专利名称：用于治疗分枝杆菌感染的组合物的制作方法
技术领域：
本发明应用于免疫学领域-具体地说应用于控制由分枝杆菌引起的传染病-基于使用含有抗体的制剂，通过粘膜和其它途径施用，其具有预防和治疗作用。
现存分枝杆菌生物中，我们发现证明对动物和人都危险的病原体，包括结核分枝杆菌(Mycobacterium)，其引起肺结核，麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)，引起麻风病，鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)和胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracelulare)，其在免疫缺陷患者中引起肺结核，以及在人类中引起频率少得多的疾病的其它分枝杆菌(Sommer HM，Good RCMycobacterium.InManual of clinical Microbiology，4thEd.Washington D.CA society for Microbiology；1985.p.216-248.，Orme IM.Immunity to mycobacteria.Current Opinion inImmunology.1993；5497-502)。
在动物的情况下，鸟分枝杆菌副结核亚种，其引起反刍动物的Jones病(Jones Disease)，和牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)，其引起牛肺结核，尤其值得注意(Dannenberg Am.Pathogenesis ofTuberculosisnative and acquired resistance in animals andhumans.InLeive L，Schlesinger D(eds).Microbiology.1984，p.344-354)。
在影响人的最重要分枝杆菌疾病中，肺结核(TB)感染构成了全世界的健康关注并且是与传染病相关的主要死亡原因，尽管使用了BCG疫苗并设计了很多药物来控制它(Dolin PJ，Rayiglione MK，Kochi A.Global tuberculosis，incidence and mortality during 1990-2000.Bull Who.2001；72213)。
据估计世界人口的三分之一已经感染了结核分枝杆菌。每年，全世界8百万人发展为活动的TB和3百万人死于它。人免疫缺陷病毒(HIV)协同感染代表了百分之3至5的病例(Dolin PJ，Raviglione MK，Kochi A.Global tuberculosis，incidence and mortality during1990-2000.Bull Who.1994；72213)。
该疾病重要的传播迫使发展新的和更好的诊断方法，以及疫苗和治疗剂的开发(Collins FM.TuberculosisThe Return of an OldEnemy.Critical Reviews in Microbiology.1993；191-16)。
关于治疗，它在于以相对高剂量施用药物和施用延长的时间的组合，其引起致使受控治疗程序的实行困难的相关毒性(McCarthy M.Experts see progress in fight against tuberculosis.Lancet.2002；3592005)。在这方面，将期望缩短治疗周期，和由此利于控制程序的应用和完成，其将防止抗性菌株的出现。施用的药物剂量降低也将证明对降低综合治疗的毒性有用。
对具有多药抗性菌株和携带它们的很多患者的出现，以及不断增长的预示将来出现的病例的关心在增加，这要求开发新的治疗替换物(McCarthy M.Experts see progress in fight against tuberculosis.Lancet.2002；3592005；Hopwell PC.Tuberculosis ControlHowthe world has changed since 1990.Bull.World Health Org 2002，80427，Freire M，Rosigno G.Joining forces to develop weaponsagainst TBtogether we must.Bull.World Health Org 2002，80429)。
除此之外，存在对人引起无充分治疗方法的疾病的许多种分枝杆菌。
卡介苗是用于人的唯一现存疫苗。在全世界，已经施用3×1012的剂量。根据采用的菌株-其营养状况、其遗传背景、其已经历的老化过程和并发感染的存在，其功效变化很大。认为它仅对影响婴儿的严重形式疾病(粟疹和脑膜形式)的预防有效，对肺结核的预防无效，因此急需开发新疫苗(Hirsch LS，Johnson-JL，Ellner JJ.Pulmonarytuberculosis.Curr-Opin-Pulm-Med1999；5(3)143-50；Jacobs GG，Johnson JL，Wallis RS.Tuberculosis vaccineshow close to humantesting.Tuber Lung Did 1997；78159-169；Ginsberg AM.What’snew in tuberculosis vaccines？Bull.World Health Org 2002，80483)。
基本上由THl亚群引起的细胞介导的免疫反应在对抗结核分枝杆菌，和抗一般的分枝杆菌中的决定性作用已经被认可并构成该感染不可避免具有之的国际法则(Specificity and Function of T-andB-cell Recognition in TuberculosisPathogenesis，Protectionand Control.J infect.Dis.1994；30117-135)。
按照这个理由，用于对抗肺结核和其它分枝杆菌的新疫苗开发中利用的所有接种策略旨在刺激这种免疫反应机制(Ginsberg AM.What’s new in tuberculosis vaccines？Bull.World Health Org 2002，80483)。然而，尚未广泛研究特异性抗体在对抗分枝杆菌中可能起的作用(Glatman A.Casadevall A.Serum therapy for tuberculosisrevisitedreappraisal of the role of antibody mediate immunityagainst Mycobacterium tuberculosis.Clin Microbiol Rev.1998；11514-532)。
分枝杆菌生物通过粘膜穿透身体；这意味着分泌物中特异性抗体的存在可能构成这些微生物穿透的屏障，预防感染。而且，来自粘膜、血液或生物的其它部分的特异性抗体到达存在感染的部位可能具有治疗作用。
迄今为止，在动物和人进行的包括使用含有多克隆抗体的血清和制剂注射施用的治疗工作尚未产生决定性的结果(Glatman A.Casadevall A.Serum therapy for tuberculosis revisitedreappraisal of the role of antibody mediate immunity againstMycobacterium tuberculosis.Clin Microbiol Rev.1998；11514-532)。
在十九世纪末和二十世纪初对人类进行研究的情况下，采用的血清总是从其它物种获得的，很少给出关于它们的提取形式、它们的强度等细节，并且进行的调查缺乏允许获得有效结论的方法学和统计学严密性(Glatman A.Casadevall A.Serum therapy for tuberculosisrevisitedreappraisal of the role of antibody mediate immunityagainst Mycobacterium tuberculosis.Clin Microbiol Rev.1998；11514-532)。
与未经处理的动物相比，给小鼠施用气雾形式的微生物之前，结核分枝杆菌与单克隆抗体、antilipoarabinomannan预孵育延长了生存率，尽管它没有减少研究的器官中微生物的数量(Teitelbaum R.Glatman-Freedman A，Chen B，Robbins JB，Unanue E，CasadevallA，Bloom B.A mAb recognizing a surface antigen of Mycobacteriumtuberculosis enhances host survival.Proc Natl Acad Sci USA.1998；9515688-15693；US Patent Application 20010007660)。值得注意的是，当评价“体内”通过腹膜施用该抗体的效果时，没有检测到有益效果。
前述策略最主要的缺点之一是使用含有从其它物种获得的抗体的血清和制剂，其中抗原识别不同，因为来自非人物种的抗体的类型和亚类不利用人类的所有抗体依赖性、免疫效应机制，大大降低了它们的有效性。在伴随施用异源蛋白中发现了另一个缺点，它引起血液疾病，全身消肿的严重并发症，尤其是关节和肾，和由于受体产生的抗物种抗体的反应造成抗体失活，导致采用制剂的抗微生物活性丧失。
除了这些缺点，单克隆抗体具有将它们的作用限于仅与一种微生物抗原的一个表位的缺点，它降低了它们的抗微生物潜力和采用它们抗各种类型分枝杆菌的可能性。这些要素的组合使得这些策略效率低和在实践中危险。
本发明的目标是开发含有人抗体的制剂，单独或与待通过粘膜以及其它途径施用的免疫增效剂、免疫调制剂、灭活或减毒菌株、抗原、基因和/或药物组合预防或治疗由分枝杆菌引起的感染。
使用的抗体制剂由下列组成●通过任何已知、现有技术方法获得的IgG人抗体，如乙醇沉淀、离子交换层析和病毒灭活阶段。
●IgA分泌型和含乳铁(lactoferrous)的人抗体，由初乳通过任何已知、现有技术方法获得。
●提及的制剂的混合物所有制剂是从大量个体获得的，并且在它们采用之前，检测样品中对结核分枝杆菌抗原特异性的高浓度抗体和BCG的存在。意外地，获得了抗分枝杆菌抗原的广泛活性，允许在预防和治疗由这种类型微生物引起的广谱感染中使用这种类型制剂，特别是细菌种类成分中抗原的广泛交叉反应性。
这些制剂可以用于有分枝杆菌感染风险的群体的预防，如接触患者的群体(包括亲戚、朋友、专业人员等等)，或尤其是预先有接触这些感染倾向的那些患者，如HIV携带者的情况，他们更易感分枝杆菌感染，包括结核分枝杆菌引起的和特别是鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌引起的感染，这些分枝杆菌通过摄取食物经由胃肠系统穿透生物，这些感染抵抗治疗并且构成这群患者的主要死亡原因之一。
另一方面，这些制剂对治疗确定的感染具有治疗价值，使得施用抗体制剂可能具有治疗作用以及减少感染敏感菌株的患者的治疗周期-这是非常重要的，因为当前的治疗漫长，证明对患者有损害并妨害公众卫生系统的工作；其风险没有正确追踪造成治疗毒性增加，可以导致对药物制剂有抗性的菌株出现，或其在携带对特殊药物具有多种抗性的菌株的患者中应用，这是不断增长的全球现象，当前没有治疗替换方法。
代表本发明的制剂在采用鼻内模型的小鼠中引起BCG肺感染水平明显减少(实施例2)。在IgG抗体制剂中，在它们通过腹膜施用后也获得了预防和治疗作用。在所有施用该抗体的方法中，已经证明了抗体有效通过支气管和唾液分泌物。微生物与采用的制剂预先孵育后达到肺感染的抑制(实施例2)。
从血浆或初乳获得的人丙种球蛋白制剂显示了靶向完全的BCG细胞和结核分枝杆菌抗原的抗体的存在(实施例1)；这暗示所产生的免疫作用不能与特别靶向一种抗原的抗体相联系，很多不同抗原的同时识别是这些类型制剂的优良品质，它来自制剂中存在的每种类型的特异性抗体的抗菌活性。
本发明的另一个目的是所提及的制剂用于预防和治疗由任何类型分枝杆菌引起的人的感染的用途，包括引起肺结核、麻风病和其它的分枝杆菌，以及它们通过粘膜施用，包括注射和鼻内方法。
本发明也涉及另外含有任何类型天然、重组、合成等的免疫增强剂和/或免疫调制剂的制剂，以及含有减毒或灭活菌株的制剂，或含有抗原或其等同物，或已知具有抗分枝杆菌活性的药物的制剂。
本发明提供了治疗和预防由分枝杆菌引起的疾病的新方法，通过“体内”使用含有IgG和IgA类人抗体的制剂。IgA分泌型抗体的使用特别新颖，迄今为止其它作者未曾提及。当全身和通过粘膜施用时证明所述制剂有效同样是新的。
本发明通过得到的结果证明了人抗体如何在″体内″预防和治疗分枝杆菌感染中起作用，这是惊奇的事实，因为现有技术中抗体不是被描述为分枝杆菌感染的抑制剂，和认为仅仅细胞介导的保护机制是相关的。
将通过下列具体的实施例描述本发明实施例1.丙种球蛋白的分布动力学来自同源基因Balb/c库，8至10周龄和体重20至22克，由国家实验动物生产中心(CENPALAB)，哈瓦那，古巴供给的雄性小鼠用于实验。给它们接种日本BCG实验室生产的日本(东京)BCG菌株，和通过Cadiz和同事们所述方法(Cadiz A.Fernandez J.Joo L.Moya A.Modifications to the alcoholic fractioning method employed inCuba for the production of immunoglobulines for intravenous use.Vaccimotor 1998；72-7)获得的人丙种球蛋白制剂。如表1所示，I和II组的动物分别通过腹膜内和鼻内施用人丙种球蛋白(IgG)，从属于每组的四只不同动物中连续抽取血清、唾液和气管支气管分泌物样品。对接受鼻内IgA抗体制剂的动物进行相似的实验。
表1.人丙种球蛋白在Balb/c小鼠中的分布动力学的实验设计
完整细胞ELISA测试后表明每份样品中抗牛分枝杆菌抗原的抗体的存在。人丙种球蛋白IgG制剂中检测到抗BCG表面抗原的抗体，滴度(titer)4096。在含有IgA抗体的制剂的情况下，也检测到特异性抗体。在I组中，第一时期(1小时)抽取的血清样品具有滴度5120的抗体，2小时后增加到20480，3小时后减少到2560，并保持稳定直到实验结束(5小时)。在唾液样品的情况下，结果相似，滴度20、1280、0和0。气管支气管分泌物中没有检测到抗体的存在，直到过去了2小时，滴度80，3小时后减少到40，实验结尾(5小时)达到20的值。如所见到，对应于血清、唾液和气管支气管分泌物样品的抗体滴度的最大值分别是20480、1280和80。
图1示出了这些结果。
在鼻内接种IgG丙种球蛋白制剂的属于II组的动物(图2)中，在实验不同时间，血液中没有检测到特异性抗体的存在，尽管在实验第一个小时期间抽取的气管支气管分泌物中检测到滴度160的抗体。比较关于接种方法的结果，观察到仅当腹膜内接种丙种球蛋白时，血液样品中显示特异性抗体的存在。在唾液样品中，当腹膜内进行接种时，观察到更高滴度值，该结果与这些动物血液中存在高水平抗体有关。在气管支气管分泌物中，当鼻内进行接种时获得更高的抗体滴定度值。该研究证明两种施用方法中，识别BCG的抗体聚集在这些动物的粘膜中。
在鼻内施用IgA抗体制剂的情况下，其分布模式类似于用相同方法施用IgG制剂得到的模式。
实施例2.攻击(challenge)实验使用IgG和IgA分泌型抗体制剂，进行攻击实验。使用的设计在表3示出。
表3.在Balb/c小鼠中使用BCG的攻击实验设计
第I组动物用作阴性对照组并用0.1mL戊巴比妥钠(IMEFA)，每公斤重量50mg通过静脉内麻醉。随后给它们鼻内接种含0.5×106个细胞的BCG的50μL Sauton溶液。根据鼻内感染模型，使用自动微吸管(Plastomed)给它们施用25μL/鼻腔。用人丙种球蛋白腹膜内处理属于II组的小鼠，每克体重1mg。给III组的小鼠鼻内接种含1mg丙种球蛋白的20μL溶液。2小时后，鼻内施用0.5×106个细胞的BCG“攻击”属于II和III组的动物。给IV组的动物鼻内接种50μL与人丙种球蛋白预孵育的BCG。为了完成这点，0.5×106个细胞的BCG与每毫克人丙种球蛋白孵育，室温下轻轻搅拌4小时的时间。混合物以5585rcf离心10分钟，沉淀重悬于500μL PBS中并以同样方式再次离心，最后以10×106个细胞/mL重悬。然后在感染后24小时杀死所有动物，在无菌条件下取出它们的右肺进行分枝杆菌分析，进行每毫克组织的集落形成单位数量(CFUs/毫克组织)的计算。
在含有IgA抗体的制剂的情况下，鼻内施用给一组动物，遵循施用IgG抗体的制剂情况下采用的方法，其也在施用给一组动物前，BCG的预孵育中使用。I和III组分别采用腹膜内和鼻内接种含有IgG抗体的制剂(表2)。利用的丙种球蛋白剂量与动力学实验中使用的相同。这之后，用BCG“攻击”动物。如我们在图3中所见，比较从I组动物(阴性对照)和其余组获得的CFUs，存在显著性差异(p＝0.01)。发现从II、III和IV组获得的CFUs数量之间没有显著性差异。在鼻内接受IgA抗体制剂的动物组和接种与这种制剂预孵育的BCG的动物组得到了相似的结果。这些结果提示在它们接种后或接种前，对BCG特异性的抗体的相互作用，通过抑制或阻断微生物进入，通过抑制它们增殖，以及通过不同机制最终消灭它们而发挥着保护性作用。攻击实验证明了两种制剂提供了相似水平的保护。
所建议溶液的优点这些类型的制剂具有从人类获得的优点，为我们免去了物种间免疫不相容性相关的困难(由于物种对它的反应等造成血液患病、制剂活性降低)和确保属于相同物种和所有IgG和IgA亚类的抗体的存在，这些保证了将动员依赖于物种可利用的抗体的所有免疫机制(中和、调理、补体固定、ADCC等等)，产生最佳的抗微生物活性。
这种类型制剂的另一个优点是它含有IgA分泌型抗体，这确保微生物的穿透遭受阻断或抑制活动。由于分泌型成分的存在，这种类型抗体非常稳定并且在分泌物内具有长半衰期，使得其抗菌作用更加有效。制剂中存在人乳铁蛋白(lactoferrin)，这与初乳中提纯它之后连同IgA分泌型抗体一起出现，由于乳铁蛋白对可吸收铁作用决定的已知的广泛抗菌作用，给该制剂赋予了另外的抗微生物活性。
另一个优点是低水平的不良反应，包括不存在病毒灭活特殊时期的病毒传播。重要地，这些制剂表现出预防活性，通过在粘膜水平阻断微生物穿透而发挥，和通过不同类型抗体的联合作用而发挥的治疗活性，该抗体与很多抗原反应，发动多种多样的抗微生物机制。
通过粘膜施用该制剂确保在微生物进入部位导入制剂的不复杂和通用方法，有利于感染的抑制和因此利于制剂的预防作用，以及容易接近感染组织(肺、肠等等)，也有利于对确定的感染发挥的治疗作用。
考虑的另一个优点是发挥抗不同类型分枝杆菌的广谱活性，这由存在抗体的高滴度和这些抗体的广泛交叉反应性，以及它们从具有抗其生物体中分枝杆菌的高滴度抗体的供体提取做保证，这确保了高水平的特异活性。
附图简述图1.腹膜内给Balb/c小鼠施用人丙种球蛋白的分布动力学。数值代表在实验每个时间抽取的样品中发现的平均滴度值，通过完全BCG细胞的ELISA试验确定。
图2.鼻内给Balb/c小鼠施用人丙种球蛋白的分布动力学。数值代表在实验每个时间抽取的样品中发现的平均滴度，通过完全BCG细胞的ELISA试验确定。
图3.使用鼻内施用BCG的Balb/c小鼠的攻击实验结果。该值代表所研究的每个组计算的CFUs/器官的平均数量。第1组的动物(阳性对照)鼻内接种BCG，在鼻内施用BCG“攻击”前，属于第2组和第3组的动物分别鼻内和腹膜内接种人丙种球蛋白。第4组动物鼻内接种与人丙种球蛋白预孵育的BCG。
权利要求
1.具有下列特征的抗分枝杆菌的组合物，(a)具有抗分枝杆菌成分活性的IgG或分泌型IgA类或二者的混合物的人多克隆抗体；(b)合适的药物载体；以及(c)最后选自免疫调制剂、任意组合的失活或减毒菌株和乳铁蛋白的组分。
2.根据权利要求1的抗分枝杆菌的组合物，其中人多克隆抗体浓度范围为40-160mg/ml。
3.根据权利要求1的抗分枝杆菌的组合物，其中乳铁蛋白浓度范围为10-20mg/ml。
4.根据权利要求1的抗分枝杆菌的组合物，具有两种抗体比率为50∶50-80∶20的混合物。
5.根据权利要求1的抗分枝杆菌的组合物，所述的免疫调制剂是免疫增效剂。
6.根据权利要求1的抗分枝杆菌的组合物，所述的免疫调制剂是选自天然、重组、合成或基因之组。
7.根据权利要求1的抗分枝杆菌的组合物，其中灭活或减毒菌株的组合包括表达异源抗原和/或编码所述抗原的基因的菌株。
8.根据权利要求1至8的组合物在预防和治疗由分枝杆菌引起的疾病中的应用。
9.根据权利要求1至8的组合物与具有抗分枝杆菌活性的药物组合的用途。
全文摘要
本发明涉及免疫学领域，具体地说涉及由分枝杆菌引起的传染病的治疗，其通过粘膜和其它途径施用抗体组合物，用于预防和治疗所述疾病。本发明涉及具有抗分枝杆菌抗原的特异活性的IgG类、IgA分泌型或二者的混合物的人抗体组合物的制备用于预防和治疗由这种类型微生物引起的感染。本发明组合物证明了其防止“体内”分枝杆菌感染的能力。
文档编号C07K16/12GK1756565SQ200380109162
公开日2006年4月5日 申请日期2003年11月25日 优先权日2002年11月25日
发明者A·阿科斯塔多明格斯, M·E·萨缅托加西亚圣米格尔, Y·洛佩斯埃尔南德斯, J·F·因方特布尔扎克, A·卡迪斯拉亨斯, G·法莱罗罗德里格斯, V·G·谢拉冈萨雷斯, M·B·马丁内斯贝尼特斯 申请人:血清疫苗研究生产中心芬雷学院