专利名称：用作甲酰化肽受体样1受体的配体的组合物及其用法的制作方法
技术领域：
本发明涉及用作甲酰化肽受体样(Formyl Peptide Receptor Like 1)1受体的配体的组合物及其用法。
背景趋化因子(趋化细胞因子)是负责募集和激活T淋巴细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞，以及标记病原体战场(battlegrounds)的信号分子。负责抗击侵染的淋巴细胞和白细胞的募集依赖于趋化因子的变化度(gradient)。趋化因子是一类调节多种生物学过程，包括淋巴细胞运输和回巢(homing)、免疫调节、血细胞生成和血管生成的小蛋白质(8-10KD)超家族。迄今为止，已知有24种趋化因子受体。趋化因子在天然免疫和炎症反应中行使重要作用(Baggiolini等(1994)；Baggiolini等(1997)；Rollins(1997))。已对趋化因子的四个亚家族进行了描述，其分类基于最初的两个保守半胱氨酸残基C、CC、CXC和CX3C之间的距离。所有已知的趋化因子均通过四组7次跨膜受体来传送信号，这些受体属于G蛋白偶联受体和百日咳毒素敏感型的Gi家族异源三聚体G蛋白XCR、CCR、CXCR和CX3CR(Murphy等(2000))。细胞外的结合事件能够激活特异性信号转导通路，这些信号转导通路可介导不同应答，例如趋化因子的应答。在趋化因子系统中，多种趋化因子可激活单一的趋化因子受体；例如，受体CCR1可结合RANTES(通过活化调控，在正常T细胞中表达)、MIP-1α(单核细胞炎症蛋白)和MIP-1α趋化因子。同样，一种单一的趋化因子也可以激活多种受体(Mantovani(1999))。
在炎症发病机制和抗原表达中行使重要作用的单核细胞和嗜中性粒细胞可响应趋化因子(Lee等(2000))。单核细胞可表达趋化因子受体CCR1、CCR2、CCR5、CCR8、CXCR2和CXCR4(Uguccioni等(1995)；Weber等(2000))。已报导，配体MIP-1和单核细胞趋化因子蛋白1(MCP1)可在体外作为有效的单核细胞激活物(Fantuzzi等(1999))。嗜中性粒细胞在很多急性炎症反应中是至关重要的，并可能还在对TH1的定向免疫应答中行使功能(Bonecchi等(1999))。其主要应答一些CXC趋化因子而不迁徙到大部分CC趋化因子。人嗜中性粒细胞表达两种高亲和力的IL-8受体，CXCR1和CXCR2。
趋化因子CKβ8，也被称为CCL23、hmrp-2a、淀粉样起源物抑制因子1(MPIF-1)或SCYA23(最新命名法和Genome ID系统)，是一种含有6个半胱氨酸的99个氨基酸的CC趋化因子。其在肝、肺、胰腺和骨髓中组成性表达。CKβ8对单核细胞、树突状细胞和休眠淋巴细胞具有趋化活性(Forssmann等(1997))，并抑制骨髓所衍生的低增殖的潜在集落生长细胞的集落形成(Patel等(1997))。CKβ8-1，一种来源于CKβ8的长度为116个氨基酸的可变剪接物，已被报导。已确定CKβ8和成熟型CKβ8-1可作为CCR1受体的配体(Youn等(1998))。在单核细胞和嗜酸性粒细胞中进行的交叉脱敏研究证实CKβ8-1优先结合CCR1。对CKβ8氨基端进一步处理而形成的76个残基或75个残基的蛋白对表达CCR1的细胞具有更为显著的活性(Macphere等(1998)，Berkhout等(2000))。
另外对于趋化因子受体来说，嗜中性粒细胞和单核细胞还表达G蛋白偶联的N-甲酰化肽受体(FPR)和其同源物N-甲酰化肽1样受体(FPRL1)。由于在最初克隆FPRL1时其配体未知，因此FPRL1起初被定义为一种孤儿受体(Bao等(1992)；Murphy等(1992)；Ye等(1992))。由于可结合脂氧素(lipoxin)A4，其被定义为一种LXA4受体(Fiore等(1994))。另外，一些不同的肽或蛋白被报导可低亲和性地结合FPRL1(见
图1)。血清淀粉样A，一种在炎症急性相时分泌的蛋白，被报导可作为一种中亲和力的功能配体(Su等(1999))。一种β淀粉样片段(1-42)和神经毒剂朊蛋白肽106-126也是低亲和力配体，这暗示FPRL1可能在神经退行性疾病中行使功能(Le等(2001))。其它一些低亲和力配体包括HIV包被蛋白衍生肽(Su等(1999)，Deng等(1999))和一种幽门螺杆菌肽Hp(2-20)。已经报导，一些合成肽，例如Trp-Lys-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(WKYMVm)和Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Met-NH2(WKYMVM)(“W肽1和2”)，可作为该受体的潜在配体(Christophe等(2001)；Baek等(1996))。但是，这些来源于随机6肽库的非天然存在的肽并未显示出生理上的相关性。
发明概述发明人发现CKβ8-1的截短变异体，CKβ8-1(25-116)，可通过其作为甲酰化肽受体样1受体(FPRL1)的功能配体的作用参与炎症反应和天然免疫。另外，发明人发现CKβ8-1的一种可变(alternatively)剪接外显子，命名为SHAAGtide，和SHAAGtide的截短变异体和其它变异体，随同CKβ8-1(25-116)，对已知表达FPRL1的细胞均具有功能。功能性SHAAGtide在白细胞中的受体配体结合时形成钙流，并吸引单核细胞、嗜中性粒细胞、成熟树突状细胞(mDCs)和未成熟树突状细胞(iDCs)。
在一个实施方案中，除CKβ8-1(25-116)之外，本发明包括SHAAGtide和包含SHAAGtide的蛋白和肽。另外，本发明还包括编码SHAAGtide的核酸、编码含有SHAAGtide的蛋白和肽的核酸、特异性结合SHAAGtide的抗体，以及包含SHAAGtide的融合蛋白。
在另一个实施方案中，本发明包括含有SHAAGtide或含有包含SHAAGtide序列的蛋白或肽的组合物。这些组合物包括那些适于对患者进行给药以增强FPRL1活性的组合物。
在另一个实施方案中，本发明包括含有上述组合物的试剂盒。可组合这些试剂盒以促进施用，例如药用组合物。
在另一方面，本发明包括对患者进行治疗的方法，该方法包括将含有SHAAGtide化合物，或含有包含SHAAGtide序列的蛋白或肽的化合物进行给药，以调节FPRL1受体的活性。
在另一方面，本发明包括可用于鉴定拮抗剂的方法和试剂盒。这些方法包括，在候选拮抗剂分子存在条件下，将FPRL1受体与含有生物活性SHAAGtide，或含有SHAAGtide序列的蛋白或肽的组合物相接触的步骤。当与不存在候选化合物时观察到的结果相比，化合物降低了受体活性，则可确定拮抗剂对FPRL1受体的功能。
附图简述图1表中显示已报导的FPRL1内源性低亲和力配体和非天然配体。
图2图中显示人CCL23/CKβ8变异体与人CCL15/MIP-1α和CCL3/MIP-1δ的氨基酸序列比对。
发明详述本发明人发现一种CKβ8-1的截短变异体，CKβ8-1(25-116)，该变异体是两种不同的GPCRs趋化因子受体CCR1和甲酰化肽1样受体(FPRF1)的一种双功能配体。本发明人还发现，除了作为CCR1的配体的活性外，CKβ8-1(25-116)还可通过其作为FPRL1的一种功能性配体的作用，募集单核细胞和嗜中性粒细胞参与炎症反应和免疫。CKβ8通过CCR1吸引包括单核细胞、树突状细胞以及休眠淋巴细胞等细胞，但缺乏在CKβ8-1(25-116)中存在的可变剪接外显子(SHAAGtide序列)。CKβ8的可变剪接形式CKβ8-1(1-116)(116个氨基酸)，即CKβ8，是CCR1受体的一种功能性配体。但是，CKβ8-1(1-116)不通过SHAAGtide序列行使其功能。
本发明人还发现一类新肽(SHAAGtide肽和SHAAGtide肽的变异体-下文中通称为SHAAGtide肽)，CC趋化因子CCL23剪接外显子的截断变异体CKβ8-1(25-116)，其是FPRL1受体极为有效和有价值的配体。这些肽在表达FPRL1的淋巴细胞中产生钙流。另外，SHAAGtide可有效地吸引包括单核细胞、嗜中性粒细胞、成熟树突状细胞(mDCs)以及未成熟树突状细胞(iDCs)和其它淋巴细胞亚群。SHAAGtide肽(SEQ ID NO1)和某些SHAAGtide的变异体，与其亲本趋化因子CKβ8-1(25-116)一起，对已知可表达FPRL1的单核细胞和嗜中性粒细胞都具有功能。功能性SHAAGtide通过淋巴细胞内的受体配体结合产生钙流，并在趋化试验中吸引单核细胞、嗜中性粒细胞、成熟树突状细胞(mDCs)以及未成熟树突状细胞(iDCs)。因此，依据这些观察结果，SHAAGtide是令人惊讶的可作为FPRL1配体的潜在功能肽。
除CKβ8-1(25-116)和CKβ8-1(1-116)之外，本发明还包括SHAAGtide和含有SHAAGtide的蛋白和肽。另外，本发明还包括编码SHAAGtide的核酸，以及编码除CKβ8-1(25-116)和CKβ8-1(1-116)之外含有SHAAGtide的蛋白和肽的核酸。包含SHAAGtide的组合物，以及包含含有SHAAGtide的蛋白和肽，包括CKβ8-1(25-116)，的组合物，也同样包含于本发明中。含有上述物质的组合物适用于对患者进行给药以增强FPRL1的活性。本发明还包括含有上述组合物的试剂盒。这些试剂盒可组合以促进给药，例如，药用组合物的给药。
本发明还包括对需要刺激炎症反应和天然免疫的患者进行治疗的方法。刺激这些活性对遭受病痛，例如传染性疾病(同样也可在接种中，描述于共同待审专利申请“刺激一种免疫应答的方法和组合物”，2002年5月7日提交-代理人参考号10709/23)的患者是有益的。该方法包括将含有一种SHAAGtide、含有包含一种SHAAGtide的一种蛋白或肽，或含有其它的刺激分子的组合物进行给药，以刺激FPRL1受体。
本发明还包括对需要下调炎症反应和天然免疫的患者进行治疗的方法。下调这些活性对遭受病痛，包括神经退行性疾病，例如阿尔茨海默症或克雅氏病，的患者是有益的。该方法包括将含有一种FPRL1受体功能的拮抗剂进行给药以下调FPRL1受体。
本发明还包括用于鉴定这些拮抗剂的方法和试剂盒。该方法包括将一种含有生物活性的SHAAGtide序列，或含有包含活性SHAAGtide的一种肽或蛋白的组合物，在存在一种备选拮抗剂分子的情况下与一种FPRL1受体相接触的步骤。当这些混合物存在时受体活性较不存在候选组合物时有所降低，则可确定FPRL1受体拮抗剂的功能。该方法可在体外或体内执行，另外，可组合试剂盒以促进体外测试或体内测试。
SHAAGtide和包含SHAAGtide的分子SHAAGtide肽和包含SHAAGtide的多肽表1显示SHAAGtide多肽序列(SEQ ID NO1)和某些SHAAGtide截短变异体和其它变异体的多肽序列。表2显示SHAAGtide多核苷酸序列(SEQ ID NO2)和SHAAGtide截短变异体和其它变异体的多核苷酸序列。表3显示人CKβ8-1(25-116)核苷酸序列(SEQ IDNO20)。图2显示人CCL23/CKβ8变异体(CKβ(1-99)-SEQ IDNO13；CKβ(25-99)-SEQ ID NO14；CKβ(1-116)-SEQ ID NO15；CKβ(25-116)-SEQ ID NO16)与人CCL15/MIP-1α(SEQ ID NO19)、CCL3/MIP-1δ(SEQ ID NO17)以及Leukotactin(SEQ ID NO18)的氨基酸序列比对。四个保守的半胱氨酸残基显示在方框内，而通常不出现在CC趋化因子家族中的另两个半胱氨酸残基显示在虚线方框内。CCL23/CKβ8-1的可变剪接的外显子以下划线表示。
表1 SHAAGtide与其不同的截短变异体和其它变异体的氨基酸序列
表2 SHAAGtide与其不同的截短变异体和其它变异体的多核苷酸序列
表3 人CKβ8-1(25-116)核苷酸序列(SEQ ID NO12)
SHAAGtide分子、衍生物和类似物本发明的SHAAGtide肽包括表1中所列的分子。另外，可通过常规方法合成多种其它的SHAAGtide肽和核苷酸的衍生物。衍生物的核酸序列或氨基酸序列由天然化合物中直接获得，也可由修饰过的天然化合物或经部分替代的天然化合物中获得。类似物同天然化合物具有核酸序列或氨基酸序列上的结构相似性，但与之不完全相同，就某些成分或侧链而言有所差异。类似物可以被合成或由一种不同的进化源获得。
衍生物和类似物可以是全长，如果衍生物或类似物含有一种修饰核酸或修饰氨基酸，其也可以不同于全长。例如，SEQ ID NO3只含有SHAAGtide分子(SEQ ID NO1)的氨基端最初15个氨基酸。SHAAGtide核酸或肽的衍生物或类似物包含，但不局限于，含有与SHAAGtide核酸或肽基本同源的区域的分子，该区域与同样大小的一种核酸序列或氨基酸序列至少有大约70％、80％或95％同一性，或含有在以一种同一性运算法则进行的比对中可喻为对准序列的区域的分子，或含有其编码的核酸可与一种编码上述肽序列的互补核酸序列在严格条件下、适度严格条件或低严格条件下进行杂交的区域的分子(Ausubel等，1987)。互补核酸分子是一种能够同一种序列充分互补，该序列以低错配形式与尼龙结合，形成稳定的双链。“互补”涉及核酸间的Watson-Crick碱基配对或Hoogsteen碱基配对。
通过反应条件的“严格性”确定单链DNA对杂交互补片段的特异性。杂交严格性的提高与DNA双链形成减少的倾向同步。在核酸杂交反应中，可选择严格性以促进特异性杂交(高严格性)，这可以用于鉴定，例如，来源于库的全长克隆。低严格性杂交(低严格性)也可用于相关的DNA分子(同源的，但非相同的)或片段的鉴定，但不够精确。
DNA双链的稳定性依据(1)互补碱基对的数目，(2)碱基对的类型，(3)反应体系的盐浓度(离子强度)，(4)反应的温度，以及(5)某种有机溶剂的存在，例如可降低DNA双链稳定性的甲酰胺。通常，正确的退火要求较长的探针和较高的温度。一种通常的方法是改变温度高反应温度导致更为严格的反应条件(Ausubel等，1987)为杂交反应的严格性提供了一种较好的解释。
“严格条件”下的杂交是指可使相互间至少具有60％同一性的核苷酸序列保持杂交态的杂交方案。通常，所选的严格条件是在一种规定的离子强度和PH下，大约低于具体序列的热溶解点(Tm)5℃。Tm是指在该条件下50％的与靶序列互补的探针可与靶序列以平衡状态杂交的温度(在定义的离子强度、PH以及核酸浓度下)。由于靶序列通常是过量的，在Tm时，50％的探针以平衡状态被占据。
“严格杂交条件”可使探针、引物或寡核苷酸仅对其靶序列进行杂交。严格条件是序列依赖性的，并可以变化。严格条件包括(1)低离子强度和高温洗涤(例如50℃下1.5mM氯化钠，1.5mM柠檬酸钠，0.1％SDS)；(2)杂交中的变性剂(例如42℃下50％(v/v)甲酰胺，0.1％牛血清白蛋白，0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，50mM磷酸钠缓冲液(PH6.5)，750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠)；或(3)50％甲酰胺。典型的洗涤还包含于5x SSC(0.75M NaCl，75mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(PH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x Denhardt’s溶液、经超声的鲑鱼精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS以及10％葡聚糖硫酸酯中在42℃下杂交，以0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)在42℃下和以50％甲酰胺在55℃下进行洗涤，接着在55℃下以由一种含有EDTA的0.1x SSC所组成的高严格性洗涤剂洗涤。优选的条件是，相互间具有大约65％、70％、75％、85％、90％、95％、98％以及99％同一性的序列可在此条件下保持相互间的杂交状态。上述条件仅作为例证列出，而不意味仅限于此。
“中等严格条件”使用的洗涤液和杂交条件是低严格性的(Sambrook，1989)，这使得一种多核苷酸可与SEQ ID NOS7-12，14的整体、片段、变异体以及类似物进行杂交。一个例证包括在6xSSC、5x Denhardt’s溶液、0.5％SDS和100mg/ml变性的鲑鱼精DNA于55℃进行杂交，接着在1x SSC，0.1％SDS中于37℃进行一次或多次洗涤。可调节温度、离子强度等以适应实验因素，例如探针长度。其它的中等严格条件也已被描述(Ausubel等，1987；Kriegler，1990)。
“低严格条件”使用的洗涤液和杂交条件的严格性低于中等严格条件(Sambrook，1989)，这使得一种多核苷酸可与SEQ ID NOS7-12，14的整体、片段、变异体以及类似物进行杂交。低严格条件杂交的非局限性的例证是，在35％甲酰胺、5x SSC、50mM Tris-HCl(PH7.5)、5mM EDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100mg/ml变性的鲑鱼精DNA和10％(wt/vol)葡聚糖硫酸酯中于40℃进行杂交，接着在2x SSC、25mM Tris-HCl(PH7.4)、5mM EDTA以及0.1％SDS中于50℃进行一次或多次洗涤。其它的低严格条件，例如杂交物种(cross-species)杂交所用条件已被详尽地描述(Ausubel等，1987；Kriegler，1990；Shilo和Weinberg，1981)。
另外对SHAAGtide天然存在的等位基因变异体来说，可通过突变将改变引入到SEQ ID NO1中，这导致所编码的SHAAGtide的氨基酸序列出现变化，但对SHAAGtide的功能没有显著的改变。例如，已在SEQ ID NO6序列中，将羧端氨基酸残基以一种氨基酸来替代。“非必需”氨基酸残基是一种可与来自SHAAGtide野生型序列的等位残基不同，但不改变SHAAGtide生物学活性的氨基酸残基，而“必需”氨基酸残基是上述生物学活性所必需的氨基酸残基。例如，本发明SHAAGtide中的保守氨基酸残基被预测为是特别不易于改变的。可制备的用做保守替代物的氨基酸已为本领域所熟知。
有效的保守替代物在表4“优选替代物”中显示。借助一类氨基酸中的一种氨基酸为同类的其它氨基酸所取代的保守替代，只要此替代不根本上的改变化合物的生物学活性，即适用于本发明的范畴。
表4 优选替代
非保守替代可影响(1)多肽链结构，例如一种β-折叠或α-螺旋构象，(2)电荷，(3)疏水性，或(4)靶位点侧链体积，从而改变SHAAGtide的功能，特别是当SHAAGtide序列包含少量较大多肽分子时。基于图5中所示的常规侧链性质将残基进行分组。非保守替代物使得这些类型中的一组大量为其它类型所替代。替代物可以被引入保守替代位点，或者更优选地被引入非保守位点。
表5 氨基酸类型
可适用本领域熟知的方法，例如寡核苷酸介导(定点)诱变、丙氨酸扫描术以及PCR诱变来制备变异体多肽。定点诱变(Carter，1986；Zoller和Smith，1987)、盒诱变、限制性选择诱变(Wells等，1985)或其它已知技术可应用于已克隆DNA以生产SHAAGtide变异体DNA(Ausubel等，Sambrook，1989)。
本发明的一种已“分离”的SHAAGtide或已“纯化”的SHAAGtide包含多肽、蛋白或生物活性分割片段和(或)由其自然环境的一种组分中回收的片段。分离的SHAAGtide包含在基因工程细胞中异源表达的上述物质或在体外表达的上述物质。
污染物组分包含典型地干扰上述多肽的诊断性应用和治疗性应用的物质。为进行稳定分离，制剂所含的非SHAAGtide污染物质(污染物)应少于制剂干重的30％，更优选的是少于20％，10％，而最优选的是含有的污染物少于5％。
目的多肽和片段可通过本领域所熟知的任何方法，例如通过诸如细菌、病毒和真核细胞的载体进行生产。另外还可应用体外系统，例如肽系统。
一种“活性多肽或多肽片段”可保持类似于图1中所示SHAAGtide的生物活性和(或)免疫活性，但不必一致。在上下文中对多肽本质的相关讨论中认为，SHAAGtide的免疫活性，而不是某种急性生物学功能，在其诱导和增强FPRL1的活性时行使作用，这一观点是基于一种抗SHAAGtide抗原性表位的特异性抗体与SHAAGtide相结合的特性。该生物活性涉及一种由天然SHAAGtide多肽所导致的功能，此作用既可以是抑制性的，也可以是刺激性的。SHAAGtide多肽的生物活性包括，例如，结合FPRL1受体，或通过FPRL1受体结合来趋化或诱导钙流。剂量依赖或非剂量依赖的特定生物学分析(见实施例)可用来鉴定SHAAGtide的活性。编码SHAAGtide生物活性部分的核酸片段可通过分离一种编码含有SHAAGtide生物活性的多肽的多核苷酸序列来进行制备，以用来表达SHAAGtide的编码部分(例如，通过体外重组表达)和评价SHAAGtide多肽编码部分的活性。
通常，SHAAGtide多肽的变异体具有SHAAGtide多肽类似功能，其包含序列上特定位点上残基为其它氨基酸所替代的任何变异，还包括额外残基插入的可能性或在亲本的两个残基间插入残基的可能性，以及由亲本序列上删除一个或多个残基的可能性。本发明包括任何氨基酸的的替代、插入或删除。作为有利情况，替代是一种如下文所述的保守性替代方式。
表1显示在SHAAGtide序列的羧端的氨基酸删除较在氨基端的氨基酸删除可能会较少引起FPRL1活性的丧失(见实施例9)。例如，SEQ ID NO8，包含SHAAGtide序列11个氨基端的氨基酸，仍保持中等程度的FPRL1活性。而在删除了3个氨基端的氨基酸后(SEQID NO2)仅具有低的活性。但是，删除氨基端的氨基酸(SEQ IDNO11)并不会导致FPRL1活性的完全丧失。
“SHAAGtide变异体”代表一种活性SHAAGtide多肽，其至少具有(1)同天然SHAAGtide多肽的全长序列具有大约80％的氨基酸序列同一性(identity)或(2)全长SHAAGtide多肽的任何片段。例如，SHAAGtide多肽变异体包括在其全长天然氨基酸序列上的羧端或氨基端上添加或删除一个或多个氨基酸残基的SHAAGtide多肽，但不包括与CKβ8和CKβ8-1相同的片段。一种SHAAGtide多肽变异体与全长的SHAAGtide多肽天然序列相比应具有至少大约80％的氨基酸序列同一性，优选的是至少81％的氨基酸序列同一性，更优选的是为至少82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％的氨基酸序列同一性，最优选的是具有99％的氨基酸序列同一性。一般情况，SHAAGtide多肽变异体的长度至少为大约10个氨基酸，通常至少为大约20个氨基酸，更通常的是至少大约30、40、50、60、70、80、90、100、150、200或300个氨基酸，或者更多。
“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在将SHAAGtide同候选序列进行比对时，二者中氨基酸残基相似度的百分比。将序列进行比对以鉴定氨基酸同一性的百分比，如有可能，可引入空位(gap)以实现序列同一性的最高百分比；保守性替代不作为序列比对的一部分进行考虑。用来鉴定序列同一性的氨基酸序列比对步骤为本领域的技术人员所熟知。通常，可试验公开的适宜软件，例如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)来进行肽序列比对。
当进行氨基酸序列比对时，一种指定的氨基酸序列A与或对一种指定的氨基酸序列B(也可以描述为一种指定的氨基酸序列A，此处序列A具有或包含一种特定的与或对指定的氨基酸序列B的氨基酸同一性百分比)的氨基酸序列同一性百分比可以按如下计算氨基酸序列同一性百分比＝X/Y*100其中，X是指在序列比对程序或运算法则下进行的A和B的比对结果中，作为同一性匹配得分的氨基酸残基的数目，Y是指B中的氨基酸残基的总数。
如果氨基酸序列A的长度同氨基酸序列B的长度不相等，A对B的氨基酸序列同一性百分比将不同于B对A的氨基酸序列同一性百分比。
融合多肽可有效地用于表达研究、细胞定位、生物分析以及SHAAGtide的纯化。一种SHAAGtide的“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含融合于一种非SHAAGtide多肽的SHAAGtide。非SHAAGtide多肽与SHAAGtide多肽非充分同源。一种SHAAGtide融合蛋白可包括全长SHAAGtide多肽的任何部分，还可包括许多生物活性部分。例如，SHAAGtide可被融合入GST(谷胱甘肽S-转移酶)序列的羧端。这些融合蛋白适用于重组SHAAGtide的纯化。在某些宿主细胞，(例如哺乳动物)，异源信号序列融合物可能会改善SHAAGtide的表达和(或)分泌。
本发明还包括抗SHAAGtide序列和SHAAGtide变异体序列的特异性抗体。生产多克隆抗体和单克隆抗体的方法，包括将片段(例如F(ab)2)与单链相结合，已众所周知。由此，可通过经典技术制备多克隆抗体和单克隆抗体。
本发明的趋化(chemotactic)组合物包含一种或多种含有SHAAGtide序列的多核苷酸或多肽。在一个实施方案中，组合物包含一种独立的或重组的多核苷酸或多肽。在一个实施方案中，在组合物中，SHAAGtide是在同类中(例如多肽、多核苷酸、脂以及碳水化合物)占主导地位的种类(例如，高于组合物中同类分子的质量总体数目的大约50％，更通常的是高于大约80％)。本发明的趋化组合物所包含的SHAAGtide排除了在原位环境中通常与之相关的物质(如果存在的话)。
分离的SHAAGtide核酸是从其天然的环境(setting)中纯化的，并与至少一种污染核酸分子相分离。由于其存在于细胞，因此分离的SHAAGtide分子可与特定的SHAAGtide分子相区分。
SHAAGtide组合物在疾病治疗中的应用本发明提供了用于治疗受到疾病威胁的(或对疾病易感的)患者或患有疾病的患者的预防方法和治疗方法，该疾病与FPRL1受体活性异常或FPRL1配体活性异常有关。例证包括神经退行性疾病，例如阿尔茨海默症。
可利用SHAAGtide或含有SHAAGtide的蛋白或肽，或使用FPLR1-SHAAGtide相互作用的抑制剂或激动剂，来治疗人或其它物种的疾病或病症，例如，但不局限于，外周慢性炎症相关疾病，例如慢性炎症、血栓症、动脉硬化症、再狭窄、慢性静脉动能不全、复发性细菌感染、败血症、皮肤感染、肾病、肾小球肾炎、纤维性肺病、过敏性疾病、IBS、类风湿性关节炎以及急性细支气管炎。中枢神经系统-星形胶质细胞和小胶质细胞相关疾病，例如神经退行性疾病、阿尔茨海默症、多发性硬化症、帕金森氏病、神经炎症、HIV相关性神经疾病、HIV相关性痴呆、CNS细菌感染、脑鼠弓形虫、棘阿米巴属感染、李斯特杆菌感染、朊病毒疾病、亚急性海绵状闹病以及视网膜黄斑变性，都可以被治疗。
以FPRL1水平或生物学活性增高为特征的疾病或病症可通过拮抗(即降低或抑制)活性的疗法来医治。在治疗方法和预防方法中可将拮抗物进行给药。可使用的拮抗物包括(1)在其中含有非活性SHAAGtide肽或其类似物、衍生物、片段或同源物的分子、(2)SHAAGtide反义核酸、(3)抗SHAAGtide肽及其类似物、衍生物以及片段或同源物的抗体，或(4)调节物(即抑制物或拮抗物)，其可拮抗FPRL1受体的活性。
以FPRL1水平或生物学活性减少为特征的疾病或病症可通过增加(即激动)活性的治疗物(therapeutics)来医治。上调活性的治疗物可用于治疗性施用和预防性施用。可采用的治疗物包括肽或其类似物、衍生物、片段或同源物。可采用的治疗物包括(1)包含SHAAGtide肽或其类似物、衍生物、片段或同源物的分子；(2)SHAAGtide核酸，或(3)可激动FPRL1受体活性的调节物。
本发明提供了一种方法，该方法可在患者中预防与FPRL1受体的表达异常或活性异常相关的疾病或病症，该方法是通过将一种可调节FPRL1活性的制剂进行给药实现的。例如，可通过任何或一种组合的诊断性分析或预防性分析，对处于因FPRL1活性异常所导致或促进的疾病危险状况下的患者进行鉴定。预防性制剂的给药可先于FPRL 1异常的症状特征显现前进行，这样可在疾病或病症发展过程中对其进行预防，或者，可选地使其延迟。例如，依赖于FPRL1异常的类型，FPRL1的激动剂或FPRL1的拮抗剂可被用于治疗患者。可基于筛选分析确定最为适宜的制剂。
本发明的其它方面是关于用于治疗目的的调节FPRL1活性的方法。调节的方法包括将细胞与一种调节一种或多种其活性与细胞有关的FPRL1的活性制剂接触。调节FPRL1活性的制剂可以是核酸或蛋白、自然存在的FPRL1的同源配体(cognate)，肽、SHAAGtide拟肽、或其它的小分子。制剂可刺激FPRL1活性。制剂可抑制FPRL1活性。调节方法可在体外实现(例如，通过将细胞与制剂一同培养)或，可选地在体内实现(例如，通过将直接给药于患者)。例如，该方法可包括将一种SHAAGtide或核酸分子进行给药用于治疗以补偿FPRL1或FPRL1配体的表达异常或活性异常。
在FPRL1或FPRL1配体被异常下调的情况下和(或)在FPRL1或FPRL1配体活性增加的情况下，刺激FPRL1活性可能具有有效作用；例如，在治疗感染或在接种中。相反，在FPRL1或FPRL1配体被异常上调的情况下和(或)在FPRL1或FPRL1配体活性减少的情况下，去除FPRL1或FPRL1配体活性被描述可能具有有效的作用；例如，在治疗慢性炎症中。
适宜的体外或体内分析可用来鉴定特定治疗的效果，以及鉴定其施用是否是治疗受影响组织所需。
在不同的特定实施方案中，体外分析可在疾患的典型细胞类型中实施，以用于确定所施治疗对这些细胞类型是否具有上述作用。在于人类患者中进行检测前，治疗应用的用药形式可在适宜的模式动物体系中进行鉴定，模式动物包罗，但不局限于，大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔、狗等等。
可应用本发明的方法治疗与炎症和感染相关的疾病和病症。这些疾病和病症是因FPRL1配体对FPRL1受体的作用被抑制或激活，从而调节免疫应答的疾病和病症。
本发明的组合物可用于口腔给药途径、胃肠外给药途径(例如，肌内、腹膜内、静脉内、ICV、池内(intracisternal)注射或输注、皮下注射，或植入)、吸入式喷雾给药途径、鼻内给药途径、阴道给药途径、直肠给药途径、舌下给药途径，或局部给药途径来进行给药，还可以被单独地或协同地配制成适用于每种给药途径的剂量单位的制品，该制品可含有常规的无毒性药用载体、佐剂和赋形剂。除可治序恒温动物，例如小鼠、大鼠、马、牛、羊、狗、猫，以及猴等之外，本发明的组合物还可有效地应用于人。
已证实，调节FPRL1活性或FPRL1配体活性，以及由此预防和治疗感染性疾病或炎症疾病及病症的组合治疗可通过本发明的化合物和其它已知的针对上述应用的化合物的组合来实现。
例如，在治疗或预防炎症反应中，本发明的化合物可结合以下制剂应用抗炎症制剂或止痛制剂，如阿片激动剂类，脂肪氧合酶抑制物，如5-脂肪氧合酶抑制物、环氧合酶抑制物，如环氧合酶-2抑制物，白介素抑制物，如TNF-α、白介素-1抑制物，NMDA拮抗剂，一氧化氮抑制物或一氧化氮合成抑制物，非甾类抗炎症制剂，或细胞因子抑制型抗炎症制剂，例如同对乙酰氨基酚、阿司匹林、可待因、芬太尼、布洛芬、吲哚美辛、酮咯酸、吗啡、萘普生、非那西丁、吡罗昔康、甾类止痛剂、舒芬太尼、sunlindac、替尼达帕等化合物一起使用。类似的，即时(instant)化合物可以同减痛剂，或强化因子，如咖啡因、H2拮抗剂、迈利康、氢氧化铝或氢氧化镁，减充血剂，如苯福林、苯丙醇胺、伪麻黄碱、羟甲唑啉、肾上腺素、萘甲唑林、赛洛唑啉、环己丙甲胺或左旋-脱氧-麻黄碱，抗咳剂，如可待因、二氢可待因酮、卡拉美芬、咳必清或右美沙芬，甾类，环孢菌素A，氨甲蝶呤，IL-10，利尿剂，以及镇静性抗组胺剂或非镇静性抗组胺剂。
药用组合物FPRL1受体的激动剂或拮抗剂可被掺入药用组合物。这些组合物典型性地包括激动剂或拮抗剂以及药用载体。“药用载体”包括可与药用施用相容的溶剂、分散介质、包被剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等中的任一或全部(Gennaro(2000))。优选的上述载体或稀释剂的例子包括，但不局限于，水、盐水、Finger’s溶液、右旋糖溶液，以及5％的人血清白蛋白。脂质体和非水性载体，例如不挥发性油(fixed oil)，也可被使用。除非当传统的介质或制剂与活性成分不相容时之外，均可考虑使用上述组分。辅助活性组分也可掺入组合物。
已阐明，激动剂或拮抗剂的药用组合物可适用于其预期的给药途径，这些给药途径包括静脉内给药、真皮内给药、皮下给药、口腔给药(例如吸入给药)、经皮外给药(即局部给药)、经粘膜给药，以及直肠给药。用于注射、真皮内，或皮下应用的溶液或悬浮液包括一种无菌的稀释剂，例如注射用水、盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、乙二醇或其它的合成溶剂；抗菌制剂，例如苯甲基乙醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及调节渗透压的溶剂，例如氯化钠或右旋糖。可使用酸或碱，例如盐酸或氢氧化钠，来调节pH值。注射用制品可包装于安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制备的多剂量小瓶中。
使用于注射的药用组合物包括无菌的水性溶液(此处为水溶液)或分散剂，或无菌注射溶液或无菌分散剂的即时无菌粉末制剂。对于静脉内给药，适宜的载体包括生理盐水、灭菌水、CREMOPHOR ELTM(BASF，Parsippany，NY)，或磷酸盐缓冲液(PBS)。所有例子中，组合物必需是无菌的，并应为可流动性的以利于使用注射器进行给药，这些组合物在操作和储藏是应该是稳定的，并必需保证组合物免受微生物，例如细菌和真菌，的污染。载体可以是一种溶剂或一种分散介质，这些介质包括，例如，水、乙醇、多元醇(例如甘油、乙二醇和液态聚乙二醇)，以及适宜的混合物。适宜的流动性可以被维持，例如，通过使用一种包被，例如卵磷脂，通过维持分散情况下所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂。多种抗细菌制剂和抗真菌制剂，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸，以及硫柳汞，可抑制微生物的污染。等渗制剂，例如糖、诸如甘露醇、山梨糖醇的多元醇，以及氯化钠，也可包含于该组合物中。可延缓吸收的组合物还包括诸如单硬脂酸铝和明胶的制剂。
制备无菌注射溶液的方法可以是，将活性组分按所需剂量与一种或多种成分的组合掺入到适宜溶剂中，然后进行灭菌。通常，可通过将活性组分掺入到一种含有一种基础分散介质和其他所需组分的无菌载体，以制备分散剂。无菌粉末可用于无菌可注射溶液的配制，其制备方法包括通过真空干燥和冻干，由无菌溶液中获得一种含有活性成分和其他预期成分的粉剂。
口服组合物通常含有一种活性成分或可食用载体。这些组合物可被包裹于明胶胶囊或被压制成片剂。为到达口服治疗性给药的目的，可将活性成分与赋形剂相混合，并制成片剂、锭剂或胶囊。还可用流体载体制备口服组合物以作为一种漱剂，其中的流体载体中的组分是应用上可口服的。还可包括结合制剂和(或)调节物质的药用组合物。片剂、丸剂、胶囊以及锭剂等等，可包含下列任意成分，或类似天然的化合物粘合剂，如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，如淀粉、乳糖、诸如藻酸的分散剂、PRIMOGEL或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸铝或STEROTES；glidant，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷调味剂、甲基水杨醇调味剂或桔味调味剂。
对于吸入式给药来说，化合物作为汽雾喷剂由喷雾器或含有适宜推进剂(例如诸如二氧化碳的气体)的加压容器来递送。
也可经粘膜或经皮肤进行全身给药。对于经粘膜给药或经皮肤给药来说，对可渗入靶障碍的渗透剂进行优选。经粘膜渗透剂包括去污剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。鼻雾剂或栓剂可用于进行经粘膜给药。对于经皮肤给药来说，活性成分可以配制入软膏、油膏、凝胶或乳膏中。
还可以将化合物以栓剂或滞留性灌肠剂形式进行制备以用于经直肠递送。
在一个实施方案中，将活性成分与可保护该成分免受机体快速降解的载体一同制备，这些载体是，例如可调节的缓释配方，包括植入递送系统和微胶囊递送系统。可使用生物可降解或生物相容性多聚物，例如乙烯乙酸乙烯酯、多聚酸酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚原酸酯，以及聚乳酸。聚乙烯羟基乙酸，例如PDG，也是良好的载体。这些物质可由ALZA公司(Mountain View，CA)和NOVA制药公司(Lake Elsinore，CA)购得，或由本领域技术进行制备。脂质体悬浮液也可作为药用载体。可根据本领域技术人员已知的方法，例如(Eppstein等美国专利NO4,522,811.1985)，制备上述载体。
可制造单位剂量形式的口服制剂或胃肠外组合物以促进给药和促进剂量的均一性。单位剂量形式可参照对被治疗患者来说适用作单一剂量的机体离散单位，该单位包含与所需药用载体结合的活性化合物的治疗有效量。本发明的单位剂量形式的说明书由活性化合物的独特性质、特定预期治疗效果，以及混合活性化合物的固有局限性所界定，并直接依赖于上述因素。
SHAAGtide核酸分子可插入到载体，并作为基因治疗载体进行适用。可通过，例如，静脉注射、局部给药(Nabel和Nabel，美国专利NO5,328,470，1994)或立体定向注射，将基因治疗载体递送给患者。基因治疗载体的药学制品可包括相容性稀释剂，还可以包含可嵌入基因递送载体的缓释物质。可选择的，药学制品可包含一种或多种生产基因递送系统的细胞，例如逆转录细胞，其中的重组细胞可完整地生产完备的基因递送载体。
在一个方面，可将SHAAGtide以DNA形式进行递送，使得多肽可在原位产生。在一个实施方案中，如Ulmer等(1993)所描述，这些“DNA”是裸露的，另外Cohen(1993)也对其进行了评论。通过载体，例如可有效运输到细胞中的生物可降解珠，来包被裸露DNA可增加其的摄取。在这些疫苗中，DNA可存在于为本领域常规技术人员所熟知的众多递送系统中的任意一种，包括核酸表达系统、细菌表达系统或病毒表达系统。
用于将遗传物质由组织到组织进行穿梭的载体可以分为两个常规类型克隆载体，其是复制性的质粒或带有某些区域的噬菌体，这些区域对在一种合适的宿主细胞中进行的增殖是不必需的，但外源DNA可插入到这些区域中；外源DNA像载体的组件一样被复制和增殖。一种表达载体(例如质粒、酵母或动物病毒基因组)可用来将异源遗传物质引入到宿主细胞或组织，以用来转录和翻译外源DNA，如SHAAGtide。在表达载体中，被引入的DNA可操作性地与诸如启动子的元件相连接，启动子可向宿主细胞发放信号以转录插入的DNA。一些启动子是特别有效的，例如转录启动子可操控基因转录以响应特定因子。可操作的将SHAAGtide多核苷酸连接到转录启动子，以调控SHAAGtide多肽或片段的表达。典型的转录启动子的例证包罗那些可响应α-干扰素、热休克、重离子盐以及诸如肾上腺皮质激素和四环素的甾类化合物(Kaufman，1990.Methods Enzymol 185487-511)的启动子。其它可考虑的转录启动子包括那些对被引入该结构的细胞来说是非内源性的，但仍能在外源添加诱导剂的情况下响应细胞的启动子。通常，有效的表达载体一般是质粒。但是，也可以考虑其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和联合腺病毒)。
载体的选择是依据所适用的组织或细胞，以及载体的预期命运。载体可在靶细胞中复制一次，或被自毁。通常，载体包含单链序列、复制原点、标记基因、增强子、启动子，以及转录终止序列。
药用组合物可进一步包含其它的在文中记述的治疗性活性化合物，这些化合物通常被用来治疗FPRL1相关的疾病。
在需要调节FPRL1的疾病治疗或预防中，激动剂或拮抗剂的适宜剂量水平通常是每天每kg患者体重约0.01-500mg，可按单一剂量或多剂量进行给药。优选的，该剂量水平应为每天大约0.1-250mg/kg，更优选的是每天大约0.5-100mg/kg。适宜的剂量水平也可以是每天大约0.01-250mg/kg、每天大约0.05-100mg/kg，或每天大约0.1-50mg/kg。在此范围内，剂量可以是每天0.05-0.5mg/kg、0.5-5mg/kg，或5-50mg/kg。对于口腔给药来说，优选的是以含有1.0-1000mg活性成分的片剂形式提供组合物，具体的说是以1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0，以及1000.0mg的活性成分用做对被治疗患者的症状调节剂量。该化合物可按照每天1-4次的疗法进行给药，优选的是每天大约一次或两次。
但是，对于特定患者所采用的特定剂量水平和剂量频率是可变化的，并依赖于诸多因素，包括所适用的特定化合物的活性、代谢稳定性和化合物的作用时间长短、年龄、体重、总体健康程度、性别、饮食、给药方式和时间、排泄速率、联合用药、特定病症的严重程度，以及宿主正在接收的治疗。
试剂盒在一个方面，本发明提供的试剂盒含有下述一种或多种包装或容器(1)本发明的生物活性组合物或FPRL1拮抗剂；(2)药用佐剂或赋形剂；(3)用于给药的载体，例如注射器；(4)给药的使用说明。也可考虑组分(1)-(4)中的两种或多种在同一容器中存在的实施方案。
当提供试剂盒时，组合物的不同化合物可包装于分离的容器，而在使用前直接进行混合。这些化合物的包装可分别在不丧失活性化合物功能的状态下进行长时间的储存。
包含于该试剂盒中的制剂可由任何材质的容器提供，不同化合物活性在其中得到保护，并不会为容器的材料所吸附或改变。例如，可使用密封的玻璃安瓿来容纳冻干的SHAAGtide多肽或多核苷酸，或使用被中性不反应气体，如氮气，包装的缓冲器。安瓿可包含任何适宜的材料，例如玻璃；有机多聚物，如聚碳酸酯、聚苯乙烯等；陶瓷；金属；或其它可用来承装相似制剂的任意典型材料。适宜容器的其它例证包括由与安瓿相似物质制造的简易瓶，以及内部包含金属箔线的包膜，如铝或一种合金。其它容器包括试管、管形瓶、烧瓶、瓶子、注射器，等等。容器可带有一个无菌入口，例如瓶子可带有一个可为皮下注射针头穿透的塞子。其它的容器可带有两个为易于移除的膜所分隔的隔层，将膜移除后可混合化合物。可移除膜可以是玻璃、塑料、橡胶，等等。
试剂盒还可同指导材料一同提供。说明书可打印在纸上或其它材料上，并(或)可作为一种可阅读的电子媒体被提供，例如软盘、CD-ROM、DVD-ROM、ZIP盘、录像带、录音磁带，等等。详细的说明书可能不与试剂盒一同被提供，代替的，使用者可关注该试剂盒的制造商或发行商所指定的互联网站，或由电子邮件形式获得。
筛选和检测方法SHAAGtide(以及用来表达SHAAGtide的SHAAGtide核酸)可作为制剂被用来筛选调控FPRL1受体活性的化合物。这些化合物可用来治疗疾病，这些疾病的特征表现为FPRL1受体或FPRL1受体配体的产物量不足或过多，或所生产的FPRL1受体或FPRL1受体配体形式相对于野生型分子来说具有异常活性的。通常，这些化合物可用来调节涉及FPRL1受体或FPRL1受体配体的生物功能。
本发明提供用来定性(筛选分析)的方法，即对可影响FPRL1受体或FPRL1受体配体的候选或测试的化合物、制剂(例如多肽、拟肽、小分子，或其它药物)、食物，及其组合物等，进行鉴定。其既可以是刺激作用，也可以是抑制作用。本发明还包括在上述筛选分析中已被鉴定的化合物。
检测化合物增进或降低FPRL1受体响应配体或不依赖于配体的活性是必要的。化合物可通过增进或降低FPRL1受体自身的活性(激动剂和拮抗剂)以调节FPRL1受体活性。
待测化合物可通过合并库(combinatorial library)方法中的众多方法中的任意一种来获得，包括生物库、空间可寻址并行固相或液相库、要求去卷积的合成库方法、“一磁珠一化合物”库方法，以及应用亲和色谱法筛选的合成库方法。生物库方法限于肽，而其它四种方法适用范围包括化合物的肽库、非肽寡聚物库或小分子库(Lam，1997)。
“小分子”是指分子量低于约5kD或更低的分子，优选的是低于约4kD，而更优选的是低于约0.6kD。小分子可以是核酸、肽、多肽、拟肽、碳水化合物、脂类，或其它有机分子或非有机分子。化学合剂和(或)生物合剂的库，例如真菌提取物、细菌提取物或藻类提取物，已为本领域所知，并可通过本发明的任意测试方法进行筛选。分子库合成方法的例证已被描述(Carell等，1994a；Carell等，1994b；Cho等，1993；DeWitt等，1993；Gallop等，1994；Zuckermann等，1994)。
化合物库可保存在溶液中(Houghten等，1992)、磁珠上(Lam等，1993)、芯片上(Fodor等，1993)、细菌中、孢子中(ladner等，美国专利NO.5,223,409，1993)、质粒中(Cull等，1992)，或在噬菌体中(Cwirla等，1990；Devlin等，1990；Felici等，1991；Ladner等，美国专利NO.5,223,409，1993；Scott和Smith，1990)。
很多用于筛选可结合FPRL1受体或可调节FPRL1受体活性的候选化合物或待测化合物的鉴定是有效的。一种无细胞的鉴定包括，例如，将FPRL1受体或生物活性片段与可结合FPRL1受体从而形成鉴定混合物的一种SHAAGtide化合物相接触，将鉴定化合物与一种待测化合物相接触，鉴定待测化合物与FPRL1受体的相互作用的活性，其中对待测化合物与FPRL1受体相互作用活性的鉴定包括，鉴定FPRL1受体与待测化合物优选结合的能力，或鉴定FPRL1受体调节待测化合物活性的能力。基于细胞的鉴定包括，例如钙流检测、结合检测，细胞迁移检测也在实施例中进行了论述。
将一种含有SHAAGtide序列的分子或其伴侣分子之一(例如FPRL1)进行固定，可促进由一种或两种蛋白的非化合体形式中分离出化合体，并可以实现高通量鉴定。待测化合物与SHAAGtide分子或FPRL1受体分子的结合，或在存在或不存在候选化合物的情况下SHAAGtide分子与FPRL1受体的相互作用，可在任意适于容纳反应物的容器中实现，例如微滴度平板、试管和微离心管中。可提供能够引入一种结构域的融合蛋白，从而使得一种或两种蛋白可结合到基质上。例如，GST(谷胱甘肽S-转移酶)-SHAAGtide融合蛋白或GST-目标融合蛋白可被吸附到谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠(SIGMA化学制品，St Louis，MO)上或谷胱甘肽衍生的微滴度平板上，这些基质接着结合待测化合物或同时结合待测化合物和任意不被吸附的FPRL1受体或SHAAGtide，在导电的条件下(例如在生理盐度和PH下)对该混合物进行孵育以形成化合体形式。孵育后，清洗磁珠或微滴度平板小孔以去除任何不结合的组分、应用磁珠情况下的固定基质，以及直接及剪接鉴定的化合体。可选的，化合体可由基质上分离，并可使用常规技术鉴定SHAAGtide的结合水平或活力水平。
在筛选检测中也可使用其它的技术将蛋白固定到基质上。例如可见共同待审美国专利申请09/721,902。可使用生物素-]抗生物素蛋白系统或生物素-抗生物素链菌素系统来固定任意一种SHAAGtide分子或FPRL1受体分子。可使用很多制剂实现生物素化，例如生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺，PIERCE Chemicals，Rockford，IL)。可将与SHAAGtide分子或FPRL1受体分子反应，但不干扰SHAAGtide与FPRL1受体分子结合的抗体或抗体片段引入平板的孔中，FPRL1受体或SHAAGtide可被抗体结合捕获于孔内。除了那些已描述的用来鉴定GST固定化合体的方法之外，其它的鉴定方法还包括使用可与FPRL1受体分子或SHAAGtide分子反应的抗体，以及使用酶联检测，其依赖于鉴定连接在FPRL1受体分子或SHAAGtide分子上的酶的活性。
可通过鉴定化合物是否抑制了SHAAGtide对受体的活性来证实其是否为FPRL1受体的拮抗剂。优选的这些化合物至少具有一种下述特征(1)可有效抑制SHAAGtide或包含SHAAGtide序列的分子与FPRL1受体的结合；(2)显著抑制结合了FPRL1的SHAAGtide或包含SHAAGtide的分子的Ca2+应答；(3)受限制的非特异性Ca2+应答；或
(4)趋化活性的抑制。
可使用常规的体外结合检测以用于确认化合物对FPRL1受体的亲和力(通过与受体的竞争性相互作用抑制了SHAAGtide的活性)。见下文的实施例。优选的，活性化合物应显示IC50值＜10μM，更优选的是＜5μM，最优选的是＜1μM。
抑制SHAAGtide活性的化合物可影响SHAAGtide兴奋细胞的细胞内Ca2+浓度。结合FPRL1受体的配体可引起磷酸激酶C所诱导的G蛋白活化，这使得磷脂酰磷酸肌醇转化为磷酸肌醇和甘油二酯。磷酸肌醇转而结合定位于细胞内位点的受体，从而将Ca2+释放到细胞质中。Ca2+浓度的升高除归功于胞内钙库的释放外，还要归功于磷酸肌醇结合其受体所导致的经细胞膜进入细胞的分子外钙流的增长。其它的G蛋白信号通路也可能与之相关。
因此，可通过鉴定无细胞内Ca2+水平条件下的Ca2+浓度增长，来检测SHAA Gtide对FPRL1受体的活化作用，以及随后本发明的化合物对活化作用的抑制作用。典型的是，可使用钙敏感性的荧光探针，例如quin-2、fura-2和indo-1来实现这一鉴定过程。活性化合物阻碍Ca2+应答的效应依赖于活性化合物的量和趋化因子的存在。通常的，当存在有10nM的趋化因子和10μM的活性化合物时可产生Ca2+应答20％-100％的抑制。
用化合物孵育能够产生多种受体的细胞，这些受体包括以活性化合物为靶目标的受体，以用来检测活性化合物是否能产生非特异性的Ca2+应答。接着以针对靶受体的配体刺激细胞，随后再以细胞样中其它受体的配体进行刺激。存在或缺少化合物时的非靶受体对配体的可比较应答显示，活性化合物对靶受体是特异性的。
任何细胞迁移检测方式都可用来检测趋化作用，包括ChemoTx系统(Neuro Probe，Rockville，MD)或其它适用的装置或系统(Bacon等，1998；Penfold等，1999)。这些细胞迁移检测工作在下文中简略描述。在将生产靶趋化因子活性受体的细胞进行孵育和制备后，将这些细胞与候选拮抗剂一同混合。混合细胞放置在细胞迁移设备的上部槽中。将趋化因子配体的一种刺激性浓度添加入较低的槽中。接着执行和终止迁移检测，并评价细胞迁移。
本发明人已证实SHAAGtide对单核细胞、嗜中性粒细胞、未成熟树突状细胞，以及成熟树突状细胞所表达的FPRL1受体都具有活性。因此，可在体外检测方法中使用上述细胞。在体外的趋化检测中也可使用富集或充分纯化的细胞制品。可通过本领域已知的依赖于所需特定细胞的类型的众多技术来制备细胞制品。典型的用来制备充分纯化细胞制品的方法有，通过特定条件下的细胞培养、依据密度梯度中诸如状态的生理特性、依据特征标记物(例如，使用针对细胞表面蛋白的抗体进行的荧光激活细胞分类术(FACS)，免疫沉淀印迹)进行分类，以及其它方法。
可根据组织学(参见，例如Luna，1968)、免疫学染色以及相似的方法(参见，例如Harlow等，1998；Coligan等，1991)来对细胞进行鉴定。在下文和实施例中，对在体外趋化检测中用于制备充分纯化的细胞组合物的方法进行了简略描述。但是，只要已获得预期的细胞，本发明并不需要使用任何特殊的纯化方法；很多变化的方法和可选择的方法已为本领域技术人员所知晓。另外，很多其它的纯化方法和鉴定方法，包括在此不具体列出的适用于细胞的方法，已经被本领域所知晓或可被轻易地开发。另外，如果需要的话，由免疫系统组织中产生的克隆细胞株也可应用于文中描述的趋化检测。常规的免疫方法学方法、纯化方法和细胞培养方法已在Coligan等，(1991)，包括由1999至今的附录，中进行了描述。除非另外说明，培养物中的细胞均在37℃和5％CO2条件下进行孵育。
适用于单核细胞纯化的方法可见于Bender等，1996(还可参见美国专利NO.5,994.126)。简单来说，可通过使用抗pan T细胞表面标记物CD2的固定化抗体来消耗T细胞，以用来从PBMC中分离单核细胞。方便的是，可采用商品化的有效来源，在其中CD2抗体被附于磁珠上(Dynal；Lake Success，NY)。将通过常规的Ficoll梯度离心由软膜(通常35ml含有400×106PMBC)中分离到的PBMC以每ml 20×106细胞重悬于含有1％BSA(Sigma)的MACS缓冲液(Hyclone；Logan，UT)中。DPBSshi Dulbecco’s磷酸盐缓冲液(CaCl2(0.1g/l)、KCl(0.2g/l)，KH2PO4(0.2g/l)、MgCl2-6H2O(0.1g/l)、NaCl(8.0g/l)、Na2HPO4(2.16g/l))。将固定化CD2+磁珠的一种适宜量(通常是每106细胞10μl)添加到细胞中。轻柔振荡下于4℃下孵育混合物15分钟。依据操作方案，在磁力细胞分类器(Dynal)中将磁性标记的T细胞从未标记细胞中移除。未标记细胞主要包括单核细胞和B细胞。
利用不同的粘附性质将上述制品中的B细胞移除。简单来说，去除了T细胞的PBMC在37℃下可粘附于T-175组织培养瓶的塑料上(100×106细胞/瓶；Costar；Acton，MA)三个小时。不粘附的细胞(主要包含B细胞)被吸出。用DPBS漂洗3次以上以完全去除不粘附细胞。对单核细胞来说，所得细胞被很大程度地富集(即＞90％)。
还可通过CD14抗原的阳性筛选来分离单核细胞。简单的说，可将通过常规Ficoll梯度离心方法由外周血，例如软膜中，分离到的PBMC以1×106细胞/ml重悬于MACS缓冲液中，并且将混合物在4℃下孵育15分钟。加入固定化的抗CD14表面抗原的抗体(每1×106细胞1μl磁珠)，例如CD14+微磁珠(Milteyni)，并且将混合物在4℃下孵育15分钟。依据操作方案，将混合物过磁力细胞分类器(Miltenyi Biotech；Auburn，CA)上的阳性筛选柱，从而将单核细胞由其它细胞群落中分离出来。将柱子由MACS设备上取出后，用MACS缓冲液洗脱结合于柱上的单核细胞。然后通过离心沉降细胞，并将细胞以每ml 106细胞重悬于添加了10％FCS培养基的RMPI中。对用此方法分离的单核细胞进行培养，所用方法与CD2+消耗法分离到的单核细胞的培养方法基本相同。
用于纯化树突状细胞，包括分离成熟群落和未成熟群落，的适宜方法已为本领域所知晓。通过可选择的体外培养环境来制备充分纯化的树突状细胞(包括成熟小亚群或未成熟细胞亚群)。
树突状细胞广泛分布于可接触潜在病原体的所用组织(例如皮肤、胃肠道和呼吸道，以及次级淋巴组织的T细胞富集区域)。在皮肤和上呼吸道，树突状细胞形成一种高度分支的细胞点阵(在皮肤上被称为郎格罕氏细胞)。在捕获抗原后，外周组织，如皮肤和内脏，中的树突状细胞经引流淋巴管运输到淋巴结的T细胞区域，在此处呈现出内化的抗原。未成熟树突状细胞的功能是获得抗原和加工抗原。成熟的树突状细胞的功能是作为关键的APC，通过诱导病原体特定的细胞毒性细胞和辅助T细胞来启动免疫应答。
可通过体外培养生产足够纯的树突状细胞制品(见下文)。另外，在树突状细胞的成熟过程中，趋化因子受体的表达会发生显著的改变，这可用来进行细胞时期的鉴定(Campbell等，1998；Chan等，1999；Dieu等1998；Kellermann等，1999)。例如，未成熟的树突状细胞主要表达CCR1、CCR5和CXCR4。在成熟过程中，它们的受体除CXCR4外，都被下调。
在培养物中，树突状细胞的未成熟形式经历了成熟的过程，这一过程类似于树突状细胞迁移的事件，迁移是由抗原结合位点直到次级淋巴组织。使用特定的细胞因子，可由CD14+血祖细胞的培养物中产生各种发育时期的人树突状细胞和短尾猿树突状细胞。树突状细胞的分离系可与来自脐带血或骨髓的CD34+祖细胞的分离系相区分。在本发明的一个实施方案中，可生产树突状细胞的亚群，用于体外检测以鉴定趋化组合物(例如评价化学趋化素对限定的DC亚型的能力和选择性)。典型的树突状细胞亚群是(1)未成熟的外周血单核细胞衍生细胞；(2)成熟的外周血单核细胞衍生细胞；以及(3)CD34+祖细胞衍生细胞。可用过很多本领域已知的防范分离或生产亚群。例如，根据上述的Bender等方法生产来自PBMCs的未成熟树突状细胞或成熟树突状细胞。
简单来说，可使用抗细胞表面标记物CD2(存在于所用T细胞)的固定化抗体来消减PBMCs中的T细胞。可根据制造商的操作方法使用商品化的可利用的CD2+dynabeads。通过将T细胞消减混合物在37℃下于细胞培养级塑料中孵育三小时，将其分为粘附部分和非粘附部分。温和地将非粘附细胞移除，并将粘附细胞(一般为CD14+单核细胞)置于添加有每种1000U/mL的GM-CSF和IL-4(R&D系统，Minneapolis，MN)的培养基(例如RMPI+10％FCS)中(“第一天”)。在3-7天，细胞开始显示出一种隐藏的形态，并在第2天、第4天和第6天补充细胞因子，在此时细胞可作为未成熟树突状细胞而被收获。在一个实施方案中，分离该体外时期的细胞，并用于检测中。一般来说，可由400×106PBMCs中获得大约10×106的树突状细胞。
在第7天，未成熟树突状细胞显示出典型的树突状细胞形态，细胞胞体和很多突起延伸。细胞的大小较单核细胞祖细胞显著增长。可通过监测非树突状细胞的表面标记物的表达对其进行表型描述。
可进一步活化和分化非树突状细胞(由外周血单核细胞产生或来自骨髓CD34+衍生的祖细胞)使之称为成熟的树突状细胞。优先使用两种方法MCM(适于巨噬细胞的培养基)和双链RNA-poly(I:C)刺激(Cella等，1999；Verdijk等，1999)。
在MCM方法中，在第6天时过离心获取未成熟树突状细胞，并将其以106细胞/ml重悬于稀释的成熟用培养基中(直到与含有10％FCS的RPMI达到1∶1)添加GM-CSF(1000U/mL)和IL-4(1000U/mL)。培养细胞3天或更长时间，不再添加GM-CSF(1000U/mL)和IL-4。第9天细胞可作为成熟树突状细胞被使用。
在poly(I:C)方法中，第6天时收获细胞并重悬于补充了20μg/mlpoly(I:C)(Sigma)、1000U/mLGM-CSF和IL-4的标准培养基中(含有10％FCS的RPMI)。在不添加细胞因子的条件下将细胞再培养3天。第9天时，细胞可作为成熟树突状细胞被使用。
由这两种不同方法所生产的成熟树突状细胞显示出与那些未成熟树突状细胞或单核细胞祖细胞截然不同的表型特征和功能特性。通过FACS对来自每种制备品中的成熟树突状细胞进行定性，来确保已获得了预期的细胞类型。
值得注意的是，生成的成熟树突状细胞与未成熟细胞相比，可显著表达高水平的细胞表面II类MHC。CD80、CD83和CD86的表达也被上调。在成熟过程中，趋化因子上调的表达也发生了戏剧性的变化。例如，在成熟细胞中CCR1和CCR5被急剧下调，而CCR7被上调，并在加入MCM后在细胞表面出现了几个小时。在功能上，成熟树突状细胞不再能够有效的捕获抗原，但获得了刺激天然T细胞和B细胞的增殖的能力。成熟树突状细胞的迁移特性也发生了改变；它们不在对CCR1、CCR2和CCR5的配体，例如MIP-1α、PANTES和MIP-1β，产生应答。成熟树突状细胞改为应答CCR7的配体SLC和ELC。
可通过Romani等1996所描述的方法，其中带有少量改进，来制备MCM。简单来说是，在37℃下用5ml人Ig包被皮氏培养皿(100mm，Faclon)30分钟，并在使用后立即用PBS清洗2-3次。8ml中的50×106PBMC在人Ig包被的平板上堆积1-2小时。清洗并丢弃未粘附的细胞。在37℃下于新鲜的完全培养基(RPMI+10％标准人血清)孵育粘附细胞，并在24小时后收集所得的培养基(MCM)。通过将一种适宜量的MCM与RPMI/10％胎牛血清相混合，调整MCM中的TNF-α的最终水平至50U/ml。
用于嗜中性粒细胞纯化的适宜方法已为本领域所知。根据一种适宜的方法，在50ml离心管中，用3％的右旋糖苷1∶1稀释新鲜全血(WB)，并在室温沉降30-45分钟。在30分钟的沉降后，加入25ml右旋糖苷的25mlWB可形成35ml的上清。用12-15ml Ficoll覆盖上清，并于18-20℃以400xg离心30-40分钟。通过抽吸移除含有单核细胞和Ficoll-Paque的血浆层/血小板层。可在红细胞(RBC)层上方的白细胞层发现嗜中性粒细胞。(在一些制品中，嗜中性粒细胞和红细胞层是混合的。在这些情况中，通过低渗溶解去除RBCs搅拌下将12.5ml冷的0.2％NaCl加入到嗜中性粒细胞/RBC颗粒中。继续搅拌下，立即加入12.5ml冷的1.6％NaCl。以60-100xg离心细胞10分钟并恢复。如有必要可重复溶解步骤。)所得的嗜中性粒细胞的纯度＞95％(含有作为主要残余细胞的嗜曙红细胞)。
预后分析可进一步用利用文中描述的诊断方法来对患有疾病或病症的患者，或处于疾病或病症发生危险状况下的患者进行鉴定，这些疾病和病症与FPRL1受体或FPRL1配体的表达异常或活性异常是相关的。例如，可应用上述监测来对患有如神经退行性疾病的疾病的患者进行鉴定，或对处于该疾病发生危险状况下的患者进行鉴定。典型的是，由患者中获得一种测试样，并监测FPRL1受体或FPRL1配体，或测试其活性。测试样可以是，例如，生物流体(例如血清)、细胞样或组织。
可应用预后分析来测定是否可以对患者进行一种给药程式(例如，激动剂、拮抗剂、拟肽、蛋白、肽、核酸、小分子、食物，等等)，以治疗FPRL1受体或FPRL1配体的表达异常或活性异常相关的疾病或病症。可使用这些方法来测定用一种针对病症的制剂是否可以对患者进行有效的治疗。本发明提供了一些方法，以用来测定用一种针对病症的制剂是否可以对患者进行有效的治疗，该病症与FPRL1受体或FPRL1配体的表达异常或活性异常相关。在这一测试中，获得了一种测试样，并对SHAAGtide或核酸进行了检测(例如，对于患者来说，存在SHAAGtide或核酸在诊断上是有价值的，这代表可将制剂对患者进行给药以治疗与FPRL1受体或FPRL1配体的表达异常或活性异常相关的病症)。
下文中给出的实施例意在对本发明进行说明，但不限于此。
实施例实施例1CKβ8-1(25-116)，与其它CKβ8变异体类似，可刺激CCR1表达细胞的细胞内钙流可由R & D系统(Minneapolis，MN)获得人重组趋化因子、leukotactin、三种已知的CKβ8变异体CKβ8(1-99)、CKβ8(25-99)和CKβ8-1(1-116)，以及CKβ8-1的一种切去了氨基端的形式CKβ8-1(25-116)。在稳定转染人CCR1的HEK239细胞中，比较CKβ8-1(25-116)与其它三种变异体引起细胞内钙迁移的能力。根据制造商的方案使用Fugena 6(Roche，IN)制备人HEK239-CCR1细胞。在添加800μg/mlG-418的含10％FBS的DMEM中培养HEK-293细胞系。
通过以下方法在HEK-293细胞中实现人趋化因子受体CCR1的稳定表达通过聚合酶链式反应(PCR)，由人外周血细胞分离得到的基因组DNA中克隆获得编码CCR1的全长cDNA。通过常规分子克隆方法，将PCR产物克隆于pcDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)，并完全测序以验证准确性。
按如下方法，用2微克的CCR1/pcDNA3.1的重组体转染HEK239细胞。FuGENE将6.0μlFuGENE试剂(RocheMolecular Biochemicals，CA)与2μg CCR1/pcDNA3.1混合于100μl无血清培养基(Hyclone，CO)中制备DNA混合物。室温孵育30分钟后，将混合物加入到60mm培养板中，其中在10ml添加有10％FBS(Hyclone，CO)的DMEM培养基中包含0.5-1×106细胞。混合后，细胞返回孵育器中于37℃下培养两天。转染后48小时，加入终浓度为800μg/ml的Genetinin(G-418)(Mediatech，Herndom，VA)。然后以20,000细胞/孔的浓度在96孔板上铺细胞。经过2-3周的Genetinin选择后，测定Genetinin抗性的CCR1稳定表达细胞对1-500nM MIP-1α的钙动员应答能力。
用细胞内自发荧光染料Indo-1，来显示Ca2+动员应答。在培养基中(45分钟，20℃，107细胞/ml)，用Indo/Am(3μM；Molecular Probes，Eugene，OR)标记细胞。用10ml PBS清洗细胞一次，并以106细胞/ml将其重悬于含有1％FBS的HBSS中。使用Photon TechNologyInternational荧光仪(在350nm激发，400nm和490nm下成比例双发射)，通过在350nm下激发来鉴定胞质内的Ca2+释放。
CKβ8-1(25-116)和其它CKβ8变异体，和HEKCCR1-293转染体一起，可在100nM下诱导快速的钙流。两种截短变异体CKβ8-1(25-99)和CKβ8-1(25-116)可诱导高的钙应答，而变异体CKβ8(25-99)和CKβ8-1(1-116)产生的信号较低。在未转染的平行样HEK239细胞中，上述趋化因子不能诱导出信号，这证明该活性归功于CCR1而非内源性的受体。100nM CKβ8(25-99)和CKβ8-1(25-116)下受体被最大程度激活，用同样浓度的CCR1激活剂leukotactin可获得等同的效果。
实施例2CCL23变异体CKβ8-1(25-116)在人单核细胞和嗜中性粒细胞中显示出一种独特的活性特征，这是一种非CCR1偶联事件。
可由R&D系统(Minneapolis，MN)获得人重组趋化因子、leukotactin、三种已知的CKβ8变构体CKβ8(1-99)、CKβ8(25-99)和CKβ8-1(1-116)，以及CKβ8-1的一种切去了氨基端的形式CKβ8-1(25-116)。根据常规方法由软膜(Stanford Blood Center，Palo Alto，CA)中获得人单核细胞。简单来说，是通过常规的密度梯度离心(Ficoll-Paque-Plus，Pharmacia)分离PBMC。使用CD14微磁珠(Miltenyi，Aubun，，CA)阳性筛选来纯化单核细胞。通过在Ficoll-Hypaque(Hyclone，CA)中的梯度离心由健康个体的新鲜外周血中分离人嗜中性粒细胞。
用实施例1中描述的钙流检测方法，在新鲜制备的人单核细胞和嗜中性粒细胞中检测CCL23变异体的活性。在所有可于单核细胞中激发钙释放的趋化因子中，CKβ8(1-99)和CKβ8-1(1-116)显示低的活性，甚至在250nM下也是如此。CKβ8(25-99)显示出略高的钙激活作用。但是，CKβ8-1(25-99)显示出一种带有扩展性钙释放的独特钙流。以100nM CKβ8-1(25-116)获得的最大的受体激活作用至少二倍高于同样浓度leukotactin下所获得的最大激活作用。
在嗜中性粒细胞中，100nM leukotactin可诱导钙流，而MIP-1α、CKβ8(1-99)、CKβ8(25-99)或CKβ8(1-116)都不能诱导钙流。然而，CKβ8-1(25-116)可诱导一种独特的钙释放。钙释放量远高于由同等量leukotactin激发所获得的钙流量。
实施例3在HEK239-CCR1转染体、单核细胞和嗜中性粒细胞中进行的交叉脱敏试验在交叉脱敏试验中，以leukotactin、趋化因子CKβ8(1-99)、CKβ8(25-99)及CKβ8-1(1-116)依次刺激细胞。在HEK239-CCR1转染体中，leukotactin诱导了针对所有变异体的受体脱敏作用类似模式。当以100nM leukotactin对细胞进行预处理时，针对所有配体的钙流应答被完全抑制。
在单核细胞和嗜中性粒细胞(根据实施例2制备)中进行相似受体的交叉脱敏试验。在单核细胞中，leukotactin使CCL23变异体CKβ8(1-99)、CKβ8(25-99)和CKβ8-1(1-116)完全脱敏。相反的是，leukotactin预刺激不能在单核细胞中使CKβ8-1(25-116)的活性脱敏。在嗜中性粒细胞中，CKβ8(1-99)、CKβ8(25-99)和CKβ8-1(1-116)是不活性的，并且以leukotactin预刺激亦无作用。然而，leukotactin预刺激不能使CKβ8-1(25-116)的激活作用脱敏。
实施例4CCL23变异体与125I-MIP-1α竞争结合CCR1表达细胞在人CCR1表达细胞中比较CCL23变异体的结合特征。在HEK239-CCR1细胞(根据实施例1制备)中研究MIP-1α的结合能力，以及变异体CKβ8(1-99)、CKβ8(25-99)、CKβ8-1(1-116)和与125I-MIP-1α的竞争结合能力。在存在未标记的趋化因子的情况下，用125I标记的MIP-1α(终浓度约0.05nM)孵育细胞(4℃下三小时25mMHEPES、140mM NaCl、1mM CaCl2、5mM MgCl2和0.2％BSA，PH调至7.1)。将反应混合物吸入以细胞仪(Packard)进行PEI处理的GF/B玻璃滤器。清洗滤器两次(25mM HEPES、500mM NaCl、1mMCaCl2、5mM MgCl2，PH调至7.1)。加入闪烁体(MicroScint-10；35μl)以干燥滤膜，并在Packard Topcount闪烁计数器中对滤膜进行计数。用Prism软件(GraphPad Software，San Diego，CA)对数据进行分析和绘图。
增加MIP-1α或CCl23变异体的浓度，观察竞争曲线。MIP-1得到0.54nM下的IC50值。CCl23变异体分别得到64nM、1.34nM、206nM和112nM下的IC50值。在转染体中，CKβ8-1(1-116)由CCR1上置换已结合的125I-MIP-1α的能力较CKβ8(1-99)低3-4倍，这与CKβ8-1(1-116)对CCR1的相对弱的亲和力相一致。同样与预期相同，CKβ8(1-99)截短变异体CKβ8(25-99)显示出40倍的IC50值的增长。然而，对于CKβ8-1(25-116)来说，即截去同样氨基酸的CKβ8-1(1-116)，其IC50值只增长了一倍。
在单核细胞和嗜中性粒细胞中进行类似的结合竞争试验。如实施例2制备这些细胞。由于MIP-1α不结合嗜中性粒细胞，因此可在嗜中性粒细胞中研究CCL23变异体与MIP-1α之间的结合竞争。在单核细胞中，MIP-1α具有0.27nM下的IC50值，并且CCL23变异体分别具有10nM、0.25nM、55nM和5nM下的IC50值。总的来说，CKβ8(1-99)和CKβ8(25-99)所显示的IC50值与在HEK293-CCR1细胞中观察到的IC50值相类似。然而，CKβ8-1(1-116)和CKβ8-1(25-116)在单核细胞中，显示出较高的MIP-1α置换活性，特别是CKβ8-1(25-116)，其活性高出10倍。表6中显示了125I-MIP-1α结合竞争的数据(IC50)。由非线性最小平方曲线拟合得出每个反应的IC50值。
表6125I-MIP-1α对HEK293-CCR1转染体和单核细胞的结合竞争数据
实施例5 变异体CKβ8-1(25-116)诱导人单核细胞和嗜中性粒细胞以新的迁移特性进行迁移在单核细胞和嗜中性粒细胞中进行迁移测试。孵育人单核细胞和嗜中性粒细胞(根据实施例2制备)，并将其重悬于趋化性培养基中(CM)。CM包含添加了0.1％BSA(Sigma，St.Louis，MO)的Hank’s缓冲盐溶液(Gibco，MA)，该缓冲液含有CaCl2(1mM)和MgSO4(1mM)。在96孔ChemoTx微板(Neuroprobe，MA)中进行该测试。将Leukotactin、MIP-1α和趋化因子(CKβ8(1-99)、CKβ8(25-99)、CKβ8-1(1-116)或CKβ8-1(25-116)，根据实施例1制备)加入较低的孔(终体积29μl)，并将20μl的细胞上清(对于单核细胞，5×106细胞/ml；对于嗜中性粒细胞，2.5×106细胞/ml)加入聚碳酸酯滤器中(对于单核细胞，5μm；对于嗜中性粒细胞，35μm)。孵育90分钟后(37℃，湿度100％，5％CO2)，从滤器的上表面刮下细胞。用Quant细胞增殖分析试剂盒(Molecular Probes，OR)对迁移到低层小室的细胞进行定量。
在单核细胞中，CKβ8(25-99)、CKβ8(1-99)和CKβ8-1(1-116)在直到100nM的浓度下均显示中等活性，而CKβ8-1(25-116)在100nM下的活性显著高于其它三种变异体，虽然其活性在1-10nM时与其它的变异体非常类似。
在人嗜中性粒细胞中进行同样的测试。人嗜中性粒细胞通常缺乏对CCR1配体的激烈应答。与钙流结果一致，任何已知的CCR1的配体，包括Leukotactin和MIP-1α，都是没有活性的。然而，CKβ8-1(25-116)可在100nM下诱导一种激烈应答。活性大小可与其它有效的CXCR1和CXCR1配体，包括IK-8和GRO-α，的作用相比较。
实施例6 CKβ8-1(25-116)能够在表达甲酰化肽受体样1(FPRL1)的细胞中诱导细胞内钙流和趋化作用在FPRL1-1.2转染体和天然L1.2细胞中研究CKβ8-1(25-116)功能性活性。按照以下方法在L1.2细胞中实现甲酰化肽受体样1受体(FPRL1)的稳定表达。采用聚合酶链式反应(PCR)，由未分化的HL-60细胞中分离得到的基因组DNA中克隆编码FPRL1的全长cDNA。用常规分子克隆方法将聚合酶链式反应的产物克隆到pcDNA3.1(Invirtogen，Carlsbad，CA)，并进行完全测序以验证准确性。将20微克FPRL1/pcDNA3.1重组体用Bsm1(NEW England Biolabs，Beverly，MA)消化使之线性化，并按如下方法用线性化重组体转染鼠B细胞系L1.2。用线性化的FPRL1/pcDNA3.1重组体室温下孵育细胞10分钟，把细胞转入0.4cm的试管中，250V，960μF下施加单个电穿孔脉冲。室温下孵育经电穿孔的细胞10分钟，并转入添加有10％FCS的RPMI中，在37℃下进行培养。在转染后48小时加入终浓度为800μg/ml的Geneticin(G-418)，在96孔板中以25,000细胞/孔将细胞铺板。在药物筛选2-3周后，测定Geneticin抗性的FPRL1稳定表达细胞对1-1000nM浓度的SHAAGtide或Ckbeta8-1的钙动员应答能力。
用实施例1中描述的方法在上述转染体中进行钙流检测。在所有CCL23变异体，只有CKβ8-1(25-116)能够激发FPRL1表达细胞中的钙释放。已知的FPRL1的非天然配体，合成肽Trp-Lys-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(WKYMVm)和Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Met-NH2(WKYMVM)(“W肽1和2”)(购自Phoenix Pharmaceuticals(Belmout，CA))，可产生一种强烈的钙流。在平行样细胞或转染了其它趋化因子受体的细胞中，观察不到CKβ8-1(25-116)诱导的钙释放。当进行CKβ8-1(25-116)诱导的钙流的剂量应答分析时，在这些细胞中可观察到10-20nM下的EC50值。而即使在200nM下，CKβ8-1(1-116)也显示不出对FPRL1表达细胞的活性。
检测CKβ8-1(25-116)引发FPRL1表达细胞迁移的活性。测试条件如实施例5。平行的L1.2细胞在测试中不发生迁移，而表达FPRL1的细胞以钟型剂量依赖方式响应1nM-1μM的CKβ8-1(25-116)发生迁移。在30nM下可观察多半数最大细胞迁移。该最大响应量高于使用合成肽WKYMVm和WKYMVM时观察到的最大响应量。通常，与其它趋化因子相比，CKβ8-1(25-116)在FPRL1介导的迁移中显示出较宽的钟型曲线。因此，除了对于CCR1的活性外，CKβ8-1(25-116)还可以通过受体FPRL1的表达在单核细胞和嗜中性粒细胞中行使功能。
实施例7 CKβ8-1(25-116)能够置换结合到人单核细胞和FPRL1表达细胞上的125I标记的WKYMVm通过测定CKβ8-1(25-116)置换人单核细胞和FPRL1表达细胞上的125I标记WKYMVm(125I标记的Trp-Lys-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2，(Boston，CA))的能力来鉴定CKβ8-1(25-116)与FPRL1的结合。在为标记的WKYMVm或CKβ8-1(25-116)的浓度提高的情况下，用0.01nM125I-WKYMVm于4℃下孵育细胞三小时。通过Prism软件(GraphPadSoftware)，由数据的非线性最小平方曲线拟合得出每个反应的IC50值。
对于FPRL1-L1.2转染体和单核细胞来说，竞争曲线可随WKYMVm或CKβ8-1(25-116)浓度的提高一同获得(表7)。其它的CCL23变异体得不到这样的曲线。
表7用WKYMVm和CKβ8-1(25-116)获得的125I标记WKYMVm的竞争曲线
实施例8 趋化因子或SHAAGtide通过未成熟树突状细胞、成熟树突状细胞、单核细胞或嗜中性粒细胞诱导钙动员(mobilization)人重组CKβ8-1(25-116)趋化因子由R & D System(Minneapolis，MN)获得。合成SHAAGtide肽SEQ ID NO1、SEQ ID NO6和对照蛋白(SEQ ID NO1的相反序列)，用Sambrook等，1989和Ausubel等，1999描述的常规技术HPLC法纯化合成肽。
使用下述方法，由包膜(Stanford Blood Center，Palo Also，CA)或健康个体的新鲜血液中生产人单核细胞。简单来说，是通过Ficoll-Paque梯度离心(Ficoll-Paque-Plus，Pharmacia)分离得到PBMC。通过CD14微磁珠(Miltenyi)阳性筛选纯化单核细胞。通过葡聚糖沉降和Ficoll-Paque梯度离心由新鲜血液中分离人嗜中性粒细胞。清洗所有的细胞并将其重悬于(1×107/ml)含有10％FBS的RPMI培养基中。
在GM-CSF和IL4存在的情况下培养CD14+单核细胞获得未成熟的DCs。简单来说，是在T-175烧瓶中，以106细胞/ml于RPMI/10％FBS中培养单核细胞。在第0、第2、第4和第6天，分别加入终浓度为1000u/ml和500u/ml的重组人GM-CSF和IL4。可在第7天收获细胞作为未成熟的DCs，通过FACS检测对细胞的表面蛋白表达进行定性。通过在巨噬细胞条件培养基(MCM)中培养第6天的未成熟DCs来进行DC的成熟化作用。简单来说，是通过离心和在MCM中以106细胞/ml重悬获得第6天的未成熟DCs。培养基中补充1000u/ml的GM-CSF和500u/ml的IL4。经过三天以上的培养后，细胞可作为成熟的DCs被收获，并通过表面蛋白表达流式细胞计数器对其进行定性。
通过以下方法制备MCM在以10mg/ml人IgG(Sigma，St Louis，MO)预先包被的塑料瓶中，于37℃下孵育由包膜中分离得到的PBMCs 30分钟。30分钟后，移除未粘附的细胞，用DPBS清洗粘附细胞三次，然后在PRMI/10％人血清中进行培养。24小时后收集条件培养基。用TNF-α ELISA试剂盒(R&D System，MN)鉴定TNF-α的浓度，TNF-α的浓度是DC成熟的关键。通过混入PRMI/10％人血清将TNF-α的最终水平调整至50u/ml，并在-80冰箱中储藏直到使用。
用细胞内自发荧光染料Indo-1来显示Ca2+动员应答。用Indo-1/AM(3μM；Molecular Probes(Eugene，OR))在培养基中对细胞进行标记(45分钟，20℃，107细胞/ml)。染料标记后，清洗细胞一次(10ml PBS)，并以106细胞/ml重悬于含有1％FBS的HBSS中。使用Photon TechNology International荧光仪(在350nm激发，400nm和490nm下成比例双发射)，通过在350nm下激发来鉴定胞质内的Ca2+释放。
SHAAGtide肽SEQ ID NO1、SEQ ID NO6以及CKβ8-1(25-116)，这些肽可在单核细胞和嗜中性粒细胞中产生强烈的钙流，并且在未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞中也具有部分活性。使用对照肽时观察不到显著的钙流。由于未成熟树突状细胞可生产高水平的CCR1，因此CKβ8-1(25-116)可在这些细胞中诱导Ca2+的释放。
实施例9 趋化因子、SHAAGtide和SHAAGtide截短变异体通过稳定表达FPRL1的细胞诱导钙动员如实施例6所述，在L1.2细胞中可观察到人FPRL1的稳定表达。可用实施例1中描述的方法在转染体中进行钙流测试。可如实施例1制备趋化因子CKβ8(1-99)、CKβ8(25-99)、CKβ8-1(1-116)和CKβ8-1(25-116)。可如实施例6得到W肽1和2。此外，检测以下的SHAAGtide序列和其截短变异体(制备如实施例8)CCXP1SEQ ID NO1CCXP2SEQ ID NO2CCXP3SEQ ID NO3CCXP4SEQ ID NO4CCXP5SEQ ID NO5CCXP6SEQ ID NO6CCXP7SEQ ID NO7CCXP8SEQ ID NO8CCXP9SEQ ID NO9CCXP10 SEQ ID NO10以剂量响应方式加入所有的配体，检测钙流响应的峰值。表8显示了CKβ8(25-116)(SEQ ID NO16)和某些SHAAGtide可在FPRL1转染体中诱导钙动员。然而，)，不含有游离的SHAAGtide氨基端的CKβ8(1-116)没有产生显著的动员。结果同样说明SHAAGtide的氨基端对SHAAGtide作用于FPRL1转染体的活性是重要的。那些截去了氨基端的SHAAGtide所引起的钙动员大大减少。截去或替换了羧基端的SHAAGtide没有显示出截去氨基端时所表现出的同样的活性损失。
表8在FPRL1 L1.2细胞中诱导钙流(IC50-未列出IC50值时，序列显示低活性或没有显著活性)
实施例10 FPRL1-L1.2细胞中趋化因子、SHAAGtide和SHAAGtide的截短变异体的趋化活性用迁移试验检测趋化因子CKβ8(1-99)、CKβ8(25-99)、SHAAGtide(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)以及W肽1和2(制备如实施例6)对FPRL1-L1.2细胞的趋化活性。按照实施例1制备趋化因子。按照实施例8制备SHAAGtide序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。按照实施例6制备FPRL1-L1.2细胞。
采用实施例5所述方法在96孔ChemoTx微板(Neuroprobe)中进行迁移试验。SEQ ID NO1和SEQ ID NO2均使转染体发生迁移，这暗示它们对该受体是有功能的。
实施例11人单核细胞和嗜中性粒细胞中趋化因子、SHAAGtide和SHAAGtide的截短变异体的趋化活性用迁移试验检测趋化因子CKβ8(1-99)、CKβ8(25-99)和CKβ8(25-116)、W肽1和2，以及SHAAGtide序列SEQ ID NO1和SEQ IDNO2对单核细胞和嗜中性粒细胞的趋化活性。按照上述实施例制备上述肽。采用实施例5所述方法在96孔ChemoTx微板(Neuroprobe)中进行迁移试验。SHAAGtide SEQ ID NO1和CKb8-1(25-116)均可使单核细胞和嗜中性粒细胞发生迁移。
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权利要求
1.一种分离的蛋白或多肽，其包含与SEQ ID NO1至少有80％同一性的氨基端序列，SEQ ID NO16的序列除外。
2.权利要求1中的分离的蛋白或多肽，其中蛋白或多肽是FPRL1的配体。
3.权利要求1中的分离的蛋白或多肽，其中所述的氨基端序列与SEQ ID NO1的序列同一性至少为90％。
4.权利要求1中的分离的蛋白或多肽，其中所述的氨基端序列与SEQ ID NO1的序列同一性至少为95％。
5.权利要求1中的分离的蛋白或多肽，其中所述的氨基端序列与SEQ ID NO1的序列同一性为100％。
6.权利要求1中的分离的蛋白或多肽，其中所述的氨基端序列是SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQ ID NO6。
7.一种分离的多肽，其与SEQ ID NO1有至少80％同一性。
8.权利要求7中的分离的多肽，其与SEQ ID NO1的序列同一性至少为90％。
9.权利要求7中的分离的多肽，其与SEQ ID NO1的序列同一性至少为95％。
10.权利要求7中的分离的多肽，其具有SEQ ID NO1、SEQ IDNO3、SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的序列。
11.一种分离的核酸，其包含与SEQ ID NO20有至少80％同一性的核酸序列。
12.权利要求11中的分离的核酸，其与SEQ ID NO20有至少90％同一性。
13.权利要求11中的分离的核酸，其与SEQ ID NO20有至少95％同一性。
14.权利要求11中的分离的核酸，其与SEQ ID NO20有至少99％同一性。
15.一种分离的核酸，其具有与权利要求11中的核酸互补的序列。
16.权利要求11中的分离的核酸，其包括SEQ ID NO20、SEQID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO25、SEQ ID NO27或SEQ IDNO30。
17.权利要求15中的分离的核酸，其包含SEQ ID NO20。
18.权利要求15中的分离的核酸，其包含SEQ ID NO25。
19.一种抗体，其特异性结合权利要求1中的肽。
20.一种融合蛋白，其包含与权利要求1中的肽融合的非SHAAGtide多肽。
21.一种试剂盒，其包含药用组合物以及注射器，所述药物组合物包含权利要求1中的多肽和药用载体。
22.一种鉴定FPRL1受体拮抗剂的方法，包括将表达FPRL1受体的细胞与一种蛋白或多肽相接触，所述蛋白或多肽包含与SEQ ID NO1有至少80％同一性的氨基端序列；其中受体是受刺激的；将该受体与候选拮抗剂化合物相接触；对FPRL1受体进行检测。
23.权利要求22中的方法，其中的候选化合物是抗体、肽、核酸或小分子。
24.权利要求22中的方法，其中的细胞是嗜中性粒细胞、单核细胞、T淋巴细胞或树突状细胞。
全文摘要
发明人发现CKβ8－1的一种截短变异体CKβ8－1(25－116)是针对两种不同的GPCRs，趋化因子CCR1和甲酰化肽受体样1受体(FPRL1)的一种双功能配体。因此，本发明人发现，除了对CCR1的功能性活性外，CKβ8－1(25－116)也是针对GPCR受体FPRL1的一种功能性配体，该受体通过募集单核细胞和嗜中性粒细胞而参与炎症反应和天然免疫。此外，本发明人还发现了CKβ8－1的一种选择性剪接外显子，命名为SHAAGtide。SHAAGtide，与其亲本趋化因子CKβ8－1(25－116)一同，对已知表达FPRL1的单核细胞和嗜中性粒细胞具有完整的功能。
文档编号C07K14/52GK1602352SQ02824548
公开日2005年3月30日 申请日期2002年8月19日 优先权日2001年10月9日
发明者缪振华, B·普雷麦克, T·J·沙尔 申请人:坎莫森特里克斯公司