参与聚酯合成的酶基因和使用该基因的聚酯制造方法

专利名称：参与聚酯合成的酶基因和使用该基因的聚酯制造方法
技术领域：
本发明涉及到对聚酯进行酶合成所必需的基因、利用该基因发酵合成聚酯的微生物、和利用该微生物的聚酯的制造方法。详细地讲，涉及到在对于自然环境(土中、河水、海中)下，受到微生物作用进行分解的塑料样高分子进行酶合成的宿主内发挥功能的基因、和用该基因转化的对塑料样高分子进行发酵合成的能力得到改善的转化体以及利用该转化体的聚酯的制造方法。
背景技术：
到现在为止，已知在许多微生物中将聚酯作为能量贮藏物质蓄积在菌体内。其代表性的例子是作为3-羟基丁酸(以下略为3HB)均聚物的聚3-羟基丁酸(以下略为P(3HB))，最初于1925年在巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)中发现的(M.Lemoigne，Ann.Inst.Pasteur，39，144(1925))。P(3HB)是热塑性高分子，由于在自然界中可以被生物降解，作为对环境有利的塑料而一直引入注目。然而，由于P(3HB)结晶度高，具有硬且脆的性质，实用上应用的范围有限。因此，目的在于改良其性质的研究一直在进行着。
其中，在特开昭57-150393号公报以及特开昭59-220192号公报等公开了由3-羟基丁酸(3HB)和3-羟基缬草酸(3HV)构成的共聚物(以下省略为P(3HB-co-3HV))的制造方法。该P(3HB-co-3HV)与P(3HB)相比，由于富有柔软性，用途更广泛。然而实际上，由于即使增加3HV摩尔比率，但伴随而来的P(3HB-co-3HV)的物性变化不大，特别是不能提高在膜等使用上所要求的柔软性，只能用于香波瓶和使用后扔掉的剃刀的把手等硬质成型物的领域。
近年来，就3HB和3-羟基己酸(以下略为3HH)两种成分共聚合聚酯(以下略为P(3HB-co-3HH))及其制造方法进行了研究。例如，特开平5-93049号公报以及特开平7-265065号公报分别有报道。这些公报的P(3HB-co-3HH)的制造方法是用从土壤中分离的豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)，由油酸等脂肪酸和橄榄油等油脂发酵生产的方法。另外，也进行了有关P(3HB-co-3HH)的性质的研究(Y.Doi，S.Kitamura，H.Abe，Macromolecules 28，4822-4823(1995))。在该报告中报道了以碳数在12个以上的脂肪酸作为唯一碳源，培养豚鼠气单胞菌，发酵生产3HH为11～19mol％的P(3HB-co-3HH)。该P(3HB-co-3HH)随着3HH摩尔比率的增加，表现出由P(3HB)硬且脆的性质逐渐到柔软的性质，表明已超过了P(3HB-co-3HV)的柔软性。然而，利用上述制造方法，由于菌体产量为4g/L，聚合物含量为30％，聚合物的产率低，所以要探索面向实用化，能够获得更高产率的方法。
从生产P(3HB-co-3HH)的豚鼠气单胞菌(A.caviae)已经克隆了PHA(聚羟基烷羧酸)合成酶基因(T.Fukui，Y.Doi，J.Bacteriol，vol.179，No.15，4821-4830(1997)、特开平10-108682号公报)。使用将本基因导入了真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha(旧Alcaligen eseutrophus))的转化体，使用植物油作为碳源进行培养，结果菌体产量可达到4g/L，聚合物含量达到80％(T.Hukui等Appl.Microbiol.Biotecnol.49，333(1998))。另外，也报道了大肠杆菌等细菌和植物作为宿主的P(3HB-co-3HH)的制造方法(WO 00/43525)，但没有报道其产率。
上述聚合物P(3HB-co-3HH)通过改变3HH摩尔比率，由于具有由硬质聚合物到软质聚合物很宽的性质，预期可以应用于从象电视机的框架等那样要求硬度直至象丝和膜等那样要求柔软性的材料的范围广泛的领域。然而，如果利用先前叙述的制造方法，P(3HB-co-3HH)的产率依然低，作为面向P(3HB-co-3HH)实用化的生产方法可以说还不充分。
最近，Leaf等人进行了以菌体产率高的酵母为宿主的生物可降解聚酯的生产研究(Microbiology，vol.142，pp1169-1180(1996))。将真养产碱杆菌(R.eutropha)的聚酯合成酶基因导入到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)后，制作转化体，通过以葡萄糖作为碳源进行培养，确认P(3HB)蓄积(聚合物含量0.5％)。然而，在上述研究中生产的聚合物是具有硬且脆的性质的P(3HB)。
人们都知道酵母增殖快、菌体产率高。其中，属于假丝酵母属(Candida属)的酵母过去作为单细胞蛋白引入注目，一直进行着以通常石蜡作为碳源生产饲料用菌体的研究。另外，近年来报道了假丝酵母属(Candida属)的宿主载体系已经被开发，可利用基因重组技术生产物质(化学和生物vol.38，No，614(2000))。产朊假丝酵母(Candida utilis)作为宿主的α-淀粉酶的产率高达约12.3g/L，具有这样高物质生产能力的假丝酵母属(Candida属)有望作为聚合物生产用宿主。另外，与细菌相比，菌体和培养液的分离容易，所以使聚合物的提取纯化工序更简单也是有可能的。
因此需要利用假丝酵母属(Candida属)酵母生产具有优良性质的P(3HB-co-3HH)的方法。

发明内容
本发明鉴于上述现状提供在酵母中发挥功能而且可有效表达的参与聚酯合成的基因、用该基因构成的基因表达盒转化酵母的转化体，以及通过培养得到的转化体，制造具有可生物降解和优良物性的聚酯的方法。
本发明人进行了各种各样的研究，结果发现通过制作对于一种以上的参与聚酯合成的一或多个酶基因附加了编码过氧化物酶体靶向信号的DNA的在酵母中可表达的新基因，然后分别在这些基因中连接在酵母中发挥功能的启动子和终止子，构建基因表达盒，再将该基因表达盒导入酵母后做成转化体，通过培养该转化体，利用预期高产率的方法从该培养物中可以制造聚酯。
即，本发明涉及到在编码参与聚酯合成的酶基因附加了编码过氧化物酶体靶向信号的DNA的在酵母中可表达的基因。
作为理想的实施模式，涉及到参与聚酯合成的酶来自细菌的酶、最好是来自以下述内容为特征的上述基因，即来自豚鼠气单胞菌的酶的上述基因、另外以至少一个来自细菌基因的遗传密码子CTG可以变换为TTA、TTG、CTT、CTC或CTA为特征的上述基因。
作为另外的优选方案涉及的上述基因，其中到参与聚酯合成的酶是聚羟基烷羧酸合成酶或R-特异性烯酰CoA水合酶。
另外本发明涉及到由上述基因翻译的参与聚酯合成的酶。
另外本发明涉及到将至少一种上述基因导入酵母为特征的转化体。最好是以导入包含上述基因和在酵母中发挥功能的启动子和终止子的参与聚酯合成的酶基因表达盒为特征的转化体。
作为另外的优选方案，涉及到聚酯为用下面通式(1)表示的3-羟基烷羧酸的均聚物或共聚物的转化体， (式中R代表烷基)另外涉及到聚酯最好为下式(2)表示的3-羟基丁酸和下式(3)表示的3-羟基己酸均聚或共聚形成的共聚合聚酯P(3HB-co-3HH)的上述转化体。
另外本发明涉及到以从培养上述转化体后得到的培养物提取聚酯为特征的聚酯的制造方法。
发明的详细内容以下详细说明本发明。
(1)参与聚酯合成的酶以及编码该酶的基因作为本发明中的聚酯没有特别限定，最好是通式(1)表示的3-羟基烷羧酸的均聚物或共聚物。
(式中R代表烷基)
即，最好是式(1)表示的一种3-羟基烷羧酸的均聚物，或2种以上式(1)表示的3-羟基烷羧酸的共聚物。
另外通过式(2) 表示的3-羟基丁酸和式(3) 表示的3-羟基己酸共聚合得到的式(4) (式中，m，n各表示不小于1的整数)表示的共聚合聚酯P(3HB-co-3HH)更好。
这里，上述通式中的R代表烷基，碳原子数为1～11比较好，碳原子数为1～4更好，而碳原子数为1～3最好。
作为本发明中提到的参与聚酯合成的酶，不仅包括聚酯合成酶，也包括合成聚酯中间体的合成酶。作为上述聚酯合成酶，如聚羟基烷羧酸(以下称为PHA)合成酶。另外作为合成聚酯中间体的酶，如将β氧化循环中的中间产物烯酰CoA变换为作为单体的(R)-3-羟基酰基CoA的R-特异性烯酰CoA水合酬酶(T.Fukui，et al，FEMS Microbiology Letters，mol.170.69-75(1999))和二聚(作用)乙酰CoA后还原乙酰乙酰CoA为单体3-羟基丁酰CoA的β-酮硫解酶和依赖于NADPH的乙酰乙酰CoA还原酶(PeoplesOP，et al，J.Biol.Chem.264(26)15298-15303(1989))、3-酮酰CoA还原酶(fabG)(Qun ren，et al，J.Bacteriol，vol.182，No.10、pp2978-2981)、3-羟基酰基CoA差向[异构]酶(fadB)、酰基CoA脱氢酶(Qun ren，et al，Applied andEnvironmental Microbiology，vol.66，No.4、pp1311-1320)等。
作为参与这些聚酯合成的酶没有特别限定，来自细菌的酶比较好，来自豚鼠气单孢菌和真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha)的酶更好，例如可以使用特开平10-108682号公报记载的酶。
用上述那样的来自编码细菌的酶的基因转化酵母时，如果直接利用来自细菌的基因，有时在宿主酵母中密码子翻译中表现异常。例如Candidacylindracea(Y.Kawaguchi et al，Nature 341164-166(1989))和麦芽糖假丝酵母(candida maltosa)(H.Sugiyama et al，Yeast 11，43-52(1995))是遗传密码子CTG不是翻译成亮氨酸，而是翻译为丝氨酸的酵母。在这样的酵母中，为了使来自该酵母以外的生物参与聚酯合成的酶基因表达时，由于有时遗传密码子翻译出现异常，往往生产出与该酶氨基酸序列不同的酶。担心该酶功能不能充分发挥。
这样的问题通过预先将基因内含有的至少一个遗传密码子CTG变换为与亮氨酸对应的其他遗传密码子(TTA，TTG，CTT，CTC，CTA)可以解决。对与进行变换的亮氨酸对应的其他遗传密码子没有限制，如果考虑到进行导入的基因的翻译效率，在进行基因导入的酵母中，最好是变换为使用频率高的遗传密码子。例如在麦芽糖假丝酵母中，希望将遗传密码子CTG变换为TTA，TTG中的任一个，变换为TTG最合适。
另外构成基因的遗传密码子的使用频率因生物不同而有所偏重。即，在色氨酸和蛋氨酸以外的氨基酸中，存在对应于该氨基酸的多个遗传密码子，发现在遗传密码子使用上各个生物特有偏重。在麦芽糖假丝酵母中，例如对应于丙氨酸的遗传密码子有GCT，GCC，GCA，GCG，构成基因的遗传密码子使用最高的是GCT。在这样的有多个指定同一氨基酸的遗传密码子中，使用的遗传密码子因生物不同而有所偏重，表明由使用频率高的遗传密码子构成的基因的翻译效率高。例如来自豚鼠气单孢菌的PHA合成酶基因和R-特异性烯酰CoA水合酶的基因的GC含量分别为67.16％、65.77％，而到现在为止报道来自麦芽糖假丝酵母的酶，例如磷酸甘油酸激酶GC含量为39.55％，而P450(ALK2-A)的GC含量为35.67％。
这样一来，遗传密码子使用偏重的结果是基因的GC含量发生了变化。因此，例如为了使参与聚酯合成的基因在麦芽糖假丝酵母中有效地表达，通过将上述遗传密码子CTG更换为其他的亮氨酸对应的遗传密码子，使用变换为在麦芽糖假丝酵母中使用频率高的遗传密码子的该基因最好。
关于麦芽糖假丝酵母中遗传密码子使用在Klaus Wolf编辑的NonconventionalYeasts in Biotechnology(Springer出版)中有记载。对应于丙氨酸的遗传密码子优选GCT，精氨酸为AGA、天冬酰胺为AAC或AAT、天冬氨酸为GAT、半胱氨酸为TGT、甘氨酸为GGT、谷氨酰胺为CAA、谷氨酸为GAA、组氨酸为CAC或CAT、异亮氨酸为ATT、亮氨酸为TTG或TTA、赖氨酸为AAA、苯丙氨酸为TTC或TTT、脯氨酸为CCA、丝氨酸为TCT、苏氨酸为ACT、酪氨酸为TAT或TAC、缬氨酸为GTT较好，对这些遗传密码子没有特别限制。
举一个例子，当以麦芽糖假丝酵母作为宿主时，作为参与该聚酯合成的酶基因可以利用序列5表示的聚羟基烷羧酸(PHA)合成酶基因、序列6表示的R-特异性烯酰CoA水合酶基因。
另外，上述序列5或6表示的基因的核苷酸序列只要基本上具有酶活性，即使突变，如缺失、置换和/或附加一个或多个核苷酸的核苷酸序列也可以。
这里所谓「缺失、置换和/或附加一个或多个核苷酸的核苷酸序列」指的是利用《蛋白核酸酶增刊》基因扩增PCR法TAKKALJ 35(17)，2951-3178(1990)或Henry A.Erlich编加藤郁之进鑑译PCR技术(1990)等记载的本领域都知道的方法，缺失、置换和/或附加可以缺失、置换和/或附加的数个核苷酸的核苷酸序列。
另外由上述核苷酸序列构成的DNA只要具有实质上的酶活性，也可以是在严格条件下与由序列5或6表示的核苷酸序列构成的DNA杂交的DNA。
所谓「在严格条件下与由序列5或6表示的核苷酸序列构成的DNA杂交的DNA」指的是以由序列5或6表示的核苷酸序列构成的DNA作为引物，通过菌落杂交法、噬斑杂交法、或Southern杂交法等得到的DNA。只要是同行，按照Molecular Cloning 2nd Edt.(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)记载的方法，实施杂交，可容易获得目的DNA。
(2)在编码参与DNA的聚酯合成的酶基因附加编码过氧化物酶体靶向信号DNA的可在酵母中表达的基因本发明的特征在于利用在编码参与DNA的聚酯合成的酶基因附加编码过氧化物酶体靶向信号DNA可在酵母中表达的基因用酵母使发酵生产聚酯时，作为碳源如碳水化合物、油脂类(fats andoils)、脂肪酸类、n-石蜡等，只要是酵母可以利用的，可以没有特别限制地利用。然而油脂类、脂肪酸类或n-石蜡等作为碳源发酵生产聚酯时，这些碳源经β-氧化循环可被代谢，β-氧化途径的代谢中间体可以有效地用作聚酯合成的底物(T.Fukui，Y.Doi，J.Bacteriol，vol.179，No.15，4821-4830(1997)，Q.Ren等，J.Bacteriol，182，No.105，2978-2981(2000))。其中，酵母中的β-氧化由于是在细胞内的微体过氧化物酶体内进行的，为了有效地进行聚酯合成，参与聚酯合成的酶最好局限在过氧化物酶体。
输送到过氧化物酶体的蛋白质是在游离的核糖体上合成、通过位于该蛋白质序列中的过氧化物酶体靶向信号的作用，输送到过氧化物酶体的(S.Subramani，J.Membrane Biol.，125，99-106，(1992)、坂井康能，化学与生物，35，No.10，687-695(1997)E.H.Hettema，Biochim.Biophys.Acta，1451，17-34(1999))。因此，通过将编码过氧化物酶体靶向信号的DNA附加到参与聚酯合成的基因上，可以将编码参与聚酯合成的酶定位在过氧化物酶体，以有效地合成聚酯。
另外，有报道(WO 99/35278)说，在植物中可以使PHA合成酶基因定向过氧化物酶体。
已知作为处于羧基端的过氧化物酶体靶向信号由包含3个氨基酸的序列构成「(丝氨酸/丙氨酸/半胱氨酸)-(赖氨酸/精氨酸/组氨酸)-亮氨酸」。这里所谓的表达方式(丝氨酸/丙氨酸/半胱氨酸)指的是丝氨酸、丙氨酸或半胱氨酸中任一个氨基酸。为了使参与聚酯合成的酶定向过氧化物酶体，可以将上述3个氨基酸附加到该酶的羧基端。其中已知的在羧基末端附加作为一般羧基末端过氧化物酶体靶向信号「丝氨酸-赖氨酸-亮氨酸」(以下略为SKL)(序列1)和已知的在热带假丝酵母(Candida tropicalis)中过氧化物酶体靶向羧基末端信号的「丙氨酸-赖氨酸-异亮氨酸」(以下略为AKI)(序列2)最为已知。
对应于上述氨基酸的核苷酸序列没有特别限制，例如如果是SKL可以使用序列3，如果是AKI可以使用序列4的核苷酸序列。
另外，已知存在于N末端附近的包含9氨基酸残基的序列「(精氨酸/赖氨酸)-(亮氨酸/缬氨酸/异亮氨酸)-(5氨基酸残基)-(组氨酸/谷氨酰胺)-(亮氨酸/丙氨酸)」也可作为过氧化物酶体靶向信号。通过将这些序列插入、附加到参与聚酯合成的酶中，也可以使该酶定位在过氧化物酶体中。
在编码参与聚酯合成的基因附加了编码过氧化物酶体靶向信号DNA的新基因可以用化学合成法或PCR法等制作。以下举一个例子，就通过PCR在作为参与聚酯合成的酶基因的序列5表示的PHA合成酶基因、序列6表示的R-特异性烯酰CoA水合酶基因的羧基端附加SKL的方法进行说明。
作为PCR用的引物可以使用序列11和序列12，以序列5表示的PHA合成酶基因作为模板，实施PCR反应，可以构造在PHA合成酶基因附加了过氧化物酶体靶向信号DNA的新基因(以下略为ORF2S)(序列7)。同样作为PCR用的引物使用序列14和序列15，以序列6表示的R-特异性烯酰CoA水合酶基因作为模板，实施PCR反应，可以制造在序列6表示的R-特异性烯酰CoA水合酶基因附加了过氧化物酶体靶向信号DNA的新基因(以下略为ORF3S)(序列9)。这里用的PCR条件只要是可以扩增目的基因片段，无论什么样的条件都可以使用。
另外与上述同样，通过PCR可以在PHA合成酶基因、R-特异性烯酰CoA水合酶基因的羧基端附加AKI。用序列11和序列13作为引物，以PHA合成酶基因作为模板，实施PCR反应，可以制作新基因(以下略为ORF2A)(序列8)。同样使用序列14和16作为引物，以R-特异性烯酰CoA水合酶基因作为模板，实施PCR反应，可以制作新基因(以下略为ORF3A)(序列10)。
而上述序列7～10表示的新基因的核苷酸序列只要是各个都基本具有的活性，即使缺失、置换和/或附加一个或数个核苷酸也可以。另外由上述核苷酸序列构成的DNA只要是各个都具有基本的活性，即使是在严格条件下与上述序列表示的核苷酸序列构成的DNA杂交的DNA也可以。
在编码参与聚酯合成的基因附加了编码过氧化物酶体靶向信号DNA的基因是可在酵母中表达的基因。
这里，作为酵母没有限制，可以使用寄托于菌株寄托机构(例如IFO、ATCC等)的下列酵母等针芽孢酵母属(Aciculoconidium属)，神食酵母属(Ambrosiozyma属)，节囊酵母属(Arthroascus属)，Arxiozyma属，Ashbva属，Babjevia属，Bensingtonia属，Botryoascus属，Botryozyma属，酒香酵母属(Brettanomyces属)，布勒弹孢酵母属(Bullera属)，Bulleromyces属，假丝酵母属(Candida属)，固囊酵母属(Citeromyces属)，棒孢酵母属(Clavispora属)，隐球酵母属(Cryptococcus属)，Cystofilobasidium属，德巴利酵母属(Debaryomyces属)，德克酵母属(Dekkera属)，Dipodascopsis属，Dipodascus属，爱尼拉酵母属(Eeniella属)，拟内孢霉属(Endomycopsella属)，Eremascus属，Eremothecium属，Erythrobasidium属，Fellomyces属，线黑粉菌属(Filobasidium属)，Galactomyces属，地霉属(Geotrichum属)，小季酵母属(Guilliermondella属)，有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora属)，Hansenula属，Hasegawaea属，Holtermannia属，连锁酵母属(Hormoascus属)，Hyphopichia属，伊萨酵母属(Issatchenkia属)，克勒克酵母属(Kloeckera属)，Kloeckeraspora属，克鲁维酵母属(Kluyveromyces属)，Kondoa属，Kuraichia属，Kurtzmanomyces属，白色冬孢酵母属(Leucosporidium属)，油脂酵母属(Lipomyces属)，类德酵母属(Lodderomyces属)，Malassezia属，酶奇酵母属(Metschnikowia属)，Mrakia属，Myxozyma属，纳逊酵母属(Nadsonia属)，Nakazawaea属，针孢酵母属(Nematospora属)，Ogataea属，卵孢酵母属(Oosporidium属)，管囊酵母属(Pachysolen属)，厚壁孢酵母属(Phachytichospora属)，范菲亚酵母属(Phaffia属)，毕赤酵母属(Pichia属)，红色冬孢酵母属(Rhodosporidium属)，红酵母属(Rhodotorula属)，酵母属(Saccharomyces属)，类酵母属(Saccharomycodes属)，复膜孢子酵母属(Saccharomycopsis属)，Saitoella属，Sakaguchia属，Satumospora属，裂芽酵母属(Schizoblastosporion属)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces属)，许旺氏酵母属(Schwanniomyces属)，锁合掷孢酵母属(Sporidiobolus属)，掷孢酵母属(Sporobolomyses属)，孢皮肥厚酵母属(Sporopachydermya属)，冠囊酵母属(Stephanoascus属)，梗孢酵母属(Sterigmatomyses属)，拟梗孢酵母属(Sterigmatosporidium属)，Symbiotaphrina属，合轴酵母属(Sympodiomyces属)，Sympodiomycopsis属，有孢圆酵母属(Torulaspora属)，Trichopsporiella属，丝孢酵母属(Trichosporon属)，三角酵母属(Trigonopsis属)，Tsuchiyaea属，Udeniomyces属，Waltomyces属，威克酵母属(Wickerhamia属)，拟威克酵母属(Wickerhamiella属)，拟威尔酵母属(Williopsis属)，Yamadazyma属，耶罗威亚酵母属(Yarrowia属)，Zygoascus属，接合酵母属(Zygosaccharomyces属)，Zygowilliopsis属，Zygozyma属等。
上述酵母中，从以油脂作为碳源时的增殖性好，菌株的安全性高、菌体和培养液的分离比较容易方面考虑，属于假丝酵母属或耶罗威亚酵母属的酵母比较好，麦芽糖假丝酵母、耶罗威亚解脂酵母(Yarrowia lipolytica)比较好，最好是麦芽糖假丝酵母。
另外，由在上述编码参与聚酯合成的酶的基因中附加了过氧化物酶体靶向信号的DNA的基因可以翻译参与聚酯合成的酶。
(3)基因表达盒的构建为了使在上述编码参与聚酯合成的酶的基因中附加了过氧化物酶体靶向信号DNA的基因在酵母中表达，该基因的5’上游需要启动子、UAS等DNA序列，该基因的3’下游需要聚A附加信号肽、终止子等DNA序列。如果在酵母的染色体上存在满足上述条件的适当部位，可以直接将该基因插入。或者，将该基因插入到含有适当的启动子和终止子的质粒，也可以用该质粒转化酵母。在本发明中，优选构建在该基因的5’上游连接了启动子，而在该基因的3’下游连接了终止子的基因表达盒，然后用该他转化酵母。
使用的启动子、终止子只要是在酵母中发挥作用的，无论什么样序列都可以利用。启动子有可进行组成表达的和可进行诱导表达的启动子，使用哪一种启动子都可以。在本发明中，上述启动子、终止子只要是在麦芽糖假丝酵母中起作用的都可以，上述启动子、终止子也可以是来自麦芽糖假丝酵母的。最好是利用来自麦芽糖假丝酵母的ALK1、ALK5或POX2基因的启动子，来自ALK1基因的终止子。
例如，作用启动子，可以利用麦芽糖假丝酵母的ALK1(GenBankD00481)的启动子ALK1p(序列17)、ALK5基因的启动子ALK5p(序列18)、POX2基因(GenBank D21228)的启动子POX2p(序列19)等。而作为终止子可以利用麦芽糖假丝酵母的ALK1基因的终止子ALK1t(序列20)等。另外上述启动子、终止子的核苷酸序列只要是在麦芽糖假丝酵母中起作用的序列，即使是各自缺少、置换和或附加1个或多个核苷酸的核苷酸序列也可以。另外包含上述核苷酸序列的DNA只要是在麦芽糖假丝酵母中起作用的，即使是在严格条件下与由上述序列号表示的核苷酸序列构成的DNA杂交的DNA也可以。
上述启动子连接在附加了过氧化物酶体靶向信号DNA的编码参与聚酯合成的酶的基因的5’上游，终止子连接在附加了过氧化物酶体靶向信号DNA的编码参与聚酯合成的酶的基因的3’下游。
在基因表达盒的构建中使用的载体只要是可在大肠杆菌中自主复制的质粒，无论什么样的质粒都可以，甚至一并带有在酵母中可自主复制的区域也可以。在酵母中可自主复制的载体可保持在菌体内。另外也可以将基因表达盒整合到染色体上。举一个例子，如在麦芽糖假丝酵母可以使用在麦芽糖假丝酵母中可自主复制的pUTU1(M.Ohkuma，etal，J.Biol.Chem.，vol.273，3948-3953(1998))。
为了制作用于连接启动子和终止子和结构基因的限制性内切酶位点，可以利用PCR方法。PCR中使用的引物序列没有特别限定，例如可以使用序列21至序列28表示的序列。PCR的条件只要是可以扩增目的基因片段，使用什么样的条件都可以。
本发明的基因表达盒的构建方法没有特别限定，作为一个例子，以下对在参与聚酯合成的酶基因中附加了过氧化物酶体靶向信号DNA序列的基因，以及使用上述的ORF2S和ORF3S的2种基因时的构建方法进行说明。
(a)使用ALK1p、ALK5p和ALK1t时启动子部分可以用ALK1基因做模板，使用序列21和序列22为引物，制作5’端为PvuII、3’端为NdeI的ALK1p。终止子部分可以用ALK1基因做模板，使用序列27和序列28为引物，制作5’端为HindIII、3’端为EcoRV的ALK1t。至于载体用pUTU1和麦芽糖假丝酵母的ADE1基因(序列29)(GenBank D00855)(S.Kawai，et al，Agric.Biol.Chem.，vol.55，59-65(1991))，将标记基因由尿嘧啶换成腺嘌呤的载体pUTA1(图1)和pUCNT(WO94/03613)。
将ALK1p在PvuII-NdeI位点连接pUCNT后构建pUCNT-ALK1p，将ALK1t在HindIII-EcoRV位点连接pUCNT后构建pUCNT-ALK1t，然后用PvuII、NdeI从pUCNT-ALK1p切出ALK1p，与pUCNT-ALK1t在PvuII-NdeI位点连接，可以构建pUAL1(图2)。
另外，在NdeI-PstI位点ORF2S结合pUAL1，可以构建质粒pUAL-ORF2S(图3)。
另外，使用EcoT22I将ORF2S连同处于上游的启动子、处于下游的终止子一起从质粒pUAL-ORF2S切出，与pUAL1在PstI位点连接，可以构建pHA2S(图4)。
以上的构建方法都归纳在图8和图9中。而在图8、图9中的「*」表示图8和图9相连的部分。
另外，用麦芽糖假丝酵母的ALK5基因(GenBank D12717)作为模板，使用引物序列23和24，可以制作5’端为PvuII、3’端为NdeI的ALK5p(序列18)。通过将该DNA片段换成pUAL1的ALK1p，可以构建pUAL5。通过用PvuI、PvuII从该质粒切出ALK5启动子、ALK1终止子，与市售的载体pSTV 28在SmaI-PvuI位点连接，可以构建pSTAL5。在NedI-PstI位点ORF3S结合此质粒，可以构建pSTAL 5-OSF3S(图5)。
另外，用SalI将ORF3S连同处于上游的启动子，处于下游的终止子一起从pSTAL 5-OSF3S切出，然后与pHA2S的SalI位点结合，可以构建质粒pHA23S2(图6)。
以上的构建方法归纳在图10和图11中。而图10、图11中的「*」表示图10和图11相关连的部分。
(b)使用ALK1p、POX2p和ALK1t时以麦芽糖假丝酵母的POX2基因(GenBank D21228)为模板，使用引物序列25和序列26，可以制作5’端为PvuII、3’端为NdeI的POX2p(序列19)。通过在pSTAL 5-OSF3S中将该DNA片段换成lac启动子，可以构建pPOX2-OSF3S。用SalI将ORF3S连同处于上游的启动子，处于下游的终止子一起从pPOX2-OSF3S切出，与pHA2S在SalI位点结合可以构建质粒pHA23S1(图7)。以上的构建方法归纳在图12中。
利用以上方法，可以构建用于在酵母麦芽糖假丝酵母中制造通式(1)表示的3-羟基烷羧酸均聚或共聚合形成的聚酯的基因表达盒。
(4)宿主本发明提到的酵母没有特别限制，可以使用寄托于菌株寄托结构(例如IFO、ATCC等)的下列酵母等针芽孢酵母属(Aciculoconidium属)，神食酵母属(Ambrosiozyma属)，节囊酵母属(Arthroascus属)，Arxiozyma属，Ashbya属，Babjevia属，Bensingtonia属，Botryoascus属，Botryozyma属，酒香酵母属(Brettanomyces属)，布勒弹孢酵母属(Bullera属)，Bulleromyces属，假丝酵母属(Candida属)，固囊酵母属(Citeromyces属)，棒孢酵母属(Clavispora属)，隐球酵母属(Cryptococcus属)，Cystofilobasidium属，德巴利酵母属(Debaryomyces属)，德克酵母属(Dekkera属)，Dipodascopsis属，Dipodascus属，爱尼拉酵母属(Eeniella属)，拟内孢霉属(Endomycopsella属)，Eremascus属，Eremothecium属，Erythrobasidium属，Fellomyces属，线黑粉菌属(Filobasidium属)，Galactomyces属，地霉属(Geotrichum属)，小季酵母属(Guilliermondella属)，有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora属)，Hansenula属，Hasegawaea属，Holtermannia属，连锁酵母属(Hormoascus属)，丝孢毕赤式酵母属(Hyphopochia属)，伊萨酵母属(Issatchenkia属)，克勒克酵母属(Kloeckera属)，Kloeckeraspora属，克鲁维酵母属(Kluyveromyces属)，Kondoa属，Kuraichia属，Kurtzmanomyces属，白色冬孢酵母属(Leucosporidium属)，油脂酵母属(Lipomyces属)，类德酵母属(Lodderomyces属)，Malassezia属，酶奇酵母属(Metschnikowia属)，Mrakia属，Myxozyma属，纳逊酵母属(Nadsonia属)，Nakazawaea属，针孢酵母属(Nematospora属)，Ogataea属，卵孢酵母属(Oosporidium属)，管囊酵母属(Pachysolen属)，厚壁孢酵母属(Phachytichospora属)，范菲亚酵母属(Phaffia属)，毕赤酵母属(Pichia属)，红色冬孢酵母属(Rhodosporidium属)，红酵母属(Rhodotorula属)，酵母属(Saccharomyces属)，类酵母属(Saccharomycodes属)，复膜孢子酵母属(Saccharomycopsis属)，Saitoella属，Sakaguchia属，Satumospora属，裂芽酵母属(Schizoblastosporion属)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces属)，许旺氏酵母属(Schwanniomyces属)，锁合掷孢酵母属(Sporidiobolus属)，掷孢酵母属(Sporobolomyses属)，孢皮肥厚酵母属(Sporopachydermya属)，冠囊酵母属(Stephanoascus属)，梗孢酵母属(Sterigmatomyses属)，拟梗孢酵母属(Sterigmatosporidium属)，Symbiotaphrina属，合轴酵母属(Sympodiomyces属)，Sympodiomycopsis属，有孢圆酵母属(Torulaspora属)，Trichopsporiella属，丝孢酵母属(Trichosporon属)，三角酵母属(Trigonopsis属)，Tsuchiyaea属，Udeniomyces属，Waltomyces属，威克酵母属(Wickerhamia属)，拟威克酵母属(Wickerhamiella属)，拟威尔酵母属(Williopsis属)，Yamadazyma属，耶罗威亚酵母属(Yarrowia属)，Zygoascus属，接合酵母属(Zygosaccharomyces属)，Zygowilliopsis属，Zygozyma属等。
另外用作本发明转化体的宿主的酵母，没有特别限定，从以油脂作为碳源时的增殖性好，菌株的安全性高、菌体和培养液的分离比较容易方面考虑，最好是属于假丝酵母属或耶罗威亚酵母属的酵母，其中麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)比较好，麦芽糖假丝酵母更好。
另外用作宿主的酵母中，麦芽糖假丝酵母AC16株以保藏号FERMBP-7366，于平成12年11月15日国际寄托于位于日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。
(5)转化体的制作本发明的转化体是可向酵母导入一种以上在编码上述参与聚酯合成的基因附加了编码过氧化物酶体靶向信号的基因的转化体。最好是可以向酵母导入一种以上由上述基因和能够在酵母中起作用的启动子和终止子构成的参与聚酯合成的酶基因表达盒。
参与聚酯合成的酶基因表达盒向酵母的导入可以利用众所周知的方法进行。例如，可以使用磷酸钙法(Lederberg.E.M.et al.，J.Bacteriol.119.1072(1974))和电穿孔法(Current Protocolsin Morecular Biology、1卷、1.8.4页、1994年)等。另外也可以利用Fast TrackTM-Yeast Transformation KitSM(Geno Technology)那样的市售转化体试剂盒。
举一个例子，作为宿主可以使用麦芽糖假丝酵母CHA1株(S.Kavai，etal，Agric.Biol.Chem.，vol.55，59-65(1991))。例如用上述转化法，通过用参与聚合物合成的基因表达盒转化本菌株，可以制作含有上述的pHA2S和pHA23S2等质粒的麦芽糖假丝酵母转化体。
而在上述转化体中，导入质粒pHA23S1的菌株麦芽糖假丝酵母AC16株(pHA23S1)以保藏号FERMBP-7762，导入质粒pHA23S2的菌株麦芽糖假丝酵母AC16株(pHA23S2)以保藏号FERMBP-7763，于平成13年10月3日国际寄托于位于日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。
(6)聚酯的制造在本发明的聚酯的制造方法中，从培养本发明的上述转化体后得到的培养物中提取聚酯。
就是说，本发明的聚酯可以通过将上述转化体添加到培养基后进行培养，从得到的该培养菌体或培养物中回收聚酯来制造。其中培养温度为该菌可生育的温度，15℃～40℃比较好，20℃～40℃更好，28℃～34℃最好。另外培养时间没有特别限定，例如在分批培养中约1～7日比较好，另外也可以连续培养。
培养基只要是酵母可以利用的没有特别限定。例如可以使用含有碳源、氮源、无机盐、其他有机营养源等培养基。
作为碳源只要是酵母利用吸收利用的，没有特别限定，例如可以使用碳水化合物、油脂类、脂肪酸类、n-石蜡等。作为碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、甘油等。作为油脂类，例如油菜籽油、椰子油、棕榈油、棕榈核油等。作为脂肪酸类，例如己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、油酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸等饱和和不饱和脂肪酸、或这些脂肪酸酯或盐等脂肪酸衍生物。作为n-石蜡，如十二烷、十四烷等。
另外当启动子的表达为诱导型时，可以添加适当的诱导物质(例如醇等)。有时诱导物质也是主要碳源。
举一个例子，在麦芽糖假丝酵母的培养中，也可以使用油脂类作为碳源进行培养。在不能利用油脂或利用效率不好的酵母中，也可以通过向培养基中添加脂肪酶改善。另外通过对脂肪酶基因进行转化也可以赋予利用油脂的能力。
另外，作为碳源使用含有奇数碳的碳链时，可以提高上述通式(1)表示的3-羟基烷羧酸均聚或共聚合形成的聚酯的肽链中的奇数成分的比例。
作为氮源，例如可以使用氨水、氯化铵、硫酸二铵、磷酸氢二铵等铵盐以及其它铵盐，还有胨、肉提取物、酵母提取物等。
作为无机盐，例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢镁、硫酸镁、氯化钠等。
作为其他的有机营养源，如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸等氨基酸类；维生素B1、维生素B12、生物素、尼克酰胺、泛酸、维生素C等维生素类等。
在本发明中，从菌体中回收聚酯例如可以使用下面那样的方法。培养结束后，利用离心分离器等从培养液中分离菌体，将该菌体用蒸馏水和甲醇等洗净后，使其干燥。使用氯仿等有机溶剂从干燥菌体萃取聚酯。通过过滤等从含有该聚酯的有机溶剂溶液中除去菌体成分，向该滤液中添加甲醇或己烷等弱溶剂使聚酯沉淀。通过过滤或离心分离从沉淀的聚酯中除去上清液后，进行干燥，可以回收聚酯。
在本发明中，作为生产聚酯的菌体由于使用酵母，就有可能利用上述那样的简便的分离回收方法。
另外，得到的聚酯可以通过例如气相色谱法或核磁共振法等进行分析。
本发明的聚酯的制造方法由于由上述那样的构成组成，所以可以高效地制造通式(1)表示的3-羟基烷羧酸的均聚物或共聚合物的聚酯。
另外通过使用上述质粒pHA2S等，制作含有向编码参与DNA的聚酯合成的基因附加编码过氧化物酶体靶向信号的基因，以及在酵母中起作用的启动子以及终止子的麦芽糖假丝酵母转化体，进行培养的方法，可以制作上述式(2)表示的3-羟基丁酸和式(3)表示的3-羟基己酸共聚合形成的聚酯p(3HB-co-3HH)。


图1是表示在实施例中使用质粒pUTA1作为载体的模式图。
图2是表示实施例中构建的质粒pUAL1的模式图。
图3是表示表示实施例中构建的质粒pUAL-ORF2S、pUAL-ORF2A的模式图。
图4是表示表示实施例中构建的质粒pHA2S、pHA2A的模式图。
图5是表示表示实施例中构建的质粒STKL5-ORF3S的模式图。
图6是表示表示实施例中构建的质粒pHA23S2的模式图。
图7是表示表示实施例中构建的质粒pHA23S1的模式图。
图8、图9是表示在制作本发明的转化体时使用的质粒pHA2S、pHA2A构建方法的质粒构建图。
图10、图11是表示在制作本发明的转化体时使用的质粒pHA23S2构建方法的质粒构建图。
图12是表示在制作本发明的转化体时使用的质粒pHA23S1构建方法的质粒构建图。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明再进行具体说明。但是，本发明的技术范围并不限定于这些实施例。
(实施例1)参与聚酯合成的基因的设计和合成以来自豚鼠气单孢菌的PHA合成酶和将β氧化途径中的中间产物烯酰CoA变换为作为单体的(R)-3-羟基酰基CoA的R-特异性烯酰CoA水合酶(T.Fukui，et al，FEMS Microbiology Letters，mol.170.69-75(1999))的氨基酸序列为基础，合成参与聚酯合成的酶基因。
麦芽糖假丝酵母是将CTG翻译成丝氨酸而不是亮氨酸。因此CTG并没有分配给亮氨酸密码子。与各个氨基酸相对应的密码子优先选择在麦芽糖假丝酵母中使用频率高的密码子。密码子的使用频率参考Klaus Wolf编著的NonconvendtionalYeast in Biotechnology(Springer出版)。
基因的设计如下进行。以来自豚鼠气单孢菌的PHA合成酶和将β氧化途径中的中间产物烯酰CoA变换为单体(R)-3-羟基酰基CoA的R-特异性烯酰CoA水合酶的各个氨基酸序列为基础分配与各个氨基酸对应的最适密码子。
另外，在来自豚鼠气单孢菌的PHA合成酶的DNA序列中，为了制作2个KpnI位点，将969位的T变换为C，而将1449位的T变换为C。
通过以上置换，该基因的氨基酸序列并没有变。
象上述那样设计、合成了PHA合成酶基因(ORF2)(序列5)和R-特异性烯酰CoA水合酶(ORF3)(序列6)。
(实施例2)参与聚酯合成的酶基因表达盒的构建(a)使用ALK1p、ALK5p和ALK1t时为了使ORF2、ORF3在麦芽糖假丝酵母中表达，分别在他们的5’上游连接来自麦芽糖假丝酵母的启动子，在3’下游连接终止子。对于ORF2连接ALK1基因(GenBank D00481)的启动子ALK1p(序列17)，对于ORF3连接ALK5基因(GenBank D12717)的启动子ALK5p(序列18)。3’下游都连接麦芽糖假丝酵母的ALK1基因的终止子ALK1t(序列20)。为了制作用于连接启动子和终止子以及结构基因的限制性内切酶位点，利用PCR法。序列21至序列28给出了PCR中使用的引物序列。PCR条件一个循环为94℃下1分钟、55℃2分钟、72℃3分钟，反复进行25个循环，扩增目的基因片段。聚合酶使用宝酒造公司生产的ExTaq。
ALK1p，以ALK1基因为模板，使用序列21和序列22，制作5’端为PvuII、3’端为NdeI的ALK1p。ALK5p，以ALK5基因为模板，使用序列23和序列24，制作5’端为PvuII、3’端为NdeI的ALK5p。ALK1t，以ALK1为模板，使用序列27和序列28，制作5’端为HindIII、3’端为EcoRV的ALK1t。
对于最终连接ORF2和ORF3的载体使用在pUC19(宝酒造公司生产)中连接了麦芽糖假丝酵母的自主复制序列(ARS)(GenBank D29758)和URA3基因(GenBank D12720)的pUTU 1(M.Ohkuma，etal，J.Biol.Chem.，vol.273，3948-3953(1998))和麦芽糖假丝酵母的ADE1基因(序列29)(GenBank D00855)(S.Kawai，et al，Agric.Biol.Chem.，vol.55，59-65(1991))，构建标记基因由尿嘧啶换成腺嘌呤的载体pUTA1(图1)。
然后将ALK1p连接pUCNT(WO94/03613)在PvuII、NdeI位点后构建pUCNT-ALK1p。另外将ALK1t连接在pUCNT的HindIII、SspI位点后构建pUCNT-ALK1t。用PvuII、NdeI从pUCNT-ALK1p切出ALK1p，与pUCNT-ALK1t的PvuII-NdeI位点连接，可以构建pUAL1(图2)。
为了使上述ORF2和ORF3在麦芽糖假丝酵母中表达，定向于过氧化物酶体，在各个羧基端附加了过氧化物酶体靶向信号。作为过氧化物酶体靶向信号在羧基端应当使用Ser-Lys-Leu(SKL)或Ala-Lys-Ile(AKI)的氨基酸序列。序列7至10给出了在ORF2和ORF3基因附加了这些氨基酸后得到的基因(ORF2S、ORF2A、ORF3S、ORF3A)的核苷酸序列。以ORF2的DNA为模板，使用序列11和12作为引物，可以制作ORF2S，而使用序列11和13作为引物，可以制作ORF2A。同样以ORF3的DNA为模板，使用序列14和15作为引物，可以制作ORF3S，而使用序列14和16作为引物，可以制作ORF3A。PCR的条件如上所述。
扩增的DNA用NdeI和PstI处理，ORF2S结合在pUAL1的NdeI-PstI位点后，可以构建质粒pUAL-ORF2S，同样可以构建质粒pUAL-ORF2A(图3)。ORF3S结合在pUCNT-ALK1t的NdeI-PstI位点后，可以构建质粒pUAL-ORF3S。ORF3A用与构建ORF3S同样的方法构建。
另外，使用EcoT22I将ORF2S或ORF2A连同处于上游的启动子、处于下游的终止子一起从pUAL-ORF2S或pUAL-ORF2A切出，与pUTAl的PstI位点连接，构建了pHA2S、pHA2A(图4)。
另外，用麦芽糖假丝酵母的ALK5基因(GenBank D12717)作为模板，使用序列23和24，制作了5’端为PvuII、3’端为NdeI的ALK5p(序列18)。通过将该DNA片段换成pUAL1的ALK1p，构建了pUAL5。通过用PvuI、PvuII将ALK5启动子、ALK1终止子从该质粒切出，与pSTV 28(宝酒造公司生产)的SmaI-PvuI位点连接，构建了pSTAL 5-OSF3S(图5)。
使用SalI将ORF3S连同处于上游的启动子、处于下游的终止子一起从pSTAL 5-OSF3S切出，与pHA2S的SalI位点连接，构建了pHA23S2(图6)。
(b)使用ALK1p、POX2p和ALK1t时以麦芽糖假丝酵母的POX2基因(GenBank D21228)为基础，设计序列25和序列26引物。使用这些引物，以麦芽糖假丝酵母IAM12247的基因组DNA为模板，制作了5’端为PvuII、3’端为NdeI的POX2p(序列19)。通过将该DNA片段换成pUCNT-OSF3St的lac启动子，构建了POX2-OSF3S。用SalI将ORF3S连同处于上游的启动子，处于下游的终止子一起从POX2-OSF3S切出，与pHA2S的SalI位点结合，构建了质粒pHA23S1(图7)。
图8～图12给出了整个构建图。
(实施例3)转化体的构建酵母菌培养用的试剂只要没有特别指定，可以使用从和光制药购买的试剂。而在本发明的实施中使用了许多市售的试剂盒，只要没有特别指定可以按照附带的说明书进行。
宿主是ADE1基因破坏株，使用国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的麦芽糖假丝酵母AC16株(FERM BP-7366)，分别导入作为上述本发明的基因表达盒的质粒pHA2S、pHA2A、pHA23S1、pHA23S2。将构建的质粒导入宿主的方法用电穿孔法。导入基因的装置使用BTX公司生产的ELECTRO CELL MANIPULATOR 600。小池(cuvette)使用BIO MEDICAL CORPORATION CO.LTD制造的BM6200。向100μl感受态细胞中加入1μl质粒，取100μl的制备的感受态细胞/质粒溶液注入小池内，放置到脉冲装置中。然后于静电电容40μF、电阻值246ohm、电压1.9KV的条件下，加电脉冲。脉冲后，向各个小池中加1ml的1M山梨糖醇，缓慢混合，于室温下放置1小时。导入质粒后，用选择板(0.67w/v％YeastNitrogen base without amino acid(Difco公司生产)、2w/v％葡萄糖、2w/v％琼脂)进行培养，获得转化体。在得到的转化体中，导入质粒pHA23S1株为麦芽糖假丝酵母AC16(pHA23S1)，以保藏号FERMBP-7762，导入质粒pHA23S2株为麦芽糖假丝酵母AC16(pHA23S2)，以保藏号FERMBP-7763国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。
(实施例4)使用转化体生产聚合物(a)使用导入了pHA2S或pHA2A的转化体生产聚合物象下面那样对导入了生产聚合物必需的基因的麦芽糖假丝酵母转化体进行培养。培养基使用向YNB培养基(0.67w/v％Yeast Nitrogen base withoutamino acid)添加了1w/v％酪蛋白水解酸、1v/v％十四烷的培养基。
将各个转化体甘油原液500μl接种于加入了50ml前培养基的500ml坂口烧瓶中，培养20小时，接种(10v/v)于加入了300ml生产培养基的2L坂口烧瓶中。然后于培养温度30℃、振荡速度90rpm、培养4日的条件下进行培养。通过离心分离从培养液中回收菌体，悬浮于80ml的蒸馏水中，用超高压匀浆器(APV公司生产Rannie2000 15000Psi15分钟)破碎后，进行离心分离，用甲醇对得到的沉淀物进行清洗后，进行冷冻干燥。
将得到的干燥菌体粉碎，添加100ml氯仿，搅拌过夜，进行萃取。过滤除去菌体，用蒸发仪将滤液浓缩到1-2ml，向浓缩液中添加约10ml的己烷，使聚合物P(3HB-co-3HH)析出。此时的培养结果如表1所示。
表1.使用pHA2S、pHA2A的培养结果质粒 菌体量(g/L)聚合物含量 3HH比例(mol(wt％) ％)pHA2S 6.97 3.212pHA2A 7.53 0.49 8.6(b)使用导入了pHA2S、pHA23S1、pHA23S2的转化体生产聚合物培养基使用向YNB培养基(0.67w/v％Yeast氮基不含氨基酸)添加了2v/v％十二烷或2v/v％椰子油的培养基。
培养条件除了培养天数为2天外，用上述(a)所述方法进行。聚合物P(3HB-co-3HH)的萃取也用上述(a)所述方法进行。培养结果如表2所示。
表2.使用pHA2S、pHA23S1和PHA23S2的培养结果质粒 碳源 菌体量(g/L) 聚合物含量(wt％)pHA2S 十二烷 4.895.36椰子油 5.140.95pHA23S1 十二烷 4.489.38椰子油 5.891.47pHA23S2 十二烷 5.856.15椰子油 5.581.50(比较例1)除了使用导入了通过没有附加编码过氧化物酶体靶向信号的聚酯合成酶基因构建的质粒pUTA-ORF23(WO01/88144)的转化体(菌体量10.3g/L)以外，象实施例4(a)那样进行培养。结果得到的聚合物P(3HB-co-3HH)的含量为0.1wt％。
这样一来，通过制作附加了编码过氧化物酶体靶向信号的聚酯合成酶基因，将由该酶基因和启动子以及终止子构成的表达盒导入酵母，培养得到的转化体，与使用没有附加编码过氧化物酶体靶向信号的聚酯合成酶基因情形相比，可以制造更大量的聚酯。
产业上利用的可能性通过本发明，利用酵母可以高效地制造具有生物降解特性和优良特性的通式(1)表示的3-羟基烷羧酸均聚或共聚合形成的聚酯。
序列表<110>钟渊化学工业株式会社(KANEKA CORPORATION)<120>参与聚酯合成的酶基因和使用该基因的聚酯制造方法<130>T709.SBP-6<150>JP2001-312178<151>2001-10-10<160>29<210>1<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>过氧化物酶体靶向序列<400>1Ser Lys Leu<210>2<211>3<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>过氧化物酶体靶向序列<400>2Ala Lys Ile<210>3<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>3tctaaattg9<210>4<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列
<400>4gctaaaatt 9<210>5<211>1785<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(1785)<400>5atg tct caa cca tct tat ggt cca ttg ttc gaa gct ttg gct cat tac48aat gat aaa ttg ttg gct atg gct aaa gct caa acc gaa aga act gct96caa gcc ttg ttg caa act aac ttg gat gat ttg ggt caa gtt ttg gaa144caa ggt tct caa caa cca tgg caa ttg att caa gct caa atg aat tgg192tgg caa gat caa tta aaa ttg atg caa cac act ttg tta aaa tct gct240ggt caa cca tct gaa cca gtt att act cca gaa aga tct gat aga aga288ttt aaa gct gaa gct tgg tct gaa caa cca att tat gat tac tta aaa336caa tcc tat ttg tta act gct aga cat ttg ttg gct tct gtt gat gct384ttg gaa ggt gtc cca caa aaa tct aga gaa aga ttg aga ttc ttt act432aga caa tac gtc aac gct atg gct cca tct aat ttc ttg gct act aac480cca gaa ttg tta aaa ttg act ttg gaa tcc gat ggt caa aat ttg gtt528aga ggt ttg gct tta ttg gct gaa gat ttg gaa aga tct gct gat caa576tta aac att aga ttg act gat gaa tcc gct ttt gaa tta ggt aga gat624ttg gct ttg act cca ggt aga gtt gtt caa aga act gaa tta tat gaa672tta att caa tac tct cca act act gaa acc gtt ggt aaa acc cca gtt720
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<220>
<221>CDS<222>(1)..(405)<400>6atg tct gct caa tcc ttg gaa gtt ggt caa aaa gct aga tta tct aaa48aga ttc ggt gcc gcc gaa gtt gct gct ttt gct gcc tta tct gaa gat96ttc aac cca ttg cac ttg gat cca gct ttt gct gct act acc gcc ttc144gaa aga cca atc gtc cat ggt atg ttg tta gct tct tta ttt tcc ggt192ttg ttg ggt caa caa ttg cca ggt aaa ggt tct att tat ttg ggt caa240tct tta tct ttc aaa ttg cca gtc ttt gtc ggt gat gaa gtt acc gct288gaa gtt gaa gtt act gct ttg aga gaa gat aaa cca att gct act ttg336act act aga att ttc act caa ggt ggt gct tta gct gtt acc ggt gaa384gct gtt gtc aaa ttg cca taa405<210>7<211>1794<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(1794)<400>7
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<221>CDS<222>(1)..(1794)<400>8atg tct caa cca tct tat ggt cca ttg ttc gaa gct ttg gct cat tac48aat gat aaa ttg ttg gct atg gct aaa gct caa acc gaa aga act gct96caa gcc ttg ttg caa act aac ttg gat gat ttg ggt caa gtt ttg gaa144caa ggt tct caa caa cca tgg caa ttg att caa gct caa atg aat tgg192tgg caa gat caa tta aaa ttg atg caa cac act ttg tta aaa tct gct240
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<221>CDS<222>(1)..(414)<400>9atg tct gct caa tcc ttg gaa gtt ggt caa aaa gct aga tta tct aaa48aga ttc ggt gcc gcc gaa gtt gct gct ttt gct gcc tta tct gaa gat96ttc aac cca ttg cac ttg gat cca gct ttt gct gct act acc gcc ttc144gaa aga cca atc gtc cat ggt atg ttg tta gct tct tta ttt tcc ggt192ttg ttg ggt caa caa ttg cca ggt aaa ggt tct att tat ttg ggt caa240tct tta tct ttc aaa ttg cca gtc ttt gtc ggt gat gaa gtt acc gct288gaa gtt gaa gtt act gct ttg aga gaa gat aaa cca att gct act ttg336act act aga att ttc act caa ggt ggt gct tta gct gtt acc ggt gaa384gct gtt gtc aaa ttg cca tct aaa ttg taa414
<210>10<211>414<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(414)<400>10atg tct gct caa tcc ttg gaa gtt ggt caa aaa gct aga tta tct aaa48aga ttc ggt gcc gcc gaa gtt gct gct ttt gct gcc tta tct gaa gat96ttc aac cca ttg cac ttg gat cca gct ttt gct gct act acc gcc ttc144gaa aga cca atc gtc cat ggt atg ttg tta gct tct tta ttt tcc ggt192ttg ttg ggt caa caa ttg cca ggt aaa ggt tct att tat ttg ggt caa240tct tta tct ttc aaa ttg cca gtc ttt gtc ggt gat gaa gtt acc gct288gaa gtt gaa gtt act gct ttg aga gaa gat aaa cca att gct act ttg336act act aga att ttc act caa ggt ggt gct tta gct gtt acc ggt gaa384gct gtt gtc aaa ttg cca gct aaa att taa414<210>11<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>11aattgattta gatgattatg ttgttgatgg tgtcattgct gctttggatg gtgttgaagc60cgctactggt gaaa 74<210>12<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>12atggtactgc agttacaatt tagaagcagc atcttcttcg gttg 44<210>13<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>13atggtactgc agttaaattt tagcagcagc atcttcttcg gttg 44
<210>14<211>82<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>14ttttcatatg tctgctcaat ccttggaagt tggtcaaaaa gctagattat ctaaaagatt60cggtgccgcc gaagttgctg ct 82<210>15<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>15atggtactgc agttacaatt tagatggcaa tttgacaaca gctt 44<210>16<211>44<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>16atggtactgc agttaaattt tagctggcaa tttgacaaca gctt 44<210>17<211>1017<212>DNA<213>麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)<220>
<223>ALK1启动子<400>17atgcatgaac aggatttaat cccaagaaaa aagtctattt tctattttca caaggaaact60ggaaaaacct ttttgtgttt tgaagtagct ccgtaataac ctgtaaaaaa ataaattttg120aagatttgac ttgctgatga aaatgctatc agtgtagctc tagacttgat actagactat180gatggcaaca catggtggtc aacgtgcaag acatcaccca atgagaagac tgctaaccag240aaaaaaaagg ggacaaaaga aaaactcgag agaaaaagtc aaattggtgt aaaattggct300atttttggta ctttcctaat ggggaaatta attgtttaaa attccagttt ttccagagtt360aagatttcga ccaattattt ttaatccata tgatcttcat cattatcaac ttgtgaaaaa420taataatcga ggtacgttta atacgagata ttagtctacg gctatgaatg ttggatatac480ttcattgacg atcagaagct tgattggtta ttcaggtgca tgtgtggata taaacccaac540aaattatcta gcaactgtgc cttccccaca ttggtcaaag aaaccctaaa gcaaattaaa600atctggataa ataaatcatt catttcacat tttccggtta gtataaggtt ttttaaattt660
ttttttacag tttagccctt tcaattacca aatacggtaa caatgtgctt tgtaacatgc720aggggatttt ctccgttgct gttttctcca catgctttta atgtgtaata aattaaaaaa780attacaaaga aaaaccggca tataagcatc ggagtttaca ttgttaacta actgcaaaat840ggcgatgttt caaatcaaca aaatttaaaa aaaccccaaa aaaaaagtat catataaatt900aaactcaaaa tccttttgat tgcataaaat ttttaaatct cttctttttt ttctttttta960ctttcttatc tattctattc tttttttata tatctaattc atttataaca tctggtc 1017<210>18<211>750<212>DNA<213>麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)<220>
<223>ALK5启动子<400>18aagcttcaca tggatcaatt gcgtttgtca catgtggtca tccagctatg gttgatgagg60ttagatattt tacttgtaag aatattaaca acccagaaaa gaaaagagtt gatttctttg120aacaagtgca agtctgggct tagacgttta tttttgtttt tgttgagtgg taatacatat180tcttcgtatc tatgaagatt tttcacacgc ggatagtaat tgtactagcc gcttctttaa240gtaactgatt tacccaacaa gtacatggta atacaaactc tcactcacta gacttcgctt300ctagttgctt caaattagac ggttataatg tatgccaagg ttttgtgtaa tttcacggtg360attaaccttt tccccttttt atactcctca ttatccacga tgtaatctga tctatgaacg420tgataagtaa cattacttag tcattaagta tggccaattc agttatacat attagtaatg480ctccacatcc attgtattca tatgtaatgc caaatatcac attcatttac acagaatcgg540ttttgttaaa tactccgcta ttgtacagca acaataggat tatgtacaga atgaaaaaca600aaaggcggag aaattcgacg gaaaaattta ttatttacaa atcgtattcc cgcattatct660ataaaacaga ttcaaaataa tctagatctc ttttttttgc ttccttttat ttctttttaa720
ataagattaa actaaaaata tgattgatga 750<210>19<211>444<212>DNA<213>麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)<220>
<223>POX2启动子<400>19atcaatagat agagggaact acaattgttc tatttctctt ggaagtcgct ttttttaaca60gatagttgtg caaacttttg ttttgaaaag tagtgcaaag acgaaaaatt cgcacaaaaa120tttcctaatt gggccaaact tctatggggg acagtccgga atgaggaaaa tgcacttata180cttttttttt ttcatccaca aagaaaaaaa aaggcggggc agctgaaaat gaaaaaaagc240gggtttctat acacaaccgt ggggatgaaa attcaagcat caacaatagc tagtttaata300tttaaaaata ctgatatccc ccttataaat aacttttgat tcaatttctt ttcttcttct360tctttttttt ttatttttca agtctccata ctttttctct ttttttttta tatttatttc420ttatttatct atacttaact cacc 444<210>20<211>218<212>DNA<213>麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)<220>
<223>ALK1 Terminator
<400>20atagatggat ttttcttttt tatgtgtatt tccggttaat aaatgtttaa attttttttt60taataaaaat atttgtagtt atttatatgc aaaaaaaaaa aatattcaaa gcaatcttcc120tttctttctt tatctttccc ccatgctaag gtctaaaaca ccacaactta aaacccaact180taaccgtata atactaagat caatctccaa agatgcat218<210>21<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>21tttttcagct ggagctcgtc gacatgcatg aacaggattt aatccc 46<210>22<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>22
ccggaatcca tatgaccaga tgttataaat gaattagata40<210>23<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>23tttttcagct gctcgaggtc gacatgcatc acatggatca attgcgttt 49<210>24<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>24ccggaattcc atatgtttag tttaatctta tttaa 35<210>25<211>43
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>25ttttcccggg gtcgacatgc atatcaatag atagagggaa cta43<210>26<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>26tttttcatat ggtgagttaa gtatagataa a 31<210>27<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>27cggaagctta tagatggatt tttctttttt at 32<210>28<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>28tttttgatat cgagctcgtc gacatgcatc tttggagatt gatctt 46<210>29<211>1820<212>DNA<213>麦芽糖假丝酵母(Candida mltosa)<220>
<221>CDS<222>(538)..(1413)<400>29gatccccttc ttcaaacctt taaatgacat tgtttcgttt ctctatgttt ggtatcggtt60cttcttcttc ttcaaaaaaa aggggggcac tattcaaaaa aaaatattat aacagtatga120
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权利要求
1.一种可在酵母中表达的基因，其是通过在编码参与聚酯合成的酶基因上附加编码过氧化物酶体靶向信号的DNA而得到的。
2.根据权利要求1所述的基因，其中过氧化物酶体靶向信号包含序列1或2表示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的基因，其中编码过氧化物酶体靶向信号的DNA核苷酸序列具有序列3或4表示的序列。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的基因，其中参与聚酯合成的酶是来自细菌的酶。
5.根据权利要求4所述的基因，其中细菌是豚鼠气单孢菌。
6.根据权利要求4或5所述的基因，其特征是来自细菌酶基因的至少一个遗传密码子CTG可以变换为TTA、TTG、CTT、CTC或CTA。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的基因，其中参与聚酯合成的酶是聚羟基烷羧酸合成酶或R-特异性烯酰CoA水合酶。
8.根据权利要求7所述的基因，其中编码聚羟基烷羧酸合成酶的基因包含序列5表示的核苷酸序列。
9.根据权利要求7所述的基因，其中编码R-特异性烯酰CoA水合酶的基因包含序列6表示的核苷酸序列。
10.权利要求8所述的基因，其包含由序列7或8序列表示的核苷酸序列。
11.权利要求9所述的基因，其包含由序列9或10序列表示的核苷酸序列。
12.一种酶，是由权利要求1～11任一项所述的基因翻译的参与聚酯合成的酶。
13.一种转化体，其是至少一种由权利要求1～11任一项所述基因被转化入到酵母中得到的。
14.一种转化体，其是由参与聚酯合成的酶基因表达盒被导入到酵母中得到的，所述盒包含至少一种由权利要求1～11任一项所述的基因和在酵母中起作用的启动子和终止子。
15.根据权利要求14所述的转化体，其中启动子和终止子来自麦芽糖假丝酵母。
16.根据权利要求14或15所述的转化体，其中启动子来自麦芽糖假丝酵母ALK1、ALK5或POX2。
17.根据权利要求14-16任一项所述的转化体，其中终止子来自麦芽糖假丝酵母ALK1。
18.根据权利要求13或17所述的转化体，其中酵母是下列属中的任一种针芽孢酵母属，神食酵母属，节囊酵母属，Arxiozyma属，Ashbya属，Babjevia属，Bensingtonia属，Botryoascus属，Botryozyma属，酒香酵母属，布勒弹孢酵母属，Bulleromyces属，假丝酵母属，固囊酵母属，棒孢酵母属，隐球酵母属，Cystofilobasidium属，德巴利酵母属，德克酵母属，Dipodascopsis属，Dipodascus属，爱尼拉酵母属，拟内孢霉属，Eremascus属，Eremothecium属，Erythrobasidium属，Fellomyces属，线黑粉菌属，Galactomyces属，地霉属，小季酵母属，有孢汉逊酵母属，Hansenula属，Hasegawaea属，Holtermannia属，连锁酵母属，Hyphopichia属，伊萨酵母属，克勒克酵母属，Kloeckeraspora属，克鲁维酵母属，Kondoa属，Kuraichia属，Kurtzmanomyces属，白色冬孢酵母属，油脂酵母属，类德酵母属，Malassezia属，酶奇酵母属，Mrakia属，Myxozyma属，纳逊酵母属，Nakazawaea属，针孢酵母属，Ogataea属，卵孢酵母属，管囊酵母属，厚壁孢酵母属，范菲亚酵母属，毕赤酵母属，红色冬孢酵母属，红酵母属，酵母属，类酵母属，复膜孢子酵母属，Saitoella属，Sakaguchia属，Satumospora属，裂芽酵母属，裂殖酵母属，许旺氏酵母属，锁合掷孢酵母属，掷孢酵母属，孢皮肥厚酵母属，冠囊酵母属，梗孢酵母属，拟梗孢酵母属，Symbiotaphrina属，合轴酵母属，Sympodiomycopsis属，有孢圆酵母属，Trichopsporiella属，丝孢酵母属，三角酵母属，Tsuchiyaea属，Udeniomyces属，Waltomyces属，威克酵母属，拟成克酵母属，拟威尔酵母属，Yamadazyma属，耶罗威亚酵母属，Zygoascus属，接合酵母属，Zygowilliopsis属，Zygozyma属等。
19.根据权利要求18所示的转化体，其中酵母是假丝酵母属或耶罗威亚酵母属。
20.根据权利要求19所示的转化体，其中酵母是麦芽糖假丝酵母。
21.根据权利要求13～20任一项所述的转化体，其中聚酯是下列通式(1)表示的3-羟基烷羧酸均聚物或共聚物 其中，R代表烷基。
22.根据权利要求13～21任一项所述的转化体，其中聚酯是由下列通式(2)表示的3-羟基丁酸和由下式(3)表示的3-羟基己酸共聚合形成的共聚合聚酯P(3HB-co-3HH)。
23.一种聚酯的制造方法，是使用权利要求13～22任一项所述的转化体的聚酯的制造方法，其包含培养上述转化体，并从得到的培养物回收产物聚酯。
全文摘要
本发明涉及到以酵母为宿主的制造具有生物降解特性和优良特性的3－羟基烷羧酸均聚或共聚合形成的聚酯的制造方法。构建参与聚酯合成的一或多个酶基因，每一基因具有编码过氧化物靶向信号的DNA添加其上，将酶基因表达盒式结构转移进入酵母。培养如此得到的转化体以在细胞内积累由3－羟基烷羧酸或共聚合形成的聚酯。然后，从所述培养物收集聚酯。
文档编号C07K14/37GK1564868SQ0281988
公开日2005年1月12日 申请日期2002年10月9日 优先权日2001年10月10日
发明者横沟聪, 福地健, 小坂田史雄, 松本圭司, 高木正道, 太田明德 申请人:钟渊化学工业株式会社