专利名称：T细胞受体融合物及共轭物以及其使用方法
技术领域：
本发明是关于可溶性T细胞受体复合物，且更特定言之是关于可溶性T细胞受体融合复合物及可溶性T细胞受体共轭复合物，以及制造及使用这些分子的方法。所提供的分子是用于各种治疗上的应用以及诊断目的。
这种治疗方法之一包含利用抗体将治疗或诊断剂靶向特定目标。许多团体以利用抗体为靶向剂作为开发的中心。这些开发包含抗体融合蛋白质的构建以及将抗体连接至各种效应分子的抗体共轭分子，包含放射性分子、化学治疗剂、毒素、以及附加生物活性蛋白质。使用这些分子开发的治疗或诊断剂是设计为造成特定作用，其是通过连接的抗体加以定向的。
正如抗体已经发展为治疗剂，免疫系统的其它的初级效应物，T细胞受体(TCR)，在作为发展治疗剂的平台上具有独特的优势。同时，抗体是限于识别血液及细胞外空间中的病原体或识别细胞表面上的蛋白质靶，T细胞受体可识别在细胞表面上以MHC分子显示的抗原(包含衍生自细胞内蛋白质的抗原)。依照T细胞的亚型，该识别显示的抗原及变成具有活性，T细胞受体及具有T细胞受体的T细胞可参与控制各种免疫反应。例如，T细胞是涉及人类免疫反应的调节经由诱导B细胞分化为抗体产生细胞。此外，经活化的T细胞可起始细胞介导免疫反应。因此，T细胞受体可识别对抗体来说为不可利用的另外目标。
T细胞反应是通过抗原与T细胞受体(TCR)的结合调节。TCR中之一型是膜结合的杂二聚体，与免疫球蛋白可变区(V)及恒定区(C)相似，是由α及β链构成。该TCRα链包含共价连接的V-α及C-α，而该β链包含共价连接至C-β链的V-β链。该V-α及V-β链形成一个口袋或裂缝，其可结合超级抗原或主要组织相容性复合物(MHC，在人类中已知为HLA复合物)中的抗原。大体而言，参见Davis Ann.Rev.ofImmunology 3537(1985)；Fundamental Immunology 3rd Ed.，W.Paul Ed.Rsen Press LTD.New York(1993)。
人们认为，TCR在免疫系统的发育及功能中是扮演一重要角色。例如，已报导该TCR可调节细胞杀伤、增加B细胞增殖作用，以及对各种病症(包含癌症、过敏、病毒性感染以及自体免疫病症)的发展及严重性产生影响。
因此，基于T细胞受体，需要提供一种新颖的靶向剂，以及生产及利用这些用于治疗剂及诊断嵌体的试剂的方法。基于抗体靶向作用，尤其需要提供这些与先前技术中的复合物相比较，具有某种优点的分子。
本发明的TCR可经各种方法加以修饰，使TCR与生物活性分子相连接。本发明教导利用基因融合及化学共轭为方法而达到这种连接。可与生物活性分子附接的TCR是天然TCR杂二聚体或其可溶性型式，或者更优选为可溶性、单链TCR。该生物活性分子可为各种生物活性效应物包含，但不限于细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白质或非蛋白质毒素、免疫球蛋白结构域、细胞毒素剂、化学治疗剂、放射性物质、可检测标记等。
在某些例子中，该可溶性单链TCR蛋白质包含一或多种经融合的效应物或标记。例如，在某些例子中，该标记可有助于自自然产生的细胞成分(其典型地伴随该融合蛋白质)中纯化TCR蛋白质融合复合物。在其它例子中，该蛋白质标记可用于将预先决定的化学或蛋白酶剪切位点引入该可溶性蛋白质中。尤其，考虑的是将一段可编码出标记的序列引入DNA载体中，例如，若需要，在可编码出融合复合物与效应分子链间或与适合的片段间引入，使TCR分子可自效应物链或片段中裂解出来(亦即分离出来)。
在本发明中所使用的特优选的T细胞受体分子是单链T细胞受体。
在本发明的一个优选方面，TCR融合复合物是共价连接至免疫球蛋白，例如IgG、IgM、或IgA或者连接至其片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2)。适合的TCR融合复合物是连接至免疫球蛋白的恒定区。
在本发明的另一优选方面，TCR融合复合物是共价连接至细胞因子，例如IL-2。
在本发明的又另一优选方面，TCR融合复合物是共价连接至趋化因子，例如MIP-1β。
再者，本发明的另一优选方面，TCR融合复合物是共价连接至生长因子，例如GCSF。
在本发明的另一优选方面，TCR融合复合物是共价连接至蛋白质或非-蛋白质毒素，例如蓖麻毒蛋白。
再者，本发明的另一优选方面，TCR融合复合物是共价连接至细胞毒素剂，例如阿霉素。
在本发明的另一优选方面，TCR融合复合物是共价连接至放射性物质，例如I125。
在本发明的再另一优选方面，TCR融合复合物是共价连接至可检测标记，例如荧光、放射性或电子转移剂。
具体言之，本发明提供一种可溶性TCR融合蛋白质以及TCR共轭复合物，其包含一效应物，该效应物为细胞毒素或可检测的标记原子或适用于诊断、成像或治疗研究的化合物。该TCR融合复合物及TCR共轭复合物可用于各种应用，包含于体内检测细胞和/或使细胞或组织成像，以及治疗用途，例如在体内或体外伤害或杀死细胞。通常，靶细胞或组织是包含一或多种可选择性结合至TCR的配体。例如细胞包含肿瘤细胞，例如黑色素瘤以及病毒性感染细胞(例如经灵长类DNA或RNA病毒(分别例如巨细胞病毒或AIDS病毒)感染的细胞)。
本发明的其它方面及具体实施例是如下所述。
A)示意性说明将264 TCR建构成具有三个结构域的scTCR且共价连接至κ恒定链区域。
B)将含有经纯化的264 scTCR-κ融合蛋白质的凝胶在还原以及非还原条件下进行电泳，之后并以考马斯蓝染色。
C)经纯化的264 scTCR-κ融合蛋白质以抗-κ-辣根过氧化物酶(HRP)-标记共轭物作为探针，进行免疫印迹。
图2表示可溶性264 scTCR-IL-2融合蛋白质的构建体的设计及表达。
A)示意性显示将264 scTCR基因以EE肽标记共价连接至IL2基因，所包含的标记有助于检测该分子。
B) 将含有经纯化的264 scTCR-IL-2及264 scTCR-κ融合蛋白质的凝胶以考马斯蓝染色。
C)经纯化的264 scTCR-IL-2融合蛋白质以抗-EE标记单克隆抗体及山羊抗-鼠-HRP共轭物作为探针，进行免疫印迹。
图3是说明IL-2活性的生物分析的结果。
图4是说明以264 scTCR-IL-2融合蛋白质染色的抗原递呈细胞的结果。
图5是说明细胞共轭分析的结果。
图6是示意性说明T细胞受体作为治疗剂时的类型。
图7是示意性说明scTCR介导靶向给药的肿瘤细胞杀伤。
图8是示意性说明Fc依赖性细胞介导节胞毒性来介导的肿瘤细胞杀死。
图9是示意性说明pNAG2载体。
图10是示意性显示pSUN27载体。
图11是示意性显示较佳的双专一性杂交分子pBISP/D011.10以及pBISP/149。
图12A是示意性显示制造嵌合体双专一性抗体分子的方法。该方法利用杂交瘤表达细胞(145-2C11杂交瘤)产生抗体链(重链)，其会与细胞中的sc-TCR/Ig融合分子(轻链)结合。sc-TCR/Ig分子的较佳结构是图解于图12B中。
图13是示意性显示载体pSUN7载体。
发明详述为了改善以抗体为主的分子的表达，我们已基于利用T细胞受体(TCR)发展出抗原专一性治疗剂。以TCR为主的试剂具有数种优于抗体分子的优点。第一，以抗体为主的疗法因肿瘤抗原脱落的原因，杀死肿瘤细胞的效率经常低于所期望的效率。虽然已有MHC脱落的报告，但循环中的专一性MHC/肿瘤肽的程度极低于游离循环的肿瘤抗原。第二，由于抗原分子并未暴露在细胞的表面上或未不能接触抗体分子的缘故，抗体分子无法识别许多潜在的肿瘤抗原。许多潜在的肿瘤专一性蛋白质是存在于细胞内，但正常地是在细胞内处理成肽，然后这些肽出现在肿瘤细胞的表面上的第一类MHC或第二类MHC分子中。不同于TCR，通常抗体不会识别这些经处理过的抗原，该抗原占据MHC分子的结合口袋。第三，许多由抗体识别的抗原本身是异种基因的，其限制了抗体对单一肿瘤组织学的有效性。相反地，许多T细胞抗原决定部位常见于大多数肿瘤中，这些肿瘤源于数个不同的组织中。
总结如上所述，我们现已创造出TCR融合及共轭复合物，以及编码出这些复合物的表达载体，该TCR融合及共轭复合物包括一共价连接至生物活性肽或分子的TCR分子，以及产生这些复合物的方法及这些融合及共轭复合物及表达载体及共轭复合物的利用。
T细胞是以表达在其细胞上的T细胞受体来识别递呈在细胞表面的抗原。TCR是双硫键连接的杂二聚体，主要是由α及β链糖蛋白构成。T细胞在其受体分子中用以产生多样性的机制与B细胞中运作用以产生多样性的机制相似(Janeway and Travers；Immunobiology 1997)。与免疫球蛋白基因相似，TCR基因是由于T细胞的发育期间重排片段所组成。TCR多肽是由氨基端可变区及羧基端恒定区组成。同时，该羧基端区域的功能是作为穿过细胞膜的锚状物且当受体与抗原结合后该可变区因识别抗原而产生响应时，羧基端区域会参与细胞内的信号传导。该TCRα链含有仅由V及D片断编码的可变区，同时，β链含有附加连接(J)片断。这些片断的重排及突变以及可变区的成熟造成整个TCR所有成分的多样性，使其可识别极多展示在不同TCR分子中的不同抗原。
事先已发展出生产高专一性T细胞受体(TCR)的技术，其可识别特定抗原。例如，尚未获准专利的美国专利申请案U.S.S.N.08/813,781以及U.S.S.N.09/422,375，以参考资料合并于本文；以及国际公开案PCT/US98/04274以及PCT/US99/24645，且此处所讨论的参考资料揭示制备及使用专一性TCR的方法。此外，通过重组方法生产特定专一性TCR如可溶性、单链TCR(scTCR)。已揭示出TCR的生产方法及使用方法且说明于尚未获准专利的美国专利申请案08/943,086，以及国际申请案PCT/US98/20263，其以参考资料合并于本文。这些TCRs以及scTCRs可加以修改使创造出融合物或共轭物使成为所得的作为治疗用的TCRs以及scTCRs。本发明的TCR复合物可通过基因融合该由重组生产的TCR或scTCR编码区域和编码出具有生物活性蛋白的基因而生产TCR融合复合物。另外，TCR或scTCRs亦可化学上与生物活性分子共轭而生产TCR共轭复合物。
此处所使用的“融合分子”是指TCR分子通过重组、化学或其它适合的方法共价地与一效应物(通常为蛋白质或肽序列)连接(即融合)。若需要，该融合分子可在一或数个位点通过肽接头序列加以融合。具体地，较佳的融合分子是融合蛋白质。
“多肽”是指任何聚合物，较佳为基本由20种天然氨基酸(不论其大小)的任一者所组成。虽然该“蛋白质”一词经常是用于提及相当大的蛋白质，而“肽”经常是用于提及小的多肽，在此领域中这些名词的使用经常会重叠。“多肽”一词，除非另有所指，通常是指蛋白质、多肽以及肽。依照本发明，通常有用的肽一般是介于约0.1至100KD或高达约1000KD，较佳为介于约0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30以及50KD之间，这些肽的大小是通过标准分子大小估算技术来评定，例如离心或SDS-聚丙酰胺凝胶电泳。
此处所使用的“共轭分子”是指TCR分子通过重组、化学或其它适合的方法共价(即融合)地与一效应物(通常为化学的或合成的分子)连接。若需要，该共轭分子可于一或数个位点通过肽接头序列或载体分子加以融合。此外，该肽接头或载体可用于协助该共轭分子的构建。具体地，较佳的共轭分子是共轭毒素或可检测标记。
本发明的TCR融合及TCR共轭复合物包括共价连接至该TCR分子的生物活性分子或效应分子(此处所使用的名词可交换地使用)。如此处所使用的“生物活性分子”或“效应分子”是指一氨基酸序列，例如蛋白质、多肽或肽；糖类或多糖类；脂质或醣脂类、脂蛋白质或可产生此处所讨论的所需作用的化学药剂。亦包括可编码出生物活性分子或效应物蛋白质、多肽或肽的效应分子核酸。因此，适合的分子包含调节因子、酶、抗体或药物以及DNA、RNA、以及寡核苷酸。该生物活性分子或效应分子可为自然产生的或由已知成分合成，例如通过重组或化学合成以及可包含异源成分。生物活性分子或效应分子一般是介于约0.1至100KD或高达约1000KD，较佳为介于约0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30以及50KD之间，这些肽的大小是通过标准分子大小估算技术(例如离心或SDS-聚丙酰胺凝胶电泳)来评定。本发明期望的效果包含，例如，诱发细胞增殖或细胞死亡，激活免疫反应或为了诊断目的作为检测分子，该诊断是通过如下所揭示的分析来决定，包含含有一系列步骤的分析，如培养细胞至细胞增殖，以及使该细胞与本发明的TCR融合复合物接触然后评估该TCR融合复合物是抑制该细胞还是使该细胞分化。
如本发明所使用生物活性分子或效应分子可包含因子，例如细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白质毒素、免疫球蛋白结构域或其它生物活性蛋白质(例如酶)。亦包含化合物，例如非蛋白质毒素、细胞毒性剂、化学治疗剂、可检测标记、放射性物质等。
本发明的细胞因子是界定为由细胞产生的任何因子，其可影响其它细胞且负责一些细胞免疫的任何多重作用。细胞因子的实例包含，但不限于IL2、IL10、IL-4、IL-12以及INF-γ。
本发明的趋化因子，与细胞因子相似，是界定为当暴露于其它细胞时负责一些细胞免疫的任何多重作用的化学因子或分子。适合的趋化因子包含，但不限于MIP-1β、IL-8、MCP-1、以及瑞代(Rantes)。
生长因子包含任何分子，当其暴露于特定细胞下，会诱发该受影响的细胞的增殖作用和/或分化作用。生长因子包含蛋白质及化学分子，其中某些包含人类生长因子以及干细胞生长因子。其它生长因子亦适合用于本发明。
毒素或细胞毒剂包含任何当其暴露于细胞时具有致命作用或对生长具有抑制作用的物质。更特定言之，该效应分子可为例如由植物或细菌得来的细胞毒素，例如白喉毒素(DT)、志贺菌毒素、相思豆毒蛋白、霍乱毒素、蓖麻毒蛋白、皂草素、假单胞菌外毒素(PE)、美洲商陆抗病毒蛋白、或白树毒素。这些毒素的生物活性片段在本技术领域中是已知的且包含，例如DT A链及蓖麻毒蛋白A链。此外，该毒素可以是在细胞表面活化的药剂，例如磷脂酶(例如磷脂酶C)。
再者，该效应分子可为化学治疗药剂，例如长春碱酰胺、长春新碱、长春花碱、氨甲喋呤、阿霉素、博来霉素、或顺铂。
此外，该效应分子可为适合用于诊断或成像研究的检测性标记分子，例如荧光标记，例如绿荧光蛋白、藻红蛋白、塞可(cychome)、或得克萨斯红(texas red)或放射性核素例如碘-131、钇-90、铼-188或铋-212。参见例如Moskaug等人的J.Biol.Chem.264，15709(1989)；Pastan，I.等人的Cell 47，641，1986；Pastan等人的Recombinant Toxins as NovelTherapeutic Agents，Ann.Rev.Biochem.61，331，(1992)；“ChimericToxins”Olsnes以及Phil，Pharmac.Ther.，25，355(1982)；经颁布的PCT申请案第WO 94/29350号；经颁布的PCT申请案第WO 94/04689号；以及美国专利第5,620,939号揭示的是与制造及使用包括效应物或标记的蛋白质相关。
TCR融合或共轭复合物包含经共价连接的效应分子，其具有数种重要的用途。例如，该TCR融合或共轭复合物可用于递送该效应分子至某些可专一性结合该TCR的细胞。此外，该TCR融合或共轭复合物提供选择性伤害或杀死包括该配体的细胞的方法。可通过该TCR融合或共轭复合物伤害或杀死的细胞或组织的实例包含肿瘤以及经病毒或细菌感染的细胞，该细胞可表达一或多种可专一性结合该TCR的配体。通过本文所揭示的方法可轻易地分析遭到伤害或杀死的细胞或组织。
融合至效应分子的TCR融合复合物的特定实例如下sc-TCR，例如如下实施例5下方所揭示的p264 sc-TCR，其可通过以264 DNA载体(说明于第1图)转染哺乳类细胞所产生。该sc-TCR p264蛋白质融合复合物可识别经加工的肽片段(该肽得自存在于人类HLA抗原，HLA-2.1，中的人类野生型p53肿瘤抑制物蛋白质)。该sc-TCR p264及其肽配体已说明于Theobald，M.J.，等人的PNAS(USA)(1995)，9211993。该肽的序列为LIGRNSFEV。肿瘤抑制物蛋白质p53的表达在恶性细胞中是上调的。已显示在所有肿瘤的50％中在其表面增加p53的表达程度(Holliston，M.D.，等人的Science(1991)，25349)。因此，对这种抗原决定表位具有专一性的scTCR分子可以毒素标记，然后递送至表达该p53肽片段HLA-2.1配体的恶性细胞。这种标记专一性免疫疗法可有效地仅杀死恶性细胞。在活体外测量细胞毒性的方法为已知且包含如下所述的已知的可行性分析。
包括经连接至一效应物的p149 sc-TCR的sc-TCR分子具有其它重要的用途。例如，该sc-TCR分子可用于选择性地杀死表达264肽的人类乳癌细胞。可进行活体外的研究，其中利用非-放射性细胞胞毒素分析法(利用Eu3+释放胞毒性分析)评估经264分子标记的毒素的杀乳癌细胞的能力(Bouma，G.J.，等人(1992)Hum.Immunol.3585)。在体内可轻易地测试包括融合效应分子的sc-TCR分子。例如，通过将表达在乳癌细胞的p264/HLA.A21移植至HLA/A2基因转殖鼠进行活体外研究。(Theobald等人(1995)，见上)。将预先决定剂量的经scTCR p264分子标记的毒素注射至小鼠中，测量其对肿瘤的大小的影响，表示该scTCRp264分子的功效。此外，小鼠寿命的延长可作为评估该新颖抗肿瘤疗法的功效的第二标准。
其它适合的效应物或标记分子为已知。例如其中一种标记是在生理pH下含有电荷的多肽，例如，6xHIS。在此实例中，可通过自商业上购得的金属-琼脂糖珠基质(例如Ni-琼脂糖珠)纯化该TCR融合或共轭复合物，该金属-琼脂糖珠基质可在约pH6至9时专一性的与6xHIS标记结合。该EE抗原决定表位及myc抗原决定表位为适合的蛋白质标记的进一步实例，该抗原决定表位可与一或多种商业上购得的单克隆抗体专一性的结合。
在某些情况下，可用于制造本发明的TCR融合或共轭复合物多价化，例如，增加该sc-TCR的价数。简言之，该多价TCR蛋白质是通过利用例如，标准生物素-抗生蛋白链菌素标记技术或通过共轭至适合的固体支持物(例如乳胶珠)将一及四种蛋白质(可相同或不同)彼此间共价连接而制造该多价TCR蛋白质。化学交联蛋白质(例如交联至树状聚合物)亦为适合的多价种类。例如，可通过包含带有化学反应性侧链(例如Cys或His)的可编码出氨基酸残基的序列修饰该蛋白质。这些带有化学反应性侧链的氨基酸可位于该融合蛋白质中的各种位点，较佳位于TCR的抗原结合区域的远端。例如，可溶性融合蛋白质的C-β链片段的C端可共价连接至蛋白质纯化标记或其它包含这种反应性氨基酸的融合蛋白质。适合的侧链包含可将二或多种融合蛋白质化学地连接至适合的树状聚合物粒子而得到多价分子者。树状聚合物为合成的化学聚合物，其表面可具有一些不同官能团中的任一者(D.Tomalia，Aldrichimica Acta，2691101(1993))。根据本发明所使用的树状聚合物的实例包含，例如，E9星爆式聚胺树状聚合物以及E9燃烧性聚胺树状聚合物，其可连接半胱氨酸残基。
如本文所使用，“细胞”一词欲包含任何原代细胞或无限繁殖化细胞系、任何含有这些细胞的组群，例如组织或器官。该细胞较佳为哺乳类细胞，尤其是人类来源的细胞，且可被一或多种病原体感染。根据本发明中“宿主细胞”是经感染的细胞或可用于繁殖本文所述的核酸的细胞，例如大肠杆菌。
根据本发明，将效应分子共价连接至TCR肽上可提供许多显著的优点。经本发明产生的TCR融合复合物含有单一效应分子，包含已知结构的肽。此外，在类似的DNA载体中可生产多种效应分子。亦即，为了呈现经感染或患病的细胞，多种不同效应分子可连接至该TCR分子。再者，关于治疗的应用，为了该TCR融合复合物在活体内的表达，可投予DNA表达载体(该载体是编码经连接的该效应物肽的TCR分子)，而不是对患者投予TCR分子。这种方法避免了典型地与重组蛋白质相关的昂贵的纯化步骤以及避免了与已知方法相关的摄取抗原和加工的复杂性。
应注意，本文所揭示的融合蛋白质的构成要素，例如生物活性产物(例如细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白质毒素、免疫球蛋白结构域或其它生物活性分子及任何肽接头)，可组织成几乎任何所提供的形式，只要该融合蛋白质具有期望的功能。特别是，各个融合蛋白质的构成要素，如需要，可通过至少一个适合的肽接头序列与另一个构成要素隔开。此外，该融合蛋白质可包含标记，例如，帮助该融合蛋白质的鉴定和/或纯化。更具体的融合蛋白质是说明在下列的实施例中。
本发明的TCR融合复合物亦包含较佳在TCR蛋白质与该生物活性肽间插入柔性接头序列。该接头序列应容许与TCR分子结合沟相关的生物活性肽的有效位点，使该T细胞受体可识别所递呈的MHC-肽复合物以及将该生物活性分子递送至期望的位点。该效应分子的成功的递呈可调整细胞的活性，不论是诱发或抑制T-细胞增殖，或者对特定位点诱发或抑制免疫反应，通过下述的分析所决定，包含活体外分析法，包含培养T细胞增殖之一系列步骤及使本发明的TCR融合复合物与该T细胞接触，然后进行评估不论该TCR融合复合物是抑制该细胞或使该细胞发育。
通常，本发明的TCR融合复合物的制备可通过本文所揭示的程序以及公认的重组DNA技术而完成，该重组DNA技术包含，例如聚合酶链式扩增反应(PCR)、质粒DNA的制备、以限制性内切酶切割DNA、寡核苷酸的制备、DNA的连接、mRNA的分离、将该DNA引入至适合的细胞、宿主的转化作用或转染作用、及宿主的培养。此外，可利用离液剂以及已知的电泳、离心及层析法分离及纯化该融合分子。一般参见Sambrook等人的Molecular CloningA Laboratory Manual(2nded.(1989))；以及Ausubel等人的Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York(1989)揭示相关的方法。
本发明进一步提供核酸序列及可编码出本发明的融合蛋白质的特定DNA序列。该DNA序列较佳是携带于适合染色体外复制的载体上，例如噬菌体、病毒、质粒、噬菌质粒、粘粒、YAC或游离基因。尤其，可编码出期望的融合蛋白质的DNA载体可用于帮助本文所述的制备方法而获得显著量的融合蛋白质。可将该DNA序列插入适当的表达载体，亦即含有转录及翻译所插入的蛋白质编码序列所需元件的载体。多种宿主-载体系统可以用于表达蛋白编码序列。这些系统包含以病毒感染的哺乳细胞(例如牛痘病毒、腺病毒等)；以病毒感染的昆虫细胞，例如杆状病毒；微生物，例如含有酵母菌载体的酵母菌，或以噬菌体DNA转化的细菌、质粒DNA或粘粒DNA。根据所利用的宿主-载体系统使用多种适合的转录及翻译元件中的任一者。一般参见如前述的Sambrook等人及Ausubel等人。
通常，根据本发明较佳的DNA载体包括通过磷二酯键连接的核苷酸，由5’至3’的方向包括用于引入可编码出TCR链(操作地连接至可编码出效应分子的序列)的第一核苷酸序列的第一克隆位点。
在多数例子中，各个融合蛋白质的构成要素(由该DNA载体编码)较佳是以“盒式”型式提供。“盒式”一词是指各个构成要素可轻易地通过标准重组方法由另一个构成要素取代。尤其，当该经编码出的融合复合物是用于对抗病原体(其可能具有或具有发展血清型的能力)时，特别需要装配于盒式型式中的DNA载体。
为了制造编码TCR融合复合物的载体，通过使用适合的连接酶将编码TCR分子的序列连接至编码该效应物肽的序列。编码所递呈肽的DNA可通过自天然来源(例如自适合的细胞系或通过已知的合成方法，例如磷酸三酯法)分离DNA而获得。参见，例如，寡核苷酸合成法，IRL出版社(M.J.Gait，ed.，1984)。亦可利用商业上购得的自动寡核苷酸合成仪以制备合成的寡核苷酸。一经分离，该基因(编码TCR分子)可通过聚合酶链式反应(PCR)或其它本技术领域中已知的方法扩增。扩增该TCR肽基因的适合的PCR引物可对该PCR产物添加限制位点。该PCR产物较佳包含该效应物肽的拼接位点以及为适当表达及该TCR-效应物融合蛋白质的分泌作用所必须的前导序列。该PCR产物亦较佳包含编码该接头序列的序列，或用以接合这些序列的限制酶位点。
本文所述的融合蛋白质较佳是通过标准重组DNA技术所产生。例如，当可编码出该TCR蛋白质的DNA分子经分离后，其序列可与另一个可编码出效应物肽的DNA分子接合。该编码TCR分子的核苷酸序列可直接连结至编码该效应物肽的序列或更典型地，使用适合的连接酶，将编码如本文所讨论的接头序列插入编码TCR分子的序列与编码效应物肽的序列间。所得的混合DNA分子可于适合的宿主细胞中表达使产生该TCR融合复合物。该DNA分子是以5’至3’的方向彼此接合，以至于接合后，并未改变该经编码的肽的翻译读框(亦即该DNA分子是在符合读框中彼此接合)。所得的DNA分子是编码出符合读框的融合蛋白质。
在该基因构建中亦可含有其它核苷酸序列。例如，启动子序列，其是控制编码该TCR肽(该TCR肽经融合至效应物肽)的序列的表达，或者含有前导序列，其是将该TCR融合复合物指向细胞表面或培养基，该前导序列可包含于构建中或存在于表达载体(含有经插入的构建)中。特佳为免疫球蛋白或CMV启动子。
该融合蛋白质的构成要件几乎可以任何顺序加以组织，只要各构成要件可表达出其期望的功能。例如，在一具体实施例中，该TCR是位于该效应分子的C或N末端。
本发明较佳的效应分子具有益于所欲区域的功能的尺寸。本发明的效应分子可通过各种方法(包含已知的化学交联法)加以制作及融合至TCR。例如参见Means，G.E.及Feeney，R.E.(1974)的ChemicalModification of Proteins，Holden-Day。亦可参见S.S.Wong(1991)的Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking，CRS Press。然而，一般较佳是使用重组操作法以制作符合读框的融合蛋白质。
应注意，根据本发明的融合分子或共轭分子可利用数种方式加以组织。在一示例的构型中，该TCR的C-端是操作上连接至该效应分子的N-端。如需要，可通过重组方法完成该连接。然而，在另一构型中，该TCR的N-端是连接至该效应分子的C-端。
此外，或另外，如需要，可将一或多种附加的效应分子插入该TCR融合或共轭复合物中。
根据本发明较佳的融合或共轭复合物，典型地包含操作上经连接的序列(N至C端)1)TCR/一或多的接头分子/以及生物活性分子；2)TCR/接头分子/以及生物活性分子；3)TCR/第一接头分子/第一生物活性分子亚单位/第二接头分子/第二生物活性分子亚单位。此外，如需要(例如改进溶解度或帮助该TCR融合及共轭复合物的分离及鉴定)，可将一或多种蛋白质标记(例如EE、HA、Myc以及聚组氨酸，特别为6Xhis)融合至TCR链的N端。
该接头序列较佳为核苷酸序列，其是编码一肽，该肽可有效地坐落于该TCR分子的结合沟以识别递呈抗原。如此处所使用的“生物活性肽是有效地坐落于连接该TCR分子的位点”说法，或其它类似说法，是欲表示连接至TCR蛋白质的生物活性肽是经定位，以便于使该生物活性肽可与效应物细胞交互作用以及调节该递呈细胞的活性，不论是诱发细胞增殖、起始或抑制免疫反应、或者抑制或使细胞发育不活性化(由下列揭示的分析决定，该分析包含一系列步骤培养细胞至细胞增殖，以及使该细胞与本发明的TCR融合复合物接触然后评估该TCR融合复合物是抑制该细胞还是使该细胞发育)。
较佳的接头序列包括自约7至20个氨基酸，更优选自约8至16个氨基酸。该接头序列较佳为具有柔性才不会将该生物活性肽限制于不需要的单一构象。该接头序列可用于，例如于该融合分子中隔开识别位点。具体言之，可将该肽接头序列置于TCR链及效应物肽间，例如，以化学交联法连接两者而提供分子柔性。较佳地该接头主要包括带有小型侧链的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸及丝氨酸，以提供柔性。该接头序列中较佳包括约80或90百分比或以上的甘氨酸、丙氨酸及丝氨酸残基，特别是甘氨酸及丝氨酸残基。至于含有杂二聚体TCR的TCR融合复合物，虽然该接头序列亦可连接至该TCR分子的α链，然该接头序列是适合地连接至该TCR分子的β链。此外该接头序列可连接至该TCR分子的α及β链。至于将效应分子肽共价地连接至TCRβ链分子，该接头的氨基酸序列应可自该TCRβ链的N端残基至该效应分子肽的C端残基延伸一适当的距离。当这些β+肽链与该α链一起表达时，该经连接的TCR-效应物肽将折叠成典型地如图1所示的功能性TCR分子。一适合的接头序列为ASGGGGSGGG(即Ala Ser Gly GlyGly Gly Ser Gly Gly Gly)，较佳是连接至该TCRβ域的第一个氨基酸。不同的接头序列可使用于许多柔性接头设计中的任一者，其可成功地连结抗体变异区，参见Whitlow，M.等人(1991)MethodA Companion toMethods in Enzymology 297-105。适合的接头序列可凭经验轻易地辨识出来。此外，根据预测该TCR分子的大小及形状，接头序列的适合的大小及序列亦可通过已知的计算机模拟技术加以决定。
可使用许多策略来表达本发明的TCR融合复合物。例如，将如上述的TCR基因融合构建通过已知的方法(例如为了该构建体的插入，通过使用限制酶在载体上制造一切口，接着使该构建体与载体接合)合并至适合的载体。然后将含有该基因构建体的载体引入到适合的宿主中以表达该TCR融合肽。典型地参见，Sambrook等人，如前述。根据与克隆方法相关的因素，可凭经验选择适合的载体。例如，该载体应为可兼容的，以及对宿主(所欲使用的宿主)具有恰当的复制子。再者，该载体必需能容纳编码该TCR融合复合物(欲表达的TCR融合复合物)的DNA序列。适合的宿主细胞包含真核及原核细胞，较佳为易转化的细胞及在培养基中展现快速生长能力的细胞。具体言之，较佳的宿主细胞包含原核生物，例如大肠杆菌、枯草杆菌等以及真核生物，例如动物细胞及酵母菌种(例如啤酒酵母菌)。一般以哺乳动物细胞较佳，尤其为J558、NOS、SP2-O或CHO。其它适合的宿主包含，例如昆虫细胞(例如Sf9)。培养条件是使用已知的条件，参见，Sambrook等人，如前述。然后选择可稳定转化及转染的细胞系。可通过已知程序决定用以表达本发明TCR融合复合物的细胞。例如，经连接至免疫球蛋白的TCR融合复合物的表达可通过对该经连接的免疫球蛋白专一的ELISA和/或通过免疫印迹法加以决定。
一般上述提及的宿主细胞可用于制备的目的使增殖可编码期望的融合蛋白质的核酸。因此，宿主细胞可包含原核或真核细胞，其中该融合蛋白质的生产是特定的。因此，具体地宿主细胞包含酵母菌、蝇类、虫类、植物、蛙类、哺乳动物细胞以及可增殖编码该融合物的核酸的有机体。可使用的哺乳动物细胞株的非限制实例包含CHO dhfr-细胞(Urlaub and Chasm，Proc.Natl.Acad Sci.USA，774216(1980))，293Cells(Graham等人，J.Gen.Virol，3659(1977))或骨髓癌细胞，如SP2或NSO(Galfre and Milstein，Meth，Enzymol，73(B)3(1981))。
可增殖编码期望的融合蛋白质的核酸的宿主细胞包含非-哺乳动物真核细胞，包含昆虫(例如夜蛾，Sp.frugiperda)、酵母菌(例如啤酒酵母菌、裂殖酵母菌、毕赤酵母(P.pastoris)、克氏乳酸菌(K.lactis)、汉逊酵母菌(H.polymorpha)；典型地如Fleer，R.，Current Opinion inBiotechnology，3(5)486496(1992)所整理者)、真菌以及植物细胞。亦包含某些原核生物，例如大肠杆菌及杆菌。
通过转染细胞的标准技术将编码期望的融合蛋白质的核酸引入宿主细胞中。该“转染”或“转染作用”一词是欲包含所有已知的将核酸引入宿主细胞的技术，包含磷酸钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖-介导的转染作用、脂质转染、电穿孔、微注射、病毒转导和/或整合。可在Sambrook等人，如前述，及其它实验教科书中发现适合用于转染宿主细胞的方法。
本发明进一步提供分离期望的融合蛋白质的生产过程。在该过程中，使宿主细胞(例如酵母菌、真菌、昆虫、细菌或动物细胞)在该融合蛋白质的存在下(刺激该可编码出期望的融合蛋白质的核苷酸序列的转录作用)，生长在具有生产规模的培养基中，其中该宿主细胞已经引入期望的可编码出该蛋白质的核酸，操作上该核酸是连接至调节序列。接着，自经收集的宿主细胞或培养基中分离出该融合蛋白质。可利用标准蛋白质纯化技术自该培养基或自该经收集的细胞分离出期望的蛋白质。尤其，该纯化技术可用在自各种培养系统(包含滚瓶、旋动培养瓶、组织培养平板、生物反应器、或发酵罐)大规模(即至少毫克量)表达及纯化出期望的蛋白质。
可通过已知的方法分离及纯化出经表达的TCR融合复合物。典型地，将培养基进行离心，然后通过亲和性或免疫亲和性层析法纯化该上清液，例如蛋白质-A或蛋白质-G亲和性层析法或免疫亲和性方法，包括利用结合该经表达的融合复合物(例如经连接的TCR或其免疫球蛋白结构域)的单克隆抗体。本发明的融合蛋白质可通过适当组合已知的技术加以分离及纯化。这些方法包含，例如，利用溶解度的方法(例如盐类沉淀及溶剂沉淀法)、利用分子量的差异的方法(例如透析、超滤、凝胶过滤法以及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)、利用电荷的差异的方法(例如离子交换柱层析法)、利用专一亲和性的方法(例如亲和性层析法)、利用疏水性的差异的方法(例如逆相高效液相层析法)以及利用等电点的差异的方法(例如等电聚焦电泳)、金属亲和性柱(例如Ni-NTA)。一般参见Sambrook等人及Ausubel等人，如前述所揭示的相关方法。
本发明的融合蛋白质较佳为实质上纯的蛋白质。亦即，该融合蛋白质已自天然伴随着该蛋白质的细胞取代物中分离出，所以该融合蛋白质较佳是以至少80％或90％至95％的同质性(w/w)存在。具有98％至99％的同质性(w/w)的融合蛋白质最适合用于许多医药、临床及研究的应用。在治疗应用方面，实质上经纯化的融合蛋白质实质上应不含污染物。该蛋白质经部分纯化或实质上纯时，该可溶性融合蛋白质可用于治疗或如本文前述之内容进行活体外或活体内分析。可通过多种标准技术(例如层析法及凝胶电泳)来决定该融合蛋白质质上的纯度。
本发明经截断的TCR融合复合物含有经充分地截断的TCR分子，以致于该TCR融合复合物于表达后可分泌至培养基中。因此，经截断的TCR融合复合物不包含富有疏水性残基的区域(典型地为该TCR分子的穿膜及细胞质结构域)。因此，例如，本发明较佳的经截断DR1 TCR分子中，该TCR分子的β链的自约残基199至237以及该α链的自约残基193至230较佳是不包含于该经截断的TCR融合复合物中。
“错折叠”一词是指该融合蛋白质部分或完全未折叠(即变性)。融合蛋白质可通过与一或多种如下所讨论的离液剂接触而使其部分或完全未折叠。更一般而言，本文所揭示的错折叠融合蛋白质是相关的天然蛋白质种类中的高吉布斯自由能(Gibbs free energy，ΔG)的代表物。较佳为天然融合蛋白质，其经常是正确的折叠，其在水溶液中可完全地溶解，以及具有相对低的ΔG。此外，该天然融合蛋白质在多数场合中呈现稳定的状态。
错折叠的融合蛋白质可通过单一或组合已知的策略检测出来。例如，可通过各种已知的生物物理学技术(包含利用天然(对照组)及错折叠分子的旋光测量法)来检测错折叠的融合蛋白质。
“可溶性”一词或类似的名称是指该融合分子以及尤其是融合蛋白质在低重力离心(例如，在标准离心中小于约每分钟30,000转)下不易自水溶性缓冲液(例如细胞培养基)中沉降出来。再者，如果该融合分子在大于约5至37℃的温度下以及在低浓度或无阴离子或非-离子性去污剂存在下的接近中性pH时仍保留在水溶液中，该融合分子是呈现稳定的状态。在这些条件下，可溶性蛋白质经常具有低沉降值，例如小于约10至50斯韦柏单位。
本文所提及的水溶液典型地具有缓冲化合物以建立pH，典型地pH值是落于约5至9的范围中，以及离子强度范围是约2mM及500mM之间。有时会添加蛋白酶抑制剂或温和的非-离子性去污剂。此外，如果需要可添加载体蛋白质，例如添加牛血清白蛋白(BSA)，用量为几个毫克/毫升。水性缓冲液的实例包含标准的磷酸缓冲盐水，Tris-缓冲盐水，或其它已知的缓冲液以及细胞培养基制剂。
本发明的TCR融合及共轭复合物适合活体外或以各种细胞的活体内使用，该细胞是经感染或可由一或多种疾病感染。
利用该TCR融合/共轭治疗法的说明如下，以单一血清型的病原体感染经培养的细胞。然后将该经感染的细胞在活体外与专一性融合蛋白质接触。如先前所讨论的，该融合蛋白质是经过装配，所以通过该TCR的连结对经感染的细胞呈现该毒性结构域。在对该细胞提供引入的生物活性分子后(通常少于约30分钟)，该生物活性分子在约2至24小时期间(典型地为约18小时)可对细胞造成期望的作用。此段时间后，以适合的缓冲液或细胞培养基洗涤该细胞，然后评估其存活率。由该融合蛋白质杀死细胞或伤害细胞的持续时间是依所选用的特定效应分子而不同。然而，经常于约2至6小时或高达约24小时后可进行存活率的评估。下列将更详细解释，细胞存活率可通过监测某些已知的染料(例如锥虫蓝)的摄入或荧光而轻易地测量及定量出来。
通过本发明的融合分子转异的细胞可利用标准方法测定其存活率。在一方法中，可由测量转导后或转导期间DAN的复制而轻易地测定细胞存活率。例如，较佳的测定法是使细胞摄入一或多种可检测性-经标记的核苷，例如经放射性标记的胸腺嘧啶脱氧核苷。由数种已知的方法(包含三氯乙酸(TCA)沉淀法)可方便地测量细胞的摄入量，接着利用闪烁计数器计数。其它测定细胞存活率的方法包含已知的锥虫蓝排除法技术。
本发明融合复合物的TCR分子的氨基酸序列以符合自然产生的TCR分子较适合，例如人类、鼠类或其它啮齿类或其它哺乳动物的TCR分子。
此外，本发明用以抑制自体免疫或发炎反应的治疗方法中之一者包含TCR复合物，包括T细胞受体拮抗效应分子。较佳地，是投予“经截断”的可溶性TCR复合物，即该TCR复合物剂不含穿膜部分。所投予的可溶性TCR融合复合物的效应分子可经选择，使其对某些细胞具有专一性或可专一地产生期望的结果。这些效应分子通过熟知本技术领域的技术人员所知悉的方法可轻易地加以辨别及选择。含有效应物肽(该效应物肽是T细胞受体拮抗剂或部分激动剂)的TCR融合复合物较佳是用于治疗过敏及自体免疫疾病，例如多发性硬化症、胰岛素依赖型糖尿病以及风湿性关节炎。
本发明另一用以诱发免疫反应的治疗方法是在任何共刺激效应分子(例如细胞因子)的存在下投予有效量之一或多种本发明TCR融合复合物，因而在抗原(该抗原是与TCR结合)存在的位点诱发期望的免疫反应。该TCR融合复合物可为经截断的形式以及如上述以可溶性蛋白质投予。此外，该TCR融合复合物可为具有全长的蛋白质，即该TCR融合复合物含有穿膜部分。使用这些复合物的治疗法包括对哺乳动物投予有效量的DNA序列，该DNA序列包括可编码出本发明TCR融合复合物全长以及效应分子的DNA载体。
亦可组合使用本发明的不同的治疗法，以及组合其它已知的治疗剂，例如抗发炎药使对病症提供更有效的治疗。例如，免疫抑制TCR融合复合物可与抗发炎剂(例如皮质类固醇及非类固醇药物)组合使用以治疗自体免疫病症及过敏。
本发明化合物尤其适合用于人类病人，其具有或怀疑具有恶性疾病、病症或病情。本发明化合物特别适合用于在人类病人中靶向特定肿瘤抗原。依照本发明，可治疗的特定疾病的实例包含癌症，例如乳癌、前列腺癌等病毒性感染，例如HCV、HIV等，以及其它本文所提及的特定疾病的病症。
不欲受限于此理论，人们相信本发明的多重及明显的共价连接化合物(即至少一个经鉴定的抗癌药物与至少一个TCR组合)可显著地加强该抗癌药物的功效，例如通过增加药物的靶向作用以在个别的患者中到达靶抗原。
此外，通过该共价连接的优点，本发明的共轭物、该抗癌药物及该TCR实质上可同时投予至该患病细胞，但通过在药物“鸡尾酒”配方中投予该相同化合物而不共价连接该化合物时，不易达成期望的作用。
亦已报导，以一种药物治疗的治疗可使病人依次对另一药物变得敏感。此外，对患病细胞实质上同时呈现抗癌药物及TCR(经由本发明的共轭键)可加强药物活性，例如通过提供协同作用的结果和/或通过加强产生免疫反应。
本案化合物可通过多种适合的途径用药，包含，口服用药、局部用药(包含经皮用药、经颊用药或经舌下用药)、经鼻用药以及非口服用药(包含腹膜内用药、皮下用药、静脉内用药或肌内注射)，一般以口服或非口服较佳。应了解，较佳的用药方法及剂量会随着，例如接受者的病情及年龄而改变。
本发明的化合物可单独用于治疗或与其它药物(该药物已经识别对所指示欲治疗的病症具有药理活性)一起使用。药物的实例包含经公认的治疗法，例如手术、放射线、化学治疗及其它型式的免疫治疗(例如疫苗、治疗为主的抗体)。本发明的化合物如需要可于这些治疗法之前、进行治疗法期间或进行治疗法之后投予。
本发明之一或多种化合物可单独投予，其亦可以部分医药组成物(与已知的赋形剂混合)存在，即适合用于非口服、口服或其它期望的投予中的医药可接受性有机或无机载体物质，以及其与活性化合物不会造成有毒的反应以及对接受者亦不会造成毒性。通常，本发明的医药组成物包括一或多种本发明的TCR融合复合物或编码这些融合复合物的DNA构建体与一或多种可接受载体。考虑到为了与该配方中其它的成分兼容，该载体必需为“可接受的”以及对接受者亦不会造成毒性。适合的医药可接受载体包含，但非限于水、盐类溶液、醇、植物油、聚乙二醇、凝胶、乳糖、淀粉醣、硬脂酸镁、滑石、硅酸、黏性石蜡、芳香油、脂肪酸单甘油酯及二甘油酯、石油乙烯利脂肪酸酯、羟甲基-纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮等。该医药制剂可经灭菌且如需要可与辅剂，例如，润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐类、缓冲液、着色剂、调味剂和/或芳香物质等，其与活性化合物不会造成有毒的反应。
关于非口服的施用，特别适合者为溶液、较佳为油性或水性溶液以及悬浮液、乳液或植入物，包含栓剂。安瓿是方便的单位剂量。
关于肠的施用，特别适合者为片剂，经包被的药丸或具有滑石和/或碳氢化合物载体粘合剂等的胶囊，该载体较佳为乳糖和/或玉米淀粉和/或马铃薯淀粉。可使用糖浆、酏剂等，其中是使用甜味载剂。可调配持续释放的组成物，包含该活性成分是经不同的可分解性包衣所保护者，例如微胶囊化、多重包衣等。
本发明的治疗化合物亦可包含于脂质粒中。该包入作用可根据已知的脂质粒制备程序进行，例如，超声波处理及挤压作用。适合的脂质粒制备的已知方法亦是揭示在，例如，A.D.Bangham等人，J.Mol.Biol.，23238-252(1965)；F.Olson等人，Biochim.Biophys.Acta，5579-23(1979)；F.Szoka等人，Proc.Nat.Acad.Sci.，754194-4198(1978)；S.Kim等人，Biochim.Biophys.Acta，728339-348(1983)；以及Mayer等人，Biochim.Biophys.Acta，858161-168(1986)。
本发明亦提供于哺乳动物(例如人类)中引起免疫反应的方法，包含对哺乳动物(例如人类)注射疫苗以对抗感染剂或靶病症(例如癌症)。
这些方法包括对哺乳动物投予有效量的DNA序列，该序列包括编码本发明的TCR融合复合物的DNA载体。TCR融合复合物表达载体的制备是如上所述以及说明在下列实施例中。已有报导指出质粒DNA的投予方法、经投予者的细胞摄入该DNA的方法以及蛋白质的表达。参见Ulmer，J.B.等人，Science(1993)2591745-1749。
可编码出本发明TCR融合复合物的DNA载体适当地投予至包含人类的哺乳动物的较佳方式是肌内注射。Ulmer，J.B.等人已说明如何将cDNA投予至哺乳动物的骨骼肌，接着该肌肉细胞摄入经投予的表达载体以及表达由该DNA所编码的蛋白质的方式，以及提出该实验方法[Ulmer，J.B.等人，Science 2591745-1749]。在特定治疗的施用中，理想的剂量可通过传统方法决定。
除了用于治疗人类病症外，本发明的TCR融合及共轭复合物以及本发明的可编码出这种融合复合物的DNA构建在兽医方面的应用中亦具有显著的用途，例如，治疗家畜(例如牛、羊等)及宠物(例如狗及猫)的病症。
应明了，实际上本发明TCR融合复合物或可编码出这种融合复合物的DNA构建以特定治疗中较佳的给予量是根据特定的活性化合物或所使用的化合物、特定的经调配的组成物、施用形式、投予的特定位点、病人的体重、大致上的健康情况、性别等、治疗时的特定指示等以及其它熟知本技术领域的技术人员(包含医师或兽医人员)所确认的因子而改变。特定投予方法的最理想的投予速度可由熟知本技术领域的技术人员利用已知的剂量决定试验，例如以关于前述的指导方针以及本文所揭示的分析法轻易地决定。
本文中所有提及的文件其内容完全地是以参考资料合并于本文中。下列非限制的实施例是用以说明本发明。
简言之，自该T细胞克隆分离mRNA以及利用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech)制造cDNA。将cDNA克隆进行测序，辨识出两个V-α链(V-α3及V-α13)以及单一Vβ链(Vβ3)。于聚合酶链式反应(PCR)中该cDNA是作为模板，以引物KC228及KC229或KC226及KC227分别产生5’SfiI-3’SpeI V-α3或V-α13片段。然后以相同DNA作为模板，利用引物PRIB4及KC176产生5’XhoI-3’XmaI VβCβ链片段。在全长Cβ链中位于第127位氨基酸，即胱氨酸前将该Cβ链截断。
将该α及β链片段克隆至该pGEM-T Easy Vector System(Promega)中以进行DNA测序。将正确的片段以限制酶切割以及克隆至表达载体pKC60中(说明于前述的尚未获准专利的美国专利申请案第08/813,781号)以创造出两个Vα-(G4S)4VβCβscTCR分子、264-A(带有Vα3)以及264-B(带有Vα13)。
将上述的DNA构建体(264-A及264-B)分别以引物ET-TCRF1及KC170或ET-TCRF2及KC170通过PCR再次扩增，以产生5’AgeI-3’ClaI DNA片段。将该片段克隆至pGEM-T Easy Vector System(Promega)中以进行DNA测序。
然后将该5’AgeI-3’ClaI DNA片段在引物分别为KC232及KC208或KC231及KC208的PCR中作为模板DNA以产生用于克隆至该CD3ζ融合分子(说明如下)的5’AgeI-3’HpaI DNA片段以及最终的264 IL-2融合分子(说明如下)。
穿梭载体(shuttle vector)的构建已说明于前述尚未获准专利的美国专利申请案第09/422,375号中。
简言之，将α及β链TCR片段克隆至表达载体pKC60中以创造出Vα-(G4S)4VβCβscTCR分子。将该新的载体命名为pNAG2(图9)。然后将pNAG2在引物为KC203及KC208的PCR中再次扩增，以产生5’AgeI-3’HpaI/BspEI/NruI/ClaI DNA片段。将该scTCR片段克隆至pGEM-T Easy Vector System(Promega)中，以及然后将此以pGEM为主的新的载体作为“穿梭载体”，用于引入其它DNA片段以创造双专一性单链分子。
将sc-Fv DNA以限制酶切割以及克隆至该scTCR的“穿梭载体”之下游。为了将scTCR及sc-Fv连结成单一链融合蛋白质，遂以适当的限制酶切割该“穿梭载体”，以脱离先前的接头DNA片段以及使scTCR及Sc-Fv间的接头序列接合。
在上述的“穿梭载体”的设计中，将终止密码子及拼接位点引入至该NruI及ClaI限制酶位点之间作为带有“后”引物KC208的scTCR的PCR扩增之一部分。为了帮助接下来进行的双专一性sc蛋白质的纯化，设计了一组经退火的寡核苷酸(annealed oligos)(KC237及KC238)以引入带有终止密码子及拼接位点的3’EE标记(EEEEYMPME)。该经退火的寡核苷酸对将5′NruI-3’ClaI克隆至该已可编码出完整的专一性sc分子的“穿梭载体”中。
将scTCR、Sc-Fv、接头，以及标记DNA片段克隆至该“穿梭载体”中以完成该专一性sc分子的设计后，以限制酶切割(AgeI-ClaI)该DNA，然后克隆至哺乳动物细胞表达载体pSUN27(图10)(说明于前述的尚未获准专利的美国专利申请案序号第08/943,086号)以创造pBISP/149(图11)。CD3ζ融合载体的构建简言之，以鼠的cDNA作为聚合酶链式反应(PCR)中的模板，以引物KC312及KC304产生5’HpaI-3’ClaI鼠CD3ζ片段。
将该鼠CD3ζ片段克隆至pGEM-T Easy Vector System(Promega)中以进行DNA测序。将正确的片段以限制酶切割以及克隆至“穿梭载体”中，有效地移除该存在的接头、scFv以及EE标记。
将该CD3ζ基因克隆至该“穿梭载体”中后，以限制酶切割该DNA的AgeI-HpaI处，使其与该264-A及264-B scTCR片段(如上所述)接合，创造出两个新的scTCR/CD3ζ融合物。最后，将该新的DNA制备物以限制酶切割(AgeI-ClaI)，然后克隆至哺乳动物细胞表达载体pSUN28(pBISP/DO11.10)，图11，说明于前述的尚未获准专利的美国专利申请案序号第09/422,375号。
利用流式细胞分析法(flow cytometry analysis)筛选出于细胞表面上有scTCR表达的茱凯细胞。呈阳性的转染物是以经荧光-标记的mAb(H57-597)染色进行识别，该经荧光-标记的mAb可检测鼠TCR的Cβ部分结构域。
该转染物通过264装载的APC所进行专一性的刺激是利用IL-2ELISA评估。将抗-人类IL-2mAb包被于96孔板上整夜。洗涤该板以及以10％FBS/DPBS封闭1小时。将封闭剂弹掉以及于37下将得自该分析的上清液加入至该板中反应1小时。经洗涤后，利用另一个共轭至生物素的抗-IL-2mAb来检测经结合的IL-2。于37下45分钟后，洗涤该板以及加入链霉亲和素(strepavidin)-HRP反应15分钟。最后，洗涤该板以及使用ABTS底物显色。于405nm读取吸光度。
基于细胞活性分析，该Vα3结构域是具有功能的。只有于经264装载的APC存在下，该264-A分子经刺激而产生IL-2。
简言之，利用该Mini Total RNA Kit(Qiagen)以及Qiashredder(Qiagen)自人类茱凯细胞分离出全部的RNA。将RNA浓缩以及将其使用于带有反转录酶及专一性反向引物，KC328B，的反应中，以产生cDNA。将该cDNA于带有引物KC327B及KC328B的PCR中作为模板，以产生5’BspI-3’NruI人类IL-2基因片段。
将人类IL-2片段克隆至pGEM-T Easy Vector System中以进行DNA测序。该正确的片段经由限制酶切割以及克隆至“穿梭载体”中，有效地移除该存在的scFv基因。
然后以限制酶切割(BspI-NruI)该“经IL-2修饰的穿梭载体”以及与该scTCR(如上述)接合以完成该scTCR/IL-2的设计。最后，以限制酶切割DNA的AgeI-ClaI以及克隆至哺乳动物细胞表达载体pSUN28。
该转染物利用ELISA分析法筛选表达可溶性融合分子。将抗-人类IL-2抗体包被于96孔板上整夜。进行分析当天，以10％FBS/DPBS封闭1小时。洗涤该孔洞以及将得自该转染物之上清液加入至该板中。经培养及洗涤后，将生物素化的抗-CβmAb H57-579(细胞株是购自ATCC)加入板中，接着洗涤以及与链霉亲和素-HRP一起培养。呈阳性反应的孔是通过添加TMB底物加以辨识，以1N硫酸终止反应，以及于450nM读取吸光度。选取小量呈阳性反应的克隆，将其扩展以及进行限制稀释克隆以建立稳定的经转染细胞株。
该转染物亦可于ELISA分析法中利用mAb(其可专一性地识别各个scTCR)筛选经表达的可溶性融合分子，接着以生物素化的抗-Cβ以及链霉亲和素-HRP进行检测。对于该149融合分子，以该Vα结构域(B20.1，Pharmagen)的构型mAb作为包被抗体。该264融合分子可利用该Vα结构域的构型mAb(KJ25，Pharmingen)检测出来。
实验结果显示在图3中。利用非-放射线活性细胞增殖分析，该IL-2依赖鼠T细胞株，CTLL-2，是用于评估该264 scTCR-IL-2融合蛋白质的IL-2活性。该264 scTCR-κ融合蛋白质于该分析中是作为负对照组。
流式细胞分析及免疫荧光染色是用于显示该融合蛋白质的直接结合，经由于人类B淋巴细胞株T2的表面上TCR与肽/HLA-A2复合物(图4)A)以0.5微克(10微克/毫升)的264 scTCR-IL-2融合蛋白质进行149或经264肽脉冲的T2细胞的染色。该264 scTCR-IL-2融合蛋白质专一性地与展示该264肽而不是展示149肽的T2细胞结合。
b)该T2细胞是以50微克的149或264肽进行脉冲。为了评估各个肽的A2装载，该细胞与肽培养一整夜后，以该HLA-A2专一性mAbBB7.2(0.05微克)染色。这些实验的结果显示在带有264肽或149肽的T2细胞上具有同等程度的HLA-A2表面表达，表示HLA-A2可有效地与该两种肽结合。
已确认该单独表达该145-CII scSc-Fv(即其不是双专一性sc分子之一部分)的效率是非常低的。不欲受限于此理论，sc-Fv的低程度表达可为双专一性分子的表达中的限制因子。将原生的145-2C 11融合瘤细胞株作为抗体来源以及将细胞与以鼠IgG2b重链融合的scTCR进行转染(图12)。如果该宿主的仓鼠IgG可有效地与鼠IgG2b重链配对，该经转染的融合瘤细胞株会分泌一些145-2C11/scTCR嵌合体分子。
为了将该p149 scTCR克隆为IgG融合物，首先利用定点突变法将EcoRI限制位点进行突变。简言之，设计一对寡核苷酸，KC293及KC294，使其含有期望的突变。通过使用Pfu DNA聚合酶及该引物的PCR将pNAG2 DNA构建体扩增。以DpnI切割该PCR产物，该DpnI是切割原DNA模板而留下完整的经突变的DNA。将经突变的scTCRDNA测序，然后再次通过使用引物KC276及KC268的PCR进行扩增以产生5’NruI-3’EcoRI DNA片段。将经突变的scTCR DNA克隆至pGEM-T Easy Vector System中以进行DNA测序。该正确的scTCR DNA经由限制酶切割以及克隆至哺乳动物细胞表达载体pSUN7以创造出该p149 scTCR/IgG融合分子。DO 11.10scTCR/IgG融合分子的构建该pKC60 DNA构建体再次通过使用引物KC275及KC268的PCR进行扩增以产生5’NruI-3’EcoRI DNA片段。将该scTCR片段克隆至pGEM-T Easy Vector System中以进行DNA测序。该正确的scTCR DNA经由限制酶切割以及克隆至哺乳动物细胞表达载体pSUN7以创造出该DO11.10 scTCR/IgG融合分子(参见第12A/12B图)。鼠IgG2b表达载体的构建鼠IgG2b(重链)表达载体的构建如下。该载体的主干为质粒pCDNA3(Invitrogen)。以HindIII及XhoI切割该质粒以及将“轻链多位点接头”DNA片段插入以创造出该起始的“轻链载体”pCDNA3.LCPL。此接头含有限制位点HindIII、KpnI、ClaI、PmlI、EcoRV、XmaI、BarnHI及XhoI以帮助随后的克隆步骤。SmaI-BclI DNA片段含有轻链前导物、鼠抗-CKMBκ轻链基因组片段、以及3’UTR是克隆至pCDNA3.LCPL的EcoRV-BarnHI位点。接着进行突变以排除NruIMluI、以及BstBI位点以及引入NheI及BarnHI位点以创造出该质粒pCDNA3mut.LCPL.LCVK。
该“重链载体”pCDNA3mut.HCPL是自该pCDNA3mut.LCPL.LCVK质粒构建而得，其中是通过以“重链多位点接头”取代该轻链表达区域(HindIII-XhoI)，该“重链多位点接头”是由限制位点HpaI、BspEI、EcoRV、KpnI以及XhoI。此质粒以EcoRV及KpnI切割。以SmaIKpnI切割的DNA片段含有重链前导物以及将鼠抗-CKMB IgG2b鼠重链基因组片段(参见Near等人，MolecularImmun.，1990)接合至该经EcoRV-KpnI切割的质粒中。接着，将含有3’UTR及NotI位点(位于该SalI之上游)的KpnI-SalI寡核苷酸片段克隆至该经KpnI-XhoI切割的质粒中(淘汰该XhoI位点)以创造出该质粒。pCDNA3mut.HCPL.HCV2b，亦称为鼠IgG2b表达载体pSUN7(图13)。
实施例13-scTCR/IgG(人类)融合分子的构建(将scTCR 264克隆至pJRS355中以及表达为IgG1融合物)。
将由Kim Card提供的该264 scTCR的DNA制备物作为模板以用于此scTCR构建体的PCR扩增作用。使用引物组264 TCR1s及KC268再次进行该scTCR的扩增作用。新设计的264 TCR1s的序列为5’-TTTCgTACgTCTTgTCCCAgTCAgTgACgCAgC-3’。此寡核苷酸经设计为具有Bsi WI核酸内切酶限制位点及B6.2前导物。依照标准PCR方法，在扩增反应中使用Takara ExTag聚合酶。该扩增作用的情形为，1次循环为96℃/2分钟；5次循环为96℃/30秒、62℃/15秒、72℃/30秒；以及30次循环为96℃/30秒、68℃/1分钟。将该适当的MW(～1.3Kb)的DNA带遵循Clonetech方法进行凝胶纯化以及克隆至Promega的pGem-T容易载体中。在接合及转化至XL1-Blue细胞后，挑出6个克隆以及通过使用两个引物，KC 285及KC 288(由Kim Card所提供)，的诊断性PCR进行筛选。6个克隆中的5个克隆产生具有适当的MW的DNA带。以2个克隆，scTCR264/pGem A及B，进行DNA序列分析，发现各个克隆都为正确的。双限制酶(Bsi WI及Eco RI)切割是为了克隆A及B而建立。将该适当的片段进行凝胶纯化且聚集在一起。将经纯化的264 scTCR克隆至先前制备的pJRS355载体DNA中。在接合及转化至XL1-Blue细胞后，挑出2个克隆(A2及B1)。以Alw NI切割其DNA，显示出适当的限制图谱。利用A2 DNA进行瞬时转染，该A2 DNA可产生264 scTCR/IgG1分子，其是以对TCR及IgG1同型专一的抗体进行ELISA分析而决定。
杀伤分析是使用经标记的靶细胞(例如经肽脉冲的T2细胞、各种癌细胞)与钙黄绿素-AM染料来进行。活细胞(靶细胞)会并入染料，然后经过洗涤，加至含有效应物细胞及TCR/IL-2融合蛋白质或分别为进行正或负对照实验的蛋白质，IL-2及TCR-k融合物，的96孔板。通常，效应物对靶细胞的比例为5∶1、10∶1以及20∶1。然后，将此分析的成分于37℃下培养2至4小时以及测量该释放至培养上清液中的钙黄绿素-AM。测量钙黄绿素-AM的专一性释放或与钙黄绿素-AM非专一性对照的自发性释放进行比较。
在此实施例中，将制备及纯化264 scTCR-Dox共轭物，然后进行数种免疫共轭物的研究以验证其在活体外及在活体内具有肿瘤消灭活性的特征。首先，确认将理想数量的Dox分子偶合至该scTCR-k融合蛋白质。经由细胞吸收同化而内在化的Dox的量将直接影响消灭肿瘤的比率及功效。因此，假设在肿瘤细胞上展示的肽/MHC标记的数量受到限制，所以需要增加偶合至scTCR上的Dox的量。然而，该scTCR与Dox基之间需要充分足够的连结稳定度以防止在活体内与Dox脱落相关的非专一性细胞毒性。共同地，由这些研究的发现在前临床研究上可用于预测该TCR-Dox的表达。
虽然本发明的较佳具体实施例已使用特定术语说明，这些描述仅供说明的目的，且应了解在不悖离下列权利要求的精神及范畴下可进行各种改变及变化。
权利要求
1.一种可溶性T细胞受体融合复合物，包括T细胞受体以及通过肽接头所连接的生物活性多肽，其中该T细胞受体具有一个识别结合位点以及该生物活性多肽具有不同的识别结合位点。
2.如权利要求1所述的可溶性T细胞受体融合复合物，其中，该T细胞受体对特定抗原的识别是专一性的。
3.如权利要求1或2所述的可溶性T细胞受体融合复合物，其中，该T细胞受体是杂二聚体包括α及β链TCR。
4.如权利要求1至3中任一项所述的可溶性T细胞受体融合复合物，其中，该T细胞受体α及β链是经由非-共价连接而连接。
5.如权利要求1或2所述的可溶性T细胞受体融合复合物，其中，该T细胞受体包括单链T细胞受体多肽。
6.如权利要求1至5中任一项所述的可溶性T细胞受体融合复合物，其中，该生物活性多肽对效应物细胞的识别是专一性的。
7.如权利要求1至6中任一项所述的可溶性T细胞受体融合复合物，其中，该生物活性多肽包括免疫球蛋白结构域或其片段。
8.如权利要求1至7中任一项所述的可溶性T细胞受体融合复合物，其中，该生物活性多肽包括κ恒定链免疫球蛋白结构域或其片段。
9.如权利要求1至8中任一项所述的可溶性T细胞受体融合复合物，其中，该生物活性多肽包括细胞因子或其片段。
10.如权利要求1至9中任一项所述的可溶性T细胞受体融合复合物，其中，该生物活性多肽包括IL-2细胞因子或其片段。
11.如权利要求1至10中任一项所述的可溶性T细胞受体融合复合物，其中，该生物活性多肽包括IL-10细胞因子或其片段。
12.如权利要求1至11中任一项所述的可溶性T细胞受体融合复合物，其中，该生物活性多肽包括趋化因子或其片段。
13.如权利要求1至12中任一项所述的可溶性T细胞受体融合复合物，其中，该生物活性多肽包括生长因子或其片段。
14.如权利要求1至13中任一项所述的可溶性T细胞受体融合复合物，其中，该生物活性多肽包括GCSF或其片段。
15.如权利要求1至14中任一项所述的可溶性T细胞受体融合复合物，其中，该生物活性多肽包括蛋白质毒素结构域或其片段。
16.一种制备可溶性T细胞受体融合复合物的方法包括提供T细胞受体链，或其亚片段；提供生物活性多肽，相当于第二链，或其亚片段；将T细胞受体链及第二链连接至肽接头；以及回收该经连接的T细胞受体融合多肽复合物，因而产生T细胞受体融合复合物。
17.如权利要求16所述的方法，其中，该T细胞受体及该生物活性多肽具有不同的识别位点。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中，该T细胞受体该T细胞受体对特定抗原的识别是专一性的。
19.如权利要求16至18中任一项所述的方法，其中，该T细胞受体是TCRα链。
20.如权利要求16至19中任一项所述的方法，其中，该T细胞受体是TCRβ链。
21.如权利要求16至20中任一项所述的方法，其中，该T细胞受体包括包括单链T细胞受体多肽。
22.如权利要求16至21中任一项所述的方法，其中，该生物活性多肽是免疫球蛋白结构域或其片段。
23.如权利要求16至22中任一项所述的方法，其中，该生物活性多肽包括κ恒定链免疫球蛋白结构域或其片段。
24.如权利要求16至23中任一项所述的方法，其中，该生物活性多肽包括细胞因子或其片段。
25.如权利要求16至24中任一项所述的方法，其中，该生物活性多肽包括IL-2细胞因子。
26.如权利要求16至25中任一项所述的方法，其中，该生物活性多肽包括IL-10细胞因子或其片段。
27.如权利要求16至26中任一项所述的方法，其中，该生物活性多肽包括趋化因子或其片段。
28.如权利要求16至27中任一项所述的方法，其中，该生物活性多肽包括生长因子或其片段。
29.如权利要求16至28中任一项所述的方法，其中，该生物活性多肽包括GCSF或其片段。
30.如权利要求16至29中任一项所述的方法，其中，该生物活性多肽包括蛋白质毒素结构域或其片段。
31.一种可溶性T细胞受体共轭复合物，包括数个共价键结至具有至少一个余留的游离胺基的载体的生物活性分子，该载体是共价键结至部分的单链T细胞受体，其中所得的共轭物是可溶的。
32.如权利要求31所述的可溶性T细胞受体共轭复合物，其中，该T细胞受体对特定抗原的识别是专一性的。
33.如权利要求31或32所述的可溶性T细胞受体共轭复合物，其中，该T细胞受体是杂二聚体包括α及β链TCR。
34.如权利要求31至33中任一项所述的可溶性T细胞受体共轭复合物，其中，该T细胞受体α及β链是经由非-共价连接而连接。
35.如权利要求31至34中任一项所述的可溶性T细胞受体共轭复合物，其中，该T细胞受体是单链T细胞受体。
36.如权利要求31至35中任一项所述的可溶性T细胞受体共轭复合物，其中，该生物活性分子是胞毒性分子。
37.如权利要求31至36中任一项所述的可溶性T细胞受体共轭复合物，其中，该生物活性分子是毒素。
38.如权利要求31至37中任一项所述的可溶性T细胞受体共轭复合物，其中，该生物活性分子是化学治疗剂。
39.如权利要求31至38中任一项所述的可溶性T细胞受体共轭复合物，其中，该生物活性分子是抗-癌药物。
40.如权利要求31至39中任一项所述的可溶性T细胞受体共轭复合物，其中，该生物活性分子是可检测标记。
41.如权利要求31至40中任一项所述的可溶性T细胞受体共轭复合物，其中，该生物活性分子是荧光化合物或电子转移剂。
42.如权利要求31至41中任一项所述的可溶性T细胞受体共轭复合物，其中，该生物活性分子是酶。
43.如权利要求31至42中任一项所述的可溶性T细胞受体共轭复合物，其中，该生物活性分子是放射性化合物。
44.一种制备可溶性T细胞受体共轭复合物的方法，包括使具有共价键结至数个生物活性分子的聚合物载体与T细胞受体链反应；以及还原稳定该所得的共轭分子，其中所得的共轭T细胞受体分子是可溶的。
45.如权利要求44所述的方法，其中该T细胞受体是单链T细胞受体。
46.如权利要求44或45所述的方法，其中，该单链T细胞受体对抗原的识别是专一性的。
47.如权利要求44至46中任一项所述的方法，其中，该生物活性分子是细胞毒性分子。
48.如权利要求44至47中任一项所述的方法，其中，该生物活性分子是毒素。
49.如权利要求44至48中任一项所述的方法，其中，该生物活性分子是化学治疗剂。
50.如权利要求44至49中任一项所述的方法，其中，该生物活性分子是抗-癌药物。
51.如权利要求44至50中任一项所述的方法，其中，该生物活性分子是可检测标记。
52.如权利要求44至51中任一项所述的方法，其中，该生物活性分子是荧光化合物或电子转移剂。
53.如权利要求44至52中任一项所述的方法，其中，该生物活性分子是酶。
54.如权利要求44至53中任一项所述的方法，其中，该生物活性分子是放射性化合物。
55.一种治疗病症的治疗组成物，包括于治疗上为有效量的如权利要求1至15中任一项所述的T细胞受体融合复合物及无菌的、医药上可接受的载体媒剂。
56.一种治疗病症的治疗组成物，包括在治疗上为有效量的如权利要求31至43中任一项所述的T细胞受体共轭复合物及无菌的、医药上可接受的载体媒剂。
57.如权利要求55或56所述的治疗组成物，其中，该复合物是针对恶性病症的治疗。
58.如权利要求55或56所述的治疗组成物，其中，该复合物是针对自体免疫病症的治疗。
59.如权利要求55或56所述的治疗组成物，其中，该复合物是针对发炎反应的治疗。
60.如权利要求55或56所述的治疗组成物，其中，该复合物是针对感染性疾病的治疗。
61.如权利要求55或56所述的治疗组成物，其中，该复合物是针对病毒感染的治疗。
62.一种用于指示病症的诊断组成物，包括在诊断上为有效量的如权利要求31至43中任一项所述的T细胞受体共轭复合物及无菌的、医药上可接受的载体媒剂。
63.如权利要求62所述的诊断组成物，其中，该T细胞受体共轭复合物是适用于诊断或成像研究中的可检测的经标记的分子。
64.一种可编码出T细胞受体融合复合物的核酸序列，包括T细胞受体以及通过肽接头连接的生物活性多肽，其中，该T细胞受体具有一个识别结合位点以及该生物活性多肽具有不同的识别结合位点。
65.如权利要求64所述的核酸序列，其中，该T细胞受体对特定抗原的识别是专一性的。
66.如权利要求64或65所述的核酸序列，其中，该T细胞受体是杂二聚体包括α及β链TCR。
67.如权利要求64至66中任一项所述的核酸序列，其中，该T细胞受体α及β链是经由非-共价连接而连接。
68.如权利要求64或65所述的核酸序列，其中，该T细胞受体包括单链T细胞受体多肽。
69.如权利要求64至68中任一项所述的核酸序列，其中，该生物活性多肽对效应物细胞的识别是专一性的。
70.如权利要求64至69中任一项所述的核酸序列，其中，该生物活性多肽包括免疫球蛋白结构域或其片段。
71.如权利要求64至70中任一项所述的核酸序列，其中，该生物活性多肽包括κ恒定链免疫球蛋白结构域或其片段。
72.如权利要求64至71中任一项所述的核酸序列，其中，该生物活性多肽包括细胞因子或其片段。
73.如权利要求64至72中任一项所述的核酸序列，其中，该生物活性多肽包括IL-2细胞因子或其片段。
74.如权利要求64至73中任一项所述的核酸序列，其中，该生物活性多肽包括IL-10细胞因子或其片段。
75.如权利要求64至74中任一项所述的核酸序列，其中，该生物活性多肽包括趋化因子或其片段。
76.如权利要求64至75中任一项所述的核酸序列，其中，该生物活性多肽包括生长因子或其片段。
77.如权利要求64至76中任一项所述的核酸序列，其中，该生物活性多肽包括GCSF或其片段。
78.如权利要求64至77中任一项所述的核酸序列，其中，该生物活性多肽包括蛋白质毒素结构域或其片段。
79.如权利要求64至78中任一项所述的核酸序列，其中，该核酸序列是DNA。
80.如权利要求64至78中任一项所述的核酸序列，其中，该核酸序列是RNA。
全文摘要
本发明以T细胞受体复合物为特征，该T细胞受体复合物是设计成使免疫系统对抗各种疾病。本发明的T细胞受体复合物经设计为在功能上具有双专一性的性质，以识别靶抗原。融合蛋白质复合物及蛋白质共轭物是由高亲和性抗原－专一性TCR以及具有生物活性的蛋白质和/或效应分子。本发明的另一特征为产生T细胞受体融合物及共轭复合物的方法以及使用该复合物的治疗组成物。
文档编号C07K19/00GK1464790SQ01810346
公开日2003年12月31日 申请日期2001年6月5日 优先权日2000年6月5日
发明者J·A·韦丹茨, K·F·卡德, H·C·王 申请人:苏诺尔分子公司