专利名称：大豆1－氨基环丙烷－1－羧酸合成酶基因片段及引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及核酸，具体地讲，本发明涉及大豆的特异性核酸。
不同来源的DNA例如各种加工食品的DNA，常常会受到蛋白质、脂肪、多糖、聚酚及其他物质的污染，这些物质可能与DNA聚合酶及核酸相互作用而影响PCR分析，甚至在某些情况下还会导致假阴性结果。
大豆非常广泛地应用于食品上，如面包、蛋糕、朱古力、糖果、牛油、奶酪、奶类制成品、雪藏食物及各式各样的酱料等。据估计，含有大豆的加工食物占所有食品的百分之10-30％。食物(包括转基因食品)中是否含有大豆成份，目前尚未有简单可行的测定方法。
以聚合酶链式反应(PCR)为基础的DNA分析方法可用于检测食品中是否含有大豆DNA。在大豆中，1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase)催化腺苷甲硫氨酸(AdoMet)生成乙烯。大豆1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶DNA序列与其他农作物的1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶不同。因此，可找出其中特有的一段序列，据此设计并合成引物用于PCR扩增。
本发明的发明人根据大豆1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(简称ACC合成酶)基因(Genbank入藏号X67100)的核苷酸序列，设计了并合成了一段特定的DNA序列作为引物，使用该引物已成功地扩增出了大豆及其加工食品中所含的大豆DNA。具体地讲，本发明包括如下方面一方面，本发明提供一种DNA，其包含如下SEQ ID NO1所示的序列或与SEQ ID NO1所示序列具有至少99％序列同一性的序列ggcacagtca tggacagaaa cacactaaga accgtgatga gcttcatcaa cgagaagcgtatccaccttg tatctgatga aatatactct gcaacagttt ttagccaccc cagtttcataagcattgctg agatattaga ggaagacaca gacatcgaat gtgaccgcaa cctcgttcacattgtttata gtctttcaaa ggatatgggg ttccctggct tcagagttgg catcatatactcttacaatg atgctgtggt ccatt (SEQ ID NO1)另一方面，本发明提供一种引物，其具有如下SEQ ID NO2所示序列中的至少19个连续的核苷酸5’-ggcacagtcatggacagaaac-3’(SEQ ID NO2)。
这些引物是用于扩增大豆1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶基因片段的正向引物。其中，优选该引物具有SEQ ID NO2所示序列中的至少19个连续的核苷酸。更优选具有SEQ ID NO2所示序列中的至少20个连续的核苷酸。最优选具有SEQ ID NO2所示的序列5’-ggcacagtcatggacagaaac-3’。
再一方面，本发明提供一种引物，其具有如下SEQ ID NO3所示序列中的至少18个连续的核苷酸5’-aatggaccacagcatcattg-3’(SEQ ID NO3)。
该引物是用于扩增大豆1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶基因片段的反向引物。其中，该引物优选具有SEQ ID NO3所示序列中的至少19个连续的核苷酸。更优选该引物具有序列5’-aatggaccacagcatcattg-3’。
本发明的上述引物(下文中有时称为“ACC引物”)具有高度的特异性。在不同的植物品种(大豆、粟米、蕃茄和土豆)中提取DNA。以所得DNA为模板并使用本发明的引物，进行PCR扩增，确定大豆ACC引物的特异性。反应结果显示只在大豆中扩增得到了265bp的DNA片段。
具体实施例方式
以下以实施例的方式对本发明做进一步的描述，但是无论在何种意义上实施例都不对本发明构成限制。
实施例ACC引物的合成按照本领域公知的常规方法制备引物。例如，在DNA自动合成仪(例如在美国PE公司的ABI3949型全自动DNA合成仪)上按照制造商的说明进行合成。分别合成大豆ACC合成酶基因的正向引物5’-ggcacagtcatggacagaaac-3’(SEQ ID NO2)和大豆ACC合成酶基因的反向引物5’-aatggaccacagcatcattg-3’(SEQ ID NO3)。
ACC基因的265bp的DNA片段的扩增以Qiagen DNeasy Plant Mini试剂盒，按照制造商的说明提取大豆DNA并溶于100微升双蒸水中。取5微升DNA，加入PCR预混液(1倍PCR缓冲液，200微摩尔dNTP，200微摩尔大豆ACC正向和反向引物和0.25单位Taq DNA聚合酶)。所述PCR缓冲液为10mM Tris-HCl(pH8.6)、50mM KCl、1.5mM MgCl2和0.1％Triton X-100。PCR反应在Applied Biosystems所生产的GeneampPCR System 9700仪上进行，反应程序为95℃2分钟，随后是94℃1分钟，56℃1分钟，72℃1分钟，反应35个循环，外加10分钟最终延伸反应。PCR产物由1％的琼脂糖胶电泳分离。采用Perkin Elmer ABI377测序仪对所扩增出的DNA进行测序，结果如SEQ ID NO1所列。
大豆ACC引物的特异性以Qiagen DNeasy Plant Mini试剂盒所述方法提取DNA，在不同的植物品种(大豆、粟米、蕃茄和土豆)中提取DNA并溶于100微升双蒸水。取5微升DNA，按以上PCR反应条件进行PCR扩增。PCR产物由1％的琼脂糖胶电泳分离。实验结果显示，只在大豆中扩增得到了265bp的DNA片段。通过DNA测序，结果证实扩增得到了的该265bp的片段其序列如SEQ ID NO1所示。
对大豆加工食品进行PCR分析分别提取5％Roundup Ready大豆、面粉、酱油、豆浆、大豆的DNA。其中固体食品采用Qiagen DNeasy Plant Mini试剂盒按照生产商的说明提取DNA，液体食品采用乙烷和硫氰酸胍方法提取DNA。向2克液体样品中加入10毫升乙烷和1毫升提取液(提取液的组成为100毫摩尔Tris-HCl，pH6.4；500毫摩尔EDTA，pH8.0；2.6克Triton X100和120克硫氰酸胍；通过0.2微米微孔膜进行无菌过滤)，彻底混合均匀。然后5,000Xg离心20分钟将上层和中间层移入新的离心管；加入等体积氯仿后震荡成乳浊液状，再15,000 Xg离心10分钟后取上层，移入新的离心管；加入2微升糖原溶液(20微克糖原/微升)和400至600微升的异丙醇，室温中反应30分钟。然后15,000Xg离心10分钟沉淀DNA，并用70％的乙醇洗两次。空气干燥后加入50微升的0.2×TE(10毫摩尔Tris-HCl，pH8.0；1毫摩尔EDTA)缓冲液，此DNA溶液过Pharmacia Microspin S300柱除去残留的RNA并脱盐后保存在4℃。
从固体和液体样品中所提取DNA均用下列方法进行PCR扩增。采用本发明的ACC正向和反向引物对所提取的DNA进行PCR扩增并以PCR缓冲液为PCR阴性对照。反应程序为95℃2分钟，随后是94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，反应35个循环，外加10分钟最终延伸反应。PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳分离。结果表明，除阴性对照外，在所有被测试材料中均扩增得到了265bp的片段。
ACC引物的长度与PCR产物的序列同一性的关系分别合成具有SEQ ID NO2中至少19个连续核苷酸的DNA片段以及合成具有SEQ ID NO3中至少18个连续核苷酸的DNA片段。重复以上PCR反应的条件对大豆DNA进行扩增。所得PCR产物经1％的琼脂糖胶电泳分离后测序。并以SEQ ID NO1为参考序列，计算所扩增的PCR产物与参考序列相比的序列同一性。结果如表1所示。表1
注引物后的数字代表与正向引物(SEQ ID NO2)或反向引物(SEQ ID NO3)的序列相同的连续核苷酸数。
以上对本发明进行了详细的描述，本领域的技术人员可在不背离本发明精神的前提下对本发明作出一些不脱离本发明范围的修改或改变。只要在所附权利要求的范围内，这些修改和改变就包括在本发明之中。
序列表<110>创念分子标签有限公司(MolecularTaq Limited)<120>大豆1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶基因片段及引物<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>265<212>DNA<213>大豆(Glycine max)<400>1ggcacagtca tggacagaaa cacactaaga accgtgatga gcttcatcaa cgagaagcgt60atccaccttg tatctgatga aatatactct gcaacagttt ttagccaccc cagtttcata120agcattgctg agatattaga ggaagacaca gacatcgaat gtgaccgcaa cctcgttcac180attgtttata gtctttcaaa ggatatgggg ttccctggct tcagagttgg catcatatac240tcttacaatg atgctgtggt ccatt 265<210>2<211>21<212>DNA<213>正向引物<400>2ggcacagtca tggacagaaa c 21<210>3<211>20<212>DNA<213>反向引物<400>3aatggaccac agcatcattg20
权利要求
1.一种DNA，其包含SEQ ID NO1所示的序列或与SEQ ID NO 1所示序列具有至少99％序列同一性的序列。
2.一种引物，其具有SEQ ID NO2所示序列中的至少19个连续的核苷酸。
3.权利要求2所述的引物，其具有SEQ ID NO2所示序列中的至少20个连续的核苷酸。
4.权利要求2所述的引物，其具有序列5’-ggcacagtcatggacagaaac-3’。
5.权利要求1-4中任一项所述的引物，其为用于扩增大豆1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶基因片段的正向引物。
6.一种引物，其具有SEQ ID NO3所示序列中的至少18个连续的核苷酸。
7.权利要求6所述的引物，其具有SEQ ID NO3所示序列中的至少19个连续的核苷酸。
8.权利要求6所述的引物，其具有序列5’-aatggaccacagcatcattg-3’。
9.根据权利要求7-9中任一项所述的引物，其为用于扩增大豆1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶基因片段的反向引物。
全文摘要
本发明提供了在大豆中特有的PCR扩增得到的DNA片段以及用于该扩增的PCR引物。所述片段和引物可特异性地识别大豆DNA成分的存在。
文档编号C07H21/00GK1438231SQ0210455
公开日2003年8月27日 申请日期2002年2月11日 优先权日2002年2月11日
发明者王骏, 黄蕙薇, 萧游龙 申请人:创念分子标签有限公司