专利名称：牛初乳中乳铁蛋白的分离纯化技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从牛初乳中分离纯化乳铁蛋白的方法，特别是建立了一套适合工业化生产乳铁蛋白的新技术。该技术具有生产成本低，操作简单，无污染，不改变乳铁蛋白活性等特点，生产的乳铁蛋白纯度可达85％以上，乳铁蛋白的得率在70％以上。
乳铁蛋白(Lactoferrin，简称Lf)是富含在初乳中的一种功能因子，它最初于1939年由Sorensen等在动物乳中发现，1953年Polis等在制备乳过氧化物酶时得到了它的粗制品，1960年Johansson和Montreuil等从人乳中首次分离出Lf。Lf因最先在乳汁中被发现而得名，后来的研究表明，它也广泛存在于动物体的泪液、唾液、汗液、胰液、胆汁、精液等内、外分泌液中，只是在乳汁中含量较高，如牛初乳中的Lf质量浓度为1g/L，而在其它分泌物中含量甚微。近代研究证明，Lf具有许多独特的生物学功能增强铁的传递和吸收；广谱的抗菌性；免疫作用；抗氧化作用；促进肠道菌群的平衡；作为生长因子；抗炎症；抗病毒；抗癌症作用等。对Lf的分离、加工、综合利用的研究，已经成为食品界，特别是乳品界关心的热点。
Lf是一种铁结合性糖蛋白，属于转铁蛋白家族。分子的主体是一个大约有700个氨基酸残基构成的、相对分子质量约为80,000Da的单肽链，并连接1～2个配糖体，其组成包括甘露糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸、岩藻酸等。牛乳Lf由703氨基酸构成，等电点在8.0。
由于Lf具有一些非凡的生理功能，自1960年以来人们就试着采用各种方法来制备Lf，人乳中Lf含量虽然丰富，但是依靠从人乳中提取Lf并不现实。商用Lf通常从牛乳中分离提取，特别是牛初乳和乳清，资源丰富，可实现规模化、商品化生产。物料的前期处理方法基本相同，都是采用新鲜牛初乳通过离心脱去脂肪(4℃，3000rpm，30min)得到脱脂乳，将脱脂乳稀释后，边搅拌边向其中加入1M盐酸溶液调整脱脂乳的pH值到4.6(酪蛋白的等电点)，室温放置30min，离心除去酪蛋白(4℃，3000rpm，30min)，得到的上清就是我们需要的乳清(或直接运用生产奶酪的副产物乳清)，用它来分离Lf。
乳铁蛋白的分离纯化方法较多，常见的有吸附色谱法、亲和色谱法、固定化单克隆抗体法、超滤法、盐析法、离子交换法等。吸附色谱法是利用固相吸附剂通过与蛋白质分子相结合，利用不同物质和吸附剂结合力的差异性而将它们分离，其缺点是吸附容量小、效率低；亲和色谱法亲和色谱是一种新兴的分离技术，它用来生产高纯度的Lf，该方法分离效果好纯度高，且没有生物活性损失，是生产医药用高纯度Lf最有效的方法之一，其缺点是成本昂贵，难以工业化生产；固定化单克隆抗体法该方法实际上是利用抗原-抗体之间的高特异性结合反应而实现目标物的分离。载有单克隆抗体的免疫色谱是一种亲和力色谱法，它较成功的实现了Lf的一步分离，回收率达到97％，该方法的优点是分离效果好纯度高，抗体被固定可重复使用，其缺点是柱的制备工艺复杂，抗体成本昂贵(1000美元/克)，难以工业化生产；超滤法超滤是一种基本的膜分离技术，其原理是根据膜孔径不同可以实现不同分子质量和分子形状的大分子物质的分离，由于超滤法提供了不加热或不发生相变进行大分子质量组分的浓缩、分离的机会，非常适合热敏性的功能性组分的分离，但膜的污染和产品纯度较低难以满足生产的要求。盐析法盐析法通常是利用饱和硫酸铵沉淀乳铁蛋白，该方法尽管生产成本简单，但由于乳清中添加硫酸铵带来了污染，产品的纯度也较低，制约了其应用。离子交换法该方法原理是根据离子交换剂对不同的离子或离子化合物的结合力不同而实现目标物质的分离。Grove最早使用DEAE纤维素阴离子交换树脂分离出较纯的Lf成分，此后，他又开发出磷酸纤维素交换色谱法，并由Foley等对此法加以改进，得到的Lf的纯度为81％左右；羧甲基阳离子交换色谱法被应用于Lf和乳过氧化氢酶的分离。树脂能用0.2MNaOH和0.2MHCl再生，此法较DEAE纤维法更有效。尽管有人在尝试运用离子交换法生产乳铁蛋白，但由于所选树脂的种类、性能不同、交换条件不同，未能完全实现工业化生产。
本发明的目的在于建立一套适合工业化从牛初乳中分离纯化乳铁蛋白的方法，纯化的乳铁蛋白纯度可达85％以上。
综合国内外的文献资料可知，乳铁蛋白的分离纯化工艺复杂，产品的纯度较低，产品的价格高，难以商品化。本发明选用羧甲基阳离子交换树脂，采用分批交换的方法，结合超滤脱盐和冷冻干燥工艺成功地建立了适合工业化生产乳铁蛋白的方法。该技术的主要特点为①所选树脂符合食品卫生生产要求，分离纯化乳铁蛋白后，原料乳可继续利用，无任何污染。
②该技术的工艺简单，设备投资低，适合工业化生产。
③该技术生产的乳铁蛋白，较好的保持了乳铁蛋白的活性，生产出的乳铁蛋白纯度较高，可以满足食品及医疗行业的需要。
具体实施条件与发明制作方案1、牛初乳离心脱脂(3000rpm，30min)，用1M的HCl调pH至4.6，沉淀酪蛋白，离心(3000rpm，30min)，得乳清备用；2、树脂活化，根据需要称取一定量树脂，用去离子水浸泡(常温下1-2天，或沸水1-2小时)，再浸泡于10％NaCl溶液中，配制成Na型树脂；3、用1MNaOH将乳清pH调至5-8，加入Na型阳离子交换树脂，于0-50℃搅拌2-20h，用滤布抽滤分离树脂，用去离子水洗除杂蛋白，再用0.1-15％盐溶液(NaCl，KCl，CaCl2，MgCl2，NaCO3等)洗脱树脂，洗脱液超滤脱盐。浓缩液冷冻干燥得乳铁蛋白。
4、可用ELISA方法检测乳清中乳铁蛋白的交换情况，检测树脂的洗脱情况。产品经SDS-PAGE进行电泳，用凝胶成像系统分析其纯度。
为了更加清楚的说明本发明，下面结合实施例进行详细说明实施例1称取2g CM-SEPHAROSE FF(PHARMACIA)树脂，加入200mL去离子水浸泡24h，收集树脂浸泡于10％的NaCl溶液中30min，制备成Na型树脂。将树脂加入5L脱脂乳清液中(pH值为6.9)，于4℃轻轻搅拌交换8小时。用滤布分离收集树脂，经过交换后的脱脂乳清的pH、颜色、气味、感官均未发生变化。
将收集的树脂用pH为6.9去离子水清洗，以除掉杂蛋白，然后再用5％的盐溶液洗脱树脂，用抽滤的方式将树脂和洗脱液分离，收集洗脱液进行超滤脱盐，超滤膜的截留分子量为3-5万，超滤压力为0.15-0.2MPa。经超滤脱盐后的乳铁蛋白浓缩液进行冷冻干燥，收集产品4.01g。产品经电泳分析纯度为86％，得率为69％。
实施例2称取30g SEPABEADS FP-CM13(MITSUBISHI KASEI)阳离子交换树脂进行活化，经平衡后装柱子(直径10cm)，用蠕动泵将2L含10％KCl溶液过柱，然后用去离子水过柱，制备成K型阳离子交换树脂。然后将80L脱脂常乳乳清(pH6.6，4℃)以6L/h流速通过柱子进行交换，经交换过的乳清颜色，味道，均未发生变化。
将交换过的柱子先用去离子水过柱，除去乳清和杂蛋白，接着用15L含12％KCl溶液过柱洗脱乳铁蛋白，收集洗脱液15L。洗脱液经超滤脱盐和冷冻干燥后，得乳铁蛋白7.2g，经检测乳铁蛋白纯度为81％，得率为73％。
实施例3称取5g CM-SEPHADEX C-50(PHARMACIA)树脂，加入400mL去离子水浸泡24h，收集树脂浸泡于10％的NaCl溶液中30min，制备成Na型树脂230mL。将树脂加入20L脱脂初乳乳清液中(pH值为6.8)，于4℃轻轻搅拌交换12小时。用滤布分离收集树脂，经过交换后的脱脂乳清的pH、颜色、气味、感官均未发生变化。
将收集的树脂用pH为6.8去离子水清洗，以除掉杂蛋白，然后先用1％的盐溶液洗脱树脂，以除去结合不牢的杂蛋白，再用5％的盐溶液洗脱树脂，用抽滤的方式将树脂和洗脱液分离，收集洗脱液进行超滤脱盐，超滤膜的截留分子量为3-5万，超滤压力为0.15-0.2MPa。经超滤脱盐后的浓缩液进行冷冻干燥，收集乳铁蛋白产品14.5g。产品经电泳分析纯度为92％，得率为65％。本实施例采用两步法洗脱树脂，产品的纯度有了较大提高，但产品的得率有所下降(产品的得率以初乳中乳铁蛋白含量为1g/L计算)。
权利要求
1.牛初乳中乳铁蛋白的分离纯化技术，该发明是运用离子交换方法制备一种纯度可达85％以上的乳铁蛋白成品，本发明有其特有的技术优势。其特征在于本发明人建立了一套适合工业化生产乳铁蛋白的方法，将活化的弱酸性阳离子交换树脂与脱脂初乳(或初乳乳清)混合，在0-50℃范围内，轻轻搅拌2-20h，用滤布将树脂分离，用去离子水洗脱树脂除去杂蛋白，然后用0.1％-15％的盐溶液(NaCl，KCl，CaCl2，MgCl2，NaCO3等)洗脱树脂，洗脱液用截留分子量为30000-50000的膜超滤脱盐，浓缩液冷冻干燥后得乳铁蛋白产品。该方法具有生产工艺简便，设备简单，无污染，副产物方便利用，保持乳铁蛋白活性，对人体健康无害等特点。
2.根据权利要求1所述，本发明的特征是运用离子交换方法分离纯化乳铁蛋白，运用超滤脱盐技术和冷冻干燥方法制备乳铁蛋白。
3.根据权利要求1所述，本发明所选树脂为弱酸性阳离子交换树脂，交换基团为羧甲基，所选树脂符合食品卫生生产要求，交换条件为0-50℃，pH5-8，时间2-20h，搅拌速度200r/min。
3.根据权利要求1所述，选用滤布(孔径100-600目)分离树脂，采用超滤脱盐(截留分子量为3-5万)方法，具有快速方便等特点，符合工业化生产要求。采用冷冻干燥技术，可以较好的保持乳铁蛋白的活性。
4.根据权利要求1所述，本发明技术生产乳铁蛋白，其特征在于生产工艺简便，设备简单，投资成本低，能耗低，对环境无污染，分离乳铁蛋白后的初乳清，无颜色、味道的改变，可继续开发利用。
5.根据权利要求1、4所述，本发明建立了一套完善的分离纯化乳铁蛋白的方法，具有成本低，操作简单，无污染，不改变乳铁蛋白活性等特点，生产的乳铁蛋白纯度可达85％以上，乳铁蛋白的得率在70％以上。
全文摘要
乳铁蛋白具有多种生物学功能，在食品及医疗行业应用潜力巨大。本发明建立了一套适合工业化的从牛初乳中分离纯化乳铁蛋白的方法，生产的乳铁蛋白具有成本低、工艺简单、设备投资低、无污染、产品纯度高、保持活性好等特点。具体方法为①活化弱酸性阳离子交换树脂，制备成Na或K型；②初乳脱脂，沉淀酪蛋白备用；③在合适的pH和温度下将树脂和乳清混合，轻轻搅拌2－20h；④用滤布将树脂与乳清分离，并用去离子水清洗树脂，除去乳清和杂蛋白；⑤用合适的盐溶液洗脱乳铁蛋白；⑥洗脱液采用超滤工艺脱盐；⑦超滤浓缩液采用冷冻干燥方法干燥得乳铁蛋白产品；⑧运用SDS－PAGE电泳分析产品纯度。
文档编号C07K14/79GK1663961SQ20041008026
公开日2005年9月7日 申请日期2004年9月29日 优先权日2004年9月29日
发明者胡志和, 庞广昌, 张东送, 陈庆森 申请人:天津商学院