递送核酸的脂质体组合物的制作方法

专利名称：递送核酸的脂质体组合物的制作方法
专利说明递送核酸的脂质体组合物 发明的领域 本发明涉及递送核酸的脂质体组合物。更特别地，发明涉及的脂质体组合物含有pH反应性脂类和可释放的亲水聚合物链的表面涂层以核酸给药。
发明的背景 已经开发了许多种方法来促进遗传物质向特殊细胞的传递。这些方法可用于体内和体外的基因转移。对于前者，基因直接导入受者体内(静脉内，腹膜内，气雾剂，等)。在离体(或体外)的基因转移中，基因在细胞从个体的特定组织中移出后被导入细胞中。然后转染的细胞再被导回受者体内。
可获得体内和离体基因治疗的递送系统包括病毒载体如逆转录酶病毒载体或腺病毒载体，微注射，电穿孔，原生质体融合，磷酸钙，和脂质体(Feigner，J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847413-7417(1987)；Mulligan，R.S.，Science 260926-932(1993)；Morishita，R.，等人，J.Clin.Invest.912580-2585(1993))。
使用脂质体载体将遗传物质向细胞的递送已经被广泛研究。一般认为，脂质体囊泡被细胞通过胞饮作用摄取，并进入溶酶体降解通路。因此，已经做了一些努力来设计避免降解的脂质体。
广泛报道了作为脂质体脂质双分子层成分，使用阳离子脂类如带正电荷铵或含锍离子头基的糖脂衍生物，递送负电荷的生物分子如寡核苷酸和DNA片段。脂质的正电荷头基与负电荷的细胞表面相互作用，促进生物分子和细胞的接触和递送。阳离子脂类的正电荷进一步对核酸的配合是重要的。
但是，全身给予这种阳离子脂质体/核酸复合体使其容易滞留在肺中。这种肺内定植是由于传统阳离子复合体的强表面正电荷引起的。已有文献报道，静脉给药后，具有报告子基因的传统阳离子复合体在肺、心、肝、肾和脾中体内基因表达。但是，形态学检查表明大多数表达位于肺血管的内皮细胞层。对这种观察现象的可能解释是，肺是阳离子脂质体/核酸复合体静脉注射后所遇到的第一个器官。另外，肺内皮细胞的大表面积为阳离子脂质体/核酸复合体提供了容易进入的靶标。
尽管早期的结果是令人鼓舞的，但单一阳离子脂质体的静脉注射并未证明可有效用于将基因递送至疾病的全身部位(如实体肿瘤而不是肺肿瘤)或临床相关的基因表达(如p53或HSV-tk)所需的部位。阳离子脂质体被迅速清除，并带来了宿主的安全性问题。
另一种方法是在脂质体中包含一种pH敏感的脂类，如棕榈酰同型半胱氨酸(Connor，J.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 811715(1984)；Chu，C.-J.和Szoka，F.，J.Liposome Res.4(1)361(1994))。这种pH敏感的脂类在中性pH时是带负电荷的，可被稳定的掺入脂质体脂质双分子层中。但在弱酸性pH(pH＜6.8)下，脂质成为中性电荷的，并改变结构足以使脂质体双分子层不稳定。当脂质掺入已经被摄取进入内涵体的脂质体中时，据报告其中pH为5.0-6.0之间，使之不稳定并引起脂质体内容物的释放。
另外，直接靶向肿瘤细胞较靶向血管内皮细胞更有挑战性。脂质体/DNA复合体进入肿瘤脉管系统的血管来源内皮细胞相对容易，因为细胞直接暴露在血液腔中。为了靶向肿瘤细胞，脂质体/DNA复合体需要从有漏洞的肿瘤血管中渗出，然后可以到达肿瘤细胞。因此复合体的稳定性、大小、表面电荷、血液循环时间和复合体的转染效率都是肿瘤细胞转染和表达的因素。
发明概要 因此，发明的一个目的是提供全身递送核酸至细胞的组合物。
发明的另一个目的是提供含有中性阳离子脂质的脂质体，一个可释放的亲水聚合物衍化的脂质。脂质体与核酸联合以随后将核酸递送至细胞或组织，。
因此，在一个方面，发明包括用于给予核酸的组合物，包括 (a)脂质体含有(i)具有下面结构式的脂质
其中每个R1和R2是具有8-24个碳原子的烷基或烯基链；n＝0-20；L选自(1)-X-(C＝O)-Y，(2)-X-(C＝O)-，和(3)-X，其中X和Y独立地选自氧、NH和直接结合键；Z是pK小于7.4并大于大约4.0的弱碱部分。
脂质体也含有(ii)具有下列通式结构的化合物
其中R3是含有与二硫代苄基部分附着的连接键的亲水聚合物；R4选自H、烷基和芳基；R5选自O(C＝O)R7、S(C＝O)R7和O(C＝S)R7；R7包括含胺的脂类；R6选自H、烷基和芳基；其中CH2-R5的方向选自邻位和对位。
脂质体也包括，(b)一个联合的核酸。
在一个实施例中，X是NH，Y是氧。在另一个实施例中，L是氨基甲酸酯键、酯键或羧酸酯键。又在另一个实施例中，L是NH-(C＝O)-O。
在另一个实施例中，Z是咪唑。又在另一个实施例中，Z是pK值在5.0-6.5之间的部分。
脂质体组合物一般含有1-80摩尔百分比之间的脂质。
在另一个实施例中，每个R1和R2是具有8-24个碳原子的无支链烷基和烯基链。例如，每个R1和R2可以是C17H35。
在另一个实施例中，n在1-20之间，或在0-10之间，或在1-10之间。
在进一步的实施例中，R6是H，R4选自CH3、C2H5和C3H8。在另一个实施例中，R4和R6是烷基。
在一个实施例中，含胺的脂质包括单烃尾或双烃尾。在另一个实施例中，含胺的脂质是具有双烃尾的磷脂。
在一个实施例中，R3部分选自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基噁唑啉、聚羟丙基-甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基-丙烯酰胺、聚羟丙基甲基丙烯酸酯、聚羟乙基丙烯酸酯、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙二醇、聚天冬酰胺、其共聚物，和聚环氧乙烯-聚环氧丙烯。
在一个优选的实施例中，R3是聚乙二醇，R6是H和R4是CH3或C2H5。
一般地，脂质体包括5-20摩尔之间百分比的化合物。
应当理解，脂质体除了与核酸结合以外，可进一步包括包裹在脂质体内的治疗化合物。核酸可以包裹在脂质体至少一部分中或与脂质体外部结合。核酸可以是DNA、RNA、其片段，或DNA或RNA寡核苷酸。
在另一个实施例中，脂质体进一步包括将脂质体靶向靶部位的配体。一般地，配体共价附着在化合物上亲水聚合物R3的远端。在一个实施例中，配体具有与内皮肿瘤细胞的结合亲合力，以便被这些细胞摄取。例证的配体包括适合与下述受体结合的配体HER2/neu癌基因的c-erbB-2蛋白产物的受体、表皮生长因子(EGF)受体、碱性成纤维细胞生长因子(碱性FGF)受体、血管内皮细胞生长因子受体、E-选择素受体、L-选择素受体、P-选择素受体、叶酸盐受体、CD4受体、CD19受体、αβ整合素受体和趋化因子受体。在优选的实施例中，配体是her2、FGF、叶酸盐和E-选择素。应当理解，脂质体可以包含一种以上类型的配体。
在另一个实施例中，脂质体可以进一步包括阳离子脂质，如将要描述的。
下面关于发明的详述与附图一起进行阅读时，发明的这些和其他目的和特征将被更全面的理解。
附图描述

图1显示了根据本发明制备具有氨基甲酸酯连接和咪唑“Z”基团的脂类的合成图； 图2A-2D显示了根据本发明制备pH反应性脂类的合成反应流程图； 图3A-3D显示了根据本发明pH反应性脂类的多种结构； 图4描述了合成mPEG-DTB-胺-脂类的合成反应流程图，其中胺-配体是脂类二硬脂酰磷酯酰乙醇胺(DSPE)； 图5描述了对-二硫代苄基氨基甲酸乙酯(DTB)连接的mPEG-DSPE共轭物的硫解断裂机制； 图6A-6B显示了根据本发明制备mPEG-DTB-DSPE化合物的合成反应流程图，其中DTB连接是由一个烷基在空间上阻遏的； 图7显示了根据本发明制备mPEG-DTB-配体化合物的另一个合成反应流程图； 图8A是合成mPEG-DTB-脂类的一个合成反应流程图，在硫解断裂过程中产生了一种阳离子脂类；和 图8B显示了在图8中化合物硫解断裂后的产物。
发明的详细描述 定义 如果没有特别指出，下面的术语具有下列的含义。
如在此所使用的，“中性”脂类是不带电荷的，具有非离子特性的脂类。
“带电荷”的脂类是具有正电荷或负电荷，具有离子特性的脂类。
“形成囊泡的脂类”是指具有疏水性和极性头基部分的两性分子脂类，可在水中自发形成双分子层囊泡，其例证是磷脂，或可稳定地掺入进脂质双分子层中，疏水部分与双分子层膜的内疏水区相结合，极性头基部分朝向膜的外极性表面。这种类型的形成囊泡的脂类一般含有一个或两个疏水酰基烃链或一个类固醇基团，可能在极性头基处含有一个化学反应性基团，如胺，酸，酯，醛或乙醇。包含在这种类型中的有磷脂，如磷脂酰胆碱(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酸(PA)，磷脂酰肌醇(PI)，和鞘磷脂(SM)，其中两个烃链一般长度大约在14-22碳原子之间，不饱和度不等。包含在术语“形成囊泡的脂类”的范围内的还有糖脂，如脑苷脂和神经节苷脂，和固醇，如胆固醇。
“烷基”是指含有碳和氢的完全饱和单价基，可以是支链或直链。烷基的实例是甲基、乙基、正-丁基、叔-丁基、正-庚基和异丙基。“低级烷基”是指1至6个碳原子的烷基，其例证是甲基，乙基，正-丁基，异-丁基，叔-丁基，异戊基，正-戊基，和异戊基。
“烯基”是指含有碳和氢的单价基，可以是支链或直链，含有一个或多个双键。
在此使用的“亲水聚合物”是指含有可溶于水部分的聚合物，可使聚合物在室温下具有一定程度的水溶性。亲水聚合物的实施例包括聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯甲基醚，聚甲基噁唑啉，聚乙基噁唑啉，聚羟丙基噁唑啉，聚羟丙基-甲基丙烯酰胺，聚甲基丙烯酰胺，聚二甲基-丙烯酰胺，聚羟丙基甲基丙烯酸酯，聚羟乙基丙烯酸酯，羟甲基纤维素，羟乙基纤维素，聚乙二醇，聚天冬酰胺，上述聚合物的其共聚物，和聚环氧乙烯-聚环氧丙烯共聚物。许多这些共聚物的特性和反应在美国专利第5,395,619和5,631,018中进行了描述。
“含有反应功能基团的聚合物”或“含有可附着连接的聚合物”是指在终末端部分已经被修饰的聚合物，但一般不是必须的，以便与另一个化合物反应形成一个共价键。使聚合物具有这样一种反应功能基团部分的反应流程图可很容易的为本领域那些专业技术人员所确定和/或已经被描述，例如在美国专利5,613,018或Zalipsky等人，例如在Eur.Polymer.J.，19(12)1177-1183(1983)；Biocon j.Chem.，4(4)296-299(1993)中的描述。
“快速-可断裂的PEG”是指一种mPEG-DTB-脂类，其中R4和R6(见下面章节IIB中的结构)是氢。
“缓慢-可断裂的PEG”是指一种mPEG-DTB-脂类，其中二硫代苄基部分被在R4和/或R6上的一个烷基部分附着而阻遏(见下面章节IIB中的结构)。
“脂肪族二硫化物”连接是指R’-S-S-R″形式的连接，其中R’和R″是线性的或分支的烷基链，可被进一步取代。
缩写PEG聚乙二醇；mPEG甲氧基末端的聚乙二醇；Chol胆固醇；PC磷脂酰胆碱；PHPC部分氢化的磷脂酰胆碱；PHEPC部分氢化的鸡蛋磷脂酰胆碱；PHSPC部分氢化的大豆磷脂酰胆碱；DSPE二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；APD1-胺-2，3-丙二醇；DTPA二乙烯四胺五醋酸；Bn苄基；NCL中性阳离子脂质体；FGF成纤维细胞生长因子；HDSG；组胺二硬脂酰甘油；DOTAP1，2-二油烯氧-3-(三甲胺)丙烷；DTB二硫代苄基；FC-PEG快速-可断裂的PEG；SC-PEG缓慢-可断裂的PEG；DDAB二甲基双十八烷基铵；GC33N2-[N2，N5-双(3-氨丙基)-L-ormithyl]-N，正-双十八烷基-L-谷氨酰胺四氢三氟醋酸盐；EtDTB，乙基-二硫代苄基；DOPE，二油酰基磷脂酰乙醇胺。
II.脂质体成分 在一个方面，发明包括一种由脂质体和核酸组成的脂质体组合物。脂质体属于一种“阳离子中性脂质”，是用一种亲水性聚合物通过一个可释放的结合剂衍生的一种脂质。这些脂质体成分现在将予以描述。
A.阳离子-中性脂质 包括在本发明脂质体中的阳离子-中性脂质通常是由下面结构所代表的一种脂类
其中每个R1和R2是含有8-24个碳原子的烷基或烯基链；n＝1-20，在一个优选的实施例中在1-10之间；L选自(i)-X-(C＝O)-Y，(ii)-X-(C＝O)-，和(iii)-X，其中X和Y单独选自氧，NH和一个直接结合键；Z是一个弱碱性部分，其pK小于7.4并大于大约4.0。
在另一个实施例中，Z是一个pK值在4.5-7.0之间，更优选在5-6.5之间，最优选在5-6之间的部分。
弱碱性部分Z可使一种脂类在生理pH7.4下主要，例如超过50％是带中性电荷的，但在低于生理pH可选择的pH值下趋向于带正电荷。通过实施例，和在一个优选的实施例中，Z是一个咪唑部分，其pK为大约6.0。在生理pH7.4下，此部分主要是中性的，但在低于6.0的pH值下，该部分变为主要是带正电的。为证明本发明，如下所述，制备具有咪唑部分的脂质，并用于制备脂质体。
只要取代作用不改变pKa至所需范围外的值，除了咪唑，取代的咪唑以及苯并咪唑和萘并咪唑，可用作上述特定结构中的Z部分。合适的取代基一般包括烷基，羟烷基，烷氧基，芳基，卤素，卤烷基，氨基，和氨基烷基。这些据报道pK的范围在5.0至6.0之间的化合物的实施例包括，但不限于，各种甲基取代的咪唑和苯并咪唑，组胺，萘[1，2-d]咪唑，1H-萘[2，3-d]咪唑，2-苯咪唑，2-苄基苯并咪唑，2，4-联苯基-1H-咪唑，4，5-联苯基-1H-咪唑，3-甲基-4(5)-氯-1H-咪唑，5(6)-氟-1H-苯并咪唑，和5-氯-2-甲基-1H-苯并咪唑。
其他含氮的杂芳族化合物，如吡啶，喹啉，异喹啉，嘧啶，邻二氮杂菲，和吡唑也可用作Z基团。此外，具有选自下列的取代基，烷基，羟烷基，烷氧基，芳基，卤烷基，氨基，氨基烷基和羟基的许多这样的化合物据报道其pK在所需的范围之内。这些化合物包括，吡啶中的2-苄基吡啶，多种甲基-和二甲基吡啶，以及其他的低级烷基和羟烷基吡啶，3-氨基吡啶，4-(4-氨苯基)吡啶，2-(2-甲氧乙基)吡啶，2-(4-氨苯基)吡啶，2-氨基-4-氯吡啶，4-(3-呋喃基)吡啶，4-乙烯基吡啶，和4，4’-二氨基-2，2’-二吡啶，所有这些据报道其pK在5.0和6.0之间。据报道pK在所需范围内的喹啉类化合物包括，但不限于，3-，4-，5-，6-，7-和8-氨基异喹啉，多种低级烷基和羟基取代的喹啉和异喹啉，4-，5-，7-和8-羟喹，5-，6-，7-和8-羟喹，8-肼基喹啉，2-氨基4-甲基喹唑啉，1，2，3，4-四氢-8-羟喹，1，3-异喹啉二胺，2，4-喹啉二醇，5-氨基-8-羟喹和奎宁环。pK在所需范围内的还有几种胺取代的嘧啶，如4-(N，正-二甲氨基)嘧啶，4-(正-甲氨基)嘧啶，4，5-嘧啶二胺，2-氨基-4-甲氧嘧啶，2，4-二氨基-5-氯嘧啶，4-氨基-6-甲基嘧啶，4-氨基嘧啶，和4，6-嘧啶二胺，以及4，6-嘧啶二醇。多种邻二氮杂菲，如1，10-，1，8-，1，9-，2，8-，2，9-和3，7-邻二氮杂菲，其pK在所需的范围内，大多数它们的低级烷基-，羟基-，和芳基取代的衍生物也是如此。可使用的吡唑包括，但不限于，4，5-二氢-1H-吡唑，4，5-二氢-4-甲基-3H-吡唑，1-羟基-1H-吡唑，和4-氨基吡唑。
许多氮取代的芳香族化合物，如苯胺和萘胺，也是基团Z的合适实施例。进一步用选自甲基或其他低级烷基，羟烷基，烷氧基，羟基，其他胺基团，氨基烷基，卤素和卤烷基的基团取代的苯胺和萘胺一般据报道其pKa在所需的范围内。可使用的其他胺取代芳香族化合物包括2-氨基吩嗪，2，3-吡嗪二胺，4-和5-氨基乙酰苯，3-和4-氨基哒嗪，2-氨基-4-甲基喹唑啉，5-氨基二氢化茚，5-氨基吲唑，3，3’，4，4’-联苯四胺，和1，2-和2，3-二氨基蒽醌。
也包含在Z的实施例中的还有某些脂肪胺化合物，如N，N’-二甲基胍和多种取代的肼，如三甲基肼，四甲基肼，1-甲基-1-苯肼，1-萘肼，和2-，3-，和4-甲苯基肼，所有这些化合物据报道其pKa在4.5和7.0之间。pKa在此范围内的脂肪族化合物包括1-吡咯烷乙醯胺，1-哌啶乙醯胺，环六亚甲基四胺，和1，5-二氮杂二环[3.3.3]十一烷。
在上述特定的结构中适合作为Z部分的还有某些氨基糖类，如将在下面图3C-3D中所描述的。
上面的列表给出了pKa在4.5和7.0之间的化合物的实施例，它们可用作本发明脂质共轭物中的pH反应性基团；这些列表并不是要进行限制。在可选择的实施例中，基团Z是咪唑，苯胺，氨基糖或其衍生物。优选地，基团Z的有效pKa并不显著地受其与脂类基团附着而影响。连接的共轭物的实施例在下面列出。
发明的脂类包括连接Z部分的一个中性键L和脂类的尾部分。键L是可变化的，在优选的实施例中可选自氨基甲酸酯，酯，酰胺，碳酸酯，尿素，胺，和醚。在一个优选的为证实本发明制备的脂类中，制备了一个氨基甲酸酯键，其中L是-X-(C＝O)-Y，X是NH和Y是氧。
在脂类的尾部分，R1和R2相同或不同，可以是具有8-24个碳原子的无支链烷基或烯基。更优选地，R1和R2基团在长度上在12-22个碳原子之间，R1＝R2＝C17H35(这样基团是一个硬脂酰基)或R1＝R2＝C17H33(这样基团是一个油酰基)。
发明的脂类可采用标准的合成方法制备。如上所述，在证实本发明而进行的研究中，制备了具有上面显示的结构的脂类，其中Z是咪唑，N＝2，L是氨基甲酸酯，和R1＝R2＝C17H35。制备实施例脂类的反应流程图在图1中图解，合成的细节在实施例1中提供。简言之，1，2-二硬脂酰甘油(化合物III)的对-硝基苯基碳酸酯从1，2-二硬脂酰-s正-甘油(化合物I)和对-硝基苯基氯甲酸酯(化合物II)中制备，并与组胺(化合物IV)反应产生一种脂类(化合物V)，它具有一个通过氨基甲酸酯键与二硬脂酰尾连接的咪唑部分。可采用甘油替代1-氨基-2，3-丙二醇的相似路线产生氨基甲酸酯键的产物(L＝-O-(C＝O)-O-CH2-)。
制备具有其他连接的脂类很容易地由那些本领域的专业技术人员采用常规的方法来完成。其他的连接包括醚(L＝-O-CH2-)和酯键(L＝-O-(C＝O)-)，以及尿素，酰胺和胺键(即，其中L＝-NH-(C＝O}-NH-，-NH-(C＝O)，或-NH-)。也可能是酮键，其中X是直接结合键。图2A-2B图解了胺键脂类的制备(图2A)和具有含NH键的脂类(图2B)。在图2A中，组胺末端的胺与缩水甘油氯化物反应，得到的环氧化物被水解，得到的二醇被酰化。
在图2B中，制备了具有含NH键的脂类，例如已显示的通过将组胺与甘油酸丙酮化物(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-羧酸)的活化衍生物或四碳同系物，2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-乙酸反应。然后二醇被去保护和酰化。
图2C和2D显示了根据本发明制备pH反应性脂类的其他反应流程图。在图2C中，4-硝基安息香酸用1-氨基-2，3-丙二醇浓缩，得到酰胺键；二醇被酰化，硝基基团还原为胺得到产物，脂类-苯胺共轭物。在图2D种，开始的浓缩反应发生在乙醇(二酰基甘油)和异氰酸酯之间，在产物中形成氨基甲酸酯键。
图3A-3D显示了根据本发明pH反应性脂类的多种结构，其中图3A-3B进一步显示了芳香胺作为“Z”部分的脂类，图3C-3D显示了其氨基糖与一种脂类附着的脂类。这些脂类的合成可由本领域那些专业技术人员采用市售的起始原料很容易的进行。例如，图3A的产物可通过间-硝基苯溴化物和二酰基甘油的反应而制备，形成醚键，然后进行硝基的还原。图3B的产物通过二醇的酰化和硝基的还原从市售的(2-硝基苯基)-1，2-乙二醇进行制备。为了制备图3C中显示的氨基糖-脂质共轭物，D-葡萄糖(呋喃糖形式)通过与两分子的丙酮反应而被保护，游离的羟基顺序地与TsCl，叠氮化钠和碘反应产生一个中间硝基化合物。exocyclic diol被去保护并酰化，硝基还原为胺。图3D的化合物以与D-半乳糖相似的方式被制备。
在一个优选的实施例中，pH依赖的脂类是组胺-二硬脂酰甘油(HDSG)。组胺的咪唑pKa为6。HDSG在生理pH(pH7.4)下趋向于中性，在低于6的pH下主要是带正电荷的。
HDSG掺入的脂质体在大约pH4至5时包裹DNA，类似于常规的阳离子脂质体。HDSG脂质体/复合体的表面电荷在血液循环中的生理pH下被还原。HDSG的表面电荷在pH5至6(在内涵体和溶酶体中相同的pH)下主要是带正电荷的，以便促进复合体与溶酶体膜的相互作用，将核酸内容物释放至细胞浆中。
B.脂类-DTB-聚合物 发明的脂质体也包含用亲水聚合物通过可释放的结合键衍化的脂类，如二硫代苄基部分。这种脂类聚合物成分具有通式结构
其中R3包含一种亲水聚合物，后者含有适合将聚合物与二硫代苄基部分共价附着的功能基团。R4和R6可单独地选择是H，烷基或芳基，可被改变以适合二硫化物断裂的速度。例如，为了达到更快的断裂速度，R4和R6是氢。通过选择烷基或芳基作为R4和R5的一个或两个，通过空间阻遏二硫化物可获得较慢的断裂速度。R5含有与R7结合的连接部分，它含有一个含胺的脂类。在优选的实施例中键合部分是O(C＝O)，S(C＝O)或O(C＝O)。含胺脂类R7可以是伯胺或仲胺，可选自任何数目的脂类，包括下面要描述的那些。基团CH2-R5的定位可以是邻位或对位。
含胺的脂类R7一般是水不溶性分子，含有至少1个酰基链，含有至少8个碳原子，更优选的是含有大约8-24个碳原子的酰基链。一个优选的脂类是含有一个含胺极性头基和一个酰基链的脂类。实施例的脂类是含有一个单酰基链，如硬脂酰胺，或两个酰基链的磷脂。优选的具有一个含胺头基的磷脂包括磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸。脂类的尾在大约12至大约24个碳原子之间，可以完全饱和的或不饱和的。一个优选的脂类是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，但本领域的那些专业技术人员将要理解的是很广泛的脂类都可包含在这种描述中。也可以理解的是脂类可自然地包含一个胺基团或可被衍化含有一个胺基团。其他不含有酰基尾的脂类部分，如胆固醇胺也是合适的。
聚合物-DTB-脂类化合物的合成在图4中用示意图说明。具有甲氧羰基二硫烷基末端基团的mPEG衍生物(分子量2000和5000道尔顿)通过将2-(甲氧羰基二硫)乙胺与mPEG-氯甲酸酯反应而制备，可很容易的通过干燥的mPEG-OH溶液的光气化作用而制备(Zalipsky，S.等人，Biotechnol.Appl.Biochem.15100-114(1992).)。前面的化合物可通过2-氨基乙硫醇盐酸盐与等量的甲氧羰基烃基硫化氯的反应而获得，根据已发表的操作步骤(Brois，S.J.等人，J.Amer.Chem.Soc.927629-7631(1970)；Koneko，T.等人，Bioconjugate Chem.2133-141(1991))。巯基苄醇的对位和邻位异构体(Grice，R.等人，J.Chem.Soc.1947-1954(1963))整齐地与得到的PEG-连接的酰基二硫化物连接在一起，产生具有一个二硫苄醇末端基团的mPEG。与未衍化的mPEG-OH一样，进行主动的羧酸酯导入作用，得到对-硝基苯基羧酸酯。在乙醇胺中加入DSPE形成所需的mPEG-DTB-DSPE产物。制备邻位和对位的-DTB-脂类化合物，用硅胶色谱纯化，用NMR和MALD异-TOFMS进行定性，其细节见实施例2。
图5显示了mPEG-DTB-DSPE共轭物在断裂过程中硫解断裂的机制。在断裂过程中，磷脂酰乙醇胺以其天然的，未修饰形式被再生。
图6A-6B显示了mPEG-DTB-DSPE共轭物的合成反应流程图，该共轭物含有一个邻接于二硫键的烷基，如一个更受阻遏的二硫键。如在实施例3A中更完全描述的，二氯甲烷中的mPEG-OH与p-硝基苯基氯甲酸酯在三乙胺(TEA)的存在下反应形成mPEG-硝基苯基羧酸酯。二甲基甲酰胺(DMF)中的氨基醇，如1-氨基-2-丙醇或1-氨基-2-丁醇，与mPEG-硝基苯基羧酸酯在TEA的存在下反应形成与PEG附着的仲醇。然后仲醇转变为所需的mPEG-DTB-DSPE化合物，如图6A所图解，在实施例3A中详述。
在这个反应流程图中，mPEG-甲基-二硫代苄基-硝基苯基氯甲酸酯与DSPE反应形成所需的化合物。在mPEG-甲基-二硫代苄基-硝基苯基氯甲酸酯化合物中的硝基苯基氯甲酸酯部分在与选择的脂类反应过程中作为可离去的基团，产生所需的产物。化合物也可通过与如mPEG-甲基-二硫代苄基-R3的化合物反应而产生，其中R3代表一个离去基团，通过一个连接部分与苯环相连接。离去基团在与含胺配体，如DSPE，多肽或含胺药物反应的过程中移位。离去基团根据配体中胺的反应性而选择，优选来自多种具有羟基或含氧离去基团的酸性乙醇。这些包括氯化物，p-硝基苯酚，o-硝基苯酚，正-羟基-四氢邻苯二甲酰亚胺，正-羟基琥珀酰亚胺，正-羟基-戊二酰亚胺，正-羟基降冰片烯-2，3-二羧基酰亚胺，1-羟基苯并三唑，3-羟基吡啶，4-羟基吡啶，2-羟基吡啶，1-羟基-6-三氟甲基苯并三唑，咪唑，三唑，正-甲基-咪唑，无氟苯酚，三氟苯酚和三氯苯酚。
实施例3B描述了mPEG-EtDTB-脂类共轭物的制备，其中二硫键被一个乙基部分阻遏。
图7显示了另一个根据本发明制备mPEG-DTB-配体化合物的合成反应流程图。反应步骤的细节见实施例4A-4B。简言之，冷的1-氨基-2-丙醇与硫酸反应形成2-氨基-1-甲基乙基硫化氢。这种产物与二硫化碳和酒精水溶液中的氢氧化钠反应产生5-甲基四氢噻唑-2-硫酮。盐酸水溶液加入至5-甲基四氢噻唑-2-硫酮中并加热。在回流一周后，产物，1-巯基(甲基)乙基氯化铵，被结晶和回收。这种产物与甲氧羰基烃基硫化氢反应产生2-(甲氧羰基二硫)乙胺(ethaneamine)。2-(甲氧羰基二硫)乙胺与mPEG-氯甲酸酯使用上述图4描述的步骤反应产生所需的适合与选择的含胺脂类反应的mPEG-DTB-硝基苯基化合物。
实施例4B描述了mPEG-(乙基)DTB-硝基苯基合成的反应。
图8A显示了另一个根据本发明的mPEG-DTB-脂类化合物的制备反应流程图。反应的细节在实施例5中提供。脂类1，2-二硬脂酰-s正-甘油被活化以便与mPEG-DTB-硝基苯基反应，其制备如图6A或图7所述。得到的mPEG-DTB-脂类与上述缺乏磷酸盐头基时的化合物不同。图8A的mPEG-DTB-脂类在断裂前是中性的。如图8B所示，在二硫键的硫解还原过程中，化合物分解产生阳离子脂类。带正电荷的脂类提供了体内的静电相互作用，在体内的靶向中提供了相当的优势。
在上述的反应流程图中，已要求的化合物的R6是H。但在另一个实施例中，R6是烷基或芳基部分。在这种方法中，例如其中R4和R6都是CH3部分，α，β-不饱和酰基氯(R’R″C＝CHCOCl，例如其中R’是CH3和R″是CH3，但可考虑任何烷基或芳基)与胺为末端的PEG反应，得到相应的正-PEG取代的α，β-不饱和胺。这个化合物与硫羟乙酸反应，经共轭添加至C＝C键上得到相应的正-PEG-取代的β-(乙酰硫基)酰胺。乙酰硫基(-SCOCH3)被水解为硫基(-SH)，然后与甲基(氯亚磺酰)甲酸盐(ClSCOOCH3)反应，产生甲氧羰基二硫基(-SSCOOCH3)；这种中间产物与p-巯基苄醇反应得到正-PEG-取代的β-(二硫苄醇)酰胺(具有PEG-NH-CO-CH2CR’R″-SS-p-苯基-CH2OH的结构)。然后苄醇部分与硝基苯基氯甲酸酯反应得到如上的硝基苯基羧酸酯离去基团。
如下面将要描述的，为支持本发明在研究中制备由阳离子-中性脂类和聚合物-DTB-脂类组成的脂质体。
C.核酸 在本发明的一个优选实施例中，上述脂类形成的脂质体与核酸相结合。“结合”的含义是一种治疗性药剂，如核酸，被包裹在脂质体中央区室和/或脂质双分子层间隙中，与脂质体外表面结合，或同时包裹在内部或结合在脂质体外面。应理解的是治疗性药剂可以是核酸或药物化合物。也应理解的是药物化合物可包裹在脂质体中，核酸结合在脂质体外面，或反之。
在本发明的一个优选实施例中，核酸与脂质体相结合。核酸可选自多种DNA和RNA为基础的核酸，包括这些的片段和类似物。治疗多种病状的多种基因已经被描述，目的特异基因的编码序列可从DNA序列数据库中检索到，如GenBank或EMBL。例如，以及描述了治疗病毒，恶性和炎性疾病和病状，如囊性纤维化，腺苷脱氨酶缺陷和AIDS的多核苷酸。可考虑通过给予肿瘤抑制基因，如APC，DPC4，NF-1，NF-2，MTS1，RB，p53，WT1，BRCA1，BRCA2和VHL来治疗癌症。
特殊核酸治疗特定病状的实例包括HLA-B7，肿瘤，结直肠癌，黑色素瘤；IL-2，癌症，特别是乳癌，肺癌和肿瘤；IL-4，癌症；TNF，癌症IGF-1反义，脑肿瘤；IFN，神经母细胞瘤；GM-CSF，肾细胞癌；MDR-1，癌症，特别是进展的癌症，乳癌和卵巢癌；和HSV胸苷激酶，脑肿瘤，头颈部肿瘤，间皮瘤，卵巢癌。
多核苷酸可以是反义DNA寡核苷酸，由与其靶标互补的序列组成，一般是信使RNA(mRNA)或mRNA的前体。mRNA含有功能，或感觉和定位的遗传信息，反义寡核苷酸的结合可灭活目的mRNA，并阻止其翻译成蛋白质。这样的反义分子可根据生化试验来测定，该试验可显示蛋白翻译自特异的RNA，一旦RNA的序列已知，就可设计出可通过互补Watso 正-Crick碱基对与其结合的反义分子。这样的反义分子一般含有10-30之间的碱基对，更优选的在10-25之间，最优选的在15-20之间。
反义寡核苷酸可被修饰以提高对核酸酶水解的抵抗力，这种类似物包括硫逐磷酸酯，膦酸甲酯，磷酸二酯和p-乙氧寡核苷酸(WO 97/07784)。
包裹的药剂也可以是核糖酶、DNA酶或催化的RNA。
在另一个实施例中，核酸或基因被插入进质粒中，优选是一个环形的或闭合的双链分子，其大小优选在5-40Kbp(千碱基对)的范围。这样的质粒根据已知的方法进行构建，并包含一种治疗性基因，即要在基因治疗中表达的基因，在合适的启动子和增强子的控制下，其他在宿主细胞中复制和/或整合进宿主细胞基因组所必需的元件。用于基因治疗制备质粒的方法已被广泛的了解和文献参考。
多核苷酸，寡核苷酸，其他的核酸，如DNA质粒，可通过被动的内陷作用在脂膜的水合作用过程中被包裹在脂质体中。包裹多核苷酸的其他操作步骤包括以单分子的形式浓缩核酸，其中核酸悬浮在含有鱼精蛋白硫酸盐，精胺，亚精胺，组蛋白，赖氨酸，其混合物或其他合适的多阳离子浓缩剂的水媒质中，在可有效浓缩核酸成小颗粒的条件下。浓缩核酸分子的溶液可用于将干燥的脂膜再水合形成脂质体，浓缩核酸以内陷的形式在其中。
D.靶向配体 脂质体可随意地被制备以含有表面基团，如抗体或抗体片段，可与细胞表面受体相互作用的小效应剂分子，抗原和其他类似的化合物，以形成对特殊细胞群的所需的靶向结合特性。这种配体可包含在脂质体中，通过将靶向分子衍化的脂类，或具有极性头端化学基团的脂类包含在脂质体脂类中，其中该极性头端化学基团可用靶向分子在预先形成的脂质体中被衍化。可选择地是，靶向部分可通过将预先形成的脂质体与配体-聚合物-脂类共轭物孵育，而被插入进预先形成的脂质体中。
通过将配体共价附着于亲水聚合物链的游离远端，脂类可被靶向配体衍化，亲水聚合物链的近端附着在一种形成囊泡的脂类上。有许多种技术可将选择的亲水聚合物附着在选择的脂类上，并活化聚合物的游离，未附着末端以便与选择的配体反应，特别是亲水聚合物聚乙二醇(PEG)已经被广泛研究(Alien，T.M.等人，Biochemicia et Biophysica Acta 123799-108(1995)；Zalipsky，S.，Bioconjugate Chem.，4(4)296-299(1993)；Zalipsky，S.等人，FEBS Lett.35371-74(1994)；Zalipsky，S.等人，Bioconjugate Chemistry，705-708(1995)；Zalipsky，S.，在STEALTH LIPOSOMES(D.Lasic和F.Martin主编)第9章，CRCPress，Boca Raton，FL(1995))。
靶向配体为本领域的那些专业技术人员所熟知，在本发明的一个优选实施例中，配体是与内皮肿瘤细胞具有结合活性的配体，更优选地，可被细胞内化。这样的配体经常与生长因子受体的细胞外区结合。实施例的受体包括HER2/neu癌基因的c-erbB-2蛋白产物，表皮生长因子(EGF)，碱性成纤维细胞生长因子(碱性FGF)受体和血管内皮细胞生长因子受体，E-，L-和P-选择素受体，叶酸受体，CD4受体，CD19受体，αβ整合素受体和趋化因子受体。
III.组合物的制备 A.脂质体成分 含有上述脂类的脂质体，也就是阳离子-中性脂类和聚合物-DTB-脂类，可通过多种技术制备，如在Szoka，F.，Jr.等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)中的详述，为支持本发明制备的脂质体的特殊实施例将在下面描述。一般，脂质体是多层的囊泡(MLVs)，可通过简单的脂膜水合技术来形成。在这种操作中，形成脂质体的脂类混合物溶解在一种合适的有机溶剂中，该溶剂然后在一个容器中被蒸发，形成薄膜，脂类混合物的类型在下面详述。然后通过一种水媒介覆盖脂膜，水合形成MLVs，一般大小在大约0.1至10微米。
用于本发明组合物中的脂质体包括(i)中性-阳离子脂类和(ii)通过DTB健共价附着于亲水聚合物的脂类。脂质体也可包括其他成分，如形成囊泡的脂类或可稳定掺入进脂质体脂质双分子层的脂类，如甘油二酯，溶血磷脂，脂肪酸，糖脂，脑苷脂和固醇，如胆固醇。
一般，脂质体包含大约10-90摩尔百分比的中性-阳离子脂类，更优选的是大约20-80摩尔百分比，还更优选的是大约30-70摩尔百分比。包含的聚合物-DTB-脂类一般摩尔百分比为大约1-20之间，更优选的为大约2-15摩尔百分比，还更优选的为大约4-12摩尔百分比。在下面描述的为支持本发明进行的研究中，脂质体由60摩尔百分比的中性-阳离子脂类和5摩尔百分比的聚合物-DTB-脂类组成。
根据本发明制备的脂质体在选择的大小范围内其尺寸被定量为实质上均一的大小，一般为大约0.01至0.5微米，更优选的在0.03-0.40微米之间。一种REV和MLV的有效的尺寸定量方法涉及通过一系列聚碳酸酯膜挤出脂质体的水悬浮液，该膜选择的统一孔径大小范围在0.03至0.2微米，一般为0.05，0.08，0.1，或0.2微米。膜的孔径大小大概对应于通过该膜挤出而产生的脂质体的最大尺寸，特别是其中通过相同的膜制剂被挤出两次或三次。均化作用的方法也可用于减小脂质体的大小至100nm或更小(Martin，F.J.，在SPECIALIZED DRUG DELIVERYSYSTEMS-MANUFACTURING AND PRODUCTION TECHNOLOGY.(P.Tyle主编)MarcelDekker，New York，267-316页(1990))。
B.制备和定性举例的组合物 在支持本发明而进行的研究中，具有CMV启动子的pNSL荧光素酶原生质DNA包裹在由中性-阳离子脂类和聚合物-DTB-脂类组成的脂质体中。通过包含叶酸或FGF作为靶向配体可完成复合体的靶向作用。根据本领域已知的和例如在美国专利6,180,134中所描述的的常规化学技术，一般靶向配体被共价附着在聚合物-DTB-脂类共轭物中PEG链的远端。
实施例7描述了给予Lewis肺癌细胞肿瘤小鼠的配方(7-1)，(7-2)，(7-3)，(7-4)，和(7-5)的制备。配方2和3含有上述图1(化合物V)中的中性阳离子脂类和图4中描述的mPEG-DTB-脂类，其中R是H(在此也指“FC PEG”或“快速-可断裂的PEG”。配方也包括一种FGF靶向配体。配方1，4和5作为比较的对照。
脂质体-DNA复合体静脉给予试验小鼠。24小时后，收集肿瘤和其他组织，分析荧光素酶的表达。结果在表1显示。
表1 静脉给予FGF靶向的脂质体配方后Lewis肺癌荷瘤小鼠中荧光素酶的表达 配方编号(详见实施例7)靶向配体荧光素酶表达(pg荧光素酶/mg蛋白)肿瘤肺肝配方7-1(HDSG/CHOL)FGF15.31.41.2配方7-2(HDSG/CHOL/F-C PEG)FGF7.81.94.5配方7-3(HDSG/PHSPC/F-C PEG)FGF1.22.03.2配方7-4(HDSG/PHSPC/PEG)FGF3.72.04.6配方7-5(DDAB/CHOL)叶酸4.3403.925.4 由DDAB(配方5)组成的脂质体，是一种阳离子脂质体，在肺中的荧光素酶表达几乎较其他配方高100倍。这是因为肺中巨大的表面积和肺中带正电荷的质粒-脂质体复合体和带负电荷的内皮细胞表面之间的静电荷相互作用。根据本发明的脂质体组合物克服了这种问题，其中使用中性-阳离子脂类而不是阳离子脂类。配方1-4所有都包含了HDSG中性-阳离子脂类(图1的化合物V)。由于脂类在生理pH(7.4)下为中性，脂质体不会依附于肺表面，使脂质体分布于全身。对于配方1和2，肿瘤组织中较高的荧光素酶表达反映了这种改良的生物分布作用。
实施例8-12描述了为支持本发明而进行的其他研究，其中FGF-靶向脂质体/DNA复合体给予接种Lewis肺肿瘤的小鼠或用Matrigel注射的小鼠，Matrigel是进行肿瘤血管系统靶向的一种FGF-血管内皮细胞模型。在这些研究中，根据本发明脂质体由中性-阳离子脂类HDSG(图1的化合物V)和胆固醇或PHSPC组成。根据本发明PEG-DTB-脂类也包含在配方中。阳离子脂类也包含在复合体中，以确定阳离子脂类对复合体稳定性和转染效率的影响。使用两种阳离子脂类，DOTAP和N2-[N2，N5-双(3-氨丙基)-L-ormithyl]-N，正-双十八烷基-L-谷氨酰胺四氢三氟醋酸酯，在此称为“GC33”。
各种配方静脉给予患肿瘤或Matrigel的小鼠，给药后24小时在Matrigel或肿瘤，肺和肝中测定荧光素酶的表达。在一个研究中(实施例10)，肿瘤细胞和Matrigel被接种在同一只小鼠相对的两侧腹部。结果在表2-6中显示。 表2配方编号(详见实施例8)靶向配体荧光素酶表达(pg荧光素酶/mg蛋白)Matrigel肺肝配方8-1(DOTAP/Chol)无28.62286.118.1配方8-2(HDSG/PHSPC)FGF16.0126.73.1配方8-3(HDSG/PHSPC/FC-PEG)FGF8.94.11.2配方8-4(HDSG/DOTAP/PHSPC)无9.94.41.7配方8-5(HDSG/DOTAP/PHSPC)FGF10.33.81.6配方8-6(HDSG/DOTAP/PHSPC/FC-PEG)FGF14.22.01.3配方8-7(HDSG/GC33/PHSPC)无10.5223.12.7配方8-8(HDSG/GC33/PHSPC)FGF11.2121.33.1配方8-9(HDSG/GC33/PHSPC/FC-PEG)FGF11.396.02.2表3配方编号(详见实施例9)靶向配体荧光素酶表达(pg荧光素酶/mg蛋白)肿瘤肺配方9-1(DOTAP/Chol)无3.418317.0配方9-2(HDSG/PHSPC)FGF6.5306.4配方9-3(HDSG/PHSPC/FC-PEG)FGF5.62.8配方9-4(HDSG/DOTAP/PHSPC)无4.49.7配方9-5(HDSG/DOTAP/PHSPC)FGF17.17.4配方9-6(HDSG/DOTAP/PHSPC/FC-PEG)FGF4.34.6配方9-7(HDSG/GC33/PHSPC)无2.478.0配方9-8(HDSG/GC33/PHSPC)FGF1.4377.2配方9-9(HDSG/GC33/PHSPC/FC-PEG)FGF2.142.1 表4配方编号(详见实施例10)靶向配体荧光素酶表达(pg荧光素酶/mg蛋白)肿瘤Matrigel肺肝配方10-1(DOTAP/Chol)无16.813.638956.8139.5配方10-2(HDSG/DOTAP/CHOL)无37.127.891.72.3配方10-3(HDSG/DOTAP/CHOL)FGF22.187.323.61.0配方10-4(HDSG/DOTAP/CHOL/FC-PEG)FGF179.410.15.52.6配方10-5(HDSG/GC33/PHSPC)无20.05.12.27.9配方10-6(HDSG/GC33/PHSPC)FGF38.918.82.01.2配方10-7(HDSG/GC33/PHSPC/FC-PEG)FGF16.74.32.12.2表5配方编号(详见实施例11)靶向配体荧光素酶表达(pg荧光素酶/mg蛋白)Matrigel肺肝配方11-1(DOTAP/Chol)无35.0102929.3116.9配方11-2(HDSG/PHSPC)FGF34.31.62.1配方11-3(HDSG/DOTAP/PHSPC)FGF45.51.72.3配方11-4(HDSG/DOTAP/CHOL)无40.962.03.0配方11-5(HDSG/DOTAP/CHOL)FGF21.461.24.0配方11-6(HDSG/DOTAP/CHOL/FC-PEG)FGF64.54.01.6配方11-7(HDSG/DOTAP/CHOL)唾液酸Lewix-X42.834.12.2配方11-8(HDSG/DOTAP/CHOL)FGF38.112.42.6 表6配方编号(详见实施例12)靶向配体荧光素酶表达(pg荧光素酶/mg蛋白)1肿瘤肺肝配方12-1(DOTAP/Chol)无72.1273214.0174.4配方12-2(HDSG/PHSPC)(＞5天)FGF17.59.23.5配方12-3(HDSG/PHSPC)(1天)FGF32.88.43.9配方12-4(HDSG/DOTAP/Chol/FC-PEG)(＞5天)无22.312.26.2配方12-5(HDSG/DOTAP/Chol/FC-PEG)(1天)FGF33.423.22.5 1在给予配方12-1，12-3和12-5的脂质体后24小时和给予配方12-2和12-4后5天测定表达。
表2-6中的数据显示采用HDSG中性-阳离子脂类而不是常规的阳离子脂类可使DNA-脂质体复合体达到更广泛的生物分布作用。例如可通过对配方9-1和9-2比较肺和肿瘤中的荧光素酶表达可发现这种特征。当中性阳离子脂类包含在脂质体中时可达到这种增强的生物分布作用，即使除了中性-阳离子脂类以外还存在阳离子脂类时，当比较配方10-1和10-2的结果时也可发现同样的特征。
FGF靶向配体对体内基因表达的效果可通过用配方9-2和9-3的比较以及配方9-5和9-6的比较，配方10-3和10-4的比较而发现。在这些配方中，当复合体含有FGF靶向配体时荧光素酶表达更高，有时是显著地更高。
配方9-7，9-8和9-9与配方10-5，10-6和10-7的比较显示将GC33的量从22.5摩尔百分比减少至11.25摩尔百分比可将荧光素酶的表达从肺中转移至肿瘤或Matrigel。表达水平的这种转移是由于脂质体-DNA复合体表面电荷的减少，表明全身给药后，在生理pH时表面电荷的缺乏增加了复合体在血液的滞留时间，并改变了组织的分布。
实施例13-15描述了多种脂质体配方对KB荷瘤小鼠的体内给药。在这些研究中，复合体含有靶向表达叶酸的肿瘤细胞的叶酸配体。配方在实施例13-15中进行描述，静脉给药后肿瘤肺和肝中的荧光素酶表达在表7-9中显示。
表7配方编号(详见实施例13)靶向配体荧光素酶表达(pg荧光素酶/mg蛋白)肿瘤肺肝配方13-1(DOTAP/Chol)无4.216727.213.3配方13-2(HDSG/PHSPC)叶酸4.22.51.0配方13-3(HDSG/PHSPC/FC-PEG)叶酸7.32.41.0配方13-4(HDSG/DOTAP/PHSPC)叶酸1.03.31.0配方13-5(HDSG/DOTAP/PHSPC/FC-PEG)叶酸10.52.71.1配方13-6(HDSG/GC33/PHSPC)叶酸6.032.90.7配方13-7(HDSG/GC33/PHSPC/SC-PEG)叶酸4.85.01.0配方13-8(HDSG/GC33/PHSPC/FC-PEG)叶酸2.813.31.1 表8剂量编号(详见实施例14)靶向配体荧光素酶表达(pg荧光素酶/mg蛋白)肿瘤肺肝配方14-1(DOTAP/Chol)无5.9481.41.9配方14-2(HDSG/DOTAP/Chol)叶酸3.32.21.6配方14-3(HDSG/DOTAP/Chol/FC-PEG)叶酸3.67.61.2配方14-4(HDSG/DOTAP/Chol)叶酸1.23.31.2配方14-5(HDSG/DOTAP/Chol/FC-PEG)叶酸2.54.41.1表9配方编号(详见实施例15)靶向配体荧光素酶表达(pg荧光素酶/mg蛋白)肿瘤肺肝配方15-1(DOTAP/Chol)无6.911575.710.5配方15-2(HDSG/PHSPC)叶酸6.22.20.9配方15-3(HDSG/PHSPC/FC-PEG)叶酸2.91.90.9配方15-4(HDSG/DOTAP/PHSPC)叶酸0.32.21.0配方15-5(HDSG/DOTAP/PHSPC/FC-PEG)叶酸0.82.01.3配方15-6(HDSG/DOTAP/Chol)叶酸2.017.01.1配方15-7(HDSG/DOTAP/Chol/FC-PEG)叶酸2.43.02.1 表7-9显示了中性-阳离子脂类的包涵体与用阳离子脂类制备的脂质体(配方13-1，14-1，15-1)相比所观察到的生物分布发生了改变。最高的转染在配方13-5观察到，它是由中性-阳离子脂类，PEG-DTB-脂类和叶酸靶向配体组成的脂质体。
VI.实施例 下面的实施例是要说明而决不是要限制本发明。
材料下面的材料从指定的来源获得部分氢化的大豆磷脂酰胆碱(VemonWalden Inc.，Green Village，NJ)；胆固醇(Solvay Pharmaceuticals，TheNetherlands)；二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二甲基双十八烷铵(DDAB)(AvantiPolar Lipids，Inc.，Birmingham，AL)。
方法 采用Coulter N4-MD(Coulter，Miami FL)进行动态光散射。
Zeta-电位采用Malver Instruments，Inc.的ZETASIZER 2000来测量Zeta电位。仪器如下操作测量的数目3；测量之间的延迟5秒；温度25C；粘度0.89cP；介电常数79；单元类型毛细流；zeta限度-150mV至150mV。 实施例1制备举例的中性-阳离子脂类 A.制备二硬脂酰甘油的邻-硝基苯基碳酸酯 如在图1中所图解的，1，2-二硬脂酰-s正-甘油(500mg，0.8mmol；化合物I)用苯共沸干燥(旋转蒸发器3次)。邻-硝基苯基氯甲酸酯(242mg，1.2mmol，1.5当量；化合物II)，4-二甲基氨基吡啶(10mg，0.08mmol，0.1当量)，和三乙胺(334μl，204mmol，3当量)加入至CHCl3(5ml)中的1，2-二硬脂酰甘油中。反应混合物在室温下搅拌2小时。TLC显示反应完成。混合物用CHCl3(50ml)稀释，用10％柠檬酸(3×15mL)提取。有机层被干燥(MgSO4)并蒸发得到固体。固体(浅橙色)用乙腈(4×3ml)冲洗去掉过量的p-硝基苯基氯甲酸酯。二硬脂酰甘油(化合物III)的产物，邻-硝基苯基碳酸酯，在真空下经P2O5干燥。产量557mg(88％)。
1H NMR(360MHz，DMSO-D6，)δ0.88(t，CH3，6H)；1.26(s，CH2 58H)；1.62(m，CH2CH2CO，4H)；2.4(2xt，CH2CO，4H)；4.2(dd，反式CH2OCO，1H)；4.35(m，CH2OCOO，2H)；4.5(dd，顺式CH2OCO，1H)；5.38(m，CH2CHCH2，1H)；7.4(d，C6H5，2H)；8.3(d，C6H5，2H)。
B.制备组胺和二硬脂酰甘油的氨基甲酸酯 1，2-二硬脂酰甘油(350mg，0.44mmol，化合物III)的邻-硝基苯基碳酸酯加入至CHCl3(1ml)中的组胺(46mg，0.40mmol，0.9当量；化合物IV)和DMSO(200μl)中。吡啶(300μl；化合物V)加入至溶液中。反应混合物在室温下搅拌过夜(-20h)。TLC(CHCl3∶MeOH＝90∶10)显示反应趋向完成。溶剂被蒸发。产物(化合物VI)溶解在CHCl3中，倒在硅胶(Aldrich，230-400目，60A)柱上，用下列溶剂洗脱，CHCl3∶CH3COCH3＝90∶10，40ml(洗脱的上部)；CHCl3∶IPA＝80∶20，40ml(产物洗脱)；CHCl3∶IPA＝70∶30，40ml(更多的产物洗脱)。含有纯产物的馏分混合在一起，并蒸发。产物在真空下经P2O5干燥，得到白色固体(236mg，80％产量)。1H NMR(360MHZ，CDCl3/MeOH＝1∶1用TMS)δ0.88(t，CHS，6H.)；1.28(s，CH2，56H；1.62(m，CH2CH2CO，4H)；2.34(2xt，CH2CO，4H)；2.77(t，CH2CH2NH，2H)；3.18(t，CH2CH2CO，2H)；4.05-4.2(dd，顺式和反式CH2CHCH2，4H)；5.13(m，CH2CHCH2，1H)；608(s，组胺，1H)；7.53(s，组胺，1H)。 实施例2 合成mPEG-DTB-DSPE 反应流程图在图4中图解。
mPEG-MeDTB-硝基苯基碳酸酯(300mg，0.12mmol，1.29当量)溶解在CHCl3(3ml)中。DSPE(70mg，0.093mol)和TEA(58.5μl，0.42mmol，4.5当量)加入至PEG溶液中，在50℃(油浴温度)下搅拌。15分钟后，TLC显示反应没有完成。然后每10分钟加入TEA(10μl，和20μl)的两部分和少部分mPEG-MeDTB-硝基苯基碳酸酯(50mg，30mg，10mg)，直至反应完成。溶剂被蒸发。产物混合物溶解在MeOH中，加入1g C8硅。再次蒸发溶剂。含有C8硅的产物加至柱的顶端，用MeOH洗脱∶H2O梯度(压力)，MeOH∶H2O＝30∶70，60ml；MeOH∶H2O＝50∶50，60ml；MeOH∶H2O＝70∶30，140ml(初始物质洗脱)；MeOH∶H2O＝75∶25＝40ml；MeOH∶H2O＝80∶20，80ml(产物洗脱)；MeOH∶H2O＝85∶15，40ml；MeOH∶H2O＝90∶10，40ml；MeOH＝40ml；CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶10，40ml。混合含纯产物的馏分并蒸发干燥以得到无色浓稠液体的产物。添加叔丁醇(5ml)，冻干，然后在真空条件下经P2O5干燥以得到白色蓬松的固体产物(252mg，89％产率)。
邻位-和对位-DTB-DSPE复合物通过硅凝胶层析纯化(氯仿中的甲醇梯度0-10％，≈70％单独的产率)，通过NMR和MALD异-TOFMS确证结构。(对位共扼的1H NMR(d6-DMSO，360MHz)δ0.86(t，CH3，6H)，1.22(s，脂质的CH2，56H)，1.57(m，CH2CH2CO2，4H)，2.50(2xt，CH2CO2，4H)，2.82(t，CH2S，2H)，3.32(s，OCH3，3H)，3.51(m，PEG，≈180H)，4.07(t，PEG-CH2OCONH，2H)，4.11 & 4.28(2xdd甘油的CH2CH，.2H)，4.98(s，苄基-CH2，2H)，5.09(m，脂质的CHCH2)，7.35 & 7.53(2xd，芳香族的，4H)ppm。邻位共扼仅在5.11(s，CH2，2H)和7.31(d，1H)，7.39(m，2H)7.75(d，1H)ppm上的苄基和芳香族信号不同。
MALD异-TOFMS产生以相等的44Da距离间隔的离子分布，相当于环氧乙烷重复单位。对位和邻位异构体化合物的平均分子量分别是3127和3139Da(理论分子量≈3100Da)。 实例3 mPEG-DTB-DSPE的合成 A.mPEG-MeDTB-DSPE 此反应流程解在图6A-6B中。
mPEG(5K)-OH(40g，8mmol)与甲苯共沸干燥(总容积为270ml，250ml通过Dea正-Stark蒸馏得来)。二氯甲烷(100ml)加入mPEG-OH中。在4℃(冰水)下，P-硝基苯基氯甲酸酯(2.42g，12mmol，1.5当量)和TEA(3.3ml，24mmol，3当量)被加入PEG溶液中，同时注意防潮湿。形成了浅黄色TEA氢氯化物盐。15分钟后离开冷却浴，室温下搅拌反应混合物过夜。TLC显示(CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶2)反应完成。蒸发溶剂。残余物溶解在乙酸乙酯中(~50℃)。滤出TEA氢氯化物盐，并用温的乙酸乙酯洗涤。蒸发溶剂，用异丙醇再结晶产物(三次)。产量38.2g(92％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ3.55(s，PEG，45OH)；4.37(t，PEG-CH2，2H)；7.55(d，C6H5，2H)；8.31(d，C6H5，2H)。
1-氨基-2-丙醇(1.1ml，14.52mmol，3当量)和TEA(2.02ml，14.52mmol，3当量)加入mPEG(SK)-硝基苯基碳酸酯(25g，4.84mmol)的DMF(60ml)和CH2CI2(40ml)溶液中。它是黄色清亮溶液。室温下搅拌反应混合物30分钟。TLC(CHCl3∶MeOH＝90∶10)显示反应趋向于完成。蒸发溶剂(二氯甲烷)。在产物混合物的DMF溶液(60ml)中加入异丙醇(250ml)。产物立即沉淀，然后用iPrOH再结晶(三次)。产量22.12g(90％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ.98(d，CH3CH(OH)CH2，3H)；3.50(s，PEG，180H)；4.03(t，PEG-CH2，2H)；4.50(d，CH3CHOH，1H)；7.0(t，mPEG-OCONH)。
mPEG(5K)-尿烷-2-甲基丙醇(22.12g，4.34mmol)与甲苯(45ml)共沸干燥。其中加入二氯甲烷(60ml)。甲烷磺酰氯(604.6μl，7.81mmol，1.8当量)和TEA(3.93ml，28.21mmol，6.5当量)在0℃加入mPEG-溶液中同时继续搅拌并注意防潮。30分钟后，离开冷却浴，在室温下搅拌反应混合物16h。蒸发溶剂。添加乙酸乙酯以去除TEA盐。用异丙醇再结晶产物(三次)。产量20.27g(90％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ1.27(d，CH3CHOSO2CH3，3H)；3.162(s，CH3O2SOCH，3H)；3.50(s，PEG，180H)；4.07(t，PEG-CH2，2H)；4.64(q，CH3CHOH，1H)；7.43(t，mPEG-OCONH)。
mPEG(5K)-尿烷-2甲基-甲烷砜(10.27g，1.98mmol)与甲苯(20ml，每次)共沸干燥。0℃(在冰水中)添加氢化钠(377mg，9.4mmol，4.75eq)至无水甲苯(60ml)中。5分钟后，三苯甲硫醇(3.92g，14.6mmol，7.15当量)加到溶液中。10分钟后，mPEG-尿烷-2甲基-甲烷砜(10.27gm，1.98mmol)被加入反应混合物。它变成黄色溶液。45分钟后，TLC(CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶2)显示反应趋向于完成。反应混合物中加入醋酸(445.57μl，7.42mmol，3.75当量)以中和过量的氢化钠。溶液变得浓稠和发白。蒸发溶剂，用乙酸乙酯(30ml)和异丙醇(70ml)再结晶固体。产物混合物不完全溶解，但滤出沉淀。然后，用异丙醇/叔丁醇(100ml/20ml)再结晶产物混合物。产量8.87g(84％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ.74(d，CH3CHSC(C6H5)3，3H)，3.50(s，PEG，180H)，4.0(t，PEG-CH2，2H)，4.64(q，CH3CHOH，1H)；7.49(t，mPEG-OCONH)；7.20-7.41(m，SC(C6H5)3，15H)。
mPEG(5K)-尿烷-2甲基-三苯甲硫醇(8.87g，1.65mmol)0℃被溶解在TFA/CH2Cl2(10ml/10ml)中。在剧烈搅拌下，添加甲氧羰基烃基硫化氯(185.5μl，1.99mmol，1.2当量)到溶液中。室温下搅拌反应混合物15分钟。TLC(CHCI3∶MeOH＝90∶10)显示反应完成。蒸发溶剂。用异丙醇∶叔丁醇(80ml∶20ml)再结晶产物混合物两次。叔丁醇(5ml)加入产物中，然后冻干和在真空条件下经P2O5干燥以得到白色蓬松的固体产物(8.32g，97％产率)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ1.17(d，CH3CHSSCOOCH3，3H)；3.42(s，PEG，180H)；3.84(s，CH3OCOSSCH，3H)；4.05(t，mPEG-CH2，2H)；7.38(t，mPEG-OCONH，1H)。
mPEG(5K)-尿烷乙基(甲基)二硫代羰基甲醇盐(8.32g，1.6mmol)被溶解在无水甲醇(20ml)和氯仿(2.5ml)中。巯基苄醇(592mg，4mmol，2.5eq)的无水甲醇溶液(2ml)被加到PEG-溶液中。室温下搅拌反应混合物18h。蒸发溶剂，用乙酸乙酯/异丙醇，30ml/100ml再结晶产物混合物(3次)。NMR显示——形成了16％产物。于是，另一部分巯基苄醇(322mg，2.18mmol，1.8eq)的MeOH(2ml)溶液在0℃(冰水)逐滴地加入产物混合物的MeOH/CHCI3溶液(24ml/lml)中。添加完成(-10分钟)后，离开冰浴，室温下搅拌反应混合物24h。TLC(CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶2)显示反应完成。蒸发溶剂，然后用乙酸乙酯/异丙醇，30ml/100ml再结晶产物混合物。产量7.25g，(94％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ1.56(d，CH3CHSSC6H5CH2OH，3H)；3.29(CH3O-PEG，3H)；3.50(s，PEG，450H)；4.03(t，mPEG-CH2，2H)；4.46(d，HOCH2C6H5，2H)；5.16(t，HO CH2C6H5，1H)；7.30(d，C6H5，2H)；7.40(br t.mPEG-OCONH，1H)；7.50(d，C6H5，2H)。
mPEG(5K)-尿烷-乙基(甲基)-二硫代苄醇(6.75g，1.27mmol)被溶解在CHCI3(30ml)中，P-硝基苯基氯甲酸酯(513mg，2.54mmol，2当量)在0℃(冰水)下被加入其中。5分钟后，添加三乙胺(531μl，3.81mmol，3当量)。30分钟后离开冰浴，并室温下搅拌反应混合物过夜。溶剂被蒸发。产物混合物溶解在乙酸乙酯中。TEA盐被过滤掉，然后蒸发溶剂。然后用乙酸乙酯/异丙醇，30ml/100ml(三次)再结晶产物混合物。产量6.55g(94％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ1.17(d，CH3CHSSC6H5，3H)；3.24(CH3O-PEG，3H)；3.40(s，PEG，180H)；4.03(br t，mPEG-CH2，2H)；5.28(S，C6H5CH2OCO，2H)；7.45-8.35(m，C6H5)2，8H)。
mPEG-MeDTB-硝基苯基碳酸酯(766mg，0.14mmol，1.29eq)被溶解在CHCl3(5ml)中。DSPE(70mg，0.093mol)和TEA(58.5μl，0.42mmol，4.5eq)被加入PEG-溶液中，50℃下(油浴温度)搅拌。20分钟后，TLC显示反应没有趋向于完成。添加更多的mPEG-MeDTB-硝基苯基碳酸酯(总共1239mg，0.23mmol，2.47当量)和1-羟基苯并三唑(HOBt)(25mg，0.19mmol，2当量)。20分钟后，TLC(CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶2，及钼和茚三酮)显示反应完成。溶剂被蒸发。产物混合物溶解在温的(42℃)乙酸乙酯中。它是混浊的溶液(TEA盐沉淀)。过滤溶液，并蒸发溶剂。
在产物混合物中加入MeOH和2g的C8硅。溶剂再次蒸发。含C8硅的产物被加在柱的顶端，用MeOH∶H2O梯度(压力)洗脱，MeOH∶H2O 30∶70，100ml；MeOH H2O50∶50，100ml；MeOH H2O 70∶30，250ml(起始反应物洗脱)；MeOH H2O 75∶25＝40ml；MeOH H2O 80∶20，200ml(产物洗脱)；MeOH＝100ml；CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶2，100ml；CHCl3∶MeOH∶H2O＝75∶36∶6，100ml。混合含纯产物的馏分并蒸发干燥以得到无色浓稠液体的产物。添加叔丁醇(5ml)，冻干，然后在真空条件下经P2O5干燥以得到白色蓬松的固体产物(457mg，83％产率)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ0.83(d，2(CH3)，3H)；1.16(d，CH3CHSSC6H5，3H)；1.21(s，28(CH2，56H)；1.47(br m，CH2CH2CO，4H)；2.23(2xt，CH2CH2CO，4H)；3.50(s，PEG，180H)；4.04(br t，mPEG-CH2，2H)；4.05(trans d，PO4CH2CHCH2，1H)；4.24(cis d，PO4CH2CHCH2，1H)；4.97(s，C6H5OCO-DSPE，2H)；5.03(br s，(PO4CH2CH，1H)；7.32(d，C6H5 2H)；7.53(d，C6H5，2H)；7.52(br s，mPEG-OCONH，1H)。MALD异-TOFMS产生以相等的44Da距离间隔的钟形分布的离子，相当于环氧乙烷重复单位。共扼物和mPEG-硫醇(大部分裂解的二硫化物)的平均分子质量是6376和5368Da(理论分子质量——6053和5305道尔顿)。
B.mPEG-乙基DTB-DSPE mPEG-尿烷乙基(乙基)二硫代羰基甲醇盐(2g，0.90mmol)溶解在无水甲醇(8ml)中。开始时溶液是混浊的，但5分钟后变成清亮溶液。PEG-溶液中加入巯基苄醇(265.2mg，1.79mmol，2当量)。室温下搅拌反应混合物30小时。在反应溶液中加入乙醚(70ml)以沉淀产物，并保持4℃过夜。过滤白色固体，并用乙酸乙酯/乙醚，30ml/70ml再结晶。产量1.96g，(94％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ0.86(d，CH3CH2CHSSC6H5CH2OH，3H)；1.42(p，CH3CH2CHSSC6H5CH2OH，1H)；1.64(p，CH3CH2CHSSC6H5CH2OH，1H)；3.51(s，PEG，180H)；4.03(t，mPEG-CH2，2H)；4.47(d，HOCH2C6H5，2H)；5.20(t，HOCH2C6H5，1H)；7.31(d，C6H5，2H)；7.42(br t，mPEG-OCONH，1H)；7.49(d，C6H5，2H)。
正-羟基-s-降冰片烯-2，3-二羧基酸酰亚胺(HONB)(48mg，0.269mmol)在50℃(油浴温度)下加入DSPE(55mg，0.073mmol)的CHCI3(3ml)溶液。3-4分钟后，它变成清亮的溶液。然后，添加mPEG-EtDTB-硝基苯基氯甲酸酯(334mg，0.134mmol)，随后加三乙胺(TEA，45μl，0.329mmol)。20分钟后，TLC(CHCI3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶2)显示反应趋向于完成(钼和茚三酮喷雾)。溶剂被蒸发。产物混合物溶解在甲醇中，与C8硅(1g)混合，并通过旋转蒸发作用去除溶剂。固体残余物被加在CS-柱顶端，然后用MeOH∶H2O梯度(压力)洗脱，MeOH∶H2O＝30∶70，60ml；MeOH∶H2O＝50∶50，60ml；MeOH∶H2O＝70∶30，140ml；MeOH∶H2O＝75∶25＝140ml(起始反应物洗脱)；MeOH∶H2O＝80∶20，80ml；MeOH∶H2O＝90∶10，140ml(产物洗脱)；MeOH＝40ml；CHCI3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶10，40ml。混合含纯产物的馏分并蒸发干燥以得到无色浓稠液体的产物。添加叔丁醇(5ml)，冻干，然后在真空条件下经P2O5干燥以得到白色蓬松的固体产物(175mg，78％产率)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ0.85(d，2(CH3)，6H；d，CH3CHSSC6H5，3H)；1.22(s，28(CH2)，56H)；1.49(br m，CH2CH2CO，4H)；2.24(2xt，CH2CH2CO，4H)；3.50(s，PEG，180H)；4.04(br t，mPEG-CH2，2H)；4.08(trans d，PO4CH2CHCH2，1H)；4.27(cis d，PO4CH2CHCH2，1H)；4.98(s，C6H5CH2OCO-DSPE，2H)；5.06(brs，(PO4CH2CH，1H)；7.34(d，C6H5，2H)；7.53(d，C6H5，2H)；7.55(br s，mPEG-OCONH，1H)。
实例4 mPEG-DTB-硝基苯氯甲酸酯的合成 本反应流程图见图7所示。
A.1-(巯甲基)-氯化乙铵的合成步骤 1.2-氨基-1-甲基乙基硫酸氢盐 1-氨基-2-丙醇(22.53g，0.3mol)在冰浴中剧烈搅拌，在1小时内缓慢加入硫酸(16.10ml，0.3mol)，烧瓶中将形成浓雾和极其粘稠的溶液。加样完成后在低压环境下加热到170℃～180℃，反应液将变为淡褐色。当所有水份除去后(接近1小时)冷却至室温。在冷却过程中会形成一种玻璃样的褐色固体(用甲醇研磨后可结晶)，然后溶解于60℃水(50ml)中，并加入足量甲醇制成80％甲醇溶液。冷却时，形成的结晶需经过滤和P2O5干燥。产量17.17g(37％)，1H NMR(D6-DMSO)δ1.16(d，CH3，3H)；δ2.78(dd，NH3-CH2，1H)；δ2.97(dd，NH3-CH2，1H)；δ4.41(m，CH-OSO3，1H)；δ7.69(s，H3N，3H)。熔点248°～250℃(实际250℃)。
2.5-甲基噻唑烷-2-硫酮 2-氨基-1-甲基乙基硫酸氢盐(23.03g，148mmol)和二硫化碳(10.71ml，178mmol，1.2当量)置于一250ml圆底烧瓶内搅拌(内含50％乙醇40ml)，缓慢地逐滴加入氢氧化钠(13.06g，327mmol，2.2当量)溶于50％乙醇50ml)。滴加氢氧化钠过程中，所有反应起始物均溶解于液体中并变为橙色。反应经40分钟反流(85℃)后转呈鲜黄色，并有厚重的沉淀形成。蒸发乙醇，然后温热的水溶液经过Buchner漏斗过滤除去所有水溶性杂质。余下的结晶溶解于温乙醇并加入温水制成80％水溶液。冷却并冷冻该混合物，最终生成长针样结晶。产量14.64g(75％)。1H NMR(D6-DMSO)δ1.33(d，CH3，3H)；δ3.50(m，R3CH，1H)；δ3.95(dd，正-CH2，1H)；δ4.05(m，正-CH2，1H)；δ10.05(s，NH，1H)。熔点92.5～93.5℃(实际94～95℃)。
3.1-(巯甲基)乙基氯化铵 5-甲基噻唑烷-2-硫酮(6.5g，49mmol)置于一250ml圆底烧瓶内。加入一种盐酸水溶液(40ml，含18％水)并在油浴中加热。整个反应需经一周时间反流(120℃)。在这一周中还需3次加入1ml浓缩盐酸，并用TLC进行监测(使用乙酸乙酯作为洗脱剂)。利用紫外线、水合茚三酮和碘蒸汽可使这些物质显色。在大多数时间里反应物是混杂的——反应起始反应物是油性的，浓于水；一周后油性起始反应物耗尽(尽管TLC下仍可见)。除去加热装置令反应物冷却至室温，冷冻结晶起始反应物。过滤结晶的起始反应物。过滤物脱水并经P2O5干燥，用NaOH去除所有水份和盐酸。粗产物经两份二乙醚洗涤(每次50ml)除去所有起始反应物，再用P2O5干燥。产量2.83g(45％)。1H NMR(D6-DMSO)δ1.33(d，CH3，3H)；δ2.92(m，正-CH2，2H)；δ3.12(m，SH，1H)；δ3.18(m，R3-CH，1H)；δ8.23(bs，NH3，3H)。熔点80～82℃(实际92～94℃)。
B.mPEG-乙基-PTB-硝基苯基氯甲酸酯的合成 1.2-氨基-1-甲基乙基硫酸氢盐 1-氨基-2-丁醇(15ml，158mmol)置于100ml圆底烧瓶内，在冰浴条件下剧烈搅拌。在1小时的过程中缓慢加入硫酸(8.43ml，158mmol)。烧瓶中将形成浓雾和及其粘稠的溶液。加样完成后在与真空装置连接的低压环境下加热到170℃～180℃。加热过程中反应液将变为淡褐色。当所有水份除去后(接近1小时)冷却至室温。在冷却过程中会形成一种玻璃样的褐色固体，溶解于热水(50ml)，然放置冰箱过夜。冷却时，形成的结晶需经过虑和P2O5干燥。产量9.98g(37％)。1H NMR(D6-DMSO)δ0.87(t，CH3，3H)；δ1.51(q，CH3-CH2，2H)；δ2.82(dd，NH3-CH2，1H)；δ3.00(dd，NH3-CH2，1H)；δ4.21(m，CH-OSO3，1H)；δ7.70(s，H3N，3H)。
2.5-甲基噻唑烷-2-硫酮 2-氨基-1-乙基-硫酸氢乙酯(9.98g，59mmol)和二硫化碳(4.26ml，71mmol，1.2当量)置于一100ml圆底烧瓶内搅拌(内含50％乙醇15ml)。非常缓慢地逐滴加入溶于50％乙醇(20ml)的氢氧化钠(5.20g，130mmol，2.2当量)。滴加氢氧化钠的过程中，所有反应起始物均溶解于液体中并变为橙色。反应经40分钟反流(85℃)后转呈鲜黄色，并有厚重的沉淀形成。蒸发乙醇，然后水溶液经过Buchner漏斗过滤除去所有水溶性杂质。余下的结晶溶解于温乙醇并加入温水制成80％水溶液。冷却并冷冻该混合物，最终生成长针样结晶。产量7.28g(86％)。1H NMR(D6-DMSO)δ0.88(t，CH3，3H)；δ1.66(in，CH3-CH2，2H)；δ3.58(m，R3CH，1H)；δ3.93(m，正-CH2，2H)；δ10.06(s，NH，1H)。熔点76～78℃(实际76.6～76.9℃)。
3.1-(巯甲基)乙基氯化铵 5-甲基噻唑烷-2-硫酮(7.24g，50mmol)置于一250ml圆底烧瓶内。加入一种盐酸水溶液(45ml，含18％水)并在油浴中加热。加热过程中，整个反应需经一周时间反流(120℃)。在这一周中还需4次加入1ml浓缩盐酸，并用TLC进行监测(使用乙酸乙酯作为洗脱剂)。利用紫外线、水合茚三酮和碘蒸汽可使这些物质显色。在大多数时间里反应物是混杂的——反应起始反应物是油性的，浓于水；一周后油性起始反应物耗尽(尽管TLC下仍可见)。除去加热装置令反应物冷却至室温，冷冻后结晶并过滤结晶的起始反应物。过滤物脱水并经P2O5干燥，用NaOH去除所有水份和盐酸。粗产物经两份二乙醚洗涤(每次50ml)除去所有起始反应物，再用P2O5干燥。产量3.66g(52％)。1H NMR(D6-DMSO) 实例5 mPEG-DTB-脂类的合成 本反应设计见图8A所示。
1，2-二硬脂酰-s正-甘油(500mg，0.8mmol)与苯共沸3次进行干燥。对硝基苯基氯甲酸酯(242mg，1.2mmol，1.5当量)，二甲基氨基吡啶(DMAP)(10mg，0.08mmol，0.1当量)以及TEA(334.5μl，2.4mmol，3当量)加到1，2-二硬脂酰甘油和CHCl3的混合物(5ml)中。室温搅拌2小时，由TLC(甲苯∶乙酸乙酯＝7∶3)显示反应完成。产物混合物随后进行萃取用10％柠檬酸去除二甲基氨基吡啶(DMAP)，用乙腈(3ml，4次)去除多余的对硝基苯基氯甲酸酯。纯化产物在真空条件下经P2O5干燥。产量557mg(88％)。1H NMR(CHCl3，360MHz)50.88(t，end CH3，6H)；1.25(s，28xCH2，56H)；1.58(m，CH2CH2CO，4H)；2.34(2xt，CH2CO，4H)；4.22(trans d，CH2OCOC17H35，1H)；4.35(m，OCOOCH2CH，2H)；4.51(cis d，CH2OCOC17H35，1H)；5.37(m，OCOOCH2CH，1H)；7.39(d，C6H5，2H)8.28(d，C6H5，2H)。
乙二胺(42μl，0.63mmol，5倍过量)和吡啶(200μl)加到CHCl3(1ml)中。2-二硬脂酰-s正-对硝基苯基碳酸酯(100mg，0.13mmol)溶于CHCl3(1ml)，在0℃(冰水)用巴斯德移液管逐滴加入至乙二胺溶液并持续过夜(16小时)。由TLC(CHCl3∶MeOH∶H2O 90∶18∶2，和CHCl3∶MeOH＝90∶10)显示反应完成。蒸发溶剂以去除吡啶。然后，产物混合物溶解于CHCl3，上柱(Aldrich，Silicagel，60_，200-400目)，并经CHCl3洗脱∶CH3COCH3和CHCl3∶MeOH梯度，CHCl3∶CH3COCH3＝90∶10，60ml(洗脱的上部)；CHCl3∶NeOH＝90∶10，60ml(洗脱的产物)。混合含纯净产物的各个馏分并蒸发。加入叔丁醇在真空条件下经P2O5干燥。产量64mg(75％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ.83(t，end CH3，6H)；1.22(s，28xCH2，56H)；1.51(m，CH2CH2CO，4H)；2.25(2xt，CH2CO，4H)；2.83(m，H2NCH2CH2NH，2H)；3.21(m，H2NCH2CH2NH，2H)；4.10-4.14(m & cis d，COOCH2CHCH2，4H)；5.17(m，OCOOCH2CH，1H)；7.78(m，H2NCH2CH2NH，2H)。
mPEG-MeDTB-硝基苯基氯甲酸酯(400mg，0.162mmol，2.2当量)溶于CHCl3(2ml)中。1，2-硬脂酰-s正-乙烯胺(51mg，0.075mmol)和TEA(37μl，0.264mmol，3.52当量)同时加入到溶液中，然后45℃搅拌20分钟进行反应，TLC(CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶2，而且CHCl3∶MeOH＝90∶10)显示反应完成。蒸发溶剂后，产物混合物溶于甲醇中，继而加入2g C8硅石，并再次蒸发溶剂。此后含产物混合物的C8硅石加到C8柱的顶部(Supelco，Supel clean，Lot no.SP0824)并用MeOH∶H2O梯度(压力)洗脱，MeOH∶H2O＝60∶40，40ml；MeOH∶H2O＝70∶30，80ml(起始反应物洗脱)；MeOH∶H2O＝80∶20，40ml；MeOH∶H2O＝90∶10＝20ml；CHCl3∶MeOH∶H2O＝5∶80∶15，20ml；CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶10，40ml(产物洗脱)。混合含纯净产物的各个馏分并蒸发，所得产物为无色粘稠液体。加入叔丁醇(5ml)，然后冻干溶液并在真空条件下经P2O5干燥，产物为白色固体。(200mg，产量89％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δδ.83(t，CH3，6H)；1.22(s，28xCH2，56H)；1.48(m，CH2CH2CO，4H)；2.25(2xt，CH2CO，4H)；3.10(m，HNCH2CH2NH，4H)；3.50(s，PEG，180H)；4.04(t，mPEG-CH2，2H)；4.09(trans d，COOCH2CHCH2，1H)；4.25(cis d，COOCH2CHCH2，1H)；4.98(s，C6H5CH2OCO，2H)；5.23(m，COOCH2CHCH2，1H)；7.18(m，NHCH2CH2NH，2H)；7.33(d，C6H5，2H)；7.38(m，mPEG-OCONH，1H)；7.52(d，C6H5，2H)。实例6 含核酸脂质体的制备 脂质体的制备是将所需的脂质组分以所需的摩尔比例溶于有机溶剂制成溶液，然后与pH4～5的5％葡萄糖水合。脂质组分和组分的摩尔比例在下面例子中有详述。
编码荧光素酶的pNSL质粒按美国专利5,851,818所述构建，所需两个质粒均来自市售产品，pGFP-N1质粒(来自Clontech，Palo Alto，CA)，pGL3-C(来自Promega Corporation，Madison，WI)。荧光素酶报告质粒DNA溶液缓慢加入酸性脂质体溶液中，持续搅拌10分钟。
依据本领域中已知的方法(Gabizon A等人，Bioconjugate Chem.，1999，10289)将FGF或叶酸配体共轭至马来酰亚胺-PEG-DSPE上。DNA-脂质体复合物与mPEG-DSPE，FGF-PEG-DSPE或者叶酸-PEG-DSPE微胶粒溶液共同孵育20分钟，并不断搅拌以使配体-PEG-脂质能够插入到预先形成的脂质体中。
实例7 在肿瘤组织中的活体转染和表达 A.肿瘤模型 KB肿瘤细胞(100万细胞)皮下接种至裸鼠侧腹部。给予小鼠低叶酸饮食以上调KB肿瘤细胞上叶酸受体的表达。此模型用于以肿瘤血管内皮细胞为靶向目标的叶酸共轭脂质体-DNA复合物。
Lewis肺癌细胞(100万细胞)皮下接种至B6C3-F1鼠侧腹部。FGF受体在血管内皮细胞或肿瘤细胞上均有表达。此模型用于以肿瘤血管内皮细胞为靶向目标的FGF共轭脂质体-DNA复合物。
B.脂质体配方 在实例6中按照如下的脂质组分制备了5种脂质体配方。
配方No.7-1 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的60摩尔百分比胆固醇总脂质的40摩尔百分比荧光素酶质粒100μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 配方No.7-2 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的60摩尔百分比胆固醇总脂质的40摩尔百分比mPEG-DTB-DSPE(FC PEG)总脂质的5摩尔百分比荧光素酶质粒100μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 配方No.7-3 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的40摩尔百分比PHSPC总脂质的60摩尔百分比mPEG-DTB-DSPE(″FC PEG)总脂质的5摩尔百分比荧光素酶质粒100μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 配方No.7-4 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的40摩尔百分比PHSPC总脂质的60摩尔百分比mPEG-DSPE总脂质的5摩尔百分比荧光素酶质粒100μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 配方No.7-5 组分量DDAB总脂质的55摩尔百分比PHSPC总脂质的45摩尔百分比荧光素酶质粒100μg叶酸靶向配体15FGF/脂质体 C.体内给药 15只接种了Lewis肺癌细胞的小鼠随机分入4个实验组，接受上述配方1-5中的一种。脂质体-DNA复合物静脉注入小鼠(剂量为200μg DNA质粒)，24小时后收集肿瘤和其他组织，组织提取物的荧光素酶表达经荧光素酶法测定，结果见表1。实例8 FGF-靶向脂质体-DNA复合物的体内给药 A.Matrigel肿瘤模型 小鼠Matrigel_肿瘤模型用于以FGF-血管内皮细胞为靶向目标的肿瘤血管系统。Matrigel_中的血管内皮细胞类似于肿瘤血管内皮细胞，这些Matrigel_内皮细胞(只是内皮细胞，没有肿瘤细胞)模拟了肿瘤内皮细胞被用于研究以FGF为靶向目标的脂质体/核酸复合物的活体转染和表达。当注入小鼠皮下后，Matrigel_形成固体胶状物并诱发迅速而强烈的血管反应。
R.脂质体配方 在实例6中按照如下的脂质组分制备了9种脂质体配方。
配方No.8-1 组分量DOTAP总脂质的55摩尔百分比胆固醇总脂质的45摩尔百分比荧光素酶质粒100μg 配方No.8-2 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的40摩尔百分比PHSPC总脂质的60摩尔百分比荧光素酶质粒200μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 配方No.8-3 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的40摩尔百分比PHSPC总脂质的60摩尔百分比FC-PEG总脂质的1摩尔百分比荧光素酶质粒200μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 配方No.8-4 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的35摩尔百分比DOTAP总脂质的30摩尔百分比PHSPC总脂质的35摩尔百分比荧光素酶质粒200μg 配方No.8-5 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的35摩尔百分比DOTAP总脂质的30摩尔百分比PHSPC总脂质的35摩尔百分比荧光素酶质粒200μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 配方No.8-6 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的35摩尔百分比DOTAP总脂质的30摩尔百分比PHSPC总脂质的35摩尔百分比FC-PEG总脂质的1摩尔百分比荧光素酶质粒200μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 配方No.8-7 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的42.5摩尔百分比GC33总脂质的22.5摩尔百分比PHSPC总脂质的35摩尔百分比荧光素酶质粒250μg 配方No.8-8 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的42.5摩尔百分比GC33总脂质的22.5摩尔百分比PHSPC总脂质的35摩尔百分比荧光素酶质粒250μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 配方No.8-9 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的42.5摩尔百分比GC33总脂质的22.5摩尔百分PHSPC总脂质的35摩尔百分比FC-PEG总脂质的1摩尔百分比荧光素酶质粒250μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 C.体内给药 27只小鼠注射了Matrigel_。植入Matrigel 6天后，小鼠被随机编入处理组中(n＝3)，接受上述B章节中所述的9种配方之一的处理。静脉注射脂质体-DNA复合物，剂量为200μg DNA质粒。FGF靶向脂质体-DNA复合物给药后24小时后检测Matrigel、肺以及肝脏荧光素酶的表达，结果如表2所示。 实例9 体内给药FGF靶向脂质体-DNA复合物 A.试验动物 小鼠用Lewis肺癌细胞接种，如实例7A所述。
B.脂质体配方 按照实例6所述制备了9种如下脂质组分的脂质体配方。
配方No.9-1 组分量DOTAP总脂质的55摩尔百分比胆固醇总脂质的45摩尔百分比荧光素酶质粒100μg 配方No.9-2组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的40摩尔百分比PHSPC总脂质的60摩尔百分比荧光素酶质粒200μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 配方No.9-3 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的40摩尔百分比PHSPC总脂质的60摩尔百分比FC-PEG总脂质的1摩尔百分比荧光素酶质粒200μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 配方No.9-4 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的35摩尔百分比DOTAP总脂质的30摩尔百分比PHSPC总脂质的35摩尔百分比荧光素酶质粒200μg 配方No.9-5 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的35摩尔百分比DOTAP总脂质的30摩尔百分比PHSPC总脂质的35摩尔百分比荧光素酶质粒200μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 配方No.9-6 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的35摩尔百分比DOTAP总脂质的30摩尔百分比PHSPC总脂质的35摩尔百分比 FC-PEG总脂质的1摩尔百分比荧光素酶质粒200μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 配方No.9-7 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的42.5摩尔百分比GC33总脂质的22.5摩尔百分比PHSPC总脂质的35摩尔百分比荧光素酶质粒250μg 配方No.9-8 组分HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的42.5摩尔百分比GC33总脂质的22.5摩尔百分比PHSPC总脂质的35摩尔百分比荧光素酶质粒250μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 配方No.9-9 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的42.5摩尔百分比GC33总脂质的22.5摩尔百分比PHSPC总脂质的35摩尔百分比FC-PEG总脂质的1摩尔百分比荧光素酶质粒250μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 C.体内给药 接种肿瘤细胞9天后，27只荷瘤小鼠随机分入处理组中(n＝3)，接受上述9种配方之一，配方(9-1)至配方(9-9)的处理。静脉注射脂质体-DNA复合物，剂量为200μg DNA质粒。FGF靶向脂质体-DNA复合物给药后24小时检测肿瘤、肺以及肝荧光素酶的表达，结果如表3所示。 实例10 体内给药FGF靶向脂质体-DNA复合物 A.试验动物 小鼠用Lewis肺癌细胞接种，如实例7A所述。在两侧侧腹部注入Matrigel，如实例8A所述。
B.脂质体配方 按照实例6制备了7种如下脂质组分的脂质体配方。
配方No.10-1 组分量DOTAP总脂质的55摩尔百分比胆固醇总脂质的45摩尔百分比荧光素酶质粒100μg 配方No.10-2 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的35摩尔百分比DOTAP总脂质的30摩尔百分比CHOL总脂质的35摩尔百分比荧光素酶质粒200μg 配方No.10-3 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的35摩尔百分比DOTAP总脂质的30摩尔百分比CHOL总脂质的35摩尔百分比荧光素酶质粒200μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 配方No.10-4 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的35摩尔百分比DOTAP总脂质的30摩尔百分比CHOL总脂质的35摩尔百分比FC-PEG总脂质的1摩尔百分比荧光素酶质粒200μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 配方No.10-5 组分量 HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的53.75摩尔百分比GC33总脂质的11.25摩尔百分比PHSPC总脂质的35摩尔百分比荧光素酶质粒200μg 配方No.10-6 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的53.75摩尔百分比GC33总脂质的11.25摩尔百分比PHSPC总脂质的35摩尔百分比荧光素酶质粒200μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 配方No.10-7 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的53.75摩尔百分比GC33总脂质的11.25摩尔百分比PHSPC总脂质的35摩尔百分比FC-PEG总脂质的1摩尔百分比荧光素酶质粒200μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 C.体内给药 接种肿瘤细胞9天后，21只荷瘤小鼠随机分入处理组中(n＝3)，接受上述7种配方之一，配方(10-1)至配方(10-7)的处理。静脉注射脂质体-DNA复合物，剂量为200μg DNA质粒。FGF靶向脂质体-DNA复合物给药后24小时检测Matrigel、肿瘤、肺以及肝荧光素酶的表达，结果如表4所示。
实例11 体内给药FGF靶向脂质体-DNA复合物 A.试验动物 Matrigel植入小鼠，如实例8A所述。
B.脂质体配方 按照实例6制备了8种如下脂质组分的脂质体配方。
配方No.11-1 组分量DOTAP总脂质的55摩尔百分比胆固醇总脂质的45摩尔百分比 荧光素酶质粒100μg 配方No.11-2 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的40摩尔百分比PHSPC总脂质的60摩尔百分比荧光素酶质粒200μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 配方No.11-3 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的35摩尔百分比DOTAP总脂质的30摩尔百分比PHSPC总脂质的35摩尔百分比荧光素酶质粒200μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 配方No.11-4 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的35摩尔百分比DOTAP总脂质的30摩尔百分比CHOL总脂质的35摩尔百分比荧光素酶质粒200μg 配方No.11-5 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的35摩尔百分比DOTAP总脂质的30摩尔百分比CHOL总脂质的35摩尔百分比荧光素酶质粒200μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 配方No.11-6 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的35摩尔百分比DOTAP总脂质的30摩尔百分比CHOL总脂质的35摩尔百分比FC-PEG总脂质的4摩尔百分比荧光素酶质粒200μg FGF靶向配体 15FGF/脂质体 配方No.11-7 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的35摩尔百分比DOTAP总脂质的30摩尔百分比CHOL总脂质的35摩尔百分比荧光素酶质粒200μgsialyl-Lewis X靶向配体15/脂质体 配方No.11-8 组分量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的45摩尔百分比DOTAP总脂质的20摩尔百分比CHOL总脂质的35摩尔百分比荧光素酶质粒200μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 C.体内给药 植入Matrigel 6天后，24只小鼠随机分入处理组中(n＝3)，接受上述8种配方之一，配方(11-1)至配方(11-8)的处理。静脉注射脂质体-DNA复合物，剂量为200μg DNA质粒。FGF靶向脂质体-DNA复合物给药后24小时检测Matrigel、肺和肝荧光素酶的表达，结果如表5所示。
实例12 体内给药FGF靶向脂质体-DNA复合物 A.试验动物 小鼠用Lewis肺癌细胞接种，如实例7A所述。
B.脂质体配方 按照实例6制备了5种如下脂质组分的脂质体配方。
配方No.12-1 组分量DOTAP总脂质的55摩尔百分比胆固醇总脂质的45摩尔百分比荧光素酶质粒100μg 配方No.12-2 组分(＞5天)量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的40摩尔百分比PHSPC总脂质的60摩尔百分比 荧光素酶质粒200μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 配方No.12-3 组分(1天)量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的40摩尔百分比PHSPC总脂质的60摩尔百分比荧光素酶质粒200μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 配方No.12-4 组分(＞5天)量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的35摩尔百分比DOTAP总脂质的30摩尔百分比胆固醇总脂质的35摩尔百分比FC-PEG总脂质的1摩尔百分比荧光素酶质粒200μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 配方No.12-5 组分(1天)量HDSG中性阳离子脂质(图1中化合物V)总脂质的35摩尔百分比DOTAP总脂质的30摩尔百分比胆固醇总脂质的35摩尔百分比FC-PEG总脂质的1摩尔百分比荧光素酶质粒200μgFGF靶向配体15FGF/脂质体 C.体内给药 接种肿瘤细胞9天后，15只荷瘤小鼠随机分入处理组中(n＝3)，接受上述5种配方之一，配方(12-1)至配方(12-5)的处理。静脉注射脂质体-DNA复合物，剂量为100μg DNA质粒。配方12-1、12-3和12-5给药后24小时，配方12-2和12-4给药后5天，分别检测肿瘤、肺和肝荧光素酶的表达，结果如表6所示。实例13 体内给予叶酸-靶向的脂质体-DNA复合物 A.试验动物 小鼠接种KB癌细胞，并如实例7A所述饲养。
B.脂质体配方 如实例6所述用以下脂质组分制备八个脂质体配方 配方No.13-1 组分量DOTAP总脂质的55摩尔百分比胆固醇总脂质的45摩尔百分比荧光素酶质粒100μg 配方No.13-2 组分量HDSG中性-阳离子脂质(图1的化合物V)总脂质的40摩尔百分比PHSPC总脂质的60摩尔百分比荧光素酶质粒200μg叶酸靶向配体30叶酸/脂质体 配方No.13-3 组分量HDSG中性-阳离子脂质(图1的化合物V)总脂质的40摩尔百分比PHSPC总脂质的60摩尔百分比FC-PEG总脂质的4摩尔百分比荧光素酶质粒200μg叶酸靶向配体30叶酸/脂质体 配方No.13-4 组分量HDSG中性-阳离子脂质(图1的化合物V)总脂质的35摩尔百分比DOTAP总脂质的30摩尔百分比PHSPC总脂质的35摩尔百分比荧光素酶质粒200μg叶酸靶向配体30叶酸/脂质体 配方No.13-5 组分量HDSG中性-阳离子脂质(图1的化合物V)总脂质的35摩尔百分比DOTAP总脂质的30摩尔百分比PHSPC总脂质的35摩尔百分比FC-PEG总脂质的4摩尔百分比 荧光素酶质粒200μg叶酸靶向配体30叶酸/脂质体 配方No.13-6 组分量HDSG中性-阳离子脂质(图1的化合物V)总脂质的42.5摩尔百分比GC33总脂质的22.5摩尔百分比PHSPC总脂质的35摩尔百分比荧光素酶质粒250μg叶酸靶向配体30叶酸/脂质体 配方No.13-7 组分量HDSG中性-阳离子脂质(图1的化合物V)总脂质的42.5摩尔百分比GC33总脂质的22.5摩尔百分比PHSPC总脂质的35摩尔百分比SC-PEG总脂质的4摩尔百分比荧光素酶质粒250μg叶酸靶向配体30叶酸/脂质体 配方No.13-8 组分量HDSG中性-阳离子脂质(图1的化合物V)总脂质的42.5摩尔百分比GC33总脂质的22.5摩尔百分比PHSPC总脂质的35摩尔百分比FC-PEG总脂质的4摩尔百分比荧光素酶质粒250μg叶酸靶向配体30叶酸/脂质体 C.体内给药 接种瘤细胞后9天，24只荷瘤小鼠被随机分进处理组(n＝3)，用配方(13-1)至配方(13-8)的配方之一处理。脂质体-DNA联合体以100μg DMA质粒的剂量静脉内给药。给药后24小时，检测肿瘤、肺和肝中的荧光素酶表达。结果显示在表7中。 实例14体内给予叶酸-靶向的脂质体-DNA联合体 A.试验动物 小鼠接种KB癌细胞，并如实例7A所述饲养。
B.脂质体配方 如实例6所述用以下脂质组分制备六个脂质体配方 配方No.14-1 组分量DOTAP总脂质的55摩尔百分比胆固醇总脂质的45摩尔百分比荧光素酶质粒100μg 配方No.14-2 组分量HDSG中性-阳离子脂质(图1的化合物V)总脂质的35摩尔百分比DOTAP总脂质的30摩尔百分比胆固醇总脂质的35摩尔百分比荧光素酶质粒200μg叶酸靶向配体30叶酸/脂质体 配方No.14-3 组分量HDSG中性-阳离子脂质(图1的化合物V)总脂质的35摩尔百分比DOTAP总脂质的30摩尔百分比胆固醇总脂质的35摩尔百分比FC-PEG总脂质的4摩尔百分比荧光素酶质粒200μg叶酸靶向配体30叶酸/脂质体 配方No.14-4 组分量HDSG中性-阳离子脂质(图1的化合物V)总脂质的45摩尔百分比DOTAP总脂质的20摩尔百分比胆固醇总脂质的35摩尔百分比荧光素酶质粒200μg叶酸靶向配体30叶酸/脂质体 配方No.14-5 组分量HDSG中性-阳离子脂质(图1的化合物V)总脂质的45摩尔百分比DOTAP总脂质的20摩尔百分比 胆固醇总脂质的35摩尔百分比FC-PEG总脂质的4摩尔百分比荧光素酶质粒200μg叶酸靶向配体30叶酸/脂质体 C.体内给药 接种瘤细胞后9天，18只荷瘤小鼠被随机分进处理组(n＝3)，用配方(14-1)至配方(14-6)的配方之一处理。脂质体-DNA联合体以100μg DNA质粒的剂量静脉内给药。给药后24小时，检测肿瘤、肺和肝中的荧光素酶表达。结果显示在表8中。 实例15 体内给予叶酸靶向的脂质体-DNA联合体 A.试验动物 小鼠接种KB癌细胞，并如实例7A所述饲养。
B.脂质体配方 如实例6所述用以下脂质组分制备七个脂质体配方 配方No.15-1 组分量DOTAP总脂质的55摩尔百分比胆固醇总脂质的45摩尔百分比荧光素酶质粒100μg 配方No.15-2 组分量HDSG中性-阳离子脂质(图1的化合物V)总脂质的40摩尔百分比PHSPC总脂质的60摩尔百分比荧光素酶质粒200μg叶酸靶向配体30叶酸/脂质体 配方No.15-3 组分量HDSG中性-阳离子脂质(图1的化合物V)总脂质的40摩尔百分比PHSPC总脂质的60摩尔百分比FC-PEG总脂质的4摩尔百分比荧光素酶质粒200μg叶酸靶向配体30叶酸/脂质体 配方No.15-4 组分量 HDSG中性-阳离子脂质(图1的化合物V)总脂质的35摩尔百分比DOTAP总脂质的30摩尔百分比PHSPC总脂质的35摩尔百分比荧光素酶质粒200μg叶酸靶向配体30叶酸/脂质体 配方No.15-5 组分量HDSG中性-阳离子脂质(图1的化合物V)总脂质的35摩尔百分比DOTAP总脂质的30摩尔百分比PHSPC总脂质的35摩尔百分比FC-PEG总脂质的2.3摩尔百分比荧光素酶质粒200μg叶酸靶向配体30叶酸/脂质体 配方No.15-6 组分量HDSG中性-阳离子脂质(图1的化合物V)总脂质的35摩尔百分比DOTAP总脂质的30摩尔百分比胆固醇总脂质的35摩尔百分比荧光素酶质粒200μg叶酸靶向配体30叶酸/脂质体 配方No.15-7 组分量HDSG中性-阳离子脂质(图1的化合物V)总脂质的35摩尔百分比DOTAP总脂质的30摩尔百分比胆固醇总脂质的35摩尔百分比FC-PEG总脂质的2.3摩尔百分比荧光素酶质粒200μg叶酸靶向配体30叶酸/脂质体 C.体内给药 接种瘤细胞后9天，21只荷瘤小鼠被随机分进处理组(n＝3)，用配方(15-1)至配方(15-7)的配方之一处理。脂质体-DNA联合体以100μg DMA质粒的剂量静脉内给药。给药后24小时，检测肿瘤、肺和肝中的荧光素酶表达。结果显示在表9中。
尽管本发明已经就特殊实施例进行了描述，显然，本领域技术人员可以在不背离本发明的情况下做出各种变化和修改。
权利要求
1.一种给予核酸的组合物，包含
(a)含有以下部分的脂质体
(i)具有如下结构式的脂质
其中每个R1和R2是具有8-24个碳原子的烷基或烯基链；
n＝0-20；
L选自(1)-X-(C＝O)-Y，(2)-X-(C＝O)-，和(3)-X，其中X和Y独立地选自氧、NH和直接结合键；
Z是pK小于7.4并大于大约4.0的弱碱部分；和
(ii)具有如下通式结构的化合物
其中R3是亲水聚合物，包含附着二硫代苄基部分的连接键；R4选自H、烷基和芳基；R5选自O(C＝O)R7、S(C＝O)R7和O(C＝S)R7；R7包括含胺的脂质；和R6选自H、烷基和芳基；其中CH2-R5的方位选自邻位和对位；和
(b)与所述脂质体相结合的核酸。
2.根据权利要求1的组合物，其中X是NH，Y是氧。
3.根据权利要求1的组合物，其中L是氨基甲酸盐键、酯键或碳酸酯键。
4.根据权利要求1的组合物，其中L是NH-(C＝O)-O-CH2。
5.根据权利要求1的组合物，其中Z是咪唑。
6.根据权利要求1的组合物，其包含1-80摩尔百分比之间的脂质。
7.根据权利要求1的组合物，其中Z是pK值在5.0-6.5之间的部分。
8.根据权利要求1的组合物，其中每一个R1和R2是具有8-24个碳原子之间的无支链烷基或烯基链。
9.根据权利要求8的组合物，其中每一个R1和R2是C17H35。
10.根据权利要求1的组合物，其中n在1-10之间。
11.根据权利要求1的组合物，其中R6是H，R4选自CH3、C2H5和C3H8。
12.根据权利要求1的组合物，其中含胺脂质包括单烃尾或双烃尾。
13.根据权利要求1的组合物，其中含胺脂质是具有双烃尾的磷脂。
14.根据权利要求1的组合物，其中R4和R6是烷基。
15.根据权利要求1的组合物，其中R3选自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基噁唑啉、聚羟丙基-甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基-丙烯酰胺、聚羟丙基甲基丙烯酸酯、聚羟乙基丙烯酸酯、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙二醇、聚天冬酰胺、其共聚物，和聚环氧乙烯-聚环氧丙烯。
16.根据权利要求1的组合物，其中R3是聚乙二醇。
17.根据权利要求16的组合物，其中R6是H，R4是CH3或C2H5。
18.根据权利要求1的组合物，其中所述的脂质体包括5-20摩尔百分比之间的化合物。
19.根据权利要求1的组合物，进一步包括脂质体中包裹的治疗性化合物。
20.根据权利要求1的组合物，其中所述的核酸被包裹在所述脂质体至少一部分中。
21.根据权利要求20的组合物，其中所述的核酸选自DNA、RNA、其片段和寡核苷酸。
22.根据权利要求1的组合物，进一步包括靶向脂质体到靶部位的配体，所述的配体在所述化合物上共价地附着在亲水聚合物R3的远端。
23.根据权利要求22的组合物，其中的配体具有对内皮肿瘤细胞的结合亲合力，以被这种细胞内化。
24.根据权利要求22的组合物，其中的配体选自E-选择素、Her-2和FGF。
25.根据权利要求22的组合物，其中所述的配体选自HER2/neu癌基因的c-erbB-2蛋白产物、表皮生长因子(EGF)受体、碱性成纤维细胞生长受体(碱性FGF)受体、血管内皮生长因子受体、E-选择素受体、L-选择素受体、P-选择素受体、叶酸受体、CD4受体、CD19受体、αβ整合素受体和趋化因子受体。
26.根据权利要求1的组合物，其中所述的脂质体进一步包含阳离子脂质。
全文摘要
本发明描述了一种体内或体外递送核酸的脂质体组合物。组合物中的脂质体含有(i)在生理的pH下是中性电荷，在低于生理pH的pH值下是正电荷的脂类；和(ii)通过二硫代苄基键与亲水聚合物连接的脂类。脂质体与核酸联合以递送给细胞。
文档编号C07D233/54GK1617710SQ0282490
公开日2005年5月18日 申请日期2002年12月5日 优先权日2001年12月12日
发明者黄世昆, S·扎利普斯基, 张伟明 申请人:阿尔扎公司