具有血小板生成活性的肽和相关的化合物的制作方法

专利名称：具有血小板生成活性的肽和相关的化合物的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及具有血小板生成活性的肽和相关的化合物。本发明的化合物可以用于提高哺乳动物中血小板或血小板前体(例如，巨核细胞)的生成。
背景技术：
本发明涉及具有刺激血小板和它们的前体细胞例如巨核细胞的体内和体外的生产能力的化合物，特别是肽。下面是作为背景提供的已知具有血小板生成活性的两种蛋白质血小板生成素(TPO)和巨核细胞生长和发育因子(MGDF)。
内源血小板生成素(TPO)的克隆(Lok等，自然，369568-571(1994)；Bartley等，细胞，771117-1124(1994)；Kuter等，美国国家科学院院刊，9111104-11108(1994)；de Sauvage等，自然，369533-538(1994)；Kato等，生物化学杂志，119229-236(1995)；Chang等，生物化学杂志，270511-514(1995))已经快速地加深了我们对巨核细胞生成(巨核细胞生产)和血小板生成(血小板生产)的了解。
内源的人TPO，主要是在肝和肾中生产的60到70kDa的糖基化蛋白质，是由332个氨基酸组成的(Bartley等，细胞，771117-1124(1994)；Chang等，生物化学杂志，270551-514(1995))。该蛋白质在不同物种之间是高度保守的，而在氨基末端(氨基酸1到172)(Bartley等，细胞，771117-1124(1994)与人红细胞生成素具有23％的同源性(Gurney等，血液，85981-988(1995))。内源TPO已经显示具有生成血小板的主要生物调节物的所有特征。它的体外的作用包括从纯化的小鼠造血干细胞(Zeigler等，血液，844045-4052(1994))和人CD34+细胞(Lok等，自然，369568-571(1994)；Rasko等，干细胞，1533-42(1997))特异地诱导巨核细胞克隆，产生倍性增加的巨核细胞(Broudy等，血液，85402-413(1995))，和诱导末端巨核细胞的成熟和产生血小板(Zeigler等，血液，8440445-4052(1994)；Choi等，血液，85402-413(1995)。相反，合成的TPO受体(c-mpl)反义寡聚脱氧核苷酸能明显抑制巨核细胞祖先的克隆形成能力(Methia等，Blood，821395-1401(1993))。另外，c-mpl敲出小鼠是严重的血小板减少和缺少巨核细胞的(Alexander等，血液，872162-2170(1996))。
重组的人MGDF(rHuMGDF，Amgen Inc.，Thousand Oaks，CA)是与TPO相关的另一个血小板生成多肽。它是利用质粒转化的大肠杆菌生产的，该质粒中含有编码截短的蛋白质的cDNA，截短的蛋白质中包括人TPO的氨基末端受体结合区(Ulich等，血液，86971-976(1995))。将该多肽萃取，再折叠，和纯化，将聚乙二醇(PEG)成分共价地附着于氨基末端。得到的分子在本文中称为PEG-rHuMGDF或简短地称为MGDF。
利用动物模型的各种研究(Ulich，T.R.等，血液，86971-976(1995)；Hokom，M.M.等，血液，864486-4492(1995))已经清楚地证明了在骨髓移植中和在血小板减少的治疗中，经常是化学治疗或放射治疗产生的症状的治疗中的TPO和MGDF的治疗效果。在人中的最初的数据已经证明在各种设备中提高血小板计数中MGDF有用途(Basser等，Lancet3481279-81(1996)；Kato等，生物化学杂志，119229-236(1995)；Ulich等，血液，86971-976(1995))。MGDF可以用于加强血小板供应过程，因为施用MGDF在健康的血小板供体中将循环的血小板计数从起初的值提高了约3倍。
TPO和MGDF通过结合c-mpl受体发挥它们的作用，c-mpl受体最初是在一些造血细胞如巨核细胞的表面，血小板，CD34+细胞和最初的祖先细胞上表达的(Debili，N.等，血液，85391-401(1995)；de Sauvage，F.J.et al，自然，369533-538(1994)；Bartley，T.D.等，细胞，771117-1124(1994)；Lok，S.等，自然，369565-8(1994))。象大多数白细胞介素和蛋白质激素的受体一样，c-mpl属于I类细胞因子受体超家族(Vigon，I.等，美国国家科学院院刊，895640-5644(1992))。这一类受体的激活包括配体诱导的受体同型二聚体化作用，这一作用依次引发了信号转导事件级联。
通常，蛋白质配体和它的受体的相互作用经常发生在相对大的界面。但是，如在与受体结合的人生长激素的情况中证明的，只有界面上的少数几个关键的残基是对大多数结合能有真正的贡献(Clackson，T.等，科学，267383-386(1995))。这和大量的残余蛋白质配体的作用只是在正确的几何结构中展示结合表位的事实使有可能发现更小型的活性配体。因此，只有“肽”长度(例如，2到80个氨基酸)的分子可以结合给定的大的蛋白质配体的受体蛋白质。这样的肽可以模拟大的蛋白质配体的生物活性，或者尽管有竞争结合也抑制大的蛋白质配体的生物活性，并且通常称为“肽模拟物”或“模拟肽”。
在鉴定这样的肽模拟物中，噬菌体展示肽文库已经作为有力的技术出现。参见例如，Scott，J.K.等，科学，249386(1 990)；Devlin，J.J.等，科学，249404(1990)；1993年6月29日公开的美国专利5,223,409，；1998年3月31日公开的美国专利5,733,731；1996年3月12日公开的5,498,530；1995年7月11日公开的美国专利5,432,018；1994年8月16日公开的美国专利5,338,665；1999年7月13日公开的美国专利5,922,545；1996年12月19日公开的WO96/40987；和1996年4月16日公开的WO 98/15833(上述各专利全文引入作为参考)。在这样的文献中，任意的肽序列都是通过与丝状噬菌体的包衣融合来展示的。通常，展示的肽是对受体的抗体固定细胞外区来亲和洗脱的。保留的噬菌体可能是通过连续的亲和纯化和再繁殖的循环来累积。结合最好的肽可以进行测序来鉴定在肽的一个或几个结构相关的家族内的关键残基。参见例如，Cwirla等(1997)，科学，2761696-9。这些肽序列同样暗示了，残基可以安全地被丙氨酸扫描(alanine scanning)或DNA水平的诱变来替代。可以产生和筛选诱变文库，以便进一步使最好结合物的序列最佳化。Lowman(1997)，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26401-24。
蛋白质-蛋白质相互作用的结构分析也可以暗示肽模拟了大的蛋白质配体的结合活性。在这样的一个分析中，结晶结构可以表明，从中可以设计一个肽的大的蛋白质配体的关键残基的同一性和相对定向。参见例如，Takasaki等(1977)，自然生物技术，151266-70。这些分析方法也可以用于研究噬菌体显示器选择的受体蛋白质和肽之间的相互作用，可以进一步表明肽的修饰增强了结合亲和力。
在肽研究中有其他方法与噬菌体展示(phage display)技术竞争。肽文库可以与lac受体的羧基末端融合，并且在大肠杆菌中表达。另一个基于大肠杆菌的方法通过与肽聚糖结合的脂蛋白质(PAL)融合，在细胞的外膜上展示。下文中，这些和相关的方法总称为“大肠杆菌展示(display)”。在另一个方法中，在核糖体释放之前终止任意RNA的翻译，导致多肽的文库仍然附着它们的相关的RNA。下文中，这和相关的方法总称为“核糖体展示”。其他方法利用了与RNA连接的肽；例如，PRO融合技术，Phylos公司，参见，例如Roberts & Szostak(1997)，美国国家科学院院刊，9412297-303。下文中，这和相关的方法总称为“RNA-肽筛选”。化学起源肽文库已经开发了，其中肽是固定在稳定的、非生物的物质上的，如聚乙烯棒或溶剂可渗透树脂。另一个化学起源肽文库利用了光刻法(photolithography)扫描玻璃片上固定的肽。下文中，这些和相关的方法总称为“化学肽筛选”。化学肽筛选可能是有利的，因为它允许利用D-氨基酸和其他非天然类似物，以及非肽元素。生物和化学方法的综述在Wells & Lowman(1992)，Curr.Opin.Biotechnol，3355-62中。从理论上来说，可以利用噬菌体展示技术、RNA-肽筛选、和其他上面提到的方法来发现任何蛋白质的肽模拟物。
利用噬菌体展示肽文库技术，发现了作为c-mpl受体的激动剂的小肽分子(Cwirla，S.E.等，科学，2761696-1699(1977))。在这样的研究中，被展示与丝状体噬菌体的包衣蛋白质融合的随机小肽序列是针对c-mpl的抗体固定的细胞外区域亲和洗脱的，并且保留的噬菌体可以累积起来用于第二轮亲和纯化。这一结合选择和再繁殖过程重复了许多次，富集了更紧密的结合物的集合体。作为结果，c-mpl结合肽的两个家族，尽管在它们的序列中相互不相关，但首先得到了鉴定。然后，诱变文库产生了，进一步使最好的结合物最佳化，最后导致了活性非常的肽的分离，IC50＝2nM，EC50＝400nM(Cwirla，S.E.等，科学，2761696-1699(1997))。这14个残基的TPO模拟肽与TPO或MGDF没有明显的序列同源性。这一特殊的TPO模拟肽(TMP)化合物的结构如下Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala(SEQ IDNO1)或者利用单字母氨基酸缩写IEGPTLRQWLAARA过去，在EPO模拟肽的同样的研究中，利用相同的技术发现了EPO模拟肽(EMP)(Wrighton，N.C.等，科学，273458-463(1996))，并且发现在于EPO受体(EPOR)的结合中是作为二聚体起作用的。根据X-射线晶体数据，这样形成的(配体)2/(受体)2复合物具有C2对称结构(Livnah，O.等，科学，273464-471(1996))。根据这一结构信息，设计了两个EMP单体的C末端与柔韧的间隔子交联的EMP的共价连接二聚体，发现具有巨大的已增强的结合以及体外/体内生物活性(Wrighton，N.C.，等，自然生物技术，151261-1265(1997))。
对TPO模拟肽(TMP)应用相似的C末端二聚体化方案(Cwirla，S.E.等，科学，2761696-1699(1997))。已经发现，在细胞增殖实验中，特别的TPO模拟肽的C末端连接二聚体(C-C连接)的结合亲和力提高到0.5nM，并且体外活性提高(EC50＝0.1nM)(Cwirla，S.E.等，科学，2761696-1699(1997))。
为了增强或提高这样的蛋白质作为药物试剂的特性，用于治疗用途的重组蛋白质的可获得性已经导致进一步的蛋白质修饰。这样的修饰可以通过减少或消除蛋白质水解增强蛋白质的保护和降低降解。另外的优点包括，在一些情况中，增强治疗蛋白质的稳定性，循环时间和生物活性。叙述蛋白质修饰的一个回顾文章是Farncis的“关注生长因子(Focuson Growth Factor)34-10(1992年5月)(Mediscript，伦敦，英国)。
有用的蛋白质治疗试剂的修饰包括连接多聚体如聚乙二醇(PEG)和葡聚糖。这样的修饰在专利申请“作为治疗试剂的修饰肽”中有详细讨论，美国系列号09/428,082，PCT申请WO 00/24782，该专利全文引入作为参考。
另一个这样的修饰是利用免疫球蛋白分子的Fc区。抗体包含两个功能独立部分；已知作为结合抗原的“Fab”的可变区，已知作为“Fc”的恒定区，提供与效应器功能的连接的“Fc”的恒定区，如补体或噬菌体细胞。免疫球蛋白的Fc部分具有长的血浆半衰期，而Fab是短期生活的(Capon等，自然，337，525-531(1989))。
利用Fc区已经构建了治疗蛋白质产物，提供了更长的半衰期或参与了如Fc受体结合，蛋白质A结合，互补固定和胎盘转移的功能，它们都归于免疫球蛋白的Fc蛋白质。(Capon等，自然，337525-531(1989))。例如，一个IgG1抗体的Fc区已经与CD30-L，结合在Hodgkin’s疾病肿瘤细胞上，退行发育的淋巴细胞，T细胞白血病细胞和其他恶性细胞类型上表达的CD30受体的分子融合。参见，美国专利号，5,480,981。为了增强细胞因子的短期循环半衰期，抗炎症和抗反射试剂已经与小鼠Fc 2a融合(Zheng，X.等，免疫学杂志，1545590-5600(1995))。许多研究也已经评价了与人IgG1的Fc蛋白质连接的肿瘤坏死因子受体在治疗败血休克的患者中的用途(Fisher，C.等，N.Engl.J.Med.，3341697-1702(1996)；Van Zee，K.等，免疫学杂志，1562221-2230(1996))。Fc也已经与CD4受体融合，产生治疗AIDS的治疗性蛋白质。参见Capon等，自然，337525-531(1989)。另外，白细胞介素2已经与IgG1或IgG3的Fc部分融合，以便克服白细胞介素2和它的系统毒素的短的半衰期。参见，Harvill等，免疫技术，195-105(1995)。
公开的PCT申请WO 00/24770公开了特异的血小板生成化合物，通常是肽，具有一个串联(tandem，即N-到C-末端)方向，和在其N末端附着于一个载体分子，如线性聚合物，多糖或Fc基团的串联的肽二聚体。
提供其他具有刺激血小板的生产(血小板生成活性)和/或血小板前体细胞，特别是巨核细胞(巨核细胞生成活性)的超级生物活性的其他化合物仍然是需要。提供具有血小板生成活性和同时具有超级治疗质量如长的半衰期的化合物也仍然是需要的。这样的化合物将具有非常有利的有关生产，分离，纯化，生物活性，稳定性和循环时间等方面的特性。本发明提供具有这样的活性的新化合物和相关的方面。
发明概述本发明涉及结合c-mpl受体(下文中称为“mpl受体”)的治疗化合物。更具体地说，本发明提供了一组化合物，它们结合于和/或引发跨膜信号通过(即激活)mpl受体的能力提高，所述受体是介导内源血小板生成素(TPO)的活性的相同受体。所以，发明的化合物具有优异的血小板生成活性，即能在体内和体外刺激血小板的生产和/或巨核细胞生成活性的能力，即在体内和体外刺激血小板前体的产生的能力。另外，本发明的某些化合物也具有优异的治疗特性，如提高的血浆半衰期、生物活性和体内循环时间。
在一个方面，本发明提供了与mpl受体结合的化合物，包括下述序列X1-X2-X3-X4-G-P-T-L-X9-X10-W-L-X13-X14-X15-X16-X17-X18其中X1-X4，X9-X10，和X13-X18各自独立地是如本文定义的氨基酸，其中该化合物具有与mpl受体的结合亲和力和/或具有大于下面序列的生物活性I-E-G-P-T-L-R-Q-W-L-A-A-R-A而在另一方面，本发明提供了具有下面序列的结合mpl受体的化合物X1-X2-R-E-G-P-T-L-R-Q-W-L-X13-W-R-R-X17-X18其中X1，X2，X13，X17和X1 8各自独立地是氨基酸。
在另一方面，本发明提供了结合mpl受体的化合物，该化合物包括选自SEQ ID NO2到SEQ ID NO30的序列。
在另一方面，本发明是化合物的二聚体或多聚体，该化合物包括选自SEQ ID NO2到SEQ ID NO30的序列。
在另一方面，本发明提供了结合mpl受体的组合物，其具有下式(LN1)l--(TMP1)a--(LN2)m--(TMP2)b--(LN3)n--(TMP3)c--(LN4)o--(TMP4)d其中TMP1，TMP2，TMP3和TMP4各自独立地选自本文公开的TMP；LN1，LN2，LN3和LN4各自独立地是接头；a，b，c和d各自独立地是0到10的整数；l，m，n和o各自独立地是0到20的整数。
在另一方面，本发明提供了结合mpl受体的组合物，其具有下式(V1)v--(LN1)l--(TMP1)a--(LN2)m--(TMP2)b--(LN3)n--(TMP3)c--(LN4)o--(TMP4)d--(V2)w其中V1和V2各自独立地是载体(vehicle)，v和w各自独立地是0到1的整数。
本发明的化合物可以通过标准的合成方法、重组DNA技术或任何其他制备肽和融合蛋白质的方法来制备。除标准肽化学反应(当可用时)外，包括非肽部分的本发明的化合物可以通过标准的有机化学反应来合成。
本发明的化合物可以通过与适当的药用载体物质一起配制和对患者如需要治疗的人(或其他哺乳动物)以有效量施用，达到治疗或预防目的。载体连接的肽可以具有与肽(这里是血小板生成素)模拟的天然配体可比较或甚至更大的活性。
在另一方面，本发明提供了治疗血小板减少症的方法。在其他方面，本发明提供了增加巨核细胞或血小板的方法，以及生产本文所述的化合物的方法。
在另一方面，本发明也提供了相关的药物组合物。
在其他方面，本发明提供了编码本文公开的组合物的多核苷酸，包括该多核苷酸的表达载体和包括该表达载体的宿主细胞。
附图简述所以，考虑下面的详细叙述，参考附图，本发明的许多其他方面和优点将是显而易见的。其中

图1显示本发明的肽和肽接头化合物的结构的例子。
图2显示了本发明的肽-载体和肽-接头-载体化合物的结构的例子。
图3显示了可以用作本发明的优选的载体的人IgG1 Fc的核酸和氨基酸序列(SEQ ID NOS31和32)。
图4显示了可以从IgG1抗体衍生的本发明的Fc单体和二聚体化合物的例子。“Fc”在图中代表在本文的Fc区域的意义中的任何Fc变异体。“肽”代表任何肽，接头-肽，肽-肽结合体，或如本文公开的任何结合体。特异的二聚体如下图4A和4D显示了单个二硫键二聚体。IgG1抗体通常在抗体的铰合区具有两个二硫键。在图4A和4D中的Fc区可以通过在两个二硫键位点之间截短或通过用未反应的残基(例如，丙氨酰)来取代半胱氨酰残基来形成。在图4A中，Fc区是与肽的氨基末端连接的；在4D中Fc区在肽的羧基末端。
图4B和4E显示双倍二硫键结合的二聚体。这一Fc区可以通过截短亲本抗体保留Fc区链中的两个半胱氨酰残基或提高从包括编码这样的Fc区的序列的构建体来到表达来形成。在图4B中，Fc区是与肽的氨基末端连接；在4E中是连接在肽的羧基末端。
图4C和4F显示了非共价二聚体。这一Fc区域可以通过截短或取代来去除半胱氨酰残基来形成。人们可以期望去除半胱氨酰残基来避免半胱氨酰残基与宿主细胞中存在的其他蛋白质的半胱氨酰残基形成的杂质。Fc区的非共价键合是足以与二聚体结合在一起。其他二聚体可以利用从抗体的不同类型的抗体(例如，IgG2，IgM)衍生的Fc区来形成。
图4G和4H显示了在肽的N末端(图4G)和在肽的C末端(图4H)附着的单链Fc区(图4H)。
图5显示了特征为附着于Fc区域的药物活性肽的串联重复的本发明的优选化合物的结构的例子。图5A显示了具有附着于串联肽二聚体的单链(或Fc单体)分子，同时也可以代表该分子的DNA构建体。图5B显示了Fc二聚体，其中接头-肽部分只出现在Fc二聚体的一个链上。图5C显示了在两条链上具有肽部分的Fc二聚体(在这种情况下，是串联的肽二聚体)图5C的二聚体将自发地在编码图5A中所示的单链的DNA构建体的表达的基础上在一些宿主细胞中形成。在其他宿主细胞中，细胞可以放置于有利于形成二聚体或可以在体外形成二聚体的条件下。图5D到5I代表了单链(Fc单体)和双链(Fc二聚体)优选实施方案的其他例子。
图6显示了如本文实施例3所示的用于构建TMP-Fc融合化合物的优选的载体(20003180)的核苷酸序列(SEQ ID NO33)和氨基酸序列(SEQ ID NO34)。
图7显示了用于产生如实施例3所示的本发明的优选的肽的寡核苷酸对的例子的片段。每个都提供了核酸和氨基酸序列(SEQ ID NO35-93)。
图8显示了用于构建C末端Fc融合化合物(即附着于Fc的N末端到C末端的肽)的作为例子的载体(20003182)的核酸序列(SEQ IDNO94)和氨基酸序列(SEQ ID NO95)。
图9显示了选定的噬菌体克隆的ELISA剂量应答。
图10，11和12显示了本发明的选定化合物的生物活性。
图13和14显示了在小鼠中单次注射本发明的选定化合物后体内的血小板计数。
发明详述I.术语的定义除非在特定的情况中特别限制，在本说明书中通篇使用的术语定义如下。
术语“肽”指约2到80个氨基酸的分子，分子为3到40个氨基酸是优选的。可以作为例子的肽可以是本文所述的任意方法随机产生的，如肽文库中携带的(例如，噬菌体展示文库)，化学合成产生的，蛋白质消化衍生的等。
术语“随机化”，与肽序列结合使用时，指完全任意的序列(例如，通过噬菌体展示方法或RNA肽筛选来选择)，和天然存在的分子的一个或多个残基是由天然存在的分子的那个位置中不存在的氨基酸残基替代的序列。产生和鉴定随机化肽序列的方法的例子包括噬菌体展示、大肠杆菌展示、核糖体展示、RNA-肽筛选、化学筛选等。
术语“二聚体”如用于肽，是指具有利用或不利用接头，共价或非共价结合的两个肽链的分子。肽是C末端连接到N末端到N末端的的肽二聚体也可以称为“串联重复”或“串联二聚体”。肽是从C连接到C末端或N连接到N末端的肽二聚体也可以称为“平行重复”或“平行二聚体”。
术语“多聚体”如与肽一起应用，是指共价、非共价、或既共价也非共价相互作用结合的，带或不带接头的3个或多个肽链的分子。
术语“衍生”和“衍生物”或“衍生的”包括了加工和产生化合物的过程，其中(1)化合物具有环部分；例如在化合物内的半胱氨酰残基之间交联；(2)化合物是交联的或具有交联位点；例如，化合物具有半胱氨酰残基，所以在培养基中或在体内形成交联二聚体；(3)一个或多个肽基键被非肽基键取代；(4)N末端是-NRR1，NRC(O)R1，-NRC(O)OR1，-NRS(O)2R1，-NHC(O)NHR，琥珀酰胺基团，或已取代或未取代的苯氧基羰基-NH-，其中R和R1和环取代基如下文定义；(5)C-末端是-C(O)R2或-NR3R4替代的，其中R2，R3，和R4如下文定义；和(6)各种化合物，其中个别氨基酸成分可以通过用能够与选定的侧链或终端残基反应的试剂来修饰。衍生物进一步如下文所述。
术语“血小板生成素模拟肽”，“TPO模拟肽”或“TMP”指结合mpl受体和/或具有血小板生成活性，即体内或体外刺激血小板或血小板前体包括但不限于巨核细胞的生产的能力的肽。
术语“mpl-结合区”指结合mpl受体并且包括天然存在序列或随机化序列的任何氨基酸序列。举例的mpl结合区可以通过噬菌体展示或本文提到的其他方法来鉴定或衍生。
术语“mpl受体激动剂”指结合mpl受体并且如内源血小板生成素(eTPO)，天然mpl受体配体一样加强或减弱一个或多个实验参数的分子。
术语“包含”指在给定的序列的N-或C-末端的一边或两边上包括其他氨基酸的化合物。当然，这些其他的氨基酸应该不会明显干扰化合物的活性。
另外，本发明的化合物的生理可接受盐也可以包括在本文中。术语“生理可接受盐”指已知或后来发现的药物可接受的任何盐。一些特异的例子是乙酸，三氟乙酸盐；卤化氢，如盐酸和氢溴酸；硫化物；柠檬酸；酒石酸；羟乙酸和草酸。
术语“载体(vehicle)”指预防治疗性蛋白质的降解和/或增加半衰期，降低毒性，降低免疫原性和/或提高生物活性的分子。举例的载体包括Fc区(优选的)以及线性多聚物(例如，聚乙二醇(PEG)，聚赖氨酸，葡聚糖，等等)；支链的多聚物(参见例如，1981年9月15日公开的授予Denkenwalter等的专利4,289,872；1993年7月20日公开的授予Tam的5,229,490，1993年10月28日公开的Frechet等的WO 93/21259)；脂类；胆固醇基团(如类固醇)；碳水化合物或寡聚多糖(例如，葡聚糖)；结合补救(salvage)受体的任何天然或合成蛋白质、多肽或肽；白蛋白，包括人血清白蛋白(HSA)，亮氨酸拉锁区，和其他这样的蛋白质和蛋白质片段。
术语“天然Fc”指包括从不管是单体或多聚体形式的整个抗体的消化得到的非抗原结合片段的序列的分子或序列。天然的Fc的原初免疫球蛋白源优选地是人起源，并且可以是任何免疫球蛋白，尽管IgG1和IgG2是优选的。天然Fcs是有单体多肽组成的，这些单体多肽可以通过共价(即二硫键)和非共价结合连接成二聚体或多聚体形式。根据类别(例如，IgG，IgA，IgE)或亚类(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgA1，IgGA2)在天然Fc分子的单体亚单位之间的分子间的二硫键的数目的范围是l到4。天然Fc的一个例子是从IgG的木瓜蛋白酶消化得到的二硫键结合的二聚体(参见，Ellison等(1982)，核酸研究，104071-9)。术语“天然Fc”如本文所用属于单体，二聚体和多聚体形式。
术语“Fc变异体”指从天然Fc修饰的但仍然包括补救受体，FeRn的结合位点的分子或序列。国际申请WO 97/34631(1997年9月25日公开)和WO96/32478叙述了Fc变异体的例子，以及其与补救受体的相互作用，这些专利申请全文引入作为参考。所以，术语“Fc变异体”包括从非人天然Fc人化的分子或序列。另外，天然Fc包括可以除去的位点，因为这些位点提供了本发明的融合分子不需要的结构特征或生物活性。所以，术语“Fc变异体”包括缺乏一个或多个天然Fc位点或残基的分子或序列，这些位点或残基影响或参与了(1)二硫键的形成，(2)与选定的宿主细胞不兼容(3)在选定的宿主细胞中表达的基础上N末端不均一，(4)糖基化，(5)与补体相互作用，(6)除了补救受体还与Fc受体结合，或(7)依赖抗体的细胞毒性(ADCC)。
术语“Fc区”包括如本文定义的天然Fc和Fc变异体分子和序列。如Fc变异体和天然Fc，术语“Fc区”包括不管是否是从整个抗体消化或其他方法产生的单体或多聚体形式的分子。
术语“二聚体“如与Fc区域或包括Fc区域一起应用时，指具有共价或非共价结合的两个多聚体链的分子。
术语“多聚体”如应用于Fc区或包括Fc区的分子时，指具有共价，非共价，或共价和非共价相互反应结合的两个或多个多肽链的分子。IgG分子通常形成二聚体；IgM，五聚体；IgD，二聚体；IgA，单体，二聚体，三体，或四体。多聚体可以通过发展(exploit)该序列，产生Fc的天然Ig源的活性或通过衍生(如本文定义)这样的天然Fc来形成。
术语“肽体”指包括至少附着于至少一个肽的抗体Fc区的分子。这样的肽体可以是多聚体或二聚体或其片段，它们可以是衍生的。
II.化合物的结构通常来说，本发明提供了能够结合和/或调节mpl受体的生物活性的化合物。更具体地说，本发明提供了能够通过即激活mpl受体，即介导内源血小板生成素(TPO)活性的相同受体来结合和/引发跨膜信号的一组化合物。所以，发明的化合物具有血小板生成活性，即在体内和体外刺激血小板的生产的能力和/或具有巨核细胞生成活性，即体内和体外刺激血小板前体包括巨核细胞的生产的能力。
简要地说，本发明的化合物包括具有通式I的序列的一个或多个肽IX1-X2-X3-X4-G-P-T-L-X9-X10-W-L-X13-X14-X15-X16-X17-X18；其中X1-X4，X9-X10和X13-X18各自独立地是氨基酸。
在根据本发明制备的其他组合物中，这些化合物可以包括通式I的序列的一个或多个肽，所述肽附着于或相互连接，例如作为二聚体或多聚体。
在本发明制备的其他组合物中，这些化合物可以包括在肽的N末端或C末端附着或连接到载体上的通式I的一个或多个肽。任何这些肽可以有或没有接头串联连接(即，按顺序N到C)或平行(即，N-到N-末端，或C-到C-末端)。肽.本发明的化合物包括单独或结合另一个TMP的TPO模拟肽，如二聚体或多聚体。本发明的TMP包括下面的序列IX1-X2-X3-X4-G-P-T-L-X9-X10-W-L-X13-X14-X15-X16-X17-X18；其中X1-X4，X9-X10，和X13-X18是各自独立的氨基酸。上面的序列的优选的氨基酸残基另外如下表1定义。
表1-优选的氨基酸残基


本发明的更优选的TMP序列是具有下面序列的那些IX1-X2-X3-X4-G-P-T-L-X9-X10-W-L-X13-X14-X15-X16-X17-X18其中X1-X4，X9-X10，和X13-X18各自独立地是氨基酸，其中肽具有mpl受体的结合亲和力，和/或具有等于或大于下面序列的生物活性I-E-G-P-T-L-R-Q-W-L-A-A-R-A(SEQ ID NO1)结合亲和力可以通过任何本领域技术人员已知或可得的任何实验方法来测量，包括但不限于BIAcore测量，ELISA实验，竞争实验等等。
生物活性也可以通过本领域技术人员已知或可得的任何实验在体内或体外测量。作为例子的实验包括但不限于，基于细胞的测试，即巨核细胞增殖测试，32D细胞测试(在WO 95/26746中有更详细叙述的已经用人mpl受体转染的小鼠32D细胞的IL-3依赖克隆)，CD34+测试，CD61细胞测试等。生物活性也可以通过各种体内动物实验来测量。
本发明的其他优选的TMP序列在下面的表2中表明。
表2优选的TMP序列

肽TMP2-TMP30的结合亲和力和生物活性数据进一步如实施例所述。为了更好地模拟从中选择肽的噬菌体环境，和为了保护优选的18氨基酸肽的带电的氨基和羧基末端，在各个肽的各个末端加入两个氨基酸“帽子(cap)”。特别是，TMP2-TMP30中每一个的氨基末端都加入谷氨酰胺(Q)和半胱氨酸(C)。同样，在肽-组氨酸(H)和丝氨酸(S)各个的羧基末端加入两个氨基酸“帽子”。本领域技术人员应理解帽子仅仅保护带电的末端，并且不打算对优选的肽的结合亲和力和/或生物活性进行加强或减低。
因为肽亲和力已知是随着肽的长度而增加的，基准生物活性肽(SEQID NO1)的长度从14个氨基酸提高到22个氨基酸，是与测试肽TMP2-TMP30相同的长度。参见实施例6-11。本领域技术人员可以理解的是，比较子(comparator)肽的生物活性区是核心的14个氨基酸序列，鉴定为SEQ ID NO1，也称为TMP1。
含有半胱氨酰残基的任何肽可以与另一个含有Cys的肽交联，两者中的每一个或两者都可以与一个载体连接。具有一个以上的Cys残基的任何肽也可以形成一个肽内二硫键。任何这些肽可以如下文所述衍生。
其他有用的肽序列可以从本文公开的TMP的氨基酸序列的保守和/或非保守修饰得到。保守修饰将产生具有功能和化学特征相似于进行了这些修饰的那些肽。相反，在肽的功能和/或化学特征中的基本的修饰可以通过选择氨基酸序列中的取代来完成，这些氨基酸序列中的取代在它们维持(a)在取代的区域中分子的主链的结构，例如作为片层或螺旋构型，(b)在靶位点分子的电荷或疏水性，或(c)分子的大小上的效果都是明显不同的。
例如，“保守氨基酸取代”可以包括用非天然残基取代天然氨基酸残基，使在那个位置的氨基酸残基的极性或电荷效果很小或没有。另外，在多肽中的任何天然残基也可以用丙氨酸取代，正如前面在“丙氨酸扫描诱变中”所述(参见，例如，MacLennan等，Acta Physiol.Scand.Suppl.64355-67；Sasaki等，1998，Adv.Biophys.351-24，其中讨论了丙氨酸扫描诱变)。
通过本领域的技术人员在需要这样的取代的时候可以确定需要的氨基酸取代(不管是保守或非保守的)。例如，氨基酸取代可以用于鉴定肽序列的重要的残基，或提高或降低本文所述的肽或载体-肽分子(参见前面的通式)的亲和力。作为例子的氨基酸取代如表3所述。
表3-氨基酸取代


在一些实施方案中，保守氨基酸取代也包括通常通过化学肽合成而不是生物系统中的合成掺入的非天然存在的氨基酸残基。
天然存在的残基可以根据一般的用于序列的修饰的侧链特性来分类。例如，非保守取代可以包括这些类别中的一个成员与另一个类别的成员交换。这样的取代残基可以导入与非人同源进化类别同源的肽的区域，或导入该分子的非同源区。另外，人们也可以为了影响链的方向利用P或G进行修饰。
在进行这样的修饰时，可以考虑氨基酸的亲水指标。在它们的疏水和带电特征的基础上，各个氨基酸已经指定了亲水指标，那是异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
在给予一个蛋白质相互作用的生物功能中的亲水氨基酸指标的重要性是本领域所理解的。Kyte等，J.Mol.Biol.，157105-131(1982)。已知一些氨基酸可以取代其他具有相似亲水指标或得分的氨基酸，并且仍然保留相似的生物活性。在亲水指标上进行改变时，亲水指标在±2内的氨基酸取代是优选的，在±1内的特别优选的，在±0.5内的是尤其优选的。
本领域同样能理解的是根据疏水性也可以有效地进行类似的氨基酸的取代。一个蛋白质的最大的局部平均疏水性，正如它的邻接的氨基酸的疏水性所控制是与它的免疫原性和抗原性，即与蛋白质的生物特性相关。
下面的疏水值已经指定到氨基酸残基精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。在根据相似的疏水值进行改变时，疏水值在±2内的氨基酸取代是优选的，那些在±1内的是特别优选的，那些在±0.5内的是尤其优选的。在疏水性的原理上同样可以从最初的氨基酸序列鉴定表位。这些区域也可以称为“表位核心区域”。
熟练的技术人员将能够利用已知的技术确定适当的变异体。为了鉴定可以不破坏活性改变分子的适当区域，本领域一个技术人员可以不相信对活性重要的区域当作目标。例如，当具有来自相同物种或来自其他物种的相似活性的相似多肽是已知的，本领域的一个技术人员可以将一个肽的氨基酸序列与相似的肽比较。在这样的比较下，可以鉴定在相似的多肽中保守的分子的残基和部分。应理解，在相对于这样的相似的肽不保守的一个肽的区域中的变化似乎更加不会不利地影响该肽的生物活性和/或结构。本领域的一个技术人员也知道，甚至在相当保守的区域，也可以在保留活性的情况下用化学上相似的氨基酸取代天然存在的残基(保守氨基酸残基取代)。所以，甚至可能对生物活性或对于结构重要的区域也可以进行保守氨基酸取代，而不破坏生物活性或没有不利地影响肽的结构。
可能具有L或D立体化学结构的氨基酸(除了甘氨酸，它既不是L也不是D)的氨基酸和本发明的TMPs也可以包括立体化学的结合体结构。但是，L型立体化学对TMP链中的所有氨基酸都是优选的。本发明也提供了逆转的TMP分子，其中氨基酸的氨基末端到羧基末端序列是逆转的。例如，具有正常序列的X1-X2-X3的分子逆转后将是X3-X2-X1。本发明也提供了后-逆转TMP分子，其中，如逆转TMP，氨基酸的氨基末端到羧基末端序列是逆转的，而正常在TMP中的“L”对映体残基改变到“D”立体异构形式。
也应该注意到，TMP的“衍生物”可以取代上面叙述的TMP。这样的衍生物TMP包括已经进行了下面的一个或几个修饰的成分●一个或多个肽基[-C(O)NR-]连接(键)已经被非肽基连接取代，如-CH2氨基甲酸酯连接[-CH2-OC(O)NR-]；磷酸连接；-CH2-磺酰胺[-CH2-S(O)2NR-]连接；脲[-NHC(O)NH-]连接；-CH2仲胺连接；或烷基化肽基连接[-C(O)NR6-，其中R6是低级烷基]；●N末端已经衍生成-NRR1基团；-NRC(O)R基团；NRC(O)OR基团；-NRS(O)2R基团；NHC(O)NHR基团的肽，其中R和R1是氢或低级烷基，如果R和R1不是氢；那么衍生成琥珀酰胺基团；苯氧羧基-NH-(CBZ-NH-)基团；或苯氧羧基-NH-基团，在苯环具有1到3个取代基，选自低级烷基，低级烷氧基，氯和溴等基团。和●游离的C末端衍生成-C(O)R2的肽，其中R2选自低级烷氧基和-NR3R4，其中R3和R4独自选自氢和低级烷基。“低级”是指具有1到6个碳原子的基团。
另外，个别氨基酸的修饰可以通过将肽的目的氨基酸残基与能够与选定的侧链或末端残基反应的有机衍生试剂反应来导入TMP分子。例子如下赖氨酸基和氨基末端残基可以与琥珀酸或其他羧酸酸酐反应。用这些试剂衍生具有逆转赖氨酸残基的电荷的效果。衍生含α-氨基的残基的其他适当试剂包括亚氨酸酯，如甲基吡啶甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氢酸；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4戊二酮；和转氨酶催化的与乙醛酸的反应。
精氨酰残基可以通过与一个或几个常规的试剂反应来修饰，其中苯基乙二醛基，2，3-丁二酮，1，2-环己二酮，和茚三酮。由于胍功能基团的pKa高，精氨酸残基的衍生需要反应在碱性条件下进行。另外，这些试剂可以与赖氨酸基团以及精氨酸胍基基团反应。
酪氨酰残基本身的特异修饰已经广泛地研究，特别关注的是通过与芳香重氮化合物或四硝基甲烷反应将光谱标记导入酪氨酰残基。最常见的是，N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷可以用于形成O-乙酰基酪氨酰物类，和3-硝基衍生物。
羧基侧基团(天冬氨酰基或谷氨酰基)可以通过与碳二亚胺(R’-N＝C＝N-R’)如1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮阳离子-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺反应来选择性地修饰。另外，天冬酰基和谷氨酰基残基可以通过与铵离子反应转变成天冬酰胺残基和谷氨酰胺残基。
谷氨酰胺基和天冬酰胺基通常脱酰胺成对应的谷氨酰基和天冬酰基残基。或者，这些残基可以在温和的酸性条件下脱酰胺。这些残基的形成是在本发明的范围内的。
与双功能试剂的衍生可用于将肽和它们的功能衍生物与水不溶支持基质或其他大分子载体交联。通常使用的交联试剂包括例如，1，1-二(重氮乙酰基)-2-苯乙烷，戊二醛，N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如具有4-叠氮唾液酸，同型双功能亚胺酯，包括二-N-顺丁烯二酰亚胺-1，8-辛烷。衍生试剂如甲基-3-[(p-叠氮苯基)二硫代]丙酰亚胺(propioimidate)产生在光存在时能形成交联的光可活化的中间产物。或者，美国专利3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537；和4,330,440所述的反应性水不溶基质如溴化氰活化的碳水化合物和反应底物可以用于蛋白质的固定。
其他可能的修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝酰基或苏酰基残基的羟基基团的磷酸化，在Cys中的硫原子的氧化，赖氨酸，精氨酸，和组氨酸侧链的α-氨基基团的甲基化(Creighton，T.E.，蛋白质结构和分子特性，W.H.Freeman & Co.，旧金山，79-86(1983))，N末端胺的乙基化，和在一些情况中C末端羧基基团的酰胺化。
这样的衍生成分优选地提高了一个或几个特征，包括发明的化合物的血小板生成活性，可溶性，吸收，生物学半衰期等。或者，衍生的成分可以导致化合物具有相同或基本相同的非衍生的化合物的特征和/或特性。这些成分或者可以去除或减弱这些化合物的任何不需要的副作用等。
本发明的化合物可以在DNA水平等发生改变。化合物的任何部分的DNA序列可以改变到密码子与选择的宿主细胞更兼容的地步。最适当的密码子是本领域已知的。密码子可以取代，以便去除限制位点或包括沉默限制位点，可以辅助选择的宿主细胞中的DNA的加工。可以修饰载体，接头和肽DNA序列来包容任何前面所述的序列的变化。所以，本文讨论的所有修饰，取代，衍生等同样可应用于本发明的所有方面，包括但不限于肽，肽二聚体和多聚体，接头和载体。
另外，本领域的一个技术人员都可以查阅鉴定对活性或结构重要的相似的肽中的残基的结构-功能研究。从这样的比较来看，对应于相似肽的活性或结构重要的氨基酸残基的肽中的氨基酸残基的重要性是可以预测的。本领域的一个技术人员可以选择化学相似的氨基酸取代肽的一些预测重要的氨基酸残基。
本领域的一个技术人员也可以分析与相似的多肽中的结构相关的三维结构和氨基酸序列。从这个情况来看，本领域的一个技术人员可以预测与三维结构相关的肽的氨基酸残基的排列。本领域的一个技术人员可以选择不对预测是在蛋白质的表面上的氨基酸残基作基本的改变，因为这样的残基可以包括在与其他分子的重要的相互作用中。另外，本领域的一个技术人员可以在每个需要的氨基酸残基生成含有单个氨基酸取代的测试变异体。然后，该变异体可以利用本领域技术人员已知的活性测试来筛选。这样的数据可以用于收集关于适当的变异体的信息。例如，如果如果发现对特别的氨基酸残基的变化产生了破坏的，不需要的减少，或不适当的活性，有这样的变化的变异体是需要避免的。用另一句话说，根据从这样的常规实验收集的信息，本领域的一个技术人员可以很容易确定应该避免单独或结合其他突变的进一步的取代的氨基酸。
预测二级结构已经有了许多科学出版物。参见Moult J.，Curr.Op.inBiotech.，7(4)422-427(1996)，Chou等，生物化学，13(2)222-245(1974)；Chou等，生物化学，113，(2)211-222(1974)；Chou等，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.，4745-148(1978)；Chou等，Ann.Rev.Biochem.，47251-276和Chou等，Biophys.J.，26367-384(1979)。另外，目前可得的计算机程序可以用于辅助预测二级结构。预测二级结构的一个方法是根据同源学模型来进行。例如，两个多肽或蛋白质具有序列同一性大于30％，或相似性大于40经常具有相似的几何结构。蛋白质结构数据库(PDB)的最新发展已经使二级结构的可预测性增强，包括多肽或蛋白质结构内的折叠的潜在数目。参见Holm等，核酸研究，27(1)244-247(1999)。已经表明(Brenner等，Curr.Op.Struct.Biol.，7(3)369-376(1997))在给定的多肽中的折叠数目有限，并且一旦关键数目的结构已经分辨，结构预测将达到非常准确。
预测二级结构的其他方法包括“线法(threading)”(Jones，D.，现代结构生物学评论，7(3)377-87(1997)；Sippl等，结构，4(1)15-9(1996))，“分布分析(profile analysis)”(Bowie等，科学，253164-170(1991)；Gribskov等，酶学方法，183146-159(1990)；Gribskov等，美国国家科学院院刊，84(13)4355-8(1987))，和“进化连接(evolutionarylinkage)”(参见Home，出处同上，和Brenner，出处同上)。
本发明的优选的肽和肽接头分子的通式如图1所示。另外，也包括了TMPs的生理可接受盐。
肽化合物除了新肽，本发明提供了新肽化合物，其中本发明的一个或多个肽相互附着或连接到接头(LN)或载体(V)上。TMPs可以串联(即，按顺序，N末端到C末端)，或平行(即，N-到N-末端或C-到C-末端)。TMPs可以在有或没有接头的情况下附着于其他的TMP或相同的TMP。TMP也可以在有或没有接头和有或没有载体的情况下附着于其他TMP或相同的TMP。本发明的肽-接头-载体化合物可以通过下面的通式来叙述II(V1)v--(LN1)1--(TMP)a--(LN2)m--(TMP2)b--(LN3)n--(TMP3)c--(LN4)o--(TMP4)d--(V2)w
其中V1和V2是载体；LN1，LN2，LN3和LN4各自独立地是接头；TMP1，TMP2，TMP3和TMP4各自独立地是通式I的肽序列；a，b，c和d和l，m，n和o各自独立地是0到20的整数，v和w各自独立地是0到1的整数。
本发明的作为例子的化合物如下面的通式所示TMP1-V1 TMP1-LN1-V1TMP1-TMP2-V1TMP1-LN1-TMP2-LN2-V1和其另外的多聚体，其中V1是载体(优选地是Fc区)并且在有或没有接头的情况下附着于TMP的C末端；V1-TMP1 V1-LN1-TMP1V1-TMP1-TMP2V1-LN1-TMP1-LN2-TMP2和其多聚体，其中V1是载体(优选地Fc区)，并且在有或没有接头的情况下附着于TMP的N末端。本发明的优选的肽-载体和肽-接头-载体分子的通式如图2所示。
本发明的许多优选的化合物是二聚体或多聚体，因为它们具有两个TMP成分或多聚体，因为它们具有多个TMP成分。TMP1到TMP4等的每一个可以具有相同或不同的结构。优选地，本发明的化合物将具有2到5个TMP成分，特别优选地2-3个，最优选地2个。
这些化合物优选地是直接附着或通过接头基团与二聚体连接(参见如下)。在传统的方向上单体TMP成分显示是从左到右读码的N-到C-末端。因此，可以看到，可以定向发明的化合物，使TMP1的C末端直接或通过接头附着于TMP2的N末端(串联二聚体)。或者，可以定向发明的化合物使TMP1的C末端直接附着于或通过接头附着于TMP2的C末端，或TMP1的N末端直接或通过接头附着于TMP2的N末端(平行二聚体)。甚至如果TMP1和TMP2是结构上有区别的，这些化合物也称为二聚体。可以设想是同型二聚体和异型二聚体。
接头在另一个实施方案中，本发明提供了通过“接头”基团(LN1，LN2，等)共价键合或连接或附着于另一个TMP肽的一个或多个TMP。接头基团可任意选择。由于首先是作为间隔子，当存在时，它的化学结构不是关键。应该选择接头，以致不能干扰最后的化合物的生物活性，并且同时使最后的化合物的免疫原性没有明显增加。接头优选地是由肽键连接在一起的氨基酸组成的。所以，在优选的实施方案中，接头是由肽键连接的1到30个氨基酸组成的，其中的氨基酸选自20个天然存在的氨基酸。正如本领域技术人员很容易理解的，这些氨基酸的一些可以糖基化。在更优选的实施方案中，从甘氨酸，丙氨酸，脯氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，和赖氨酸中选择了1到20个氨基酸。甚至更优选地，接头是由立体结构上未铰合的许多氨基酸组成的，如甘氨酸和丙氨酸。所以，优选的接头是聚甘氨酸(特别是(Gly)4，(Gly)5)，聚(Gly-Ala)，和聚丙氨酸。接头的其他特异例子是(Gly)3Lys(Gly)4(SEQ ID NO96)(Gly)3AsnGlySer(Gly)2(SEQ ID NO97)(Gly)3Cys(Gly)4(SEQ ID NO98)；和GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO99)为了解释上面的术语，例如(Gly)3Lys(Gly)4是指Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly。Gly和Ala的组合也是优选的。本文所示的接头也是例子；在本发明的范围内的接头可以更长，并且可以包括其他残基。
非肽接头也是可以的。例如，烷基接头如-NH-(CH2)s-C(O)-，其中s＝2-20是可以利用的。这些烷基接头可以进一步用任何非立体铰合基团如低级烷基(例如，C1-C6)，低级酰基，卤素(例如，Cl，Br)，CN，NH2，苯基等等取代。作为例子的非肽接头是PEG接头， 其中n是使接头具有分子量100到5000kD，优选地100到500kD。肽接头可以如上所述相同的方式改变形成衍生物。
通常，已经发现，对于本发明的血小板生成化合物长度约0-14个亚单位的接头(例如，氨基酸)是优选的。肽接头可以改变以如上所述的相同的方法形成TMP的衍生物。另外，这一实施方案的化合物还可以是线形或环形的。“环形”是指至少两个分离的，即分子的非邻接的部分是相互连接的。例如，分子的末端的氨基和羧基末端可以共价连接形成环形分子。或者，分子可以含有两个或多个Cys残基(例如，在接头中)，该分子也可以通过二硫键的形成环化。另外值得注意，不止一个串联的肽二聚体可以连接形成多个二聚体中的一个二聚体。所以，例如，含有Cys残基的串联二聚体可以与另一个这样的二聚体的Cys形成分子间的二硫键。本发明的肽-接头化合物的例子如下CSSGGPTLREWLQCRRMQ --GGGGG-- CSSGGPTLREWLQCRRMQ(SEQ ID NO 100)；QLGHGPTLRQWLSWYRGM--(Gly)3Lys(Gly)4--ALRDGPTLKQWLEYRRQA(SEQ ID NO 101)；RFAEGPTLREWLEQRKLV-GGG(PEG)GGG- RFAEGPTLREWLEQRKLV (SEQ IDNO 102).
所以，在优选的实施方案中，接头包括(LN1)n，其中LN1是天然存在的氨基酸或其立体异构体，“n”是1到20中的任意一个。优选的肽-接头分子的通式如图1所示。其他优选的肽-接头分子包括i) TMP1-LN1-TMP2-LN2ii) LN1-TMP1-LN2-TMP2iii)LN1-TMP1-LN2-TMP1iv) TMP1-LN1-TMP1-LN1-TMP1-LN1v) LN1-TMP1-LN2-TMP2-LN3-TMP3-LN4-TMP4其中LN1-LN4是各自独立的接头。
载体仍然在另一个实施方案中，本发明的肽或肽化合物可以与载体(V)连接或附着。载体通常是指预防治疗蛋白质的降解和/或增加半衰期，降低毒性，降低免疫原性，或提高生物活性的分子。载体(V)可以通过N末端，C末端，肽骨架或侧链来附着于肽上。
载体(V)可以是载体分子，如线性多聚物(例如，聚乙二醇，聚赖氨酸，葡聚糖等等)，分支链多聚物(参见，例如1981年9月15日公开的授予Denkenwalter等的专利4,289,872；1993年7月20日公开的授予Tam的5,229,490；1993年10月28日公开的Frechet等的WO93/21259)；脂类；胆固醇基团(如类固醇)；或碳水化合物或寡聚多糖。其他可能的载体包括一个或多个水可溶多聚物附着物，如聚乙二醇，或聚丙二醇，如美国专利号4,640,835，4,496,689，4,301,144，4,670,417，4,791,192和4,179,337中所述。仍然是本领域已知的其他有用的多聚物包括单甲氧聚乙二醇，葡聚糖，纤维素，或其他碳水化合物基础的多聚物，聚(N-乙烯吡咯烷酮)-聚乙二醇，丙二醇同聚物，聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)和聚乙烯醇，以及这些多聚物的混合物。载体的例子也包括●Fc区；●能够结合补救受体的其他蛋白质，多肽，或肽；●人血清白蛋白(HSA)；●亮氨酸拉链(LZ)区；●聚乙二醇(PEG)，包括5kD，20kD和30kD PEG，以及其他多聚物；●葡聚糖和本领域已知的其他分子，提供了延长的半衰期，和/或保护蛋白质的降解或清除。
作为例子的载体可以是聚乙二醇(PEG)。PEG基团可以是任何常规的分子量并且可以是直链或分支。PEG的平均分子量优选地范围是在约2kDa到约100kDa，更优选地是约5kDa到约50kDa，最优选地是约5kDa到约10kDa。
PEG基团通常通过酰化，还原性烷基化，Michael附加，巯基烷基化或其他化学选择结合/连接方法，通过PEG成分上的反应基团(例如，醛，氨基，酯，巯基，卤代乙酰基，马来酰亚胺或肼基团)到目标化合物的反应基团上(例如，醛，氨基，酯，巯基，卤代乙酰基，马来酰胺，或肼基团)附着于本发明的化合物上。
碳水化合物(寡聚多糖)基团可以方便地附着于蛋白质的糖基化位点的位点。通常，当它们是序列Asn-X-Ser/Thr的部分时，其中X可以是脯氨酸以外的任何氨基酸，O-连接的寡聚多糖是附着于丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基，而N-连接的寡聚多糖附着于天冬酰胺(Asn)残基。X优选地是不包括脯氨酸的19个天然存在的氨基酸中的一个。在每个类型中发现的N连接和O连接寡聚多糖和糖残基的结构是不同的。两者通常发现是一个类型的糖是N-乙基神经氨酸(称为唾液酸)。唾液酸通常借助它的负电荷可以是N连接和O连接寡聚多糖的末端残基，可以给予糖基化合物酸特性。这样的位点可以掺入本发明的化合物的接头中，并且优选地在多肽化合物的重组生产过程中被细胞(例如，在哺乳动物细胞如CHO，BHK，COS)糖基化。但是，这样的位点可以进一步通过本领域已知的合成或半合成过程糖基化。
在更优选的实施方案中，载体(V)可以包括一个或多个抗体Fc区。所以，如上所述的肽化合物可以另外与一个或多个Fc区直接或通过接头来融合。Fc载体可以从人免疫球蛋白IgG-1重链，参见J.W.等，核酸研究，104071-4079(1982)，或本领域的任何其他Fc序列(例如，其他IgG类别，包括但不限于IgG-2，IgG-3和IgG4，或其他免疫球蛋白)来选择。
已知，抗体的Fc区是由可以通过二硫键或通过非共价结合来连接成二聚体或多聚体形式的单体多肽区段来组成的。根据包括的抗体的类别(例如，IgG，IgA，IgE)或亚类(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgA1，IgGA2)，在天然Fc分子的单体亚单位之间的分子间二硫键的数目的范围是1到4。术语“Fc”如本文所用通常是属于Fc分子的单体，二聚体，和多聚体形式。应该注意到，除非存在通过二硫键形成防止二聚体化的特别条件，当存在适当的Cys残基时，Fc单体将自发地二聚体化。甚至如果通过其他残基除去或取代在Fc二聚体中正常形成二硫键的Cys残基，单体链通常将通过非共价相互作用二聚体化。本文的术语“Fc”是意指任何下面的这些形式天然单体，天然二聚体(二硫键连接)，修饰二聚体(二硫和/或非共价连接)，和修饰的单体(即，衍生物)。
Fc部分的变异体，类似物或衍生物可以通过例如进行各种残基或序列的取代来构建。
变异体(或类似物)多肽包括插入变异体，其中一个或多个氨基酸残基补充Fc氨基酸序列。插入可以定位在该蛋白质的一个或两个末端，或可以定位在Fc氨基酸序列的内部区域。在一个或两个末端具有其他残基的插入变异体包括例如融合蛋白质和包括氨基酸末端或标记的蛋白质。例如，特别是当分子在细菌细胞如大肠杆菌中重组表达时，Fc分子或者可以含有N末端Met。
在Fc缺失变异体中，Fc多肽中的一个或多个氨基酸残基除去了。缺失可以在Fc多肽的一个或两个末端发生，在Fc氨基酸序列内除去一个或多个残基。所以，缺失变异体包括所有Fc多肽序列的片段。
在Fc取代变异体中，除去了Fc多肽的一个或几个氨基酸残基，并且用或选的残基取代。在一个方面，取代在天然中是保守的，但是，本发明也包括非保守的取代。
例如，半胱氨酸残基可以删除或用其他氨基酸来取代，以便防止Fc序列的一些或所有二硫交联的形成。可以除去这些半胱氨酸残基中的每一个，或者用其他氨基酸如Ala或Ser来取代一个或多个这样的半胱氨酸残基。正如另一个例子中，修饰也可以进行导入氨基酸取代到(1)脱离(ablate)Fc受体结合位点；(2)脱离补体(Clq)结合位点；和/或(3)脱离抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)位点。这样的位点是本领域已知的，并且任何已知的取代都如本文所用是在Fc的范围内的。例如，有关IgG1中的ADCC位点可以参见分子免疫学，29卷，No.5,633-639(1992)。
同样，一个或多个酪氨酸残基也可以用苯丙氨酸残基取代。另外，其他变异的氨基酸插入，缺失(例如，来自1-25个氨基酸)和/或取代也受到关注，并且是在本发明的范围内的。保守氨基酸取代通常是优选的。另外，改变可以是已改变的氨基酸的形式，如肽模拟物或D氨基酸。
本发明的Fc序列也可以是衍生的，即含有氨基酸残基的插入，缺失，或取代以外的修饰。优选地，这些修饰在天然上可以是共价的，包括例如，与多聚物，脂，其他有机，和无机成分的化学键合。可以制备本发明的衍生物来增加循环半衰期，或可以设计提高多肽对需要的细胞，组织或器官的目标能力。
如WO 96/32478，题目“半衰期增加的改变的多肽”所述，利用完整的Fc分子的补救受体结合区作为发明的化合物的Fc部分也是可能的。本文中命名为Fc的分子的类别的其他成员是题目为“半衰期增加的类免疫球蛋白区域”的WO 97/34631中所述的那些。在这一章中引证的两个公开的PCT申请引入本文作为参考。
Fc融合可以在TMP1或TMP2的N-或C-末端，或在TMP1或TMP2的N-和C末端。同样，Fc融合可以在Fc区域的N-或C-末端。
本发明的优选的化合物包括连接或附着于本文公开的TMP的二聚体或多聚体的IgG1 Fc融合二聚体。在这样的情况中，各个Fc区将在有或没有接头的情况下连接到TMP肽的二聚体或多聚体上。这样的化合物的图解例子如图2所示。
也可以利用多个载体；例如，在各个末端的Fc，或在一个末端的Fc，和在其他末端或侧链的PEG基团。
作为例子的肽-载体化合物提供在下面的表4。
表4-作为例子的肽-载体化合物

另外，本发明优选的实施方案列出在表5中。
表5-特定的优选的实施方案

III.生产的方法本发明的化合物可以各种方法生产。因为许多化合物是肽，或包括肽，合成肽的方法在本文中特别相关。固相合成技术也可以利用。适当的技术是本领域已知的，并且包括Merrfield，化学多肽，335-61(Katsoyannis and Panayotis eds.1973)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149(1963)；Davis等，Biochem.Intl.10394-414(1985)；Stewart and Young，固相肽合成(1969)；美国专利3,941,763；Finn等，蛋白质，第3版，2卷，105-253(1976)；和Erickson等，蛋白质，第3版，2卷，257-527(1976)所述的那些。固相合成是制造个别肽的优选的技术，因为它是生产小肽的耗价最有效的方法。
肽也可以利用重组DNA技术在转化宿主细胞中生产。为此，编码该肽的重组DNA分子是优选的。制备这样的DNA和/或RNA分子的方法是本领域已知的。例如，编码该肽的序列可以利用适当的限制酶从DNA中切出。利用包含随后的克隆的有用的限制位点的聚合酶链式反应(PCR)可以产生相关的序列。或者，利用化学合成技术，如亚磷酰胺方法可以合成DNA/RNA分子。同时，这些或其他技术的结合也可以利用。
本发明也包括了在适当的宿主中编码肽的一个载体。该载体包括编码与适当的表达控制序列可操作地连接的肽的DNA分子。在编码肽的DNA分子插入载体之前或以后，影响这一操作连接的方法是已知的。表达控制序列包括启动子，活化物，增强子，操纵子，核糖体结合位点，起始信号，终止信号，加帽信号，聚腺苷酸化信号，和其他在转录或翻译的控制下信号。
包括编码肽的DNA分子的得到的载体用于转化适当的宿主。这一转化可以利用本领域已知的方法来进行。
大量可得到的和已知的宿主细胞中的任意一个都可以用于本发明的实践中。选择特别的宿主是依赖于本领域已知的许多因子的。这些因子包括例如与选择的表达载体的兼容性，与DNA分子编码的肽的宿主细胞的毒性，转化的速度，肽的发现的容易度，表达特征，生物安全性和耗价。平衡这些因子必须深入理解不是所有的宿主可以平等有效地表达特别的DNA序列。
在这些一般的指导规则下，有用的微生物宿主包括培养基中的细菌(如大肠杆菌)，酵母(如啤酒酵母和巴斯德毕赤酵母)和其他真菌，昆虫，植物，哺乳动物(包括人)细胞，或本领域已知的其他宿主。转化的宿主是在常规的发酵条件下培养的，使需要的肽得到表达。这样的发酵条件是本领域已知的。然后，从发酵培养基或它们表达的宿主细胞可以纯化肽。这些纯化方法也是本领域已知的。
含有衍生肽或含有非肽基团的化合物可以通过已知的有机化学技术来合成。例如，可以利用固相合成技术。适当的技术是本领域已知的，并且包括Merrifield(1973)，多肽化学，335-61(Katsoyannis and Panayotiseds.)；Merrifield(1963)，J.Am.Chem.Soc.852149；Davis等(1985)，Biochem.Intl.10394-414；Stewart and Young(1969)，固相肽合成；美国专利3,941,763；Finn等(1976)，蛋白质(第3版)，2105-253；和Erickson等(1976)，蛋白质(第3版)，2257-527中所述的那些。固相合成技术是生产单个肽的优选的技术，因为它是生产小肽的耗价最有效的方法。
IV.化合物的用途本发明的化合物具有结合和/或激活mpl受体的能力，和/或具有(在体内和体外)刺激血小板(“血小板生成活性”)和血小板前体(“巨核细胞生成活性”)的生产的能力。为了测量这些化合物的活性，可以利用标准的测试方法，如题目为“刺激巨核细胞生长和分化的组合物和方法”的WO 95/26746所述的那些。在本文的实施例部分中进一步叙述了体内实验。
本发明的方法和组合物治疗的症状通常是在将来包括存在的巨核细胞/血小板缺陷或期望或预期的巨核细胞/血小板缺陷(例如，因为已计划的外科手术或血小板供体)的那些。这样的症状可以是体内的活性mpl配体的缺陷(暂时或永久)的结果。血小板缺陷的一般称为血小板减少，所以，本发明的方法和组合物通常是在需要的患者中治疗血小板减少的预防和治疗中可得的。
世界卫生组织已经对个体中的循环的血小板的数目的血小板减少的程度进行分类(Miller等，癌症，47210-21(1981))。例如，显示没有血小板减少信号的个体(0级)通常将至少具有100,000个血小板/mm3。温和的血小板减少(1级)表明，血小板的循环水平在79,000和99,000/mm3。中等的血小板减少(2级)显示在50,000到74,000血小板/mm3，严重的血小板减少的特征是25,000和49,000个血小板/mm3。威胁生命或衰弱的血小板减少的特征是血小板的循环浓度是小于25,000/mm3。
血小板减少(血小板缺陷)可以存在各种原因，包括化学治疗和其他许多药物的治疗，放射性治疗，外科手术，偶然的失血，和其他特异的疾病症状。包括血小板减少和可以根据本发明治疗的特异的疾病症状的例子有再生障碍贫血；自发性或免疫血小板减少(ITP)，包括与胸癌相关的自发性血小板减少紫瘢；HIV相关的ITP，和HIV相关的血栓血小板减少紫瘢；导致血小板减少的转移性肿瘤；系统性红斑狼疮；包括新生儿狼疮综合脾大；Fanconi综合症；维生素B12缺陷，叶酸缺陷；May-Hegglin异常；Wiskott-Aldrich综合症；慢性肝疾病；与血小板减少相关的骨髓可塑性不全综合症；夜发作的血红蛋白尿；在C7E3Fab(Abciximab)治疗后的急性深度血小板减少；异源免疫血小板减少，包括母本异源免疫血小板减少；与抗磷脂抗体和血栓形成相关的血小板减少；自身免疫血小板减少；药物诱导的免疫血小板减少，包括碳平板诱导的血小板减少，肝素诱导的血小板减少；新生儿血小板减少；妊怔引起的血小板减少；Hughes综合症；lupoid血小板减少；偶然和/或大量的失血；骨髓增殖紊乱；有恶性肿瘤的患者中的血小板减少；血栓形成的血小板减少紫瘢，包括血栓形成微血管造影术影证血栓形成的血小板减少的紫瘢/癌症患者中的溶血尿毒综合症；自身免疫溶血贫血；隐藏性的空肠盲管穿孔；纯红细胞发育不全；自身免疫血小板减少；肾病流行病；利福平相关的急性肾衰竭；巴黎特索鲁形象血小板减少；新生儿同种免疫血小板减少；阵发式夜间血红蛋白尿；胃癌中的血液变化；小孩溶血尿毒综合症；与病毒感染相关的血液现象，包括甲型肝炎病毒和CMV相关的血小板减少。同样，一些AIDS的治疗也导致血小板减少(例如，AZT)。一些伤口愈合紊乱也可以得益于血小板数目的增加。
有关预期的血小板的缺陷，例如由于将来的外科，本发明的化合物将在需要血小板之前几天到几小时中施用。在急性情况中，例如偶然和大量的失血，本发明的化合物可以与血液或纯血小板一起施用。
如果这些细胞发现是表达mpl受体的，本发明的化合物也可以用于刺激除了巨核细胞外的一些细胞类型。与表达mpl受体的这些细胞相关的条件，是应答mpl配体的刺激的，也是在本发明的范围内的。
本发明的化合物可以用于任何情况，其中有需要血小板和血小板前体细胞的生产的，或需要mpl受体的刺激的。所以，例如，本发明的化合物可以用于治疗需要血小板，巨核细胞，等的哺乳动物中的任何症状。这样的症状在下面的举例的来源中有详细叙述WO 95/26746；WO95/21919；WO95/18858；WO 95/21920，这些都引入本文。
本发明的化合物也可以用于维持血小板和/或巨核细胞和相关细胞的存活力或储存生命期。因此，它可以用于在含有这样的细胞的组成中包括有效量的一个或几个这样的化合物。
“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括人，家养动物，如狗和猫；外来的和/或动物园的动物，包括，猴，实验室动物，包括小鼠，大鼠，和豚鼠；农场动物包括马，牛，羊，山羊，和猪等。优选的哺乳动物是人。
V.药物组合物本发明也提供了药物组合物和使用本发明化合物的药物组合物的方法。这样的药物组合物可以注射，或口服，鼻饲，经皮或其他形式来施用，包括例如，静脉内，皮内的，肌肉内的，乳房内的，腹膜内的，鞘内的，眼球内的，眼球后的，肺内的(例如，气雾药物)或皮下注射(包括，长期释放的存储施用)；通过舌下，肛门，阴道，或通过外科植入，例如在脾囊，脑或在角膜下包埋。治疗可以在一个时期单剂量或多剂量治疗。通常，本发明了解的是包括有效量的本发明的化合物和药物可接受的稀释剂，防腐剂，溶剂，乳化剂，佐剂和/或载体。这样的组合物包括各种缓冲液含量的稀释剂(例如，Tris-HCl，乙酸，磷酸)，pH，和离子强度；添加剂如去垢剂，和溶解剂(例如，吐温80，聚山梨醇酯80)，抗氧化剂(例如，抗坏血酸，偏亚硫酸氢钠)，防腐剂(例如，硫柳汞，苯基醇)和大量的物质(例如，乳糖，山梨醇)；在多聚物化合物如聚乳酸，聚羟乙酸等的特殊制备中，或在脂质体中掺入该物质。透明质酸也可以利用，这可以具有在循环中促进维持持久性的效果。药物组合物或者可以仍然包括其他药物可接受的液体，半固体，或作为药物载体，赋形剂，或介质的固体稀释剂，包括但不限于，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸盐，硬脂酸镁，甲基-丙基羟基苯甲酸盐，淀粉，蔗糖，葡聚糖，阿拉伯胶口香胶，磷酸钙，矿质油，可可脂，和可可油。这样的组合物可以影响物理状态，稳定性，体内释放的速度，和本蛋白质和衍生物的体内清除的速度。参见，例如，Remington药物科学手册，第18版，(1990，Mack出版公司，Easton，PA 18042)，1435-1712页，该文献引入本文作为参考。组合物可以制备成液体形式，或可以是干粉末，如冻干形式。同样受到关注的植入维持释放制剂，如经皮的制剂。
本文也利用口服固体剂量形式，通常在Remington药物科学手册，第18版，1990(Mack出版公司，Easton PA 18042)89章中有叙述，该文献引入本文作为参考。固体剂量形式包括片剂，胶囊，丸剂，锭剂或糖锭，扁囊剂或小丸。同时，脂质体或类蛋白质包囊也可以用于配制本发明的组合物(例如，美国专利4,925,673中报道的类蛋白质微球体)。可以利用脂质体包囊，脂质体可以用各种多聚物来衍生(例如，美国专利5,013,556)。用于治疗的可能的固体剂量形式的叙述在Marshall，K.，现代药物，G.S.Banker and C.T.Rhodes第10章，1979中有述，该文献引入作为参考。通常，该制剂包括发明的化合物和抵抗胃环境，在肠中释放生物活性物质的惰性成分。
同样特别受到关注的是上面的发明化合物的口服剂量形式。如果需要，该化合物可以被化学修饰，使口服递送有效。通常，受到关注的化学修饰是至少一个成分附着于该化合物本身，所述的成分允许(a)抑制蛋白质的水解；并且(b)由胃或肠吸收进血液。同样需要的是加强化合物的整个的稳定性，增加体内的循环时间。这样的成分的例子包括，聚乙二醇，乙二醇和丙二醇的共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸(Abuchowski和Davis，可溶的多聚物-酶加合物，作为药物的酶，Hocenberg and Roberts，eds.，Wiley-Interscience，纽约，NY，(1981)，367-383；Newmark等，应用生物化学杂志，4185-189(1982))。可以利用的其他多聚物是聚-1，3-二氧戊环和聚-1，3，6-tioxocane。具有优选的药物用途的，如上所述是聚乙二醇成分。
对于口服递送的剂量形式，同样可能利用修饰的脂肪族氨基酸的盐，如N-(8-[2-羟基苯甲酰]氨基)辛酸钠(SNAC)，可以作为增强本发明的治疗化合物的吸收的载体。利用SNAC的肝素制剂的临床效率已经在“Emisphere技术手册”的第II章中得到证明，参见美国专利5,792,451，“口服药物递送组成和方法”。
治疗剂可以包括在作为约1mm的颗粒大小的颗粒或小丸形式的细微微颗粒的制剂中。胶囊施用的物质的制剂也可以是粉末，轻压缩的栓剂，或甚至作为片剂施用。治疗剂可以通过压缩来制备。
色剂和调味剂都可以包括在内。例如，可以配制蛋白质(或衍生物)(如脂质体或微球体包囊)，然后进一步包含在可食的产品内，如含有色剂或调味剂的冷冻饮料。
人们可以稀释或提高具有惰性物质的治疗剂的体积。这些稀释剂可以包括碳水化合物，特别是，甘露醇，乳糖，无水乳糖，纤维素，蔗糖，修饰的葡聚糖，和淀粉。一些无机盐也可以用作填充剂，包括三磷酸钙，碳酸镁和氯化钠。一些商业可得的稀释剂是Fast-Flo、Emdex、STA-Rx1500、Emcompress和Avicell。
崩解剂可以包括在固体剂量形式的治疗剂的制剂中。用作崩解剂的物质包括但不限于淀粉，基于淀粉，分散的片剂的商业崩解剂。淀粉羟乙酸钠，Amberlite，羧甲基纤维素钠，超支链淀粉，藻酸盐钠，明胶，橘子皮，酸性羧甲基纤维素，天然海绵和皂土都可以利用。崩解剂的另外的形式是不溶的阳离子交换树脂。粉末化的胶可以用作去垢剂和作为结合剂，这些可以包括粉末胶，如琼脂，Karaya或西黄蓍胶。藻酸和它的钠盐也可以用作崩解剂。
结合物可以将治疗剂结合在一起形成坚硬的片剂，并且包括来自天然产物如阿拉伯胶，西黄蓍胶，淀粉和明胶的物质。其他包括甲基纤维素(MC)，乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟基丙基甲基纤维素(HPMC)都可以用于乙醇溶液将治疗剂颗粒化。
抗摩擦剂可以包括制剂中以防止在配制过程中的粘附。润滑剂可以用作治疗剂和模壁之间的层面，这些可以包括但不限于，硬脂酸，包括它的镁和钙盐，聚四氟乙烯(PTFE)，液体石蜡，植物油，和石蜡。可溶的润滑剂也可以利用各种分子量的月桂基硫酸钠，月桂基硫酸镁，聚乙二醇，Carbowax 4000和6000。
可以提高配制过程中药物的流动特性和压缩过程中的重排的滑动剂也可以加入。滑动剂可以包括淀粉，滑石粉，煅制硅石和水合硅铝酸盐。
为了辅助治疗剂在水环境中溶解，可以加入表面活性剂作为湿润剂。表面活性剂可以包括，阴离子去垢剂如月桂硫酸钠，二辛基硫酸琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。阳离子去垢剂也可以使用并且可以包括苯扎氯胺或苄索氯胺。可以包括在制剂中的作为表面活性剂的潜在的非离子去垢剂的系列是月桂聚乙二醇400，聚氧40硬脂酸盐，聚氧乙烯氢化蓖麻油10，50，和60，甘油单硬脂酸盐，聚山梨醇酯40，60，65和80，蔗糖脂肪酸酯，甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可以蛋白质或衍生物单独或作为不同比例下的混合物的制剂来存在。
潜在性地能增强化合物的吸收的添加剂例如是脂肪酸油酸，亚油酸和亚麻酸。
释放控制的制剂可能也是需要的。这样的药物可能掺入允许通过扩散或滤取机制来释放的惰性基质，例如胶。慢性降解基质也可以掺入制剂中，如藻酸，聚多糖。这一治疗剂的控制释放的另一个形式是通过基于Oros治疗系统的方法(Alza公司)，即这样的药物包括在由于渗透效果允许水进入和推动药物从一个小口出去的半渗透膜中。一些肠包衣也具有推迟释放的效果。
其他包衣也可以用于制剂中。这些包括各种可以用于包衣盘的糖。治疗试剂也可以是给出的薄膜包衣片剂，并且用于这种情况的物质可以分成2组。第一组是非肠的物质并且包括甲基纤维素，乙基纤维素，羟乙基纤维素，甲基羟基乙基纤维素，羟基丙基纤维素，羟基丙基甲基纤维素，羧基甲基纤维素钠，吡咯烷酮和聚乙二醇。第二组包括肠物质，通常是邻苯二甲酸酯。
这些物质的混合物可以用于提供最适当的薄膜包衣。薄膜包衣可以在盘包衣器中或在液体床中或通过压缩包衣来进行。
本文中同样受到关注的是将本发明的蛋白质(或其衍生物)递送到肺。当本发明的蛋白质(或衍生物)递送到哺乳动物的肺时，就吸入和传递通过肺的内皮层到血液中。(其他报道包括Adjei等，药物研究，7565-569(1990)；Adjei等，药物学国际杂志，63135-144(1990)(leuprolide acetate)；Braquet等，心血管药物学杂志，13(第5卷)s.143-146(1989)(内皮细胞素-1)；Hubbard等，国际医学年刊，3206-212(1989)(1-抗胰蛋白酶)；Smith等，临床研究杂志，841145-1146(1989)(1-蛋白酶)；Oswein等，“蛋白质的气雾剂化”，呼吸药物递送专题讨论会记要II，Keystone，科罗拉多，1990年3月(重组人生长激素)；Deb等，免疫学杂志，1403482-3488(1988)(干扰素-和肿瘤坏死因子)和Platz等，美国专利5,284,656(粒细胞集落刺激因子)。
在本发明的实践的利用中受到关注的是设计治疗肺递送的治疗产品许多机械装置，包括但不限于喷雾器，定剂量吸入器，和粉末吸入器，所有这些都是本领域技术人员熟悉的。
适于本发明的实践的一些特异的商业可得装置的例子是Ultravent气雾器，是由Mallinckrodt公司制造的，圣路易斯，密苏里州；Acorn II气雾器，是由Marquest医学产品公司制造的，在Englewood，科罗拉多；Ventolin计量剂量吸入器，由Glaxo公司制造的，Research Triangle公园，北卡罗来那；和旋转吸入粉末吸入器，由Fisons公司制造，Bedford，马萨诸塞州。
所有这些装置需要利用适于分配发明的化合物的制剂。通常，各个制剂是特异于利用的装置的类型的，并且可以包括利用适当的推进剂物质，和稀释剂，佐剂，和/或用于治疗中的载体。
本发明的化合物最有利地应该制备成平均颗粒大小小于10μm(或微米)，最优选地0.5到5μm，可以最有效地递送到的肺的远端。
载体包括碳水化合物，如海藻糖，甘露醇，木糖醇，蔗糖，乳糖和山梨醇。其他用于配制中的成分可以包括DPPC，DOPE，DSPC和DOPC。可以利用天然的或合成的表面活性剂。可以利用聚乙二醇(甚至与它在衍生蛋白质或类似物时的用途分开)。葡聚糖，如环葡聚糖也可以利用。胆酸盐和其他相关的增强剂也可以利用。纤维素和纤维素衍生物也可以利用。氨基酸也可以利用，如用于缓冲液制剂中。
同时，脂质体，微胶囊或微球体，内含复合物或载体的其他类型的载体的用途也受到关注。
适用于利用气雾器，即喷射或超声波的制剂通常将包括以每ml溶液约0.1到25mg生物活性蛋白质的浓度溶解于水中的本发明的化合物。该制剂也包括缓冲液，和简单的糖(例如，为了蛋白质稳定和渗透压的调节)。气雾剂制剂也可以含有表面活性剂，以便减少或预防表面诱导的形成气雾的溶液的原子化引起的蛋白质的聚集。
利用记量吸入器装置的制剂通常将包括含有表面活性剂辅助下悬浮于推进剂中本发明的化合物的细微地分散的粉末。推进剂可以是用于本目的的任何常规物质，如氯氟碳，氯氟烃，氟烃，或烃，包括三氯氟甲烷，二氯二氟甲烷，二氯四氟乙醇，和1，1，1，2-四氟乙烷，或它们的组合。适当的表面活性剂包括山梨聚糖三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可以用作表面活性剂。
从粉末吸入器装置分散的制剂将包括含有本发明的化合物的细微分散的干粉末，并且也可以包括膨胀剂，如乳糖，山梨醇，蔗糖，甘露醇，海藻糖或木糖醇，它们的量可以简化粉末从装置中扩散，例如制剂重量的50到90％。
本发明的化合物的鼻腔递送也应该关注。鼻腔递送允许在将治疗产物施用到鼻后直接将蛋白质传递到血液，而不会在肺中沉积产物。鼻腔递送的制剂包括用葡聚糖或环葡聚糖的那些。通过其他粘膜传输的递送方法也同样受到关注。
剂量治疗上述症状的一个方法中包括的剂量方案将是由参与的医生，考虑改变药物的作用的各种因素，例如患者的年龄，症状，体重，性别，和饮食，任何感染的严重性，施用的时间，和其他临床因素来确定的。
本发明的化合物可以最初使用药团，接着连续地输液维持药物产品的治疗循环水平来施用。正如另一个例子，本发明的化合物可以作为一次性剂量施用。本领域的普通技术人员将是容易使有效剂量和施用方案如优秀的医学方法和个别患者的临床症状来确定而达到最佳化的。剂量的频率将依据施用的试剂和途径的药物动力学参数。最佳的药物制剂将通过本领域的技术人员根据施用的途径和需要的剂量来确定。参见例如，Remington药物科学手册，第18版，(1990，Mack出版公司，Easton，PA 18042〔1435-1712〕页，该公开物引入本文作为参考。这样的制剂可以影响施用的试剂的物理状态，稳定性，体内释放的速度，和体内清除的速度。根据施用的途径，可以根据体重，身体表面区域或器官大小来计算适当的剂量。确定包括上面提到的各个制剂用于治疗的适当剂量所需要的精细的计算通常是本领域普通技术人员不需要进行实验就可以常规操作的，特别是有了本文公开的剂量信息和实验，以及在上面讨论的人的临床实验中观察到的药物动力学数据时更容易进行。适当的剂量可以通过已建立的实验确定血液水平剂量和适当的剂量应答数据来确定。最后的剂量方案将是通过参与的医生，考虑改变药物的作用的各种因子，例如，药物的特异活性，损伤的严重性和患者的应答，患者的年龄，症状，体重，性别和饮食，任何感染的严重性，施用的时间和其他临床因子来确定。当进行研究时，关于适当的剂量水平，各种疾病和症状的治疗的时间长度将出现新的情况。
在治疗其他症状以及血小板缺陷中，本发明的治疗方法、组合物和化合物可以单独使用，或与其他细胞因子，可溶的mpl受体，造血因子，白细胞干扰素，生长因子或抗体结合来使用。可以预料，本发明的化合物可与一般的造血刺激剂(如IL-3或GM-CSF)结合，在治疗一些形式的血小板减少时有用。其他巨核细胞刺激因子，即meg-CSF，干细胞因子(SCF)，白血病抑制因子(LIF)，制癌蛋白M(OSM)，或具有巨核细胞刺激活性的其他分子也可以与mpl配体一起使用。这样的协同施用的细胞因子或造血因子的其他例子包括IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-11，集落刺激因子-1(CSF-1)，M-CSF，SCF，GM-CSF，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，EPO，干扰素-α(IFN-α)，同义干扰素，IFN-β，IFN-γ，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，血小板生成素(TPO)，血管生成素，例如，Ang-1，Ang-2，Ang-4，Ang-Y，人血管生成素类似多肽，血管内皮生长因子(VEGF)，血管生成素，骨形态发生蛋白质1，骨形态发生蛋白质-2，骨形态发生蛋白质-3，骨形态发生蛋白质-4，骨形态发生蛋白质-5，骨形态发生蛋白质-6，骨形态发生蛋白质-7，骨形态发生蛋白质-8，骨形态发生蛋白质-9，骨形态发生蛋白质-10，骨形态发生蛋白质-11，骨形态发生蛋白质-12，骨形态发生蛋白质-13，骨形态发生蛋白质-13，骨形态发生蛋白质-14，骨形态发生蛋白质-15，骨形态发生蛋白质受体IA，骨形态发生蛋白质受体IB，脑起源的亲神经因子，睫状亲神经因子，睫状亲神经因子受体，细胞因子诱导的嗜中性趋化性因子1，细胞因子诱导的嗜中性趋化性因子2，内皮细胞生长因子，内皮素1，表皮生长因子，表皮起源的嗜中性吸引剂，成纤维生长因子4，成纤维生长因子5，成纤维生长因子6，成纤维生长因子7，成纤维生长因子8，成纤维生长因子8b，成纤维生长因子8c，成纤维生长因子8b，成纤维生长因子8c，成纤维生长因子9，成纤维生长因子10，成纤维生长因子酸，成纤维生长因子碱，神经胶质细胞系起源的亲神经因子受体1，神经胶质细胞系起源的亲神经因子受体2，生长相关蛋白质，肝素结合表皮生长因子，肝细胞生长因子，肝细胞生长因子受体，胰岛素类似生长因子I，类胰岛素生长因子受体，类胰岛素生长因子受体II，类胰岛素生长因子结合蛋白质，角化细胞生长因子，白血病抑制因子，白血病抑制因子受体，神经生长因子，神经生长因子受体，亲神经因子-3，亲神经因子-4，胎盘生长因子，胎盘生长因子2，血小板起源内皮细胞生长因子，血小板起源生长因子，血小板起源生长因子A链，血小板起源生长因子AA，血小板起源生长因子AB，血小板起源生长因子B链，血小板起源生长因子BB，血小板起源生长因子受体，血小板起源生长因子受体，pre-B细胞生长刺激因子，干细胞因子受体，TNF，包括TNF0，TNF1，TNF2，转化生长因子，转化生长因子，转化生长因子1，转化生长因子1，2，转化生长因子2，转化生长因子3，转化生长因子5，潜在的转化生长因子1，转化的生长因子结合蛋白质I，转化的生长因子结合蛋白质II，转化的生长因子结合蛋白质III，I型肿瘤坏死因子受体，II型肿瘤坏死因子受体，尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂受体，血管内皮生长因子，和嵌合蛋白质和其生物或免疫活性片段。同时或按顺序施用有效量的可溶哺乳动物mpl受体可能是有用的，一旦巨核细胞达到成熟形式，所述受体似乎具有引起巨核细胞到片段成为血小板的效果。所以，施用本发明的化合物(增强成熟的巨核细胞的数目)，接着施用可溶的mpl受体(失活配体，并且允许成熟的巨核细胞产生血小板)可以希望是特别有效的刺激血小板生产的方法。上面再引证的剂量将调整到在治疗组合物中补充这样的其他成分。已治疗的患者的状态可以通过常规的方法来检测。
在本发明的化合物已加入到血小板和/或巨核细胞的组合物和相关的细胞中的情况中，包括的量通常将是通过本领域已知的技术和实验，在实验中确定的。作为例子的量的范围是每106个细胞0.1μg-1mg本发明的化合物。
应该理解，本发明的内容应用到特殊的问题或情况中将是在本文包含的内容下，本领域一个普通技术人员的能力范围内的。本发明的产物的例子和它们的分离、用途和制造的代表性过程叙述如下。
实施例下面陈述了制造和鉴定一些本文公开的化合物的例示方法。
实施例1构建二级肽文库A.制备电感受态大肠杆菌细胞在37℃，在10ml的2xYT培养基(1.6％Bacto胰蛋白胨，1％酵母提取物，85.5mMNaCl)中制备过夜的大肠杆菌培养物(TG1菌株；Amersham药物生物技术公司，Piscataway，新泽西州)。将1微升这一过夜培养物用于接种1升含有0.4％葡萄糖和1mM MgCl2的2xYT培养基，在37℃，在一个振摇器中生长这一升培养物直到OD600＝0.8。在冰上冷冻培养物15分钟，在4℃，在4000rpm离心(Beckman JA-10离心机)20分钟。在500ml的冰冷冻的10％的甘油溶液中再悬浮细菌沉淀，在4℃，在4000rpm离心得到的混合物20分钟。再次在500ml的冰冷冻的10％甘油溶液中在悬浮细菌沉淀，在4℃，在4000rpm再次离心得到的混合物20分钟。在500ml的冰冻的10％甘油溶液中再次再悬浮细菌沉淀，在4℃，在4000rpm，再次离心得到的混合物20分钟。然后，在25ml的冰冷冻的10％的甘油溶液中再悬浮细胞沉淀。将这一浓缩的细菌样品转移到冰冷冻的50ml的园锥管中，在4℃在台式离心机(Beckman CS-6R)中，在3500rpm离心。在小体积的冰冷冻甘油溶液中再悬浮细胞沉淀，立即在乙醇/干冰浴冷冻100或300μl细菌储备物，并且在-80℃下冷冻储藏。
B.pCES1载体的修饰利用扩展的长模板PCR系统(Roche Diagnostics公司，Indianapolis，印地安那州)，用1μg pCES 1载体(TargetQuest公司)作为模板，进行PCR反应。PCR混合物的体积是100μl，其中含有1X PCR缓冲液，200nM各两个引物，5’-CAAACGAATGGATCCTCATTAAAGCCAGA-3’和5’-GGTGGTGCGGCCGCACTCGAGACTGTTGAAAGTTGTTTAGCA-3’，200nM dNTP，3U Tag DNA聚合酶。TRIO -Thermoblock(Biometra)PCR系统用于进行下面的程序94℃5分钟，30个循环[94℃30秒，50℃30秒，72℃45秒]；72℃10分钟，冷却到4℃。在1％的琼脂凝胶上进行PCR产物的电泳，根据制造商的方案用QIAGEN Spin Column(QIAGEN公司，Valencia，加里福尼亚)进行纯化。用5μl PCR产物，200nM各两个引物，5’-CAAACGAATGGATCCTCATTAAAGCCAGA-3’和5’-AACACAAAAGTGCACAGGGTGGAGGTGGTGGTGCGGCCGCACT-3’，利用如上所述相同的PCR条件进行第二个PCR反应。
在37℃，在含有1xNEB2缓冲液，60U的ApaLI(新英格兰生物实验室，Beverly，马萨诸塞州)的100μl的反应中分离消化PCR产物和原初的pCES1 1小时。用QIAGEN Spin柱纯化消化的DNA，并且在40μl含有1x连接缓冲液和40U T4 DNA连接酶(新英格兰生物实验室)的反应混合物中，在室温下过夜连接在一起。
将载体转移到大肠杆菌中，并且在37℃过夜温育。选择分离的单个菌落，用QIAGEN Spin柱纯化。用DNA测序证实准确的插入。
C.制备载体DNA利用基因脉冲发生器II(BIO-RAD，Hercules，加里福尼亚)，设定在2500V，25°F，200ohms将1微克修饰的p CES1载体DNA(部分1B)转化进100μl电感受态TG1大肠杆菌(部分1A)。然后，立即将转化的细菌样品转化进含有900μl SOC(2％蛋白胨，0.5％酵母提取物，10mMNaCl，2.5mM KCl，20mM葡萄糖，10mMMgSO4，10mM MgCl2)的试管中，并且允许这一培养物在37℃，振摇1小时在37℃生长。然后，在2xYTAG(具有100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的2xYT)，琼脂平板上铺细胞，并且在37℃过夜温育。在37℃，利用单个菌落接种1升的2xYTAG，振摇过夜。用QIAGEN质粒Maxi试剂盒，根据制造商的方案来纯化质粒载体DNA。
D.消化载体DNA在含有1x NEB缓冲液2，200U的ApaLI，和200U XhoI的400μl的反应混合物中消化50微克载体DNA(部分1C)，在37℃过夜。在37℃过夜温育限制消化反应混合物，在预制的1％的琼脂凝胶(Embi Tec，圣迭戈，加里福尼亚)中分析。根据制造商的指导，从凝胶中切出线性载体DNA，用QIAquick凝胶萃取试剂盒来萃取(QIAGEN公司)。
E.制备文库寡核苷酸设计两个文库寡核苷酸(固定的和预测的)。合成了固定的文库寡核苷酸5’-
CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKNNKGGTCCTACTCTGMRKSARTGGCTGNNKNNKNNKNNKNNKNNKCATTCTCTCGAGATCG-3′和预测(doped)文库寡核苷酸5’-5′-CACAGTGCAC-AGGGTNNKNNKNNKNNKggKcc-KacKctKNNKNNKtgKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKCATTCTCTCGAGATCG-3′(小写字母代表70％标示的碱基和各10％的其他三种核苷酸的混合物)。这些寡核苷酸中的每一个都可以用作聚合酶链式反应中的模板。
利用展开的高度精确的PCR系统试剂盒(Roche诊断公司)进行PCR反应。各个PCR反应在体积上是100μl，含有10nM的文库寡核苷酸，1XPCR缓冲液，300nM各个引物5’-CACAGTGCACAGGGT-3’和5’-TGATCTCGAGAATG-3’，200nM dNTP，2mMCaCl2，和5U扩展的聚合酶。利用热循环仪(GeneAmp PCR系统9700，应用生物系统公司)进行下面的程序94℃5分钟，30个循环的[94℃30秒，55℃30秒，72℃45秒]；72℃7分钟，冷却到4℃。利用QIAquick核苷酸除去试剂盒(QIAGEN公司)根据制造商的方案除去游离的核苷酸。
F.文库寡核苷酸的消化在含有1xNEB缓冲液2，200U ApaLI，和200U XhoI的400μl的反应混合物中消化5微克各个PCR产物(部分IE)，37℃过夜。在3％的琼脂凝胶上分离消化的DNA(Embi Tec)。来自各个反应的需要的DNA带从凝胶中切出，用QIAquick凝胶萃取试剂盒萃取。
G.将载体与文库寡核苷酸连接在含有1xNEB连接缓冲液和80U的T4 DNA连接酶的400μl反应混合物，在16℃过夜连接线性化的载体(1D部分，25μg)和各个消化的PCR产物(1F部分，5μg)。在65℃，温育连接的产物20分钟，失活DNA连接酶，进一步在37℃与8U NotI温育2小时，使载体自身连接最小化。然后，通过标准的酚/氯仿萃取纯化连接的产物(分子克隆，Maniatis et al，第3版)，再悬浮于30μl的H2O中。
H.电穿孔转化对于每个文库，进行10个电穿孔反应。对于每次转化，在0.2cm的小管中(BIO-RAD)混合3μl的连接的载体DNA(1G部分)，和300μl的TG1细胞(1A部分)。通过基因脉冲器II，设定在2500V，25uF，和200ohms脉冲得到的混合物。将从10个电穿孔反应的转化细菌样品合并，并且转移进含有27ml的SOC烧瓶中，在37℃温育1小时。然后，在170ml 2xYTAG中加入细胞，在37℃生长，振摇3小时。在5000rpm离心细胞，4℃，10分钟。然后，在10ml的15％的甘油/2xYT中再悬浮细胞沉淀，存储在-80℃。这是最初的文库的储备物。滴定显示，文库分别是固定的和预测文库中大小为1.0×109个独立的转化体和2.4×109个独立的转化体。
2.扩增文库A.制造文库的二级储备物(stock)利用初级文库细胞储备物(1H部分)接种1300ml(对于固定的文库)和2600ml(对于预测文库)2xYTAG培养基，使起始OD600＝0.1。允许培养物在37℃生长，振摇几小时，直到OD600＝0.5。取出120ml的固定的文库的等分试样和240ml的预测文库的等分试样，在另外的烧瓶中在37℃再生长2小时。4℃下，在5000rpm(Beckman JA-14离心机)离心这些亚培养物10分钟，在10ml(对于各个文库)10％的甘油/2xYT中再悬浮细菌沉淀，在-80℃储存。
B.噬菌体诱导将M13KO7辅助噬菌体等分试样(Amersham药物生物技术公司)加入到OD600＝0.5(2A部分)的剩余的细菌培养物，直到最后浓度为3X109pfu/ml。允许辅助噬菌体在37℃不振摇感染细菌30分钟，慢振摇感染30分钟。在4℃，在5000rpm离心感染的细胞10分钟。将细胞沉淀用1300ml(固定文库)和2600ml(预测文库)的2xYTAK(具有100μg/ml氨苄青霉素和40μg/ml卡那霉素的2YT)再悬浮。在37℃过夜振摇允许进行噬菌粒生产。
C.收获噬菌体在4℃，5000rpm离心细菌培养物(2B部分)10分钟。将上清液转移到新的瓶中，加入0.2体积的20％PEG/2.5M NaCl，在冰浴上温育1小时，沉淀噬菌粒。在4℃，8000rpm离心沉淀的噬菌粒20分钟。小心用100ml冷PBS再悬浮。通过在4℃，用8000rpm离心10分钟除去剩余的细胞，并且通过加入0.2体积的20％PEG/2.5M NaCl沉淀噬菌粒来进一步纯化噬菌粒溶液。在4℃，在8000rpm离心噬菌粒20分钟，用12ml冷PBS再悬浮噬菌粒沉淀。在噬菌粒溶液中加入4微升60％的甘油溶液，储存在-80℃。通过标准的方法确定噬菌粒效价(分子克隆，Maniatis et al，第3版)。
3.人MpL结合噬菌体的选择A.人MPL的生物素化利用EZ-连接的Sulfo-NHS-LC-生物素化试剂盒，根据制造商的指导将1微克重组人MPL生物素化。
B.在磁性小珠上固定MPL以来自制造商的每100μl小珠储备物1μg MPL的浓度将生物素化的MPL(3A部分)固定在Dyn小珠M-280链霉抗生物素蛋白(DYNAL，Lake Success，纽约)。在磁性吸引下将小珠吸引到试管的一侧，吸去液体，用磷酸缓冲盐(PBS)洗涤小珠两次，再悬浮于PBS。以上面的浓度将生物素化的MPL蛋白质加到洗涤的小珠上，在室温下旋转温育1小时。然后，通过加入BSA到2％的最后浓度封闭MPL包衣的小珠，在4℃旋转温育过夜。然后，在进行选择过程之前用PBST(具有0.05％吐温-20)洗涤两次得到的MPL包衣的小珠。
C.利用MPL包衣的小珠选择用1ml的含有2％的BSA的PBS封闭约100倍的文库等当噬菌粒(2C部分，对于固定文库1×1011cfu，对于预测文库2.4×1011cfu)。通过将它加入到空白小珠(相同的小珠作为3B部分，但不是MPL包衣)，将封闭的噬菌粒样品进行负选择步骤，在室温下旋转温育这一混合物1小时。利用磁性将上清液中含有的噬菌粒吸引出来，转移到含有MPL包衣的小珠的新试管(3B部分)，在室温下旋转温育这一混合物1小时。在丢弃上清液后，用PBST洗涤噬菌粒结合的小珠10次，用PBS洗涤10次。然后，允许噬菌粒在离心机上，在1ml 100mM三乙胺溶液(Sigma，圣路易斯，密苏里州)中洗脱10分钟。通过加入0.5ml的1MTris-HCl(pH7.5)中和含有噬菌粒的溶液的pH。在37℃，不振摇利用得到的噬菌粒感染5ml的新鲜生长的TG1细菌(OD600约0.5)30分钟，和慢振摇感染30分钟。在大的2xYTAG平板上铺所有感染的TG1细胞，在30℃过夜温育。
D.诱导和收获噬菌体在平板(部分3C)上加入10ml 2xYTAG培养基等分试样，再悬浮TG1细胞。在试管中收集所有的TG1细胞，在25ml的2xYTAG中加入250μl这些细胞的等分试样，并且在37℃生长直到OD600＝0.5。加入M13K07辅助噬菌体直到最后浓度为3×109cfu/ml，并且在37℃温育，不振摇30分钟和慢振摇30分钟。在4℃，在5000rpm离心细胞10分钟，用25ml的2xYTAK再悬浮。允许振摇时在30℃过夜生长这些细菌。收获诱导的噬菌粒，并且如2C部分中纯化。
E.第二轮选择除了下面的步骤，如3B到3C部分指出进行第二轮选择。将从3D部分得到的噬菌粒溶液的约0.5ml的等分试样用作输入的噬菌粒。只有0.1μg的生物素化的MPL(3A部分)包衣到Dyna小珠M-280链霉抗生物素蛋白。用PBST洗涤噬菌体结合小珠16次，最后的洗涤包括在PBST中，在室温下温育30分钟。用PBS洗涤小珠10多次。
4.克隆分析A.制备主平板挑选第二轮选择的单个菌落，在每个孔含有120μl的2xYTAG的96孔平板中温育。在30℃振摇器中温育96孔平板过夜。在每个孔中加入50微升的60％的甘油，用于在-80℃储存。
B.噬菌粒ELISA将来自主平板的约3μl等分试样细胞接种到每孔含有120μl的2xYTAG的新鲜的96孔平板中，在37℃生长这一新平板直到约OD600＝0.5。在每个孔中加入50微升的含有M13K07辅助噬菌体的2xYTAG(1.2×1010cfu/ml)，不振摇，在37℃温育96孔平板30分钟，慢振摇温育另外30分钟。在4℃，在2000rpm(Beckman CS-6R台式离心机)离心平板10分钟。从孔中除去上清液，每孔160μl 2xYTAK再悬浮各个细胞沉淀。在30℃过夜温育平板用于噬菌粒表达。
在4℃，以0.1M碳酸缓冲液中5μg/ml，pH9.6将重组的人MPL包衣到96孔Maxisorp平板上(NUNC)，过夜。作为对照，以5μg/ml将BSA(Sigma)包衣到分离的Maxisorp平板上。
在第二天，在4℃，过夜的细胞培养物在2000rpm离心10分钟。将每个孔的20微升的上清液转移到每个孔中含有180μl的2％的BSA/PBS溶液的新的96孔平板中。在室温下振摇温育得到的混合物1小时，封闭噬菌粒。同时，在振摇的同时，在室温下用每孔200μl的2％的BSA/PBS溶液封闭MPL包衣的平板1小时。丢弃BSA溶液，用PBST溶液洗涤每个孔3次。在最后的洗涤步骤后，在MPL包衣的平板以及对照平板的每个孔中加入50μl的封闭噬菌粒溶液，并且在振摇时在室温下温育1小时。再次丢弃液体，用PBST溶液洗涤每个孔3次。在MPL包衣和对照平板的每个孔中以1∶15,000的稀释度加入50微升的HRP结合的抗M13mAb(Amersham Pharmacia生物技术公司)，将这些平板在室温振摇温育1小时。再次丢弃液体，用PBST溶液洗涤每个孔3次。在孔中加入50微升LumiGLO化学发光底物(Kirkegaard&Perry实验室，Gaithersburg，马利兰州)，通过Luminoskan AscentDLRearly机器将每个孔读数(实验室系统公司，弗兰克林，马萨诸塞州)。
C.噬菌体克隆的测序利用来自主平板的每个孔的1μl细菌(4A部分)作为模板进行PCR反应。每个PCR混合物的体积是20μl，其中含有1xPCR缓冲液，300nM各两个引物，5’-GTTAGCTCACTCATTAGGCAC-3’和 5’-GTACCGTAACACTGAGTTTCG-3’，200nM dNTP，2mM CaCl2，和5Utaq DNA聚合酶(Roche分子生物化学公司)。利用GeneAmp PCR系统9700(应用生物系统公司)进行下面的程序94℃5分钟；40个循环[94℃45秒，55℃45秒，72℃90秒]；72℃10分钟；冷却到4℃。用QIAquick 96 PCR纯化试剂盒(QIAGEN公司)，根据制造商的指导纯化PCR产物。用引物5’-CGGATAACAATTTCACACAGG-3’，利用ABI 3770序列仪，根据制造商的说明将所有纯化的PCR产物测序。
5.序列分级从上面的核苷酸序列翻译的肽序列是与ELISA数据相关的。在MPL包衣的孔中显示高OD读数和在BSA包衣的孔中显示低OD读数的克隆可以考虑为进一步研究的候选物。发生多次的序列也认为可以作为进一步研究的候选物。根据这些原则选择的噬菌体克隆可以进一步在ELISA滴定实验中鉴定。参见图9(选择的噬菌体克隆的ELISA剂量应答)。
实施例2
肽的制备通过已确定的逐步的固相合成方法制备所有的肽。Merrifield(1963)，J.Am.Chem.Soc.852149。Steward and Young(1969)，固相肽合成。将Fmoc保护的氨基酸用作构建块，利用ABI或Symphony肽合成仪构建肽链。通常，肽合成是用预加载的Wang树脂开始的，产生在C末端有游离羧酸的肽(或者，可以利用Rink树脂生产具有C末端酰胺功能性的肽)。Fmoc的除去是在标准的哌啶方案中进行的。利用uronium(如HBTU)或碳化二亚胺(如DCC/HOBt)化学进行偶联。侧链保护基团是Glu(O-t-Bu)，Asp(O-t-Bu)，Ser(t-Bu)，Thr(t-Bu)，Arg(Pbf)，Asn(Trt)，Gln(Trt)，His(Trt)，Lys(t-Boc)，Trp(t-Boc)，和Cys(Trt)。用RT，4小时，利用含有2.5％H2O，5％酚，2.5％三异丙基硅氧烷和2.5％硫茴香醚或巯基乙醇的三氟乙酸(TFA)进行所有肽基树脂的最后的去保护和裂解。在除去TFA后，用冷的无水醚沉淀裂解的肽。对于含有二硫键的那些肽，利用水中的15％的DMSO(pH7.5)的粗物质直接形成环化产物。通过逆相HPLC纯化所有原肽，通过ESI-MS和氨基酸分析证明纯化的肽的结构。
实施例3TMP-Fc肽体化合物的制备选择几个肽用于作为肽-Fc融合来表达(即，附着于肽的C末端的Fc)(C末端融合)。在如下的质粒表达载体pAMG21中的luxPR启动子的控制下放置编码与各个TPO模拟肽在框架内融合的人IgG1的Fc区的DNA序列。
改变编码TMP1-Fc的质粒(Amgen菌株#3788)，以便含有ApaLI位点和XhoI位点，允许容易地从退火的寡核苷酸克隆短肽。将引物2396-69用于加入ApaLI和XhoI限制酶位点。利用2396-69的扩展长聚合酶和3788 DNA模板上的普遍性3’引物191-24进行PCR。引物序列如下
2396-69ACAAACAAACATATGGGTGCACAGAAAGCGGCCGCAAAAAAACTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACA191-24 GGTCATTACTGGACCGGATC用NdeI和BsrGI，凝胶纯化，来消化得到的PCR片段，并且用作插入片段。来自菌株#3788的质粒也用NdeI和BsrGI消化，凝胶纯化，用作载体。将载体和插入片段连接在一起，将得到的连接混合物电穿孔进GM221细胞(参见如下)。挑选单个菌落，制备质粒DNA，将DNA测序。一个得到的质粒，200003180显示具有准确的DNA序列，并且用作构建TMP-Fc融合的载体。载体显示在图6中。
用ApaLI和XhoI消化质粒200003180，并且作为载体。将每对寡核苷酸(参见图7)退火，形成具有ApaLI和XhoI粘性末端的双倍体。将这些分子连接进载体产生需要的融合蛋白质。各个寡核苷酸的对应对的ApaLI到XhoI片段提供在图7。
TMP 1-23，25，26，28作为C末端融合体表达。
实施例4Fc-TMP肽体化合物的制备一些肽表达成Fc肽融合体(即，Fc附着于肽的N末端)(N末端融合)。改变编码Fc-TMP1的质粒(Amgen菌株#3728)，以便含有ApaLI位点和XhoI位点，允许容易地从退火的寡核苷酸克隆短肽。设计引物2396-70加入ApaLI和XhoI限制酶位点。利用2396-70的扩展长聚合酶和在3728 DNA模板上的普遍的5’引物1209-85进行PCR。引物序列如下1209-85CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG2396-70TTTGTTGGATCCATTACTCGAGTTTTTTTGCGGCCGCTTTCTGTGCACCACCACCTCCACCTTTAC用BsrGI和BamHI消化得到的PCR片段，凝胶纯化，用作插入片段。用BsrGI和BamHI同时消化来自菌株#3728的质粒，凝胶纯化，用作载体。将载体和插入片段连接在一起，将得到的连接混合物电穿孔进GM221细胞。挑选单个菌落，制备质粒DNA，将DNA测序。一个得到的质粒，200003182(图8)显示具有准确的DNA序列，并且用作载体构建Fc-TMP融合。
用ApaLI和XhoI消化200003182质粒，并且作为载体。将具有ApaLI和XhoI粘性末端的退火的寡聚物连接进载体产生需要的融合。
TMP20，TMP24，TMP27，TMP29和TMP30作为以这种方式产生的N末端融合物。
转化如下所述，通过电穿孔将各个上面的连接物转化进宿主菌株GM221。对克隆的生产重组蛋白质产物，并且具有准确核苷酸序列的基因融合的能力进行筛选。
pAMG21表达质粒pAMG21可以从ATCC以保藏号98113(1996年7月24日保藏)得到。
GM221(Amgen宿主菌株#2596)Amgen宿主菌株#2596是已经修饰的大肠杆菌K-12菌株，在早ebg区中含有温度敏感的λ受体cI857s7，和在后ebg区含有lacIQ受体(68分钟)。这两个阻遏物基因的存在允许这一宿主利用各种表达系统，但是，这两个阻遏物是与从1uxPR的表达不相关的。未转化的宿主没有抗生素抗性。
CI857s7基因的核糖体结合位点已经进行修饰包括了增强的RBS。在基因库登记号M64441Gb_Ba，中的编号，在核苷酸位置1170和1411之间已经插入了ebg操纵子，缺失了干扰的ebg序列。
利用称为MMebg-cI857s7的重组噬菌体增强的RBS#4将构建体递送到染色体进入F’tet/393。在重组和溶解后，只有如上所述的染色体插入片段仍然在细胞中。它的名称为F’tet/GM101。
然后，在缺失干扰ebg序列的基因库登记号M64441Gb_Ba中编号为核苷酸2493和2937位置之间，通过递送lacIQ构建体进入ebg操纵子来修饰F’tet/GM101。利用称为Agebg-LacIQ#5的重组噬菌体进入F’tet/GM101将构建体递送到染色体中。在重组和分解后，只有如上所述的染色体插入片段保留在细胞中。它仍然命名为F’tet/GM221。利用LB中的25μg/ml浓度的丫啶橘红从菌株中保藏F’tet附加体。保藏的菌株鉴定是四环素敏感的，储存为GM221。
表达在Luria肉汤培养基中，在37℃生长表达各个融合蛋白质的GM221培养物。在培养基中加入合成的自身诱导物N-(3-氧己醇)-DL-同丝氨酸内酯到最后浓度20ng/ml，并且在37℃再温育3小时后，就可以从luxPR启动子诱导基因产物的表达。在3小时后，通过显微镜检测细菌培养物，检测内含体的存在，然后，通过离心收集。在诱导的培养基中观察折射内含体，表明融合蛋白质最有可能是在大肠杆菌中的不溶部分中产生的，通过在含有10％的巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液中再悬浮直接溶解细胞沉淀，并且通过SDS-PAGE分析。每个蛋白质都能观察到适当大小(约30kDa)的强烈的考马斯染色带。
实施例5肽体化合物的纯化通过高压均一化在水(1/10)中分裂细胞(在14,000PSI有2个通过)，通过离心收获内含体(在1小时，在J-6B中4200RPM)。在6M胍，50mMTris，8mMDTT，pH8.7中溶解内含体1小时，比例是1/10。在2M脲，50mMTris，160mM精氨酸，3mM半胱氨酸，pH8.5中将溶解的混合物稀释20倍。在冷中搅拌混合物过夜。然后，通过超过滤浓缩混合物10倍。然后，用10mM Tris，1.5M脲，pH9稀释3倍。然后，用乙酸将混合物的pH调整至pH5。通过离心除去沉淀，在20mM NaAc，100mMNaCl，pH5(10mg/ml蛋白质加载，室温下)中平衡的SP-Sepharose快速流动柱上加载上清液。在相同的缓冲液中，范围10mM NaCl到500mMNaCl的20个柱体积梯度中洗脱蛋白质。从柱中的合并液稀释了3倍，加载到20mM NaAc，150mM NaCl，pH5)中的SP-Sepharose HP柱上(10mg/ml蛋白质加载，室温)。利用范围150mM NaCl到400mM NaCl范围的相同缓冲液中的20柱体积梯度洗脱蛋白质。合并峰值时的液体，过滤。
实施例6肽亲和结合研究在室温下利用BIACORE 3000进行实验，确定几个TMP肽的结合亲和力(TMP1-TMP23)。利用胺偶联过程，在传感条(CM5)表面固定Hu-mpl(通过NHS/EDC的激活，和通过乙醇胺封闭)固定Hu-mpl。在hu-mpl表面注射0.78nM到100nM的TMP肽。BIACORE缓冲液是具有0.005％表面活性剂P20的PBS。对于一个对照的空白表面同时注射样品。利用BIAEVALUATION 3.1软件包分析实验数据。
如前面讨论，为了更好地模拟噬菌体环境，从中选择肽，和从受体隐藏18个氨基酸优选的肽(TMP2-TMP30)的带电的氨基和羧基末端，在每个肽的羧基末端和氨基末端加上两个氨基酸“帽子”在氨基末端加谷氨酰胺-半胱氨酸(QC)，在羧基末端加组氨酸-丝氨酸(HS)，使各个肽的长度达到22个氨基酸。因为已知肽的亲和力是增加肽的长度的，基准的生物活性14个氨基酸肽序列(SEQ ID NO1)也增加到总共22个氨基酸。但是，每个肽的生物活性区仍然相同，并且用下面的黑体(bold)表示。

实施例7肽生物活性研究利用基于细胞的研究确定肽TMP1-TMP23的生物活性。
小鼠32D细胞增殖实验包括利用已经用人mpl受体转染的小鼠32D细胞。如下结果报道与TMP1相关。
CD61细胞实验包括利用最初的人CD34+细胞，它们在存在肽TMP1-TMP23时培养了几天。然后，将这些细胞分拣，确定表达细胞表面上的巨核细胞特异标记(CD16)的细胞的百分数。当活性化合物以依赖剂量的方式刺激这些血小板前体细胞的出现时，细胞胞类前体(CD36+)和嗜中性前体(CD15+)的标记仍然在基线上。代表三个不同浓度的平均值的CD61细胞实验的定量的结果表示如下

实施例8
肽体的结合研究在BIAcore上，在直接的结合分析中，测试几个TMP肽体与hu-MPL的结合活性。在25℃，利用BIAcore 2000(BIACORE公司)进行实验。利用的缓冲液是具有0.005％表面活性剂P20的PBS。根据标准的胺偶联过程(NHS/EDC和用乙醇胺封闭)，在CM5条上固定重组的蛋白质G(Pierce 2113ZZ)，捕获TMP肽体到约400RU。以50μl/min在捕获的肽体表面注射3分钟之前，在样品缓冲液(有0.005％表面活性剂P20和100μg/ml BSA的PBS)中将重组hu-MPL(Lot 27315-53)从1uM系列稀释到0.15nM。在空白的蛋白质G表面也注射了rhu-MPL样品，以便减去任何非特异的结合背景。在两个循环之间用100μl ImmunoPure IgG洗脱缓冲液(Pierce 21009zz，pH2)和100μl 8mM甘氨酸pH1.5，1M NaCl，以50μl/min系列注射，再生蛋白质G的表面。利用BIAevaluation3.1(BIACORE公司)，通过数据的非线性回归分析确定肽体与rhu-MPL的结合亲和力(KD)。结果概括如下

实施例9肽体活性测试在存在几个TMP-Fc融合蛋白质时，培养初级人CD34+细胞几天。然后，分拣这些细胞确定在细胞表面表达巨核细胞特异标记(CD61)的细胞的百分数。当活性化合物以依赖剂量的方式刺激这些血小板前体细胞的出现时，细胞胞类前体(CD36+)(没有显示)和嗜中性前体(CD15+)(没有显示)的标记仍然在基线上。参见图10，11和12(CD61细胞实验)。
实施例10体内活性正常的雌性BDF1小鼠，约10-12星期的年龄，用于体内活性研究。
用皮下注射小鼠进行丸剂处理。皮下注射递送的体积是0.2ml。用0.1％的BSA在PBS中稀释化合物。所有实验包括只用这一稀释剂处理的一个对照组，标记“载体”。
在第0天每组10个小鼠，在第4天开始两组，总共每组20个小鼠。在每个时间点在5个小鼠取血，小鼠取血最少一个星期3次。用异氟烷麻醉小鼠，通过针刺眶轴得到总共体积140-160μl的血液。在TechniconH1E血液分析仪电泳软件上对小鼠血液计数。检测的参数是白血液细胞，红血液细胞，血细胞比容，血红蛋白，血小板，嗜中性粒细胞。参见图13和14。
本发明至此已经全部叙述了，本领域普通技术人员应该了解，其中可以进行许多改变和修饰，而不脱离本文所述的本发明的实质和范围。
权利要求
1.结合mpl受体的化合物和其生理可接受盐，其包括以下序列X1-X2-X3-X4-G-P-T-L-X9-X10-W-L-X13-X14-X15-X16-X17-X18，其中X1-X4，X9-X10和X13-X18各自独立地是氨基酸，所述的化合物对mpl受体的结合亲和力大于下面的序列X19-X20-I-E-G-P-T-L-R-Q-W-L-A-A-R-A-X21-X22，其中X19-X20和X21-X22各自独立地是氨基酸。
2.结合mpl受体的化合物和其生理可接受盐，其包括以下序列X1-X2-X3-X4-G-P-T-L-X9-X10-W-L-X13-X14-X15-X16-X17-X18，其中X1-X4，X9-X10和X13-X18各自独立地是氨基酸，所述的化合物具有的生物活性大于下面的序列X19-X20-I-E-G-P-T-L-R-Q-W-L-A-A-R-A-X21-X22，其中X19-X20和X21-X22各自独立地是氨基酸。
3.权利要求1的化合物，其中X1选自A，V，W，M，G，Y，C，Q，E，R和H；X2选自A，V，L，I，G，S和C；X3选自L，I，P，W，G，S，D，K和R；X4选自L，G，Q，D，E和H；X9选自K和R；X10选自Q和E；X13选自A，V，L，S，Q，E和R，X14选自A，W，T，Y，C和Q；X15选自V，L，G，Y和R；X16选自A，L，F，G和R；X17选自A，V，L，M，G，C，Q和N；X18选自A，V，P，M，F，G，C，Q和K。
4.权利要求2的化合物，其中X1选自A，V，W，M，G，C，E和R；X2选自A，V，L，M，F，G，S，C，D和R；X3选自A，L，I，P，W，Q，K和R；X4选自L，G，Q，D和E；X9选自K，R和H；X10选自Q和E；X13选自A，L，P，F，G，Q，N，E和R；X14选自L，W，M，C，Q和H；X15选自V，L，P，G，Y和R；X16选自A，V，L，F，S，Q，K和R；X17选自A，V，L，W，M，G，S，C和N；X18选自A，V，P，M，G，C，Q和K。
5.结合mpl受体的化合物，其包括以下序列X1-X2-R-E-G-P-T-L-R-Q-W-L-X13-W-R-R-X17-X18，其中X1，X2，X13，X17和X18各自独立地是氨基酸。
6.结合mpl受体的化合物，其包括选自SEQ ID NO2到SEQ IDNO30的序列
7.权利要求1，2或6的化合物，它是环状的。
8.权利要求1，2或6的化合物，其中至少一个氨基酸残基具有D构型。
9.权利要求1，2或6的化合物，其中所有的氨基酸残基具有D构型。
10.权利要求1，2或6的化合物的一种二聚体或多聚体。
11.结合mpl受体的组合物，其包括下式(LN1)l--(TMP1)a--(LN2)m--(TMP2)b--(LN3)n--(TMP3)c--(LN4)o--(TMP4)d其中TMP1，TMP2，TMP3，TMP4各自独立地选自权利要求1，2和6的化合物；LN1，LN2，LN3和LN4各自独立地是接头；a，b，c和d各自独立地是0到20的整数；l，m，n和o各自独立地是0到20的整数。
12.权利要求11的组合物，其进一步包括载体，并具有下式(V1)v--(LN1)l--(TMP1)a--(LN2)m--(TMP2)b--(LN3)n--(TMP3)c--(LN4)o--(TMP4)d--(V2)w其中V1和V2各自独立地是载体，v和w各自独立地是0到1的整数。
13.权利要求12的化合物，其中LN1，LN2，LN3和LN4含有肽。
14.权利要求12的组合物，其中V1和/或V2含有Fc区。
15.权利要求12的组合物，其中V1和/或V2含有IgG1 Fc区。
16.编码组合物的多核苷酸，所述组合物选自权利要求12的组合物。
17.包括权利要求12的多核苷酸的表达载体。
18.含有权利要求12的表达载体的宿主细胞。
19.权利要求12的宿主细胞，其中细胞是大肠杆菌细胞。
20.权利要求12的宿主细胞，其中细胞是原核细胞。
21.权利要求12的宿主细胞，其中细胞是真核细胞。
22.一种药物组合物，其包含有效量的与药用载体混合的权利要求12的组合物。
23.在哺乳动物中治疗血小板减少症的方法，包括施用治疗有效量的权利要求12的组合物。
24.增加患者中的巨核细胞或血小板的方法，包括对所述的患者施用有效量的权利要求12的化合物。
25.结合mpl受体的化合物，其包括下式(V1)v--(TMP1)a--(V2)w其中V1和V2各是IgG1 Fc区，条件是假如v是1，则w是零，假如v是0，则w是1，TMP1是SEQ ID NO2到30的肽，a是1到20的整数。
全文摘要
本发明总体上涉及了具有血小板生成活性的新的肽和相关的化合物。本发明的化合物可以用于提高哺乳动物中的血小板或血小板前体(如巨核细胞)的产量。
文档编号C07K7/00GK1602201SQ02824735
公开日2005年3月30日 申请日期2002年10月11日 优先权日2001年10月11日
发明者H·棉, K·C·西特尼, C·哈特利 申请人:安姆根有限公司