一种n－酰基溶血磷脂酰胆碱化合物的制备方法以及含有此化合物的治疗代谢性骨病的...的制作方法

专利名称：：一种n－酰基溶血磷脂酰胆碱化合物的制备方法以及含有此化合物的治疗代谢性骨病的...的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于预防和/或治疗代谢性骨病的药物组合物，该药物组合物包含有效剂量的N-酰基溶血磷脂酰胆碱化合物(化学式1)和其可用于药物制剂的载体。
背景技术：
：骨由骨细胞、破骨细胞、成骨细胞等骨细胞和羟基磷灰石结晶、骨胶原纤维(collagenousfibers)、粘多糖等骨基质以及骨髓腔、血管、小管、骨小腔等空间构成(StavrosC.M.，EndocrineReviews，21(2)，115-137(2000))。骨的主要功能是能机械地支持肢体，保护主要脏器，提供造血作用所必要的微环境，储存钙和多种矿物质。骨不断地反复着成长、发达、维持这一过程。旧骨不断地被吸收，新骨随之持续形成，即骨重建。骨重建主要发生在由破骨细胞和成骨细胞构成的基本多细胞单位(basicmulticellularunit，BMU)，这一过程可恢复由於成长和紧张导致的骨微小损伤，维持骨的机能。破骨细胞承担旧骨的破坏和吸收。与其对立的成骨细胞承担新骨的形成。破骨细胞贴附在骨的表面，分泌酸性物质和分解酶清除构成骨结构的磷灰石结晶和骨胶原纤维等骨基质而破坏骨。成骨细胞分泌合成的骨基质，调控钙和磷的浓度而形成新骨(StavrosC.M.，EndocrineReviews，21(2)，115-137(2000))。代谢性骨病是一种在生物体内破骨细胞和成骨细胞的平衡被破坏而发生的疾病。最有代表性的骨疾病是骨质疏松症。骨质疏松症是因为破骨细胞的活性比成骨细胞的活性增加而引起骨量减少所致的症状。一旦发生骨质疏松症，皮质骨变薄、髓腔增大、骨小梁变细、骨逐渐变成多孔质结构。随着骨质疏松症的进展，骨强度下降，诱发腰痛和关节痛，对轻微的冲击也易发生骨折。代谢性骨病此外还有乳腺癌或前列腺癌的癌骨转移、原发性骨癌(比如多发性骨髓瘤)、风湿性或者退行性关节炎、被引起牙周疾病的细菌感染后牙槽骨被破坏的牙周疾病、移植牙科用移植物后发生的炎症性牙槽骨吸收疾病、在整形外科领域，为了固定骨而移植移植物后引起的炎症性骨吸收疾病、由多种遗传因素而发生的Paget`sdisease等。骨髓瘤是一种伴有剧痛易发生骨折的疾病，因肿瘤细胞激活破骨细胞的活性而发生。乳腺癌或前列腺癌易发生癌骨转移，增加破骨细胞的活性，破坏骨。患有风湿性或者退行性关节炎，在免疫反应中生成的肿瘤坏死引子(TNF)、白介素-1、白介素-6等细胞因子激活在关节腔里的破骨细胞的活性，引起关节局部的骨破坏。被引起牙周疾病的细菌感染而发生炎症时，在免疫反应中也生成肿瘤坏死引子、白介素-1、白介素-6等细胞因子，这些因子可促进破骨细胞的分化而破坏支持牙龈的牙槽骨。近几年，对治疗骨质疏松症等代谢性骨病的分子生物学研究很活跃，开发了骨形成促进因子和破骨细胞抑制因子。骨形成促进因子有氟化物、甲状旁腺素、转化生长因子(TGF-β])、骨形成蛋白、雌激素、降血钙素、维生素D和其衍生物、双磷酸盐(bisphosphonate)(Jardineetal.，AnnualReportsinMedicinalChemistry，31，211(1996))等。现已有很多物质被开发为骨质疏松症的治疗药物，其中最常用的药物是雌激素，但还没有完全鉴定其实际效能，有一生都要服用的缺点，而且长期服用时可增加乳腺癌和子宫癌的发病率。阿仑瞵酸钠(alrendronate)也具有其效能不明确，在消化道内的吸收缓慢，引起胃和食道粘膜炎症等问题。钙制剂虽然被认为副作用少而且效果优秀，但与其说是治疗药物倒不如说是预防制剂。此外还有降血钙素等维生素D制剂，但对其效能和副作用方面还缺乏充分的研究。由此可见，很有必要开发副作用少而且效果优秀的新的治疗代谢性骨病的药物。
发明内容本发明提供一种用于预防和/或治疗代谢性骨病的药物组合物，该药物组合物包含有有效剂量的N-酰基溶血脂酰胆碱化合物(化学式1)和可用于药物制剂的载体。上面的化学式1中R是具有14～20个碳原子的饱和或者不饱和脂肪酸，R′是甲氧羰基或者羟甲基。从另外一种观点，本发明涉及从丝氨酸制备N-酰基溶血磷脂酰胆碱化合物(化学式1)的制备方法。附图简述图1在骨髓细胞和成骨细胞的共同培养系中，本发明所例示的化合物CHJ-0014对破骨细胞分化的影响。图2在骨髓细胞培养系中，本发明所例示的化合物CHJ-0014对破骨细胞的影响。图3在破骨细胞前体培养系中，本发明所例示的化合物CHJ-0014对破骨细胞分化的影响。图4本发明所例示的化合物CHJ-0014对成骨细胞毒性的影响。图5本发明所例示的化合物CHJ-0014对骨髓细胞毒性的影响。图6本发明所例示的化合物CHJ-0014对腹腔巨噬细胞毒性的影响。图7本发明所例的化合物CHJ-0014对人胚胎肾脏细胞株293T细胞毒性的影响。图8本发明所例的化合物CHJ-0014对核转录因子-κeB活性的影响。图9在骨髓细胞和成骨细胞的共同培养系统中，本发明所例示的化合物CHJ-0013(4μM)和CHJ-0014(4μM)对破骨细胞分化的影响。发明详述破骨细胞的前体(osteoclastprogenitor)起源于骨髓的单核/巨噬细胞系的造血干细胞。破骨细胞的前体在骨髓中生成的成长因子和细胞因子的作用下分化成破骨细胞(RoodmanG.D.，Endocr.Rev.，17,308-332(1996))。破骨细胞具有骨破坏或者骨吸收的功能。最近克隆出了作用于破骨细胞分化的破骨细胞分化因子(ODF)。ODF是一种结合在细胞膜上的肿瘤坏死因子受体家族成员。研究证明重组可溶性破骨细胞分化因子在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)存在下即使没有成骨细胞/骨基质细胞也能形成破骨细胞。ODF又称为细胞核因子κB受体活化因子配基(RANKL)、护骨素配基(OPGL)、TNF相关活化诱导细胞因子(TRANCE)。ODF是一种肿瘤坏死因子受体家族成员，与在破骨细胞前体和成熟破骨细胞细胞膜上的RANK结合而作用。在培养的成骨细胞中随着骨吸收刺激的增加，ODF基因表达也增加(SudaT.et.al.，Endocr.Rev.，20，345-357(1999)；Yasudaetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95(7)，3597-3604(1998))。破骨细胞生成抑制因子(OCIF)又称为护骨素(osteoprotogerin，OPG)，是一种抑制破骨细胞的生成和破骨细胞活性的蛋白质。OPG属於TNF受体家族成员，与细胞结合的ODF有很高的亲和度。ODF和OPG可调控骨重建。成熟的破骨细胞为直径50～100μM的多核细胞，有皱褶的细胞表面，具有吸收石灰化骨基质的功能(BoskeyA.L.，J.Cell.Biochem.Suppl.，30-31，83-91(1998))。成熟的破骨细胞贴附在骨基质的表面，把蛋白质分解酶和酸性物质分泌到细胞膜和骨基质之间的密封带(sealingzone)中，这种蛋白质分解酶和酸性物质引起骨破坏。根据本发明，用于预防和/或治疗代谢性骨病的药物组合物的活性成分为N-酰基溶血磷脂酰胆碱化合物(化学式1)，包括化学式(1a)-(1d)所例示的化合物。[化学式1b][化学式1c][化学式1d]上面的化学式1中R是具有14～20个碳原子的饱和或者不饱和脂肪酸。本发明的化学式1中的化合物是通过酯化反应、氨化物结合反应、磷酸胆碱化反应、还原反应得到。本发明的化学式1中的化合物的制备方法包括下列几个阶段。(a)丝氨酸与甲醇，盐酸反应，生成丝氨酸甲酯盐酸盐的阶段(酯化反应)；(b)生成的丝氨酸甲酯盐酸盐与N-甲基吗啉、具有14～20个碳原子的饱和或者不饱和脂肪酸、1-羟基苯并三氮唑、1，3-二环己基碳化二亚胺反应，生成N-酰基-丝氨酸甲酯的阶段。(氨化物结合反应)；(c)生成的N-酰基丝氨酸甲酯与N-二异丙基乙胺、乙烯氯亚磷酸盐(ethylenechlorophosphite)进行反应后，继续与三甲胺反应，得到N-酰基-o-磷脂酰胆碱-丝氨酸甲酯的阶段(磷酸胆碱化反应)；(d)得到的N-酰基-o-磷脂酰胆碱-丝氨酸甲酯与氢化锂铝反应，生成N-酰基-o-磷脂酰胆碱-丝氨酸羟甲基(还原反应)；R′为羟甲基的本发明的化合物，也可用韩国专利第2000-59468号公开的方法制备，即以丝氨酸为原料通过酯反应、氨化物结合反应、磷酸胆碱化反应、还原反应等过程制备。其反应式为上面的化学式中R是具有14～20个碳原子的饱和或者不饱和脂肪酸。本发明的药物组合物中活性成分为N-酰基溶血磷脂酰胆碱化合物(化学式1)，其化合物中R是具有14～20个碳原子的饱和或者不饱和脂肪酸，例如为C16∶1，C18∶1，C18∶2，C20∶4等脂肪酸，但不仅限于此。本发明的药物组合物中活性成分为N-酰基溶血磷脂酰胆碱化合物(化学式1)，其化合物中R是具有14～20个碳原子的饱和或者不饱和脂肪酸，其中最有代表性的脂肪酸是具有17个碳原子的硬脂酸。R为硬脂酸时，N-酰基溶血磷脂酰胆碱化合物(化学式1)可包括下列化学式所示的化合物。1)N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸甲酯(化合物CHJ-0011)(C27H55N2O7P)2)N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-D-丝氨酸甲酯(化合物CHJ-0012)(C27H55N2O7P)3)N-硬脂酸基-0-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸羟甲基(化合物CHJ-0013)(C26H55N2O6P)4)N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-D-丝氨酸羟甲基(化合物CHJ-0014)(C26H55N2O6P)上面所例示的化合物CHJ-0013和CHJ-0014可用韩国专利第2000-59468号公开的方法制备，即以丝氨酸为原料通过酯化反应，氨化物结合反应，还原反应，磷酸胆碱化反应等过程制备。本发明的化学式1中所例示的化合物CHJ-0011，CHJ-0012，CHJ-0013和CHJ-0014也可用另一种方法制备，即通过酯化反应，氨化物结合反应，磷酸胆碱化反应，还原反应等过程制备。用上述本发明的方法制备的化学式1中的化合物包含L-形和D-形立体异构体混合物。化学式1中的化合物用本发明的方法选择性地制备其立体异构体。例如，原料为L-丝氨酸时，能选择性地制备L-形的最终化合物，即只制备化合物CHJ-0011和CHJ-0013。与此相反，如果原料为D-丝氨酸时，能选择性地制备D-形的最终化合物，即只制备化合物CHJ-0012和CHJ-0014。所以，作为增加的观点，本发明可提供包括(a)L-丝氨酸与甲醇，盐酸反应，生成L-丝氨酸甲酯盐酸盐的阶段；(b)生成的L-丝氨酸甲酯盐酸盐与N-甲基吗啉，具有14～20个碳原子的饱和或者不饱和脂肪酸，1-羟基苯并三氮唑，1，3-二环己基碳化二亚胺反应，生成N-酰基-L-丝氨酸甲酯的阶段；(c)生成的N-酰基-L-丝氨酸甲酯与N-二异丙基乙胺、乙烯氯亚磷酸盐(ethylenechlorophosphite)进行反应后，继续与三甲胺反应，得到N-酰基-0-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸甲酯的阶段；(d)得到的N-酰基-0-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸甲酯与氢化锂铝、反应，生成N-酰基-o-磷脂酰胆碱-L丝氨酸羟甲基的阶段为特点的制备化学式1中的L-形立体异构体化合物的方法。作为另一增加的观点，本发明可提供包括(a)D-丝氨酸与甲醇，盐酸反应，生成D-丝氨酸甲酯盐酸盐的阶段；(b)生成的D-丝氨酸甲酯盐酸盐与N-甲基吗啉，具有14～20个碳原子的饱和或者不饱和脂肪酸，1-羟基苯并三氮唑，1，3-二环己基碳化二亚胺反应，生成N-酰基-D-丝氨酸甲酯的阶段；(c)生成的N-酰基-D-丝氨酸甲酯与N-二异丙基乙胺，乙烯氯亚磷酸盐进行反应后，继续与三甲胺反应，得到N-酰基-o-磷脂酰胆碱-D-丝氨酸甲酯的阶段；(d)得到的N-酰基-o-磷脂酰胆碱-D-丝氨酸甲酯与氢化锂铝反应，生成N-酰基-o-磷脂酰胆碱-D-丝氨酸羟甲基的阶段为特点的制备化学式1中的D-形立体异构体化合物的方法。本发明所例示的化合物来看，本发明可提供包括(a)L-丝氨酸与甲醇，盐酸反应，生成L-丝氨酸甲酯盐酸盐的阶段；(b)生成的L-丝氨酸甲酯盐酸盐与N-甲基吗啉，硬脂酸，1-羟基苯并三氮唑，1，3-二环己基碳化二亚胺反应，生成N-硬脂酸基-L-丝氨酸甲酯的阶段；(c)生成的N-硬脂酸基-L-丝氨酸甲酯与N-二异丙基乙胺、乙烯氯亚磷酸盐(ethylenechlorophosphite)进行反应后，继续与三甲胺反应，得到N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸甲酯的阶段；(d)得到的N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸甲酯与氢化锂铝反应，生成N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸羟甲基的阶段为特点的制备化学式1中的L-形立体异构体化合物的方法。本发明所例示的另一化合物来看，本发明可提供包括(a)D-丝氨酸与甲醇，盐酸反应，生成D-丝氨酸甲酯盐酸盐的阶段；(b)生成的D-丝氨酸甲酯盐酸盐与N-甲基吗啉，硬脂酸，1-羟基苯并三氮唑，1，3-二环己基碳化二亚胺反应，生成N-硬脂酸基D-丝氨酸甲酯的阶段；(c)生成的N-硬脂酸基-D-丝氨酸甲酯与N-二异丙基乙胺、乙烯氯亚磷酸盐进行反应后，继续与三甲胺反应，得到N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-D丝氨酸甲酯的阶段；(d)得到的N硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-D-丝氨酸甲酯与氢化锂铝反应，生成N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-D-丝氨酸羟甲基的阶段为特点的制备化学式1中的D-形立体异构体化合物的方法。适用本发明的制备方法时，具体反应条件可利用在本领域中惯用的技术。由氨基酸生成甲酯盐酸盐的典型方法是与用盐酸饱和的甲醇反应，减弱氨基的亲核性后，把羧基选择性地甲酯化。把L-丝氨酸与用盐酸饱和的甲醇在室温反应2个小时，用乙醚/甲醇重结晶，就能精制得到丝氨酸甲酯盐酸盐。氨化物结合反应是利用适当的肽键结合试剂把羧基活性化的方法进行。特别是，L-丝氨酸甲酯盐酸盐属於伯氨，其反应性比仲氨大得多。所以，使用比较价廉的1，3-二环己基碳化二亚胺作为肽健结合试剂，其合成得率也很高。这时一起加入外消旋化-抑制试剂1-羟基苯并三氮唑，可选择性地合成立体异构体。这一方法明示在引用的参考文献[TetrahedronLett.1996，37，2083-2084.]。磷脂酰胆碱化反应是可用乙烯氯亚磷酸盐-水溶性三甲胺的连续反应来进行。一般地，磷酸化阶段是利用乙烯氯亚磷酸盐或2-氯-2-氧代-1，2，3-二氧杂正膦烷或2-溴乙基二氯磷酸盐等试剂导入，但用上述方法得到了最有效的结果。把N-硬脂酸基-L-丝氨酸甲酯溶于四氢呋喃，与N-二异丙基乙胺，乙烯氯亚磷酸盐进行反应。然后加入溴和水，形成的化合物用二氯甲烷/丙酮重结晶。重结晶产物溶于氯仿/异丙醇/乙腈后，加入水溶性三甲胺，即可完成磷脂酰胆碱部位的合成。这一方法明示在引用的参考文献[J.Org.Chem.1998，63，2560-2563.]N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸甲酯的甲酯基转换为羟基的还原反应是利用常用的还原剂来完成，例如可利用氢化锂铝。这一方法明示在引用的参考文献[TetrahedronLett.2001，42，5645-5649.]。本发明的药物组合物中使用的活性成分包括化学式1中化合物的“可药用盐”。这些盐是把这些化合物溶於水或有机溶剂或者这两种溶剂的混合液中，与适当量的碱或酸反应制备。通常，本发明中的可药用盐包括无机碱盐、有机碱盐、有机酸盐以及碱性或者酸性氨基酸盐。无机碱盐包括钠盐、钾盐等碱性金属盐。有机碱盐包括与三甲胺、三乙胺、嘧啶、甲基比啶、2，6-二甲基比啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、环己胺、二环乙胺、N，N-二苯基乙烯二胺等形成的盐。无机酸盐包括与盐酸、硼酸、硝酸、磺酸、磷酸等形成的盐。有机酸盐包括与甲酸、醋酸、三氟乙酸、苯甲酸、反丁烯二酸、草酸、酒石酸、缩苹果酸、柠檬酸、丁二酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、p-甲苯磺酸等形成的盐。碱性氨基酸盐包括与精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等形成的盐。酸性氨基酸盐包括与天门冬氨酸、谷氨酸等形成的盐。本发明的盐用离子交换树脂等常用方法来制备。适当的盐的目录明示在本发明所引用的参考文献[Remington′sPharmaceuticalSciences，17thed.，MackPublishingCompany，Easton，PA，1985，p1418]。本发明的化合物(化学式1)在骨髓细胞和成骨细胞的共同培养系和骨髓细胞的培养系中均抑制破骨细胞的分化，其抑制作用呈现出剂量依赖关系。而且本发明的化合物(化学式1)在从骨中分离的破骨细胞前体的培养系中也抑制破骨细胞的分化，其抑制作用呈现出剂量依赖关系。本发明的化合物(化学式1)可抑制破骨细胞分化因子(ODF)诱导的转录因子NF-κB的活性。并且本发明的化合物(化学式1)对成骨细胞，骨髓细胞，腹腔巨噬细胞以及肾脏细胞中均无细胞毒性。由此，本发明的化合物(化学式1)及其药物制剂所允许的盐以单独或者两个以上的混合物使用于骨代谢性疾病的预防和治疗。术语“骨代谢性疾病”是指骨的破坏和吸收被增大，导致生理性病理状态的疾病。代谢性骨病包括骨质疏松症、乳腺癌和前列腺癌等的癌骨转移、原发性骨癌、风湿性或者退行性关节炎、被引起牙周疾病的细菌感染后牙槽骨被破坏的牙周疾病、移植牙科用移植物后发生的炎症性牙槽骨吸收疾病、在整形外科领域，为了固定骨而移植移植物后引起的炎症性骨吸收疾病、由多种遗传因素而发生的Paget`sdisease等。这种骨疾病是因为骨吸收的增加而引起的，所以骨疾病治疗药物的开发着重于减少骨吸收(science289，2000(9)，1508-1514)。骨吸收主要是由於破骨细胞而引起(Enclocr.Rev.13，1992，66-80；Bone，17，1995，87s--91s)，所以开发骨疾病治疗药物时，关键是要获得抑制破骨细胞的形成和活性的物质。已经被开发使用的骨质疏松治疗剂中，雌激素是抑制破骨细胞的形成(J.Biol.Chem.276(23)，2001，8836-8840；Endocrinology139，1998，3022-3025)；双磷酸盐(bisphosphonates)和降血钙素是抑制破骨细胞的活性(science289，2000(9)，1508-1514；J.Biol.Chem.274，1999，34967)而减少骨吸收。由此可见，本发明的N-酰基溶血磷脂酰胆碱(化学式1)在骨髓细胞和成骨细胞的共同培养系和骨髓细胞的培养系以及破骨细胞前体的培养系中均显著地抑制破骨细胞的形成，可用于骨疾病治疗剂。其中可推荐的化合物是R′为羟甲基的化合物，而且R为硬脂酸的N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸羟甲基和N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-D-丝氨酸羟甲基。化学式1中的化合物以及其药物制剂所允许的盐以其本身或者与药物制剂所允许的载体混合制备的形式来使用于骨代谢性疾病的预防和/或治疗。术语“药物制剂所允许的载体”是指把活性成分从身体的某一器官或某一部分输送到另一器官或者另一部分的过程中起作用的液体，或者固体填剂、稀释剂、赋型剂、或者药物制剂可允许的溶媒、组成物、或者溶剂。本发明的药物制剂可通过口服、局部、注射或者非口服的方式来给药。这些剂型可包含0.5～90％重量百分比的有效治疗骨代谢性疾病的有效成分(化学式1)。本发明的口服制剂包括丸剂、片剂、漆片剂(lacqueredtablets)、包衣片、散剂、颗粒剂、糖锭剂(troches)、包药干糊片、甘香酒剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、溶液剂、糖衣片、乳剂、混悬剂、气雾剂等剂型。非口服制剂可包括注射剂、微囊剂、经皮剂等剂型。牙周疾病的治疗剂可包括缓释剂的药物载体或把这一载体涂在牙科用移植体后使用。药物制剂可使用被公开的而且没有药物活性的无机或有机赋型剂来制备。例如，为了制备丸剂、片剂、包衣片、硬胶囊剂，可使用乳糖、玉米淀粉或其衍生物、活石、硬脂酸和其盐等赋型剂。软胶囊剂和栓剂可使用脂肪、蜡、半固体或液体形多元醇类、天然或固化的油等赋型剂。溶液剂和糖剂可使用水、蔗糖、淀粉、葡萄糖、多元醇类等赋型剂。注射剂可使用保存剂、止痛剂、溶解剂、稳定剂等赋型剂。局部投药型制剂可使用基质、赋型剂、润滑剂、保存剂等物质。微囊剂和移植剂可使用共聚物、乙醇酸、乳酸等赋型剂。本发明的药物制剂除了包括活性化合物和赋型剂外，还能包括其他添加剂，例如填剂、增量剂、崩解剂、结合剂、润滑剂、润湿剂、安定化剂、乳化剂、防腐剂、甜味剂、着色剂、风味剂或芳香剂、浓缩剂、稀释剂、缓冲剂、另外的溶媒或者溶解剂、得到长效效果的物质、调节渗透压而加入的物质、包衣剂、抗氧化剂等。本发明的药物制剂可包括两个以上的化学式1中的化合物或者其药物制剂可允许使用的盐以及一个以上的其他治疗活性物质。其他治疗活性物质包括血流刺激剂，例如甲磺酸双氢麦角克碱(dihydroergocristine)、尼麦角林(nicergoline)、布酚宁(buphenine)、烟酸及其酯(nicotinicacidanditsester)、pyridilcarbinole、bencyclane、桂利嗪(cinnarizine)、萘呋胺酯(naftidrofuryl)、毛萝芙木碱(raubasine)、长春胺(vincamine)；影响肌肉收缩力的药物，例如地高辛(digoxin)，乙酰地高辛(acethyldigoxine)，甲基地高辛(methyldigoxine)lanato-glycoside)；冠状动脉扩张剂例如卡波罗孟(carbocromen)，双嘧达莫(dipyridamole)，硝苯地平(nifedipin)，哌克昔林(perhexiline)；防心绞痛的药物，例如硝酸异山梨醇(isosorbiddinitrate)、单硝酸异山梨醇(isosorbidmononitrate)、硝酸甘油(glycerolnitrate)、吗多明(molsidomine)、berapamil；β-阻断剂，例如普萘洛尔(propanolol)、烯丙心安(oxprenolol)、阿替洛尔(atenolol)、美托洛尔(metoprolol)、喷布洛尔(penbutolol)。而且本发明的药物制剂可包括其他智能开发药物，例如脑复康(pyracetam)和作用于中枢神经系的药物，例如pirlindole、舒必利(sulpiride)等。本发明的化学式1中的化合物的投药量可根据活性成分在体内的吸收度，失活率以及排泄速度、患者的年龄、性别、状态、治理疾病的重症状态来适当选择。一般地，为了治疗骨代谢性疾病所投入的一日用量是口服投药时为每1千克体重约0.1～1mg，最佳量为0.3～0.5mg；静脉注射时为每1千克体重约0.01～0.3mg，最佳量为0.05～0.1mg。较多量投药时，一般把一日用量分数次服用，例如分2，3或4次服用为好。根据具体情况和个人的身体状况，上述用量可适当地上调或下调。下面，引用实施例更具体地说明本发明。但所引用的实施例只是为了说明本发明，而本发明的范围不仅限于此实施例。具体实施例方式实施例1N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸甲酯(CHJ-0011)的合成(1)L-丝氨酸甲酯盐酸盐的合成47.7mmolL-丝氨酸溶于476ml甲醇，用盐酸饱和后在室温反应2个小时。回收溶剂后用甲醇和乙醚重结晶，得到目的化合物L-丝氨酸甲酯盐酸盐(得率98％，熔点161-162℃，[α]25D＝+3.4(c2.0，MeOH))。合成的化合物结构用FTIR，1H-NMR和13C-NMR确定。FTIR(KBr，cm-1)3349O-H吸收峰，2943sp3C-H吸收峰，1749酯羰基吸收峰1HNMR(CD3OD)δ4.07～4.10(1H，t，J＝3.9Hz)，3.88-3.93(2H，m)，，3.79(3H，s)甲氧基质子的吸收峰s单重峰，d双重峰，t三重峰，m多重峰)13CNMR(CD3OD)δ52.69，55.10，59.67，168.37羰基吸收峰(2)N-硬脂酸基-L-丝氨酸甲酯的合成在上述(1)中制备的化合物(1eq)溶于257ml二氯甲烷，把温度降到0℃，依次加入N-甲基吗啉(2.1eq)，硬脂酸(1.1eq)，1-羟基苯并三氮唑(1.1eq)和1，3-二环己基碳化二亚胺(1.1eq)后反应1个小时。然后在室温中再反应3个小时。反应结束后，减压过滤除掉副产物二环尿烷，浓缩滤液。用柱层析(二氯甲烷∶丙酮＝9∶1→7∶1)精制得到目的化合物N-硬脂酸基-L-丝氨酸甲酯(得率90％，熔点81-82℃，[α]25D＝+15.2(c0.2，CHCl3))。合成的化合物结构用FTIR，1H-NMR和13C-NMR确定。FTIR(KBr，cm-1)3310O-H吸收峰，2919sp3C-H吸收峰，1720酯羰基吸收峰，1650酰胺羰基吸收峰1HNMR(CDCl3)δ0.83～0.88(3H，m)硬脂酸末端甲基质子的吸收峰，1.23(28H，s)烷基质子的吸收峰，1.60～1.63(2H，m)羰基-β-碳质子的吸收峰，2.21～2.28(2H，t，J＝7.6Hz)，2.52(1H，m)羟基质子的吸收峰，3.78(3H，s)甲氧基质子的吸收峰，3.93～3.94(2H，d，J＝3.4Hz)，4.64～4.70(1H，m)，6.36～6.39(1H，d，J＝6.5Hz)酰胺质子吸收峰13CNMR(CDCl3)δ14.1硬脂酸末端甲基碳的吸收峰，22.7烷基碳的吸收峰，25.5羰基-β-碳的吸收峰，29.2，29.3，29.5，29.7，31.9烷基碳的吸收峰，36.5，52.8甲氧基碳的吸收峰，54.6，63.7，171.0羰基吸收峰，173.8羰基吸收峰(3)N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸甲酯(CHJ-0011)的合成上述(2)中制备的化合物溶於260ml四氢呋喃，把温度降到-15℃后加入N-二异丙基乙胺(4eq)和乙烯氯亚磷酸盐(3eq)反应1个小时。这里再加入溴(3eq)，反应15分钟后加入86.6ml水，在室温继续反应1个小时。反应结束后回收有机层，增发溶剂，用二氯甲烷和丙酮重结晶。得到的化合物在0℃的下溶於87.5ml氯仿/异丙醇/乙腈(3∶5∶5，v/v/v)，加入40％水溶性三甲胺(3eq)后反应11个小时。用柱层析(二氯甲烷∶甲醇∶水＝3∶1∶0→2∶1∶0.1)精制得到目的化合物N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸甲酯(得率12％，[α]25D＝-8.4(c1.9，MeOH))。合成的化合物结构用FTIR，1H-NMR和13C-NMR确定。1HNMR(CDCl3)δ0.90～0.93(3H，m)硬脂酸末端甲基质子的吸收峰，1.31(28H，s)烷基质子的吸收峰，1.63～1.65(2H，m)羰基-β-碳质子的吸收峰，2.27～2.33(2H，t，J＝7.2Hz)，3.25(9H，s)三甲胺质子的吸收峰，3.65～3.67(2H，m)，3.77(3H，s)甲氧基质子的吸收峰，4.15～4.19(1H，m)，4.21～4.28(3H，m)，4.68(1H，m)13CNMR(CDCl3)δ13.5硬脂酸末端甲基碳的吸收峰，22.8烷基碳的吸收峰，25.9羰基-β-碳的吸收峰，29.3，29.5，29.8，32.1，35.7，51.9甲氧基碳的吸收峰，53.7，59.5，65.1，66.4，170.6羰基吸收峰，175.4羰基吸收峰实施例2N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸羟甲基(CHJ-0013)的合成(1)L-丝氨酸甲酯盐酸盐的合成47.7mmolL-丝氨酸溶于476ml甲醇，用盐酸饱和后在室温反应2个小时。回收溶剂后用甲醇和乙醚重结晶，得到目的化合物L-丝氨酸甲酯盐酸盐(得率98％，熔点161-162℃，[α]25D＝+3.4(c0.2，MeOH))。合成的化合物结构用FTIR，1H-NMR和13C-NMR确定。FTIR(KBr，cm-1)3349O-H吸收峰，2943sp3C-H吸收峰，1749酯羰基吸收峰1HNMR(CD3OD)δ4.07～4.10(1H，t，J＝3.9Hz)，3.88～3.93(2H，m)，3.79(3H，s)甲氧基质子的吸收峰(s单重峰，d双重峰，t三重峰，m多重峰)13CNMR(CD3OD)δ2.69，55.10，59.67，168.37羰基吸收峰(2)N-硬脂酸基-L-丝氨酸甲酯的合成在上述(1)中制备的化合物(1eq)溶于257ml二氯甲烷，把温度降到0℃，依次加入)N-甲基吗啉(2.1eq)，硬脂酸(1.1eq)和1-羟基苯并三氮唑(1.1eq)，1，3-二环己基碳化二亚胺(1.1eq)后反应1个小时。然后在室温中再反应3个小时。反应结束后，减压过滤除掉副产物二环尿烷，浓缩滤液。用柱层析(二氯甲烷∶丙酮＝9∶1→7∶1)精制得到目的化合物N-硬脂酸基-L-丝氨酸甲酯(得率90％，熔点81-82℃，[α]25D＝+15.2(c0.2，CHCl3))。合成的化合物结构用FTIR，1H-NMR和13C-NMR确定。FTIR(KBr，cm-1)3310O-H吸收峰，2919sp3C-H吸收峰，1720酯羰基吸收峰，1650酰胺羰基吸收峰1HNMR(CDCl3)δ0.83～0.88(3H，m)硬脂酸末端甲基质子的吸收峰，1.23(28H，s)烷基质子的吸收峰，1.60～1.63(2H，m)羰基-β-碳质子的吸收峰，2.21～2.28(2H，t，J＝7.6Hz)，2.52(1H，m)羟基质子的吸收峰，3.78(3H，s)甲氧基质子的吸收峰，3.93～3.94(2H，d，J＝3.4Hz)，4.64～4.70(1H，m)，6.36～6.39(1H，d，J＝6.5Hz)酰胺质子吸收峰13CNMR(CDCl3)δ14.1硬脂酸末端甲基碳的吸收峰，22.7烷基碳的吸收峰，25.5羰基-β-碳的吸收峰，29.2，29.3，29.5，29.7，31.9烷基碳的吸收峰，36.5，52.8甲氧基碳的吸收峰，54.6，63.7，171.0羰基吸收峰，173.8羰基吸收峰(3)N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸甲酯的合成上述(2)中制备的化合物溶於260ml四氢呋喃，把温度降到-15℃后加入N-二异丙基乙胺(4eq)和乙烯氯亚磷酸盐(3eq)反应一个小时。这里再加入溴(3eq)，反应15分钟后加入86.6ml水，在室温继续反应1个小时。反应结束后回收有机层，蒸发溶剂，用二氯甲烷和丙酮重结晶。得到的化合物在0℃的下溶於87.5ml氯仿/异丙醇/乙腈(3∶5∶5，v/v/v)，加入40％水溶性三甲胺(3eq)后反应11个小时。用柱层析(二氯甲烷∶甲醇∶水＝3∶1∶0→2∶1∶0.1)精制得到目的化合物N-硬脂酸基-o-溶血磷脂酰胆碱-L-丝氨酸甲酯(得率12％，[α]25D＝-8.4(c1.9，MeOH))。合成的化合物结构用1H-NMR和13C-NMR确定。1HNMR(CDCl3)δ0.90～0.93(3H，m)硬脂酸末端甲基质子的吸收峰，1.31(28H，s)烷基质子的吸收峰，1.63～1.65(2H，m)羰基-β-碳质子的吸收峰，2.27～2.33(2H，t，J＝7.2Hz)，3.25(9H，s)三甲胺质子的吸收峰，3.65～3.67(2H，m)，3.77(3H，s)甲氧基质子的吸收峰，4.15～4.19(1H，m)，4.21～4.28(3H，m)，4.68(1H，m)13CNMR(CDCl3)δ13.5硬脂酸末端甲基碳的吸收峰，22.8烷基碳的吸收峰，25.9羰基-β-碳的吸收峰，29.3，29.5，29.8，32.1，35.7，51.9甲氧基碳的吸收峰，53.7，59.5，65.1，66.4，170.6羰基吸收峰，175.4羰基吸收峰(4)N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸羟甲基(CHJ-0013)的合成上述(3)中制备的化合物(1eq)溶於12ml四氢呋喃，把温度降到0℃后加入氢化锂铝(3eq)反应4个小时。减压过滤，浓缩滤液后进行冷冻干燥。用柱层析(二氯甲烷∶甲醇∶水＝3∶1∶0→2∶1∶0.1→1∶1∶0.3)精制得到目的化合物CHJ-0013(得率54％，[α]25D＝+5.3(c1.9，CH2Cl2/MeOH))。合成的化合物结构用FTIR，1H-NMR和13C-NMR确定。FTIR(KBr，cm-1)3266O-H吸收峰，2920sp3C-H吸收峰，1654酰胺羰基吸收峰，1236磷酸酯吸收峰1HNMR(CD3OD)δ0.78～0.82(3H，m)硬脂酸末端甲基质子的吸收峰，1.19(28H，s)烷基质子的吸收峰，1.51(2H，m)羰基-β-碳质子的吸收峰，2.09～2.15(2H，t，J＝7.5Hz)，3.13(9H，s)三甲胺质子的吸收峰，3.50～3.56(4H，m)，3.81～vi3.96(3H，m)，4.18～4.19(2H，m)13CNMR(CD3OD)δ13.5硬脂酸末端甲基碳的吸收峰，22.8烷基碳的吸收峰，26.1羰基-β-碳的吸收峰，29.4，29.5，29.7，29.8，32.1烷基碳的吸收峰，36.2，51.6，51.8，53.7三甲胺碳的吸收峰，59.4，59.5，60.3，64.0，64.1，66.4磷脂酰胆碱亚甲基碳的吸收峰，175.3羰基吸收峰FABHRMS[M+H]+m/zC26H56N2O6PNa的计算值为523.3876，测定值为523.3861。实施例3N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-D-丝氨酸甲酯(CHJ-0012)的合成(1)D-丝氨酸甲酯盐酸盐的合成用上述实施例1中明示的合成L-丝氨酸甲酯盐酸盐的方法使用相应的D-丝氨酸合成了目的化合物D-丝氨酸甲酯盐酸盐(得率99％，熔点163-163℃，[α]25D＝-4.3(c1.8，EtOH))。分析合成化合物的结构，得到与L-丝氨酸甲酯盐酸盐相同的FTIR，1H-NMR和13C-NMR结果。(2)N-硬脂酸基-D-丝氨酸甲酯的合成用上述实施例1((2))中明示的合成N-硬脂酸基-L-丝氨酸甲酯的方法使用相应的D-丝氨酸甲酯盐酸盐合成了目的化合物N-十八碳基-D-丝氨酸甲酯(得率88％，熔点82-83℃，[α]25D＝-15.7(c2.0，CHCl3))。分析合成化合物的结构，得到与N-硬脂酸基-L-丝氨酸甲酯相同的FTIR，1H-NMR和13C-NMR结果。(3)N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-D-丝氨酸甲酯(CHJ-0012)的合成用上述实施例1((3))中明示的合成N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸甲酯的方法使用相应的N-硬脂酸基-D-丝氨酸甲酯合成了目的化合物N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-D-丝氨酸甲酯(得率12％，[α]25D＝+8.8(c2.5，MeOH))。分析合成化合物的结构，得到与N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸甲酯相同的1H-NMR和13C-NMR结果。实施例4N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-D-丝氨酸羟甲基(CHJ-0014)的合成(1)D-丝氨酸甲酯盐酸盐的合成用上述实施例1中明示的合成L-丝氨酸甲酯盐酸盐的方法使用相应的D-丝氨酸合成了目的化合物D-丝氨酸甲酯盐酸盐(得率99％，熔点163-163℃，[α]25D＝-4.3(c1.8，EtOH))。分析合成化合物的结构，得到与L-丝氨酸甲酯盐酸盐相同的FTIR，1H-NMR和13C-NMR结果。(2)N-硬脂酸基-D-丝氨酸甲酯的合成用上述实施例1((2))中明示的合成N-硬脂酸基-L-丝氨酸甲酯的方法使用相应的D-丝氨酸甲酯盐酸盐合成了目的化合物N-硬脂酸基-D-丝氨酸甲酯(得率88％，熔点82-83℃，[α]25D＝-15.7(c2.0，CHCl3))。分析合成化合物的结构，得到与N-硬脂酸基-L-丝氨酸甲酯相同的FTIR，1H-NMR和13C-NMR结果。(3)N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-D-丝氨酸甲酯的合成用上述实施例1((3))中明示的合成N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸甲酯的方法使用相应的N-硬脂酸基-D-丝氨酸甲酯合成了目的化合物N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-D-丝氨酸甲酯(得率12％，[α]25D＝+8.8(c2.5，MeOH))。分析合成化合物的结构，得到与N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸甲酯相同的1H-NMR和13C-NMR结果。(4)N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-D-丝氨酸羟甲基的(CHJ-0014)的合成用上述实施例1((4))中明示的合成N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸羟甲基(CHJ-0013)的方法使用相应的N-硬脂酸基-o-磷脂酰胆碱-D-丝氨酸甲酯合成了目的化合物CHJ-0014(得率53％，[α]25D＝-5.3(c2.0，CH2Cl2/MeOH))。分析合成化合物的结构，得到与CHJ-0013相同的FITR，1H-NMR和13C-NMR结果。实验实施例[细胞的培养]用于实验的成骨细胞(primaryosteoblast)，骨髓细胞，破骨细胞前体在含10％胎牛血清(Fetalbovineserum，GibcoBRL)和1X青酶素/链酶素(Gibco，BRL)的α-MEM(α-MinimumEssentialMedium；α-MEM，GibcoBRL)中培养。实验实施例1化合物CHJ-0014对破骨细胞分化的抑制能骨髓细胞和成骨细胞的共同培养对于研究破骨细胞分化，最大的难点是还没有确立维持破骨细胞机能的细胞株。破骨细胞源于骨髓的造血干细胞，分化时需要成骨细胞/基质细胞的帮助。所以骨髓细胞和成骨细胞的共同培养的方法多用于破骨细胞的分化。本实施例采用骨髓细胞和成骨细胞的共同培养系中观察化合物CHJ-0014对破骨细胞分化的抑制能。1)成骨细胞的分离出生24小时的ICR小鼠用70％乙醇消毒后，用剪刀和镊子取出颅盖骨。将其剪碎后置于60-mm培养板里，加入0.1％胶原酶(GibcoBRL)和0.2％透明质酸酶(dispase；BoehringerMannheim)，37℃消化15分钟，反复消化5次。收集后4次消化的细胞，在1600rpm离心5分钟，即能得到成骨细胞。将1-2x106成骨细胞接种于100-mm培养板，在含10％FBS的α-MEM(15ml)中培养3天后，分装在冷冻用小瓶子中，在液体氮中冷冻保管，用于共同培养实验。2)骨髓细胞的分离出生6-7周的ICR雌性小鼠被脱颈锥骨处死后，用70％乙醇消毒后腿部位，无菌操作下分离出胫骨，置于3HBSS(GibcoBRL)，剥离去除软组织。剪断胫骨的两端，用1cc注射器把1Xα-MEM注入到骨髓，得骨髓细胞。用吸液管充分分散细胞，在1600rpm离心5分钟，获得骨髓细胞成分(骨髓细胞和红血球)。细胞中加入15-20mlACK缓冲液(155mMNH4Cl，11mMKHCO3，0.01mMEDTA)处理2分钟后加入磷酸缓冲液，把骨髓细胞的损伤减少到最小限度，溶解红血球，在1600rpm离心5分钟后把细胞悬浮于含10％FBS的α-MEM。3)骨髓细胞和成骨细胞的共同培养上述1)和2)中分离得到的骨髓细胞和成骨细胞，各以2×105和2×104/孔的细胞密度接种于48孔培养板中，在10％FBS的α-MEM中共同培养。加入维生素D3(10-8M)和PGE2(ProstaglandinE2，10-6M)后，再加入不同浓度的CHJ-0014，其浓度分别为1.65μm，3.3μm，6.6μm。对照组为没有加入CHJ-0014的共同培养细胞。培养3天后，交换新鲜的α-MEM培养液，这时跟上述一样加入维生素D3(10-8M)PGE2(ProstaglandinE2，10-6M)以及不同浓度的CHJ-0014。培养6天后，弃去培养液，成熟破骨细胞用10％福尔马林固定5分钟。除掉福尔马林，加入0.1％胰蛋白胨-100，处理10秒钟。弃去胰蛋白胨-100后，进行TRAP(tartrate-resistantacidphosphatase)染色5min。TRAP染色是用抗酒石酸酸性磷酸酶(LeukocyteAcidPhosphataseKit)试剂盒进行的(Sigma，Cat.No.387-A)。除掉TRAP染色溶液后，用蒸馏水清洗2次，干燥，在显微镜下数TRAP阳性的破骨细胞。实验结果中可见，对照组的TRAP阳性破骨细胞数为397±36.75个。但按不同浓度处理CHJ-0014(1.65μm，3.3μm，6.6μm)的实验组的TRAP阳性破骨细胞数分别为80±6.1个，46±4.7个，16±6.4个(图1)。实验结果表明，在骨髓细胞和成骨细胞的共同培养的系中，CHJ-0014能抑制破骨细胞的分化，而且其抑制作用与浓度呈线型关系。实验实施例2化合物CHJ-0014对破骨细胞分化的抑制能骨髓细胞的培养在实施例1中观察得到的CHJ-0014对破骨细胞分化的抑制能，也可能是CHJ-0014作用于成骨细胞，间接地抑制破骨细胞分化的结果。所以本实施例中是只分离骨髓细胞，利用重组破骨细胞分化的蛋白质ODF进行分化，观察CHJ-0014对破骨细胞分化的抑制能。把与实施例1相同的方法分离得到的骨髓细胞，以4×105/孔的细胞密度接种于48孔培养板中，在10％FBS的α-MEM中共同培养。加入ODF(50ng/ml)和M-CSF(30ng/ml)后，再加入不同浓度的CHJ-0014，其浓度分别为0.825μm，1.65μm，3.3μm，6.6μm。培养3天后，交换新鲜的α-MEM培养液，这时跟上述一样加入ODF(50ng/ml)和M-CSF(30ng/ml)以及不同浓度的CHJ-0014。结束分化的破骨细胞是用TRAP染色法确认。TRAP染色是用抗酒石酸酸性磷酸酶试剂盒进行的(Sigma，Cat.No.387-A)。成熟破骨细胞用10％福尔马林固定5分钟。除掉福尔马林，加入0.1％胰蛋白胨-100，处理10秒钟。弃去胰蛋白胨-100后，进行TRAP染色5分钟。除掉TRAP染色溶液后，用蒸馏水清洗2次，干燥，在显微镜下数TRAP阳性的破骨细胞。实验结果中可见，对照组的TRAP阳性破骨细胞数为240±44个。但按不同浓度处理CHJ-0014(0.825μm，1.65μm，3.3μm，6.6μm)的实验组的TRAP阳性破骨细胞数分别为185±12.9个，172±9.3个，87±3.5个，36±3.6个。实验结果表明，在骨髓细胞培养系统中，CHJ-0014能抑制破骨细胞的分化，而且其抑制作用与浓度呈线型关系。实验实施例3化合物CHJ-0014对破骨细胞分化的抑制能破骨细胞前体细胞(osteoclastprecursorcells)的培养起源于骨髓细胞的破骨细胞前体最终移到骨，成为破骨细胞前体细胞，进一步分化形成有骨吸收机能的活性状态的破骨细胞，发挥其作用。即存在于骨里的破骨细胞前体细胞的分化阶段不同于破骨细胞。最近，克隆出对破骨细胞的分化起重要作用的破骨细胞分化因子ODF(也称为OPGL或RANKL)，而且能大量生产其重组蛋白质，所以在一次培养系统中很容易进行破骨细胞的分化。破骨细胞前体细胞是从小鼠肠骨中分离得到。出生5-6周的ICR雌性小鼠被脱颈锥骨处死后，用70％乙醇消毒后腿部位，无菌操作下分离出胫骨和大腿骨。分离的胫骨和大腿骨用上述实施例2相同的方法剥离去除软组织后数次注入3XHBSS(GibcoBRL)除掉骨髓细胞。用手术用剪刀剪成小块，放入含胶原酶的酶溶液(1mg/mlcollagenasetypeII，0.05％胰蛋白酶，4mMEDTA，GibcoBRL)中，在37℃消化15分钟，反复消化5次。第3次消化后，把骨剪成更小块。经过5次消化得到的细胞悬浮于α-MEM，在冰块中放置15分钟。然后用vortex混合1分钟，加入同量的冷α-MEM，在冰块中放置15分钟。这样处理后的骨悬浮液通过灭菌网，就能得到骨髓细胞，在含10％FBS的α-MEM中培养。分离及培养得到的破骨细胞前体细胞，以0.5×106/孔的细胞密度接种于48孔培养板中，在10％FBS的α-MEM中共同培养。加入ODF(100ng/ml)和M-CSF(30ng/ml)后，再加入不同浓度的CHJ-0014，其浓度分别为0.825μm，1.65μm，3.3μm，6.6μm。对照组为没有加入CHJ-0014的共同培养细胞。培养3天后，交换新鲜的α-MEM培养液，这时跟上述一样加入ODF和M-CSF以及不同浓度的CHJ-0014。培养6天后，用相同的方法交换新鲜的α-MEM培养液。培养9天后，进行TRAP染色，用显微镜数TRAP阳性的破骨细胞。实验结果中可见，对照组的TRAP阳性破骨细胞数344±43.7个。但按不同浓度处理CHJ-0014(0.825μm，1.65μm，3.3μm，6.6μm)的实验组的TRAP阳性破骨细胞数分别为318±19.3个，318±50.4个，267±24个，152±29.1个。实验结果表明，从骨中分离达得到的骨髓细胞前体细胞培养系统中，CHJ-0014能抑制破骨细胞的分化，而且其抑制作用与浓度呈线型关系。实验实施例4化合物CHJ-0014的细胞毒性实验为了确定CHJ-0014是否对细胞有毒性，利用不同细胞株进行MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)分析。MTT分析所使用的细胞为上述实施例3中分离得到的成骨细胞，骨髓细胞，腹腔巨噬细胞以及人胚胎肾脏细胞株293T。把上述各种细胞分别以1.5×104个，1×105个，1×105个，1.5×104个/孔的细胞密度接种于96孔培养板后处理CHJ-0014。CHJ-0014的处理浓度为6.6μm，即在破骨细胞分化抑制实验中使用的最高浓度。培养24小时后，每孔加入50μlMTT分析混合液。室温培养4个小时后，用ELISAreader(Bio-TekInstrument，Winooski，VT)在450和630nm波长测定吸收度。上述实验反复进行3次。实验结果表明，化合物CHJ-0014对成骨细胞，骨髓细胞，腹腔巨噬细胞以及人胚胎肾脏细胞株293T均无细胞毒性。实验实施例5化合物CHJ-0014对核转录因子NF-κB活性的影响测定了化合物CHJ-0014对参与破骨细胞分化的核转录因子NF-κB活性的影响。化合物CHJ-0014对核转录因子NF-κB活性的抑制能是用EMSA(electrophoresismobilityshiftassay)法进行测定。用上述实施例3的方法准备破骨细胞，加入低渗溶解缓冲溶液(hypotoniclysisbuffer10mMHEPES，pH7.9，1.5mMMgCl2，10mMKCl，0.5mMDTT，0.5mMPMSF)，置于冰块上培养10分钟。培养物移至离心分离用小管中，加入NP-40，使最终浓度达到0.1％，在冰块上培养10分钟后离心(4,000rpm)15分钟。分离得到的细胞中加入15μl高浓度盐缓冲溶液(20mMHEPES，pH7.9，420mMNaCl，25％甘油，1.5mMMgCl2，0.2mMEDTA，0.5mMPMSF，0.5mMDTT)，在冰块上培20分钟后，加入75μl储存缓冲溶液(storagebuffer；20mMHEPES，pH7.9，100mMNaCl，20％甘油，0.2mMEDTA，0.5mMPMSF，0.5mMDTT)，混合10秒钟，离心(14,000rpm，20分钟)分离得到其上清液，进行蛋白质定量分析。蛋白质定量分析使用了DC蛋白质定量分析试剂盒(DCProteinAssayKit；Bio-Rad)。与NF-κB结合的低聚物(oligomer5-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3，SantaCruz)用[γ-32P]ATP和Klenowfragment标志，作为探针。把10μg蛋白质和20,000cpm的32P标志的探针加入到含1μgpoly(dIdC)的反应缓冲溶液(10mMTris-HCl，50mMKCl，1mMEDTA，5％甘油，2mMDTT)20μl中，在室温反应30分钟。然后把与DNA结合的蛋白质用4-5％聚乙烯酰胺电泳，干燥后用辐射法进行分析。实验结果表明，化合物CHJ-0014可抑制ODF诱导的核转录因子NF-κB的活性。实验实施例6化合物CHJ-0013和CHJ-0014对破骨细胞分化的抑制能骨髓细胞和成骨细胞的共同培养在骨髓细胞和成骨细胞的共同培养系中用实施例1相同的方法测定了本发明的试验化合物对破骨细胞分化的影响。其中作为试验化合物CHJ-0013和CHJ-0014各使用了4μM浓度。其结果表示在图9。图9的结果表明本发明的化合物在骨髓细胞和成骨细胞的共同培养系中均抑制破骨细胞的分化，而且其抑制作用与浓度呈线型关系。剂型实施例将下面的成分用在本领域通用的方法来混合后压制成片剂。CHJ-001425mg乳糖66mg微晶葡萄糖NF20mgSodiumstarchglucholateNF2.99mg滑石USP1.5mg硬脂酸镁0.7mg从以上的说明来看，本发明应理解成即使不改变其
技术领域：
和必需的特征，也能以其他具体形式来实施。据此，以上记述的实施例或者实验实施例只属於举例说明，而本发明的范围不仅限於此。本发明的范围应理解为与后述的权利要求书范围的意义和范围相同，以及由此可导出的所有变更或者变形的形态都属於本发明的范围。工业使用性N-酰基溶血磷脂酰胆碱化合物(化学式1)对破骨细胞的分化有显著的抑制效果，而且没有毒性。所以包含N-酰基溶血磷脂酰胆碱化合物(化学式1)的药物制剂可能对代谢性骨病的预防和/或治疗具有很高的使用性。权利要求1.一种用于预防和/或治疗代谢性骨病的药物组合物，该药物组合物包含药物有效量的化学式1a的N-酰基-o-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸甲酯或其可药用盐，可单独使用或者分别与可药用载体一起使用，[化学式1a]上面的化学式中R为具有14～20个碳原子的饱和或者不饱和脂肪酸。2.一种用于预防和/或治疗代谢性骨病的药物组合物，该药物组合物包含药物有效量的化学式1b的N-酰基-o-磷脂酰胆碱-D-丝氨酸甲酯或其可药用盐，可单独使用或者分别与可药用载体一起使用，[化学式1b]上面的化学式中R为具有14～20个碳原子的饱和或者不饱和脂肪酸。3.一种用于预防和/或治疗代谢性骨病的药物组合物，该药物组合物包含药物有效量的化学式1c的N-酰基-o-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸羟甲基或其可药用盐，可单独使用或者分别与可药用载体一起使用，[化学式1c]上面的化学式中R为具有14～20个碳原子的饱和或者不饱和脂肪酸。4.一种用于预防和/或治疗代谢性骨病的药物组合物，该药物组合物包含药物有效量的化学式Id的N-酰基-o-磷脂酰胆碱-D-丝氨酸羟甲基或其可药用盐，可单独使用或者分别与可药用载体一起使用，[化学式1d]上面的化学式中R为具有14～20个碳原子的饱和或者不饱和脂肪酸。5.权利要求3或4的药物组合物，其中R为具有17个碳原子的硬脂酰基团。6.权利要求1-4任一项的药物组合物，其中所述代谢性骨病选自骨质疏松症、癌骨转移、原发性骨癌、风湿性或退形性关节炎、牙周疾病、炎症性牙槽骨吸收疾病、炎症性骨吸收疾病以及Paget’sdisease等代谢性骨病中的任一项。7.制备化学式1表示的化合物的方法，包括下列步骤(a)丝氨酸与甲醇，盐酸反应，生成丝氨酸甲酯盐酸盐；(b)生成的丝氨酸甲酯盐酸盐与N-甲基吗啉，具有14～20个碳原子的饱和或者不饱和脂肪酸，1-羟基苯并三氮唑，1，3-二环己基碳化二亚胺反应，生成N-酰基-丝氨酸甲酯；(c)生成的N-酰基丝氨酸甲酯与N-二异丙基乙胺，乙烯氯亚磷酸盐进行反应；(d)步骤(c)生成的化合物与三甲胺反应，得到N-酰基-o-磷脂酰胆碱-丝氨酸甲酯；和(e)得到的N-酰基-o-磷脂酰胆碱-丝氨酸甲酯与氢化锂铝反应，生成N-酰基-o-磷脂酰胆碱-丝氨酸羟甲基的阶段[化学式1]上面的化学式中R为具有14～20个碳原子的饱和或者不饱和脂肪酸，R`是甲氧羰基或羟甲基。8.权利要求7的方法，其中式I的化合物呈L-形立体异构体形式，包括下列步骤(a)L-丝氨酸与甲醇和盐酸反应，生成L-丝氨酸甲酯盐酸盐；(b)生成的L-丝氨酸甲酯盐酸盐与N-甲基吗啉、具有14～20个碳原子的饱和或者不饱和脂肪酸、1-羟基苯并三氮唑、1，3-二环己基碳化二亚胺反应，生成N-酰基-L-丝氨酸甲酯；(c)生成的N-酰基L-丝氨酸甲酯与N-二异丙基乙胺和乙烯氯亚磷酸盐进行反应，生成的化合物继续与三甲胺反应，得到N-酰基-o-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸甲酯；(d)得到的N-酰基-o-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸甲酯与氢化锂铝反应，生成N-酰基-o-磷脂酰胆碱-L-丝氨酸羟甲基[化学式1]上面的化学式中R为具有14～20个碳原子的饱和或者不饱和脂肪酸，R′是甲氧羰基或羟甲基。9.权利要求7的方法，其中下式I的化合物呈D-形立体异构体形式，包括下列步骤(a)D-丝氨酸与甲醇、盐酸反应，生成D-丝氨酸甲酯盐酸盐；(b)生成的D-丝氨酸甲酯盐酸盐与N-甲基吗啉、具有14～20个碳原子的饱和或者不饱和脂肪酸、1-羟基苯并三氮唑，1，3-二环己基碳化二亚胺反应，生成N-酰基-D-丝氨酸甲酯；(c)生成的N-酰基-D-丝氨酸甲酯与N-二异丙基乙胺和乙烯氯亚磷酸盐进行反应，生成的化合物继续与三甲胺反应，得到N-酰基-o-磷脂酰胆碱-D-丝氨酸甲酯；和(d)得到的N-酰基-o-磷脂酰胆碱-D-丝氨酸甲酯与氢化锂铝反应，生成N-酰基-o-磷脂酰胆碱-D-丝氨酸羟甲基[化学式1]上面的化学式中R为具有14～20个碳原子的饱和或者不饱和脂肪酸，R′是甲氧羰基或羟甲基。全文摘要本发明涉及一种用于预防和/或治疗代谢性骨病的药物组合物，该药物组合物包括有效剂量的N－酰基溶血磷脂酰胆碱化合物(化学式1)和其可用于药物制剂的载体。而且本发明涉及从丝氨酸制备化学式1的N－酰基溶血磷脂酰胆碱化合物的制备方法。文档编号C07F9/09GK1608073SQ02824797公开日2005年4月20日申请日期2002年12月13日优先权日2001年12月13日发明者钱吉子,韩素叶,李章熙,金洪姬,李银姬,金英娥,郭韩福申请人:钱吉子,韩素叶,李章熙,金洪姬