寡聚物或异寡聚物。取代或添加残基的数量和类型依赖于基本接触位点和某些进行探询的功能特性(例如，亲水性与疏水性)间的必须空间。这种取代较其母肽可以提高MHC分子或T细胞受体的结合亲和力。在任何情况下，这种取代应使用经选择的氨基酸残基或其它分子片段，以避免例如可能破坏结合的空间或电荷干扰。
代表性的氨基酸取代是单残基的取代。取代、删除、插入或它们的任何组合都可用于构建目的肽。取代变体是指肽的至少一个残基被移除，并且该位点插入了不同的残基。当需要精确调节太的特征时，一般根据以下表1进行取代。
表1原始残基示例性的取代丙氨酸 丝氨酸精氨酸 赖氨酸；组氨酸天冬酰胺 谷氨酰胺天冬氨酸 谷氨酸半胱氨酸 丝氨酸谷氨酰胺 天冬酰胺谷氨酸 天冬氨酸甘氨酸 脯氨酸组氨酸 赖氨酸；精氨酸异亮氨酸 亮氨酸；缬氨酸亮氨酸 异亮氨酸；缬氨酸赖氨酸 精氨酸；组氨酸甲硫氨酸 亮氨酸；异亮氨酸苯丙氨酸 酪氨酸；色氨酸丝氨酸 苏氨酸苏氨酸 丝氨酸色氨酸 酪氨酸；苯丙氨酸酪氨酸 色氨酸；苯丙氨酸缬氨酸 异亮氨酸；亮氨酸功能上的大量改变(例如，对于MHC分子或T细胞受体的亲和)由选择较表1低保守的取代产生，即选择对维持(a)取代区域的肽主链结构，例如折叠或螺旋构象，(b)靶位点分子的电荷或疏水性或(c)侧链的大小的作用更显著不同的残基。一般期望产生肽特性最大改变的取代是(a)用亲水性残基，例如丝氨酸，取代疏水性残基，例如，亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸，或前者被后者取代；(b)用具有正电性侧链的残基，例如，赖氨酸、精氨酸或组氨酸，取代负电性残基，例如，谷氨酸或天门冬氨酸；或前者被后者取代；或(c)用具有大侧链的残基，例如，苯丙氨酸，取代不具有侧链的氨基酸，如谷氨酸，或前者被后者取代。
该肽也可包括免疫原性肽上的两个或多个残基的同型空间配位体。此处同型空间配位体的含义是两个或更多残基的一个序列可以取代另一序列，因为第个序列的空间构象适合于第二个序列的特异结合位点。该术语特别包括本领域技术人员熟知的肽主链的修饰。这种修饰包括酰胺氮、α-碳、酰胺羰基的修饰、酰胺键的完全取代、伸展、删除或主链交联(一般见，Spatola，Chemistry and Biochemistry ofAmino Acids，Peptides and Proteins，Vol.VII(WeinsteinEd.，1983))。
而且，可以通过与其它分子的键而修饰肽。例如，可以引入不同的N-或C-端基对分子的物理和/或化学特性进行改变。这些改变可以用于影响，例如，分子的粘附、稳定性、生物可利用度、定位或检测。对于诊断的目的，多种标记可以和末端连接，直接或间接提供可检测信号。因此，本发明肽可以根据最终目的，使用多种方法进行修饰而仍旧保持生物活性。
因此，除了直接来源于AChR氨基酸序列的肽，这些序列的一些构象类似物也可使用。在此使用的“构象类似物”是空间或两极组织与结合于MHC成分的AChR氨基酸序列十分相似的分子。本发明的构象类似物可以完全由发现于AChR序列以外的氨基酸残基构成。V.复合物的形成本发明的可溶性MHC异源二聚体肽复合物可以用作治疗性阻断特定T细胞和抗原呈递细胞结合的拮抗剂。而且，该分子可以诱导目标T细胞的无细胞免疫反应性或增生无反应性。
该复合物的元件可以使用本领域的标准方法结合。例如，混合两种组分，抗原肽可以与MHC蛋白的抗原结合位点非共价结合。使用任何一种标准程序，例如超滤或透析可以除去过量的肽。使用标准程序，例如，光亲和标记(见，例如，Hall(1985)Biochemistry 245702-5711；Leuscher(1990)J.Biol.Chem.26511177-11184；Wraith(1989)Cell 59247-255)或其它任何适当的键方式(见，例如，Husain(1995)Biochem.Mol.Biol.Int.36669-677；Traut(1995)Biochem.Cell Biol.73949-958；Haselgrubler(1995)Bioconjug.Chem.6242-248；和Carroll(1994)Bioconjug.Chem.5248-256)它们也可以与抗原结合袋共价结合。
另外，II类肽复合物可以设计为一个连续的重组多肽(见，例如，PCT公开WO96/40944，1996年12月19日；WO96/40194，1996年12月19日；和WO97/04360，1997年11月6日)。定位于期望的自身免疫性疾病(例如，重症肌无力)的可溶性融合MHC异二聚体肽分子含有与该自身免疫性疾病相关的抗原肽(例如，AChR肽)，该抗原肽恰当位于NHC分子的结合沟，而不需溶解MHC或外源性加载独立制造的肽。在该复合物中，MHC成分和抗原肽永久连接成单链构象。这些复合物消除无效和非特异肽加载。通过重组法生产要求保护的MHC肽复合物可以产生特异和高产的蛋白，终产品仅包括所选择的适当构象的MHC肽复合物。
使用已知每个氨基酸的密码子可以合成编码肽的寡核苷酸。优选使用那些在用于表达的生物体中优选利用的密码子设计寡核苷酸。本领域已获知多种生物体和细胞类型的密码子优选利用。利用本领域已知的技术，适当的序列可以掺入编码来源于MHC成分的肽的序列。掺入位点使得当分子表达和折叠时，AChR肽抗原结合将与MHC成分的抗原结合位点结合，并且作为目标T细胞的一个表位。
例如，使用标准重组DNA技术，此处公开的AChR肽可以与源于MG相关MHC抗原的多肽的N-端抗原结合位点相连接。如果该重组复合物使用于小鼠，则AChR肽可以掺入应编码I-Ab-α或I-Ab-β链的序列。如果AChR肽将被掺入β链，寡核苷酸作为前导肽的取代物插入。本领域已知替代多核苷酸中序列的方法。
可以使用相似的方案把AChR肽掺入编码源于适当的人类HLA抗原的肽的序列。例如，人类单倍型DR2W2与MG相关。因此，AChR肽可被掺入编码DR2等位基因β-链的序列。已知DR亚区中负责主要血清学特异性的结构基础DR1-9，来源于多种DR单倍型的编码HLA-DR-β链的序列也是已知的(见，例如，Bell等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA846234-6238)。
自身免疫抗原肽和MHC成分可以通过肽键链接。然而，对本领域技术人员还有其它显而易见的键方式，包括，例如，通过糖蛋白的糖基团连接，包括，例如，α-和/或β-链的糖成分。
评定可溶性融合MHC异二聚体肽复合物的物理和生物学特性有多种方法。本领域常规使用例如电喷射和矩阵辅助激光解吸附(Matrix-Assisted Laser Desorption)/Flight质谱离子化时间(Ionization Time Of Flight mass spectrometry)(MALDI TOF)分析法，提供分子量等信息和证实二硫键构象。使用FACs分析检测单链复合物适当折叠。一些标准分析法，例如酶联免疫吸附分析(ELISA)可用于进一步检测可溶性融合MHC的浓度和证实正确折叠(见，例如，WO96/40944)。VI.检测本发明肽和复合物诱导的T细胞反应本发明的肽和AChRMHCII类分子可以使用本领域熟知的多种体外模型进行分析。
仅MHCII类肽与TCR结合不足以激活CD4+T细胞。需要额外的“共刺激”信号。本发明MHCII类肽复合物与TCR的相互作用缺少共刺激信号。因此，也诱导抗原特异的T细胞的无反应性(Boussiotis(1994)Curr.Opin.Immunol.6797-807；Park(1997)Eur.J.Immunol.271082-1090)。该“耐受”或“无细胞免疫反应性”免疫抑制和再激发无反应性可由T细胞克隆无细胞免疫反应性、免疫抑制细胞因子诱导的无反应性实现(Schwartz(1989)Cell 571073-1081；Quill(1987)J.Immunol.1383704-3712)。通过监测细胞增殖、细胞代谢、细胞因子或淋巴因子分泌或任何形式的细胞活化来检测免疫抑制或再激发无反应性(即耐受，无细胞免疫反应性)的程度。
本发明的肽诱导的T细胞反应可以同样使用上述方法检测。
T细胞活化可以使用本领域熟知的多种方法检测。例如，通过检测3H-胸苷摄入或3-(4，5-二甲基-噻唑-2-7’)-2，5二苯基溴化四唑鎓摄入而分析T细胞增生(见，例如，Liu(1997)J.Neurochem.69581-593)。另外，由于T细胞在激活时合成并分泌细胞因子，MHCII类肽复合物的免疫抑制效应和由本发明的肽诱导的T细胞反应可通过检测细胞因子转录、翻译或分泌而评估。因此，可以定量各种细胞因子和淋巴因子，例如，白细胞介素、干扰素(INFs)(例如，gamma INF)、肿瘤坏死因子(TNFs)(例如，TNFβ)等。检测细胞因子和淋巴因子产生和/或分泌的方法是本领域熟知的，包括但不限于免疫测定，例如酶联免疫测定(ELISA)。
其它可使用的测定方法包括ELISPOT测定法。ELISPOT测定法是ELISA方法的改进，可以检测反应于抗原刺激的个体T细胞的淋巴因子分泌(Czerkinsky等，(1998)J.Immunol.Methods 11029-36)。该方法在滤纸(例如，硝酸纤维素或PVDF滤纸)上平铺捕获特定淋巴因子的单克隆抗体并在微孔中加入外周血单核细胞(PBMCs)+抗原。T细胞在刺激时分泌的淋巴因子被平铺的抗淋巴因子抗体局部捕获。捕获期(一般24小时)结束时冲洗掉细胞并检测分泌的淋巴因子。使用本发明的ELISPOT测定法可以测量不同淋巴因子的分泌，包括，IL-2，IL-4等。分泌的淋巴因子可以使用例如，二级抗淋巴因子抗体检测。该二级抗淋巴因子抗体可以被标记或直接或间接与标记或容易检测到的酶(例如，碱性磷酸酶)偶联。本领域的技术人员可以获知并得到本发明内容中可以使用的各种标记物和酶。在被刺激T细胞分泌淋巴因子的部位出现班点。该技术较ELISA法更敏感，并被许多研究小组应用于MG患者T细胞反应性的研究(见，例如，Link等(1991)J.Clin.Invest.872191-2196；Sun等，(1992)Eur.J.Immnuol.21553-1559；Yi等(1994)J.Neuroimmunol.50177-186；Newsom-Davis等(1989)J.Autoimmun.2101-108；Ahlberg等(1992)J.Immunol.36435-442；Link等(1992)J.Immunol.36405-414)。
ELISPOT测定法的一种改进方法称为克隆扩充ELISA斑(或CEE-SPOT)测定法，也可在本发明内容中使用。CEE-SPOT测定法中，在合适的时间(例如，7天)中用抗原刺激PBMCs，以便在再刺激和淋巴因子捕获之前(例如，第10天)促进抗原特异性T细胞增殖。这种反应性T细胞的克隆扩充明显地提高了测定敏感性。使用这种测定可以测量产生的淋巴因子，包括，如IL-2，IL-4等。一般说来，淋巴因子在滤纸上被捕获，优选PVDF滤纸，以改进班点的本底和强度。一般使用摄象机成像和计算机分析进行斑点计数。该测定类型也可先使用完整蛋白刺激T细胞，再用来源于蛋白的肽刺激，以便识别来源于天然加工的表位。
已经观察到，延长用可溶性MHCII类肽复合物孵育静止T细胞的时间导致T细胞凋亡，所以亦可监测细胞死亡(Arimilli(1996)Immunol.Cell Biol.7496-104)。细胞死亡可以通过多种已知的方法检测，例如，染料排斥通透性。凋亡的评估可以使用，例如，细胞DNA断裂、观察(用推进电子显微镜)、凋亡相关蛋白例如bc1-2等的检测和定量等(见，例如，Arimilli(1996)supra)。
本发明的可溶性MHC异二聚体肽复合物也可使用一些自身免疫反应动物模型进行体内检测，特别是实验性过敏性重症肌无力模型。VII.本发明药物组合物的制剂和给药如果包括MHC亚基的跨膜区，本发明的组合物在掺入脂单层或双层后可便利的给药。为此目的一般使用脂质体，但也可使用任何形式的脂膜，例如细胞(例如，红细胞)的细胞膜或平面脂膜。该组合物也可便利地掺入微胶粒(micelle)中。
使用以下描述的标准方法制备脂质体。然而，如果去除跨膜区，该组合物可以以一种用于含肽药物的方式便利地给药。
给药是全身的，并在注射后起效，优选为静脉注射，因此可以使用与注射给药途径相容的制剂。适当的制剂见于Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Philadelphia，PA，17th ed.(1985)。可以制备多种包括本发明复合物的和药物学有效载体的组合物。该药物组合物适于多种药物递送系统。本药物递送方法简要综述于Langer(1990)Science 2491527-1533。
制备本发明的药物组合物时，经常需要修饰本发明的复合物，以改变它们的药代动力学特性和生物分布。药代动力学一般的讨论见Remington’s Pharmaceutical Science，Supra，Chapters 37-39。本领域的任何普通技术人员都知道改变药代动力学和生物分布的多种方法(见，例如，Langer，Supar)。例如，增加复合物血清半衰期的方法包括去除参与将该化合物从血流中清除的糖类的处理。优选地，基本上所有的糖部分通过处理被去除。如果至少约75％，优选约90％，最优选约99％的糖部分被去除，则认为基本上所有的糖部分通过处理被去除。与蛋白、多糖或如聚乙二醇的合成聚合物等可溶性大分子的偶联同样起效。其它方法包括保护小泡内的复合物，所述复合物由蛋白、脂类(例如脂质体)、糖或合成聚合物组成。
本领域技术人员熟知的常规表面活性剂可以在本发明中使用。适当的表面活性剂包括，月桂酸钠、油酸钠、月桂基硫酸钠、辛氧基乙二醇单十二烷基醚、octoxyno19和PLURONIC F-127(WyandotteChemicals Corp.)。优选的表面活性剂是与静脉注射相容的非离子型聚氧乙烯和聚氧丙烯去污剂，例如TWEEN-80，PLURONIC F-68等。优选的去污剂是十二烷基-β-麦芽糖。而且，如描述在脂质体生产中所使用的磷脂也可作为微胶粒形成。
由于本发明的MHC亚基包含亲脂跨膜区和相对亲水的细胞外结构域，在常规表面活性剂或磷脂和亚基的存在下形成混合的微胶粒。本发明的混合微胶粒可以包含任何亚基、磷脂和/或表面活性剂的组合。因此，微胶粒可包含亚基和去污剂、亚基同磷脂和去污剂的组合，或亚基和磷脂。
对于包含本发明复合物的药物组合物，剂量的变化应根据，例如，特定复合物、给药方式、治疗的不同疾病和其严重性、患者的总体健康和状况以及处方医生的判断。鼠类的给药剂量一般为约10μg至500μg。优选的总体剂量为约50μg至300μg。例如，在疾病的治疗过程中，三次25μg或100μg的剂量有效。总剂量范围为约0.015至15μg/kg，优选为约0.15至10μg/kg。
药物组合物用于肠胃外、表面、口服或局部给药，例如通过气溶胶或经皮给药，用于预防和/或治疗性处理。药物组合物根据给药方式可以以各种单位剂型给药。例如，适于口服给药单位剂型包括粉剂、片剂、药丸和胶囊。
药物组合物优选静脉给药。因此，本发明提供用于静脉给药的组合物，包含溶解或悬浮于可接受载体，优选水性载体的复合物溶液。可以使用各种水性载体，例如，水、缓冲液、0.4％的盐水等。例如，磷酸缓冲液(PBS)特别适于本发明可溶复合物的给药。优选的制剂是含0.02％TWEEN-80的PBS。这些组合物可以使用常规的已知技术灭菌或过滤灭菌。得到的水溶液可以被包装进行使用，例如冻干，冻干制剂在给药前应与无菌水溶液混合。该组合物可以包含药学可接受的使之接近生理状况的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如，醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、去水山梨糖醇月桂酸酯、三乙醇胺油酸盐等。
复合物的浓度变化范围较广，即从最少约0.05重量％，通常为或至少约1重量％至10-30重量％，主要按照所选用的特定给药方式根据液体体积，粘度等选择。优选的静脉给药浓度是PBS的约0.02-0.1％或更多。
对于固体组合物，可以使用常规的无毒固体载体，包括，例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服给药，药学可接受的无毒组合物通过掺入任何常规使用的赋形剂，如以上列出的载体和一般为10-95％的活性成份而形成。
对于气溶胶给药，复合物优选以极细的形式与表面活性剂和推进剂(propellant)一起给药。表面活性剂当然必须无毒优选为溶于推进剂。这些试剂的代表是包含6至22个碳原子的脂肪酸例如，己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、油硬酸和油酸与脂肪族多元醇或其环酐，例如，乙二醇、甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、甘露醇、山梨糖醇、衍生于山梨糖醇的己糖醇酐的酯或部分酯，以及这些酯的聚氧乙烯和聚氧丙烯衍生物。混合酯，例如混合或天然甘油酯也可使用。表面活性剂可以构成组合物的0.1重量％至20重量％，优选0.25％-5重量％。组合物的平衡一般是推进剂。液化的推进剂一般在环境条件下气化，在压力下浓缩。适当的液化推进剂是包含5个碳原子的低级烷，例如丁烷和丙烷；优选氟化或氟氯化烷。上述物质的混合也可使用。生产气溶胶时，用适当的推进剂填充装备合适阀门的容器，容器中包含极细的化合物和表面活性剂。该成分因此在高压下维持直到阀门打开时释放。
包含该复合物的组合物可用于治疗、预防或诊断应用。在治疗应用方面，组合物以足够治愈或至少部分缓解该疾病和并发症症状的量给药于已经患上述疾病的患者。足够达到该效果的量被定义为“治疗有效量”。该用途的有效量取决于疾病的严重性和患者的体重及一般状况。如前面的讨论，代表性的给药量为约0.5mg/kg至约25mg/kg，优选约3至15mg/kg。
在预防应用方面，将包含本发明复合物的组合物给药于易患特定疾病或具有患特定疾病危险性的患者。该量被定义为“预防有效量”。此用途的精确给药量仍依赖于患者的健康状况和体重。该量一般在上述范围内。
在诊断应用方面，将包含适当复合物或其混合物的组合物给药于怀疑具有自身免疫性疾病状态的患者，以便判断与疾病相关的自身反应T细胞的存在。另外，也可监测特定治疗的效果。足够达到该效果的量被定义为“诊断有效量”。该用途的精确给药量依赖于患者的健康状况等，一般在每剂0.01至1000mg，尤其是每个患者约10至100mg。
试剂盒也能应用于治疗或诊断用途。因此，本发明的组合物可以以容器中冻干的形式提供。试剂盒中包含可能与标记或毒素偶联的复合物，或非偶联的复合物，以及Tris、磷酸盐、碳酸盐等缓冲液，稳定剂，杀生物剂，血清白蛋白等的惰性蛋白和一套使用说明。基于复合物的量，这些物质一般少于约5wt％，基于蛋白浓度，通常其总量至少占约0.001wt％。往往需要包含惰性补充剂或赋形剂，以稀释活性成份，其中赋形剂可以占总组合物的约1-99wt％。在一种测定中使用了可以与复合物结合的抗体，它通常存在于独立的管瓶中。按照本领域公知的技术可以将抗体与标记偶联和配制。
本说明书引用的所有出版物和专利申请在此引入作为参考，正如每个出版物和专利申请都特别地和独立地引入作为参考。
虽然前述的发明已经通过以清楚理解为目的的图解和实施例进行了详细描述，任何本领域普通技术人员都显然容易理解根据本发明的教导可以进行某些改变和修饰，而不离开所附权利权利要求的精神或范围。VI.实施例实施例1检测对HLA-DR结合一组重叠AChR肽的IC50值通过解离增强的lenthanide免疫荧光测定(“DELFIA”)竞争结合测定，检测一组68个重叠AChRα肽(具有7个氨基酸重叠的14聚体)对HLA-DR4的相对亲和力。图1说明在对HLA-DR2和HLA-DR3亲和力的DELFIA测定中检验的重叠AChR肽的位置。显示出了AChRα亚基序列，每个跨膜区(M1-M4)以有阴影的框表示。10倍稀释(优选1-100，000nM)的非标记AChRα肽与生物素化的髓磷脂碱性蛋白肽MBP84-102在pH5.5下共同孵育，检测结合溶解HLA-DR2(DRB1*1501和DRB5*0101的混合物)或HLA-DR3(DRB1*0301和DRB3*0101的复合物)的IC50。IC50的检测优选使用铕-链霉抗生物素解离增强的lenthanide免疫荧光测定(DELFIA)，IC50的计算一般通过使用含软件程序SOFTmaxPro的4参数拟合分析。图2列出了结合HLA-DR2和HLA-DR3的每个AChR肽的IC50值。图3的1/IC50图显示了这些肽的相对亲和力。该图说明了与HLA-DR1-4具有最高相对亲和力的AChRα肽相对位置。与HLA-DR2具有高的相对亲和力的肽包括AChRα7-22、113-126、204-217、310-327、419-437和421-434。
基于与噬菌体展示文库的结合研究，合成肽及洗脱肽的测序，一些研究小组已经报道了与DRB1*1501和DRB5*0101结合的结合基序。与DR2显示高亲和力的肽片段被发现包含文献引证的潜在的T细胞表位和共有DR2结合基序。图4说明匹配这些提出的基序的与HLA-DR2具有高亲和力的AChRα肽的可能排列。与HLA-DR3具有高亲和力的肽少于与HLA-DR2具有高亲和力的肽。显示高亲和力的肽包括7-22、36-49、145-163、195-212和400-413。DR3肽基序以n+3位几乎普遍存在D残基为特征，其中n是结合DR3袋1的锚定残基。图5说明匹配这些提出的基序的与DR3具有高亲和力的AChRα肽的可能排列。图6基于IC50≤10,000nM列出与DR2和DR3相关的候选免疫优势肽的总结。
而且，一组69个合成重叠AChRα肽(14个氨基酸中重叠7位)与HLA-DR4的相对亲和力是使用溶解的DR4通过基于铕的竞争结合测定而检测的。计算抑制已知DR4结合肽的50％的结合所要求的AChRα肽浓度。基于IC50值鉴别高亲和力肽。
表2总结了从ELISPOT研究中选出的五个高亲和力DR2结合肽的结果。这些肽和它们的IC50值都在表2中给出。表2结合HLA-DR2表现出低IC50值的AChRα肽片段。较低的IC50值说明对HLA-DR的较高结合亲和力。
*IC50值绝对高于标准值实施例2AChR肽的T细胞反应性上述肽对患者和正常健康个体PBMCs的T细胞反应性通过改进的ELISPOT测定检测。本研究包括从30位正常人和9位MG患者处得到的PBMCs。检测T细胞活性时，上述肽与TT/PPD为阳性对照，培养基为阴性对照。简言之，将PBMCs和抗原孵育7天，第8天进行抗原特异性克隆扩充。对每个抗原进行的抗原特异性细胞刺激特征通过检测到的γ-IFN的分泌而测量，γ-IFN的分泌是使用一对抗-γIFN抗体检测斑点数而检测。每个抗原获得的斑点数通过从培养基对照获得的斑点数进行校准。对每个PBMC样品和抗原都确立了定义为抗原的斑点数和培养基对照的斑点数的比值的反应指数。图7和8分别给出了用于正常和患者PBMCs的反应指数对抗原的图形。
对比患者和正常个体的分析结果，没有发现T细胞对所检测的5个AcHR表位反应性的明显不同。如所期望的，一些MG患者显示了对这些所检测AcHR表位的反应性，但是其中并无显示高反应性的患者。有趣的是，正常PBMCs也显示了对这些自身抗原表位的反应性。这明显表明，包括T细胞对特定抗原的反应性的一些其它因素，可能导致活跃疾病过程的起始。类似的研究也在多发性硬化和其它自身免疫性疾病中进行。
虽然在改项目中研究的患者数量比正常健康个体少的多，患者和正常健康个体中T细胞的任何初步反应趋势的存在得到了检测。对比了反应指数大于2的患者或正常健康个体的百分比。DR2+患者中反应趋势的存在也同样得到检测。图9和图10给出该数据分析的结果。
如果忽略所有正常健康个体和患者的HLA型，对AcHR421-434、400-413和36-49肽有反应性的患者百分比大约是对这些肽有反应性的正常健康个体百分比的两倍。这进一步说明这些肽可能是活跃疾病过程中的致病性T细胞表位。仅有DR2+患者的相似分析说明，除了AcHRα204-217的所有肽都可能是致病性T细胞表位。
因此，检测的69条AcHRα肽中，5条显示了与DR2的高结合亲和力(见实施例1)，这5条中的4条显示了与正常个体相比，对MG患者有偏倚的T细胞反应性。
根据前述的说明可以理解，尽管为了说明的目的在此描述了本发明的特定实施方案，可以在不离开本发明的精神和范围的前提下进行各种修改。
权利要求
1.一种组合物，包含一种分离的AChR寡肽，该寡肽包含约12-20个氨基酸残基，其中寡肽与一种选自以下组的肽具有基本相似的序列LVAKLFKDYSSVVRPVVEVTVGLQLIQLINTGHITWTPPAIFKSHFVMQRLPLYFIVNNWVRKFIDTIPNIMFFSIPNIMFFSTMKRPSREKQQLIQLINVDEVNQIMKLGTWTYDGSVVAINPESDDTPYLDITYHFVMQRLPL。
2.权利要求1的组合物，其中肽的序列选自LVAKLFKDYSSVVRPVVEVTVGLQLIQLINTGHITWTPPAIFKSHFVMQRLPLYFIVNNWVRKFIDTIPNIMFFSIPNIMFFSTMKRPSREKQQLIQLINVDEVNQIMKLGTWTYDGSVVAINPESDDTPYLDITYHFVMQRLPL。
3.权利要求1的组合物，其中的肽包含一种D-氨基酸或氨基酸模拟物。
4.权利要求1的组合物，其中的寡肽是一种免疫优势肽。
5.权利要求1的组合物，其中的肽与具有一种抗原结合位点的分离的MHCII类成分相结合，其中肽与抗原结合位点相结合。
6.权利要求5的组合物，其中MHC成分是一种HLA-DR2分子。
7.权利要求6的组合物，其中肽选自LVAKLFKDYSSVVRPVVEVTVGLQLIQLINTGHITWTPPAIFKSHFVMQRLPLYFIVNNWVRKFIDTIPNIMFFSIPNIMFFSTMKRPSREKQ。
8.权利要求5的组合物，其中MHC成分是一种HLA-DR3分子。
9.权利要求8的组合物，其中肽选自LVAKLFKDYSSVVRPVQLIQLINVDEVNQIMKLGTWTYDGSVVAINPESDDTPYLDITYKFVMQRLPL。
10.一种组合物，包含一种抗原肽和一种具有抗原结合位点的分离的MHC成分，其中抗原肽与抗原结合位点结合，并且其中的肽与一种选自以下组的肽具有基本相似的序列LVAKLFKDYSSVVRPVVEVTVGLQLIQLINTGHITWTPPAIFKSHFVMQRLPLYFIVNNWVRKFIDTIPNIMFFSIPNIMFFSTMKRPSREKQQLIQLINVDEVNQIMKLGTWTYDGSVVAINPESDDTPYLDITYHFVMQRLPL。
11.权利要求10的组合物，其中MHC成分是HLA-DR2。
12.权利要求11的组合物，其中肽选自LVAKLFKDYSSVVRPVVEVTVGLQLIQLINTGHITWTPPAIFKSHFVMQRLPLYFIVNNWVRKFIDTIPNIMFFSIPNIMFFSTMKRPSREKQ。
13.权利要求10的组合物，其中MHC成分是HLA-DR3。
14.权利要求13的组合物，其中肽选自LVAKLFKDYSSVVRPVQLIQLINVDEVNQIMKLGTWTYDGSVVAINPESDDTPYLDITYHFVMQRLPL。
15.一种药物组合物，包含药学可接受的载体和权利要求1的肽。
16.权利要求15的药物组合物，其中肽与分离的MHCII类分子结合。
17.权利要求16的药物组合物，其中MHC成分选自HLA-DR2和HLA-DR3。
18.一种治疗患者的重症肌无力的方法，包括给予患者权利要求15的药物组合物。
19.一种治疗患者的重症肌无力的方法，包括给予患者权利要求16的药物组合物。
20.一种治疗患者的重症肌无力的方法，包括给予患者权利要求17的药物组合物。
21.一种诱导哺乳动物中靶T细胞的无反应性的方法，该方法包括给予哺乳动物一种治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含一种抗原肽和一种具有抗原结合位点的分离的MHCII类成分，其中抗原肽与抗原结合位点结合，并且其中抗原肽与一种选自以下组的肽具有基本相似的序列LVAKLFKDYSSVVRPVVEVTVGLQLIQLINTGHITWTPPAIFKSHFVMQRLPLYFIVNNWVRKFITIPNIMFFSIPNIMFFSTMKRPSREKQQLIQLINVDEVNQIMKLGTWTYDGSVVAINPESDDTPYLDITYHFVMQRLPL。
22.权利要求21的方法，其中抗原肽的序列选自LVAKLFKDYSSVVRPVVEVTVGLQLIQLINTGHITWTPPAIFKSHFVMQRLPLYFIVNNWVRKFIDTIPNIMFFSIPNIMFFSTMKRPSREKQQLIQLINVDEVNQIMKLGTWTYDGSVVAINPESDDTPYLDITYHFVMQRLPL。
23.权利要求21的方法，其中MHC成分是HLA-DR2。
24.权利要求21的方法，其中MHC成分是HLA-DR3。
25.权利要求21的方法，其中药物组合物经静脉内给药。
全文摘要
本发明涉及自身免疫性疾病，特别是重症肌无力的治疗。本发明提供来源于乙酰胆碱受体的新的自身免疫优势肽，并提供制备该肽的方法。本发明进一步提供包含这些与适当的主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的肽的复合物及制备这些复合物的方法。本发明中的复合物可以用于重症肌无力的治疗和预防性处理。
文档编号C07K19/00GK1432024SQ01810422
公开日2003年7月23日 申请日期2001年3月30日 优先权日2000年3月31日
发明者S·德斯潘德, E·斯帕克, N·韦纳, S·阿里米利 申请人:科里克萨公司