专利名称：小麦望水白抗赤霉病侵染主效基因位点及其分子标记的制作方法
技术领域：
本发明提供了小麦望水白抗赤霉病侵染主效基因位点及其分子标记，属于分子遗传学领域，专用于小麦赤霉病抗病品种的选育与种质资源的利用。
二、技术背景小麦是我国的重要粮食作物。由赤霉菌引起的小麦赤霉病，不仅造成小麦严重减产，降低籽粒品质，而且该病菌产生的毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇还影响人、畜健康，给小麦生产造成了极大损失。在我国，有超过四分之一的小麦产区遭受赤霉病的危害，且每隔3~5年就有一次大流行，仅2002年赤霉病发生面积即达3000万亩次。因此，研究防治小麦赤霉病也就成了当前小麦育种上的一个迫切任务。培育抗病品种是防治小麦赤霉病危害的最安全、有效而且节约成本的措施之一。但传统育种方法费时费力，而且由于赤霉病表型鉴定非常困难，使小麦抗赤霉病育种进程异常缓慢。通过定位鉴定抗病主效基因位点来辅助育种可以有效解决这一问题。
遗传研究表明，小麦赤霉病主要受少数几个主效基因位点控制，不同的抗性材料其抗病主效基因位点在染色体上的位置不一致，而且分为抗侵染和抗扩展两种类型。但通过不同抗病主效基因位点的聚合或者引入新的抗源可以选育出抗性很好的品种。
目前在赤霉病抗性遗传基础的研究及抗病育种的利用上多集中在苏麦3号及其衍生系，而对其它抗源的利用研究很少。望水白是我国江苏特有的地方品种，具有高且稳定的赤霉病抗性。到目前为止尚未发现比它的抗性更强的小麦品种，而且它携有不同于苏麦3号的抗性基因(廖玉才1985)。
上述小麦望水白中位于2D、4A、5A、5B和7B上的抗赤霉病侵染主效基因位点QFhs.nau-2d、QFhs.nau-4a、QFhs.nau-5a、QFhs.nau-5b和QFhs.nau-7b2的分子标记分别为Xgwm539、Xbarc184、Xbarc056、Xgwm408和Xgwm537。上述小麦望水白抗赤霉病侵染主效基因位点，是通过以下方法获得标记定位的(1)小麦品种望水白(♀)与南大2419(♂)进行杂交得到杂种F1，F1自交产生F2，然后采用单粒传方法(SSD)获得F6代的重组自交系；(2)用SDS法提取重组自交系群体各株系的DNA，采用简单重复序列标记SSR对两亲本进行多态性筛选，PCR在PE9600扩增仪上进行，扩增产物在8％(g/ml)聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离分析，根据分子标记筛选结果，筛选出亲本间有多态的引物，亲本间有多态的引物在重组自交系群体中进行分析，PCR扩增程序同上，获取群体基因型资料；(3)根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建小麦的遗传图谱，所用软件为Mapmaker 2.0，最小LOD值设为3，获得连锁图谱；(4)扬花期接种赤霉病病原菌，对重组自交系每个家系进行赤霉病抗性鉴定，获得重组自交系每个家系的病穗率；(5)利用Data desk v.5.0软件对各个分子标记的群体基因型资料和与其对应每个家系的赤霉病抗性鉴定的病穗率进行连锁分析，单向方差分析测得与赤霉病抗性不相关的概率P值，P＜0.05的分子标记即与一个主效基因位点连锁，抗赤霉病侵染主效基因位点的位置由分子标记的染体位置确定在望水白中发现P＝0.005的标记Xgwm539、P＝0.0042的标记Xbarc184、P≤0.0001的标记Xbarc056、P＝0.0014的标记Xgwm408及P＝0.0014的标记Xgwm537与抗侵染主效基因位点紧密连锁，即获得小麦望水白抗侵染主效基因位点QFhs.nau-2d，QFhs.nau-4a，QFhs.nau-5a，QFhs.nau-5b，QFhs.nau-7b2的标记定位。或者对有主效基因位点的连锁群用Map Manager QTX软件进行区间作图分析，曲线峰值位置即为一个主效基因位点，由标记Xbarc056定位可获得望水白抗侵染主效基因位点QFhs.nau-5a。有益效果本发明所提供的小麦望水白抗赤霉病侵染主效基因位点及其分子标记，具有以下优点(1)本发明在国际上首次获得定位了小麦品种望水白中的5个抗赤霉病侵染的主效基因位点，它们共同可解释79.8％的赤霉病抗性。小麦基因组巨大，是水稻基因组大小的40倍，对小麦抗赤霉病主效基因位点的精确定位工作居于同领域前列；(2)主效基因位点位置明确，鉴定方便。通过检测与这些抗侵染主效基因位点连锁的分子标记，可以确定有无抗赤霉病侵染主效基因位点并预测小麦植株的赤霉病抗性，进而快速筛选抗病品种或品系用于小麦育种。主效基因位点的检测方便快速，不受环境影响；(3)辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统育种方法中，首先要收集具有抗病基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交，而且要对赤霉病抗性进行单株选择。对小麦赤霉病进行表型鉴定要等到扬花期，受到较大的环境影响，表型鉴定的结果可靠性低。因此抗病育种不仅费时，而且难度大，成本高。通过检测抗赤霉病主效基因位点，可以在苗期就鉴定出高抗赤霉病的单株，淘汰其它植株，不仅节约生产成本而且大大提高抗赤霉病小麦的选择效率。
通过鉴定上述主效基因位点来预测小麦植株抗性，预计可迅速提高我国小麦抗病品种的育种进程。
表1.标记引物的序列及扩增片段大小片段大标记左端引物序列 右端引物序列小(bp)Xgwm539 CTGCTCTAAGATTCATGCAACC GAGGCTTGTGCCCTCTGTAG 157Xbarc184TTCGGTGATATCTTTTCCCCTTGA CCGAGTTGACTGTGTGGGCTTGCTG 210Xbarc056GCGGGAATTTACGGGAAGTCAAGAAGCGAGTGGTTCAAATTTATGTCTGT 120Xgwm408 TCGATTTATTTGGGCCACTG GTATAATTCGTTCACAGCACGC188Xgwm537 ACATAATGCTTCCTGTGCACCGCCACTTTTGTGTCGTTCCT 235表2.望水白抗侵染主效基因位点的单向方差分析病穗率主效基因位点标记P R2(％)QFhs.nau-2d Xgwm539 0.005 11.4QFhs.nau-4a Xbarc1840.0042 11.7QFhs.nau-5a Xbarc056≤0.0001 22.3QFhs.nau-5b Xgwm408 0.0014 13.5QFhs.nau-7b2Xgwm537 0.0014 14.2P表示与赤霉病抗性不相关的概率，P＜0.05表明该标记与赤霉病抗性紧密连锁R2位点对赤霉病抗性的贡献率，值越大表明与赤霉病抗性越相关
权利要求
1.小麦望水白抗赤霉病侵染主效基因位点，其特征在于主效基因位点QFhs.nau-2d，由标记Xgwm539定位，左端引物序列 CTGCTCTAAGATTCATGCAACC右端引物序列 GAGGCTTGTGCCCTCTGTAG扩增片段157bp，该主效基因位点位于小麦望水白2D染色体，利用Data deskv.5.0软件测得与赤霉病抗性不相关的概率P值为0.005，对赤霉病抗性的贡献率11.4％；主效基因位点QFhs.nau-4a，由标记Xbarc184定位，左端引物序列 TTCGGTGATATCTTTTCCCCTTGA右端引物序列 CCGAGTTGACTGTGTGGGCTTGCTG扩增片段210bp，该主效基因位点位于小麦望水白4A染色体，利用Datadesk v.5.0软件测得与赤霉病抗性不相关的概率P值为0.0042，对赤霉病抗性的贡献率11.7％；主效基因位点QFhs.nau-5a，由标记Xbarc056定位，左端引物序列 GCGGGAATTTACGGGAAGTCAAGAA右端引物序列 GCGAGTGGTTCAAATTTATGTCTGT扩增片段120bp，该主效基因位点位于小麦望水白5A染色体，利用Data deskv.5.0软件测得与赤霉病抗性不相关的概率P值小于0.0001，对赤霉病抗性的贡献率22.3％；主效基因位点QFhs.nau-5b，由标记Xgwm408定位，左端引物序列 TCGATTTATTTGGGCCACTG右端引物序列 GTATAATTCGTTCACAGCACGC扩增片段188bp，该主效基因位点位于小麦望水白5B染色体，利用Datadesk v.5.0软件测得与赤霉病抗性不相关的概率P值为0.0014，对赤霉病抗性的贡献率13.5％；主效基因位点QFhs.nau-7b2，由标记Xgwm537定位，左端引物序列 ACATAATGCTTCCTGTGCACC右端引物序列 GCCACTTTTGTGTCGTTCCT扩增片段235bp，该主效基因位点位于小麦望水白7B染色体，利用Datadesk v.5.0软件测得与赤霉病抗性不相关的概率P值为0.0014，对赤霉病抗性的贡献率14.2％。
2.根据权利要求1所述的小麦望水白抗赤霉病侵染主效基因位点，其特征在于这些主效基因位点是通过以下方法获得标记定位的(1)小麦品种望水白(♀)与南大2419(♂)进行杂交得到杂种F1，F1自交产生F2，然后采用单粒传方法(SSD)获得F6代的重组自交系；(2)用SDS法提取重组自交系群体各株系的DNA，采用简单重复序列标记SSR对两亲本进行多态性筛选，PCR在PE9600扩增仪上进行，扩增产物在8％(g/ml)聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离分析，根据分子标记筛选结果，筛选出亲本间有多态的引物，亲本间有多态的引物在重组自交系群体中进行分析，PCR扩增程序同上，获取群体基因型资料；(3)根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建小麦的遗传图谱，所用软件为Mapmaker 2.0，最小LOD值设为3，获得连锁图谱；(4)扬花期接种赤霉病病原菌，对重组自交系每个家系进行赤霉病抗性鉴定，获得重组自交系每个家系的病穗率；(5)利用Data desk v.5.0软件对各个分子标记的群体基因型资料和与其对应每个家系的赤霉病抗性鉴定的病穗率进行连锁分析，单向方差分析测得与赤霉病抗性不相关的概率P值，P＜0.05的分子标记即与一个主效基因位点连锁，抗赤霉病侵染主效基因位点的位置由分子标记的染色体位置确定在望水白中发现P＝0.005的标记Xgwm539、P＝0.0042的标记Xbarc184、P≤0.0001的标记Xbarc056、P＝0.0014的标记Xgwm408及P＝0.0014的标记Xgwm537与抗侵染主效基因位点紧密连锁，即获得小麦望水白抗侵染主效基因位点QFhs.nau-2d、QFhs.nau-4a、QFhs.nau-5a、QFhs.nau-5b、QFhs.nau-7b2的标记定位；或者对有主效基因位点的连锁群用Map Manager QTX软件进行区间作图分析，曲线峰值位置即为一个主效基因位点，由标记Xbarc056定位可获得望水白抗侵染主效基因位点QFhs.nau-5a。
3.权利要求1或2所述小麦望水白抗赤霉病侵染主效基因位点的分子标记，其特征在于望水白中位于2D、4A、5A、5B和7B染色体上的抗赤霉病侵染主效基因位点QFhs.nau-2d、QFhs.nau-4a、QFhs.nau-5a、QFhs.nau-5b和QFhs.nau-7b2的分子标记分别为Xgwm539、Xbarc184、Xbarc056、Xgwm408和Xgwm537。
全文摘要
本发明提供了小麦望水白抗赤霉病侵染主效基因位点及其分子标记，属于分子遗传学领域。对小麦品种望水白(♀)与南大2419(♂)杂交获得的重组自交系的各个家系的基因型和各家系的病穗率进行遗传连锁分析，获得望水白抗赤霉病侵染主效基因位点QFhs.nau－2d、QFhs.nau－4a、QFhs.nau－5a、QFhs.nau－5b和QFhs.nau－7b2。通过检测望水白及其衍生品种(系)中是否含有该主效基因位点，可预测其赤霉病抗性水平，大大提高抗赤霉病小麦的选择效率。
文档编号C07H21/00GK1462808SQ0313196
公开日2003年12月24日 申请日期2003年6月23日 优先权日2003年6月23日
发明者马正强, 林峰, 孔忠新 申请人:南京农业大学