专利名称：一种提取与纯化10-去乙酰基巴卡丁ⅲ(10-dabⅲ)的方法
技术领域：
本发明涉及一种从含有10-去乙酰基巴卡丁III(10-DABIII)的红豆杉植物中提取与纯化10-去乙酰基巴卡丁III的方法。
背景技术：
10-去乙酰基巴卡丁III(10-DABIII)是从红豆杉中分离出的天然有机化合物，被用于半合成紫杉醇及紫杉醇类化合物。其分子式如下 从二十世纪60年代末美国化学家Wall和Wani从太平洋红豆杉中分离得到了紫杉醇，并于70年代初确定了它的化学结构，但未引起学术界的重视。直到1979年，Albent Einstein医学院的生化药理教授Su.Horwity研究发现了紫杉醇(Taxol)具有独特的能促进微管蛋白聚合以及抑制微管解聚的活性。换句话说它有一种独特的抗癌作用机理后，才引起了业界的重视。1983年开始进入临床研究，1991年经美国FDA批准进入市场成为国际上公认的抗癌药物之一。我国对红豆杉有效成分之一紫杉醇抗肿瘤作用研究始于1984年，1986年列入国家医药总局的“七五”攻关科研计划，1995年2月经卫生部批准对国产紫杉醇进行临床研究，同年9月得到许可证。紫杉醇被誉为90年代中国抗肿瘤药的重大成果之一。但是目前从植物红豆杉(包括其他同系物种)中提取紫杉醇的方法，可获得紫杉醇的量相当少，远远不能满足医药业的需求，为此有关的药物研究人员致力于开拓紫杉醇的合成与半合成之路，以扩大紫杉醇的来源，并成功利用紫杉醇的前体10-去乙酰基巴卡丁III(简称10-DABIII，下同)为原料来半合成紫杉醇或紫杉醇的类似物如多西紫杉醇(Docetaxel)等，其抗癌活性及水溶性均优于紫杉醇，并有望很快进入工业化。但问题的关键是如何利用现有的资源能工业化地提取足够多的半合成的原料，即获得高纯度10-DABIII精品。为此，医药界的有关人士期望生物工程方面的专家探索一条从植物红豆杉中能高效地提取和纯化10-DABIII地工业化之路，以推动和支持抗肿瘤医药工业的技术进步。
发明内容
本发明的目的在于推动和支持抗肿瘤医药工业的技术进步，提供了一种从红豆杉类植物的茎叶和嫩枝中提取、纯化10-去乙酰基巴卡丁III(10-DABIII)的方法，简称“一种提取与纯化10-去乙酰基巴卡丁III(10-DABIII)的方法”，它不仅大大提高资源的利用率，而且以工业化地获得高纯度10-去乙酰基巴卡丁III(10-DABIII)精品，纯度高达99.5％以上。本发明的构思如下首先要突破高效率的提取难关。众所周知，目前从红豆杉茎叶与嫩枝中提取紫杉醇与10-去乙酰基巴卡丁III(10-DABIII)等有效组分的方法，都是藉用传统的中药浸泡工艺，需要长时间(至少需要24小时以上)反复地浸泡(多达7～8次以上)，希望尽可能多地提取获得所需的有效组分。但是这种方法本身实际的提取效果是粗放有限的。因为常识告诉我们，植物的细胞壁是相当厚的而且是比较致密的，想藉助渗透，到植物细胞中将细胞内的有效组分载带出来，它对于大分子的紫杉醇化合物载带出来的困难是可想而知的，可以说能载带出来的量是很少的，也就是说植物细胞内的有效组分基本未得到利用，往往局限在获取细胞外的有效组分。为此本发明构思用现代科学最新进展超细粉碎技术，将粗粉粉碎至0.5mm的红豆杉茎叶与嫩枝的颗粒再进一步超细粉碎至植物细胞的粒径之下，使植物细胞中的有效组分全部释放出来，这样不仅能达到最大限度的获得有效组分，而且可快速地(5～30分钟内)一次性地用溶剂将红豆杉茎叶与嫩枝的超细粉中有效组分提取出来，经过滤除去滤渣得到提取液。
然后要攻克获得高纯度10-DABIII的工业化提纯难关1、将上述提取液置于旋转蒸发器中浓缩，除去溶剂等物质(另外处理)，得到提取浓缩液，加入适量的水。激烈搅拌数分钟分散成均一的乳化液，然后加入萃取剂，再激烈搅拌数分钟，静置分层0.5～1.5小时，从底部放出含有目标产物的萃取液(萃余液为水相另行处理)，在旋转蒸发器中蒸发回收萃取剂后得到含5～10％(wt)10-DABIII粗品A；2、将粗品A先制备成硅胶混合物，再装入玻璃硅胶柱的上部，在常温常压下，用洗脱剂进行柱层析洗脱分离，分段收集洗脱液，经分析测试，将合格的洗脱液进行浓缩得到浓度达25％(wt)以上的10-DABIII粗品B；3、将粗品B先制备硅胶混合物，再装入大型制备色谱柱的上部，在室温常压或加压下用混合溶剂进行层析洗脱分离，分段收集洗脱液，通过分析测试，将合格的洗脱液浓缩，获得含量达80％(wt)的10-DABIII粗品C；
4、将粗品C先在常压，温度10～80℃，碱性条件下，用pH13-14氢氧化钠水溶液水解处理数小时，使粗品C中的BaccatinIII(巴卡丁III的简称，下同)为代表的“杂质”转化成10-DABIII；然后在旋转蒸发仪中减压蒸发至干，并用步骤(2)的同样方法，制备成硅胶混合物，通过硅胶柱进行柱层析洗脱分离，分段收集洗脱液，将合格的洗脱液进行浓缩，最终得到浓度达99.5％以上的10-DABIII精品，即本发明的目标产物。
本发明按照上诉构思是这样实现的1、本发明的10-DABIII的提取工艺主要包括如下二个步骤(1)首先将粒径≤0.5mm的红豆杉的茎叶和嫩枝在对撞式气流超细粉碎机中粉碎至粒径≤10μm(平均粒径为5～6μm)，将红豆杉植物细胞予以彻底粉碎(植物细胞平均直径在15～25μm之间)，使细胞中的有效组分全部释放出来，其中紫杉醇、10-DABIII等组分含量比现有技术所报导的公知含量要大2～4倍。
(2)然后用醇类溶剂进行一次性提取，过滤除渣后得到含有10-DABIII的提取液，所说的提取过程在室温(或加温40～60℃)、常压、搅拌下进行，可在5～30分钟内完成，搅拌转速为60～240转/分，料液比超细粉(wt)∶醇类溶剂(V)＝1∶1～2。过滤所得滤饼用少量的醇(为浸取液量的10％)洗脱，以回收夹带在滤饼中的有效组分，洗脱液与提取液合并处理(为行文简便，下面将包含洗脱液的提取液，简称提取液)。所说的醇类溶剂是甲醇、95％的工业酒精中的一种。
2、本发明的10-DABIII的纯化过程主要包括如下四个步骤(1)提取液的处理与含量为5～10％(wt)10-DABIII粗品A的制取。
将上述的提取液置于旋转蒸发器中浓缩(溶剂回收循环使用)，得到提取液浓缩，加入适量的水(为提取浓缩液的0.5～1.0倍的纯水)进行激烈搅拌数分钟(如3～8分钟)，获得均一的乳化液，再加入萃取剂。如加入与提取浓缩液等体积的乙酸丁酯，再进行激烈搅拌数分钟(如3～8分钟)，然后静置分层0.5～1.5小时。从底部放出含有10-DABIII的萃取液，置于旋转蒸发器中蒸发除去萃取剂(萃取剂回收后循环使用)，得到含5～10％(wt)的10-DABIII粗品A；萃余液集中后另行处理。
(2)5～10％(wt)10-DABIII粗品A的处理与25％(wt)以上浓度10-DABIII的制取。
首先将上述粗品A用95％酒精加热溶解成均一的溶液，然后加入粒径为10～50μm的硅胶(市售产品)搅拌均匀，置于旋转蒸发仪中蒸发至于(酒精经回收循环使用)成硅胶与10-DABIII的均匀混合物(简称硅胶混合物，下同)，存放于干燥器中备用。可以反复多次制取，以备足样品。以下为行文清晰起见，此处样品简称“硅胶混合物①”。其中粗品A(w)与95％乙醇(V)比为1∶5，粗品A(w)与硅胶(w)之比为1∶1。
然后将硅胶混合物①置于已充填入工业硅胶的玻璃层析柱的上部，用1∶1的乙酸乙酯和环己烷混合溶剂洗脱，分段收集馏分(洗脱液)，实验证明前半部分的馏分仅含有少量10-DABIII组分(洗脱下的大部分为酯类杂质)，后半部分的馏分，分段收集后，取样分析。合格部分蒸发浓缩，得到含量≥25％(wt)的10-DABIII粗品B；不合格的馏分，则经蒸发回收溶剂后，返回步骤(2)重复处理。前半部分的馏分则通过精馏，回收混合溶剂后，循环使用，残留的杂质及少量10-DABIII则集中后另行处理。如可作为原料进入醇类溶剂浸取混合系统重新浸取。
(3) 以含量≥25％(wt)的10-DABIII粗品B为原料，通过大型制备色谱柱正相制取含量≥80％(wt)10-DABIII粗品C。
先将粗品B溶解于甲醇中，加入粒度为10～50μm工业硅胶搅拌混匀后，置于旋转蒸发器中蒸干(溶剂甲醇回收后循环使用)，将此干样置于干燥器中备用。下面为行文之简明起见，将上述干样简称为“硅胶混合物②”；然后将“硅胶混合物②”填充入大型制备色谱柱的上部，用1～4∶1的乙酸乙酯与环己烷组成的混合溶剂作洗脱剂，在常压/加压下进行洗脱，分段收集洗脱液，其中，前面占总量2/3的洗脱液经检测仅含有少量10-DABIII组分，以投入的10-DABIII计，仅占5％左右；后面1/3的洗脱液经分段收集后，经检测其中达标的馏分，经蒸发回收溶剂后，得含量≥80％(wt)10-DABIII粗品C，未达标的馏分则经回收除去混合溶剂后返回步骤(3)再行处理。前面收集的占总量2/3的洗脱液经精馏回收溶剂后循环使用，残留的杂质中含有少量的10-DABIII可作为原料返回提取浓缩液工艺中再行处理。所说的加压，其压力为600～1000psi，压力源为压缩空气或瓶装氮气。
(4)粗品C的水解处理与纯度99.5％(wt)10-DABHI精品的制取。
先将粗品C溶解于甲醇中，构成一均一的溶液，加入碱性的pH13～14氢氧化钠水溶液，在10～80℃下，水解数小时(3～8小时)，使得巴卡丁III(简称BaccatinIII)为代表的同系物或衍生物转化为10-DABIII，从而进一步提高10-DABIII的产率，实践证明其产率至少可增加15％(wt)以上。所得水解液可作进一步处理。
将上述水解液，置于一蒸发装置中，经减压蒸发，除去溶剂及水，获得的浓缩物，经冷却干燥后，按步骤(2)同样的方法处理，获得的合格馏分经蒸发浓缩回收溶剂后，得到纯度大于99.5％(wt)10-DABIII精品-----即本发明的目标产物。不过在按步骤(2)的处理时，以甲醇作溶剂为好。
本发明所说的红豆杉包括南方红豆杉、云南红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉、中国红豆杉、曼地亚红豆杉、尖杉红豆杉、加拿大红豆杉。
下面结合附图和实例进一步阐明本发明的内容，但实例并不限制本发明的保护范围。
图1为从粒径＜10μm的超细红豆杉茎叶与嫩枝粉中浸取有效组分的工艺流程示意图。
由图1可见本发明的浸取有效组分的工艺特别简便、快速，其原因由于本发明采用超细粉碎技术，将红豆杉粉碎至植物细胞粒径(平均颗粒直径15～25μm)之下，使细胞内的有效组分全部释放出来，故超细粉中有效组分可以在短时间内一次性地用醇类溶剂提取出来。它不仅使资源得到充分的合理使用，而且大大减少了溶剂耗量，全面做到多块好省。
图2为制取含量达5～10％(wt)10-DABIII粗品A的工艺流程图。
由图2可见本发明用乙酸丁酯从“提取浓缩液”中萃取10-DABIII的工艺亦是一种简单易行的方法，可以一次性地获得含量高达5～10％(wt)10-DABIII的粗品A，为后续的提取工艺打下了基础。萃取剂乙酸丁酯可在系统内循环使用。提取液经旋转蒸发器浓缩回收的醇类溶剂可返回图1的浸取槽中循环使用。萃取液经旋转蒸发回收除去萃取剂后即得粗品A；萃余液集中后另行处理，可采用适当得工艺提取和纯化获得紫杉醇精品。具体工艺将在另外得专利申请中公开，故本发明申请中叙述从略。
图3为制取含量达25％(wt)以上的i0-DABIII粗品B的工艺流程。
由图3可见溶剂(95％酒精)、洗脱剂(由1∶1乙酸乙酯和环己烷组成的混合溶剂作洗脱剂)以及粗品A在粗品B的制取工艺中均实行闭路循环，基本上做到物料无损耗，亦无污染排放。所说的粗品B即为含量≥25％(wt)的10-DABIII粗制品。
图4为以粗品B为原料通过大型制备色谱柱制取含量≥80％(wt)的10-DABIII-----粗品C的工艺流程。
由图4可见其中硅胶混合物②先加入大型制备色谱柱的上部，然后密闭进口，(由1～4∶1乙酸乙酯和环己烷组成的)混合溶剂在常压/加压下进入制备色谱柱进行洗脱。所说的加压，其压力为600～1000psi，压力源为压缩空气或瓶装氮气。通过大型制备色谱柱的正相分离，以10-DABIII为基准时粗品C的得率为60％左右，纯度达80％以上。
图5为粗品C的水解处理与纯度99.5％以上精品10-DABIII的制备工艺流程。
由图5可见1、本发明独到的水解处理工艺，使得BaccatinIII为代表的同系物高效地转化成10-DABIII，从而进一步提高了10-DABIII的产率，实践验证其产率至少可增加15％(wt)以上。
2、按步骤(2)相同方法制得硅胶混合物③置于填充入工业硅胶得玻璃层析柱的上部，然后用1∶1乙酸乙酯和环己烷的混合溶剂在室温常压下洗脱，分段收集馏分(或称洗脱液)，经分析测定凡10-DABIII含量大于99.5％(wt)的馏分为合格产品，统称为馏分2，经旋转蒸发器浓缩回收除去混合溶剂后，即得本发明得目标产物——纯度大于99.5％(wt)以上得10-DABIII精品，收率达85％以上。
未达标得馏分(包括馏分1，馏分3)经集中收集蒸发回收混合溶剂后，所得粗品B”则返回至纯化步骤(3)通过大型制备色谱柱再次正相制取含量大于80％(wt)的10-DABIII粗品C。
所说的粗品B”和B’、B一样附合含量≥25％(wt)10-DABIII的原料，从本质上说没有大的区别，仅仅因出现在不同的纯化步骤中，予以适度区别而已。
总之，由图1可见本发明完善地解决了从植物组织中(包括植物细胞中)有效组分的充放释放问题，从而提高了有限资源的利用率，并使提取工艺变得十分简便。
由图2-5可见本发明比较完善地解决了10-DABIII的纯化问题，可高效地获得高纯度的10-DABIII精品。
具体实施例方式
下面就是本发明的具体的提取和纯化过程提供一些工业化的实施例，以进一步阐明本发明的内容。
实施例1用浸取法从红豆杉枝叶的超细粉(粒径＜10μm)中获得含10-DABIII的提取液。
称取30公斤粒径10μm的曼地亚红豆杉枝叶超细粉原料，置于聚乙烯容器中，加入浓度为95％工业酒精50升，搅拌浸取20分钟，过滤后得到提取液45升，滤渣(或滤饼)至少再用5升95％的酒精洗脱一次，以回收滤渣中夹带的有效组分，所得洗脱液(5升)与提取液合并后等待进一步处理。用高压液相色谱仪测定原料中的10-DABIII及其衍生物(或同系物)含量达0.21％(wt)，与现有的公知数据相比，由于超细技术的引入使原料中有效组分提高了三倍，而且用本发明的方法，不仅可以快速地提取有效组分，而且其提取率可达98％左右，提取液中有效组分含量达到1.24g/L。
实施例2用萃取法从浓缩提取液中制取含量5～10％(wt)10-DABIII粗品。
将实施例1制得50升提取液，置于旋转蒸发器中浓缩至3升(回收的酒精循环使用)，移入带搅拌的萃取器中，加入2升纯净水激烈搅拌3分钟，使浓缩液与水分散成均一的乳液，然后再加入3升乙酸丁酯萃取剂，再激烈搅拌3分钟，静置1小时或待分层清晰后，打开底部阀门，放出下层的乙酸丁酯萃取液，置于旋转蒸发器中，蒸发回收乙酸丁酯后，得到1029克含6％(wt)10-DABIII粗品(简称粗品A)，重复实施例1、2的操作步骤，制得5公斤以上的粗品A，供下一步使用；萃余液(水相)集中合并后，另外处理，可提取其他有效组分。
实施例3以粗品A为原料，经多步制取纯度达99.5％(wt)以上的精品10-DABIII。
1、称取200克粗品A，置于一带外加热和搅拌器的溶解槽中，先加入1升95％的工业酒精，待粗品A在加热(40～50℃)下完全溶解后，然后加入200克粒径为10～50μm的硅胶，搅拌均匀后，再移至旋转蒸发器中蒸发至干，制成硅胶与粗品A的混合物400克，简称硅胶混合物①，存放于干燥器中待用。蒸发回收的工业酒精可循环使用。按照上述方法，可以重复地制备，至少备足2公斤硅胶混合物①。
在一直径(内径)为15cm，有效长度为1.5m的玻璃柱中(按照层析柱的要求加工)，底部先垫上一层医用脱脂棉花，然后密实地装入18公斤工业硅胶，组成一玻璃层析柱，在工业硅胶的上部再添加2公斤要求处理的硅胶混合物①，填充密实后，在上面再加一层医用脱脂棉花，上端盖上盖子后，通入“由1∶1乙酸乙酯和环己烷”组成的混合溶剂作层析柱的洗脱液(简称洗脱液)，总量为60升，分段收集馏分，分析检测证明前面30升的馏分中仅含有少量的10-DABIII，总量仅占投入量的3％左右，通过精馏回收混合溶剂(混合溶剂循环使用)后，残余物料(包括杂质)返回浸取过程重复处理。
馏分1为第30至40升的洗脱液；馏分2为第40至50升的洗脱液；馏分3为第50升至60升的洗脱液。
分别进行旋转蒸发浓缩得到三个干样。用高压液相色谱分析三个干样的组成，结果如下馏分177.8克含量为14％(wt)的10-DABIII；馏分2145.8克含量为31％(wt)的10-DABIII，收率为75.3％；馏分383.4克含量为3％(wt)的10-DABIII。
其中馏分2为10-DABIII含量大于25％的合格中间产品，简称粗品B，收率＞75％。
馏分1、馏分3均为不合格的中间产品，生产时两者可以合并进行蒸发浓缩(回收混合溶剂)后，得到粗品A’，它与粗品A类同，因此可作粗品A原料，进入系统再行处理。
按照上述方法多次制备，至少制得2公斤以上的粗品B待用。
2、称取上述粗品B(含量为31％(wt)10-DABIII粗品)2公斤，置于带搅拌的溶解混合槽中，加入10升甲醇，溶解成均一的溶液，然后再加入2公斤粒径为10～50μm的工业硅胶，搅拌混匀后，转入旋转蒸发器中，旋转蒸发至干，所得样品简称硅胶混合物②，再移入干燥器中干燥备用。旋转蒸发回收的甲醇循环使用。
将上述的硅胶混合物②4Kg置于一大型的制备色谱柱的上部，密闭后用2∶1的乙酸乙酯和环己烷组成的混合溶剂进行常压/加压洗脱层析分离，洗脱剂(即混合溶剂)的用量为180升，(如加压，压力为800psi，压力源为净化的压缩空气或瓶装的氮气)。分段收集馏分，其中前面120升的馏分(占总洗脱剂耗量的2/3)，因仅含少量的10-DABIII，故通过精馏回收混合溶剂(回收的混合溶剂循环使用)后，残余物(其中含有少量的10-DABIII，约占投料中的10-DABIII量的3％左右)返至提取浓缩液处理工艺中再行处理。
馏分1为第120至150升段的馏分；馏分2为第150升至170升段的馏分；馏分3为第170至180升段的馏分。
将上述三个馏分，分别用旋转蒸发器蒸发至干(回收的混合溶剂循环使用)，得到三个干样，经高压液相色谱仪检测结果如下馏分1375.6克含量为36％(wt)的10-DABIII粗品；馏分2457.7克含量为82％(wt)的10-DABIII粗品；馏分3523.6克含量为18％(wt)的10-DABIII粗品；其中馏分2符合本工序规定的合格的中间产品，简称粗品C，收率大于60％；馏分1、馏分3均为不合格的中间产品，生产中可以将两者合并，然后一起进行蒸发浓缩回收混合溶剂(循环使用)后，获得浓缩物，简称粗品B’，可以和粗品B一起作为原料，进入溶解混合槽中，予以循环使用。
3、以粗品C为原料进行水解，并进一步精制纯化制取纯度大于99.5％(wt)的精品10-DABIII。
称取粗品C(纯度82％的10-DABIII)30克，置于以水解反应器中，先加入200毫升甲醇，溶解成均一的溶液，然后加入100毫升pH13～14的氢氧化钠水溶液，在碱性、常压、10～80℃下，水解4小时，使以BaccatinIII为代表的10-DABIII类衍生物转化成10-DABIII组分，从而有效提高10-DABIII的产率，一般至少可使10-DABIII的产率增加15％以上。
将水解后的溶液，移至旋转蒸发器中，减压蒸发至于，简称水解减压蒸发至干的物料，然后移至干燥器中干燥待用。减压蒸发出来的甲醇和水，集中收集达一定量后，再通过精馏，回收甲醇循环使用。
水解减压蒸发至干的物料，先按照2所述的类同方法制得“硅胶混合物③”60克，然后将“硅胶混合物③”置于玻璃层析柱的上部，用“由1∶1乙酸乙酯和环己烷，”组成的洗脱剂进行洗脱层析，洗脱剂的用量为50升，分段收集馏分，馏分1(25升)、馏分2(15升)、馏分3(10升)，将三个馏分分别通过旋转蒸发器蒸发至干，得到三个样品，经高压液相色谱仪检测结果如下
馏分18克含量为63％(wt)的10-DABHI粗品；馏分221克含量为99.62％(wt)的10-DABIII精品；馏分35克含量为48％(wt)的10-DABIII粗品。
本实例中10-DABHI的得率达115.3％(可由物料衡算得到)，其中增加的得率为其他“杂质”转化成10-DABIII的结果。
此外顺便指出，馏分2即为本发明的目标产物，含量达99.62％(wt)10-DABIII精品，在本实例中(指实施例3的实例)其收率达85％，馏分1、馏分3，未达到精品质量的要求，它们可以合并后，用旋转蒸发器蒸发浓缩得到粗品B”，它可以和B，B’一起返至溶解混合槽中作为制取粗品C的原料。
由上可见，本发明的方法具有构思新颖，方法简便、工艺合理，易于工业化的特点，能有效地推动防治肿瘤医药工业的发展与技术进步。
权利要求
1.一种提取与纯化10-去乙酰基巴卡丁III(10-DABIII)的方法，其特征在于所说的提取方法主要包括如下两个步骤(1)首先将红豆杉植物的茎叶和嫩枝进行超细粉碎得到超细粉，其粒径在10μm以下，小于植物细胞的平均直径15～25μm，从而使植物细胞中有效组分全部释放出来；(2)然后用醇类溶剂从上述超细粉中将包括10-DABIII及其衍生物在内的全部有效组分一次性地提取出来，过滤除去滤渣后，得到提取液，提取时的工艺条件为料液比超细粉(w)∶醇类溶剂(V)＝1∶1～2；提取温度室温或加温(40～60℃)；提取时间5～30分钟；搅拌转速60～240转/分。
2.如权利要求书1所述的方法，其特征在于提取方法步骤(1)中所说的红豆杉植物包括南方红豆杉、云南红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉、中国红豆杉、曼地亚红豆杉、尖杉红豆杉、加拿大红豆杉。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于提取方法步骤(2)中所说的醇类溶剂是甲醇、95％工业酒精中的一种。
4.一种提取与纯化10-去乙酰基巴卡丁III(10-DABIII)的方法，其特征在于所说的纯化方法主要包括如下四个步骤(1)首先将所得提取液置于旋转蒸发器中，蒸发浓缩除去醇类溶剂，得到浓缩提取液，用少量水稀释后，再用乙酸丁酯萃取剂进行萃取分离，萃取时的工艺条件为相比浓缩提取液(V)∶萃取剂(V)＝1∶1；温度室温；萃取时间在剧烈搅拌下3～8分钟；静止分层0.5～1.5小时；分离得到乙酸丁酯萃取液，经蒸发除去萃取剂后得到含量为5～10％(wt)10-DABIII粗品原料，简称粗品A；(2)以粗品A为原料，用95％酒精加热溶解成均一溶液，然后加入粒径为10～50μm的工业硅胶，搅拌均匀，再蒸发除去95％酒精制成“硅胶混合物①”，然后将此“硅胶混合物①”置于填充硅胶的玻璃层析柱的上部，用1∶1的乙酸乙酯和环己烷组成的混合溶剂洗脱层析，分段收集馏分，取样分析，将合格的馏分蒸发除去混合溶剂后得到含量≥25％(wt)的10-DABIII“粗品B”；(3)以粗品B为原料，溶解于甲醇中，加入粒径为10～50μm的工业硅胶搅拌混匀后置于旋转蒸发器中蒸干，得到“硅胶混合物②”填充入大型制备色谱柱的上部，用1～4∶1的乙酸乙酯与环己烷组成的混合溶剂作洗脱剂，在常压或加压下进行洗脱，分段收集馏分，经高压液相色谱仪检测达标的馏分，进行蒸发除去混合溶剂，得到含量≥80％(wt)10-DABIII粗品C；(4)以粗品C为原料，溶解于甲醇中，构成均一的溶液，加入pH13-14的氢氧化钠水溶液，在10～80℃下，水解3～8小时，用氯化铵饱和溶液终止反应，使得以BaccatinIII为代表的10-DABIII类衍生物转化为10-DABIII，所得水溶液移入蒸发装置中，经减压蒸发器除去甲醇和水，获得浓缩物再按步骤(2)同样的方法制得“硅胶混合物③”，进一步进行玻璃柱层析，分段收集馏分，经检测合格的馏分进行蒸发除去溶剂后，得到纯度大于99.5％(wt)以上的10-DABIII精品，即本发明的目标产物。
全文摘要
本发明公开了一种提取与纯化10－去乙酰基巴卡丁III(10－DABIII)的方法，该法主要包括二大部分，其一先用醇类溶剂从红豆杉枝叶的超细粉(粒径≤10μm)中快速提取含10－DABIII及其衍生物类等有效成分，然后用萃取法获得含5～10％(wt)10－DABIII原料；其二以5～10％(wt)10－DABIII原料，经硅胶柱层析，常压色谱柱层析以及水解等提纯、转化、精制步骤，工业化获得纯度大于99.5％(wt)以上的10－DABIII精品。
文档编号C07D305/00GK1473821SQ0312963
公开日2004年2月11日 申请日期2003年7月3日 优先权日2003年7月3日
发明者林复兴, 陈建民, 詹华杏, 林炯明, 张伟中, 陈建军, 杨继东, 吕琦 申请人:上海金和生物技术有限公司