一种重组苹果根皮苷糖基转移酶及分离纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种重组苹果根皮苷糖基转移酶及分离纯化方法，属于生物基因工程【技术领域】。该糖基转移酶具有如SEQ.ID.NO.1所示的氨基酸序列。本发明一方面利用生物工程技术，在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达苹果根皮苷糖基转移酶，用于催化生成根皮苷；另一方面采用饱和硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Sephadex-75凝胶过滤色谱等分离纯化方法，具有简单易行，周期短，重复性高，酶蛋白活力高等优点。
【专利说明】一种重组苹果根皮苷糖基转移酶及分离纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物基因工程【技术领域】，具体涉及一种重组苹果根皮苷糖基转移酶及 其分离纯化方法。
【背景技术】
[0002] 根皮苷（Phloridzin)属于二氢查尔酮类，是根皮素（Phloretin)的葡萄糖苷，主 要存在于苹果树的根皮、茎、嫩叶以及苹果果实中，是苹果多酚中最具代表性的一种多酚类 成分，近年来又在多穗柯甜茶中发现了根皮苷的存在。根皮苷除了具有抗菌、抗氧化、清除 体内自由基及保护心脏等生物活性外，最突出的作用就是可以降低血糖。根皮苷专一地、竞 争性地抑制钠离子关联葡萄糖载体（Sodium-linked glucose transporters, SGLTs)对葡 萄糖分子的运输，从而抑制葡萄糖在小肠和肾的吸收。因此，根皮苷可以作为一种潜在的降 糖药物，应用前景广阔。
[0003] 糖基转移酶（glycosyltransferase, GT, EC2. 4. X. y)是专门催化糖基化反应的 酶类，它们将活性糖基从糖基供体转移到糖基受体，形成糖苷键，产物包括寡糖、多糖、各 种复合糖（糖蛋白、糖脂）和糖苷化合物（如花色苷、黄酮糖苷、白藜芦醇糖苷等）。在 CAZy(Carbohydrate Active enzymes Database)数据库中，目前已划分 94 个家族。植物 糖基化的作用是通过增加亲水性改变苷元的溶解性，提供进入膜转运系统的途径。糖基化 通过调节重要细胞代谢物的水平、活性和定位的功能在保持细胞内平衡方面起到很大的作 用。某些糖基化反应参与植物体内激素的平衡调节。另外糖基化还能降低或除去内源和外 源物质的毒性。糖基转移酶具有底物特异性，故植物中含有多种糖基转移酶，如人参皂苷 肋 2葡萄糖基转移酶、葛根素糖基转移酶、红景天苷糖基转移酶、查尔酮糖基转移酶、花青素 糖基转移酶、染料木素糖基转移酶、槲皮素糖基转移酶、甜叶菊苷糖基转移酶等。苹果根皮 苷糖基转移酶存在于苹果树的根皮、茎、嫩叶以及苹果果实中，催化根皮素生成根皮苷。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种重组苹果根皮苷糖基转移酶及分离纯化方法，该方法 利用生物工程技术，在感受态细胞中异源表达苹果根皮苷糖基转移酶，经色谱分离纯化，制 得重组苹果根皮苷糖基转移酶，方法简单易行、周期短、重复性高。
[0005] 本发明是通过以下技术方案来实现：
[0006] 一种重组苹果根皮苷糖基转移酶，该糖基转移酶具有如SEQ. ID. NO. 1所示的氨基 酸序列。
[0007] -种重组苹果根皮苷糖基转移酶，编码所述重组苹果根皮苷糖基转移酶的核苷酸 序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
[0008] 一种重组苹果根皮苷糖基转移酶的分离纯化方法，包括以下步骤：
[0009] 1)采用CTAB法提取苹果叶总RNA，以反转录得到的CDNA为模板，用一对带有酶切 位点的引物FOl和ROl进行PCR扩增，经检测后获取目的基因条带，对PCR产物进行回收；
[0010] 2)将步骤1)得到的PCR产物连接到pMD18-T载体上，采用热激法转化感受态细胞 后，筛选重组子，得到重组质粒；
[0011] 3)对重组质粒双酶切鉴定阳性克隆、测序，得到重组苹果根皮苷糖基转移酶的基 因序列；
[0012] 4)对含有重组质粒的菌体进行异丙基-β -D-硫代半乳糖苷诱导表达，异源表达 产物通过饱和硫酸按沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Sephadex-75凝胶过滤色谱 纯化，再经肠激酶切除载体标签蛋白，获得纯化后的重组根皮苷糖基转移酶。
[0013] 步骤1)所述的引物FOl的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示，引物ROl的核苷酸序 列如SEQ. ID. NO. 4所示；酶切所用的酶为BamH I和Hind III。
[0014] 所述的感受态细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
[0015] 所述热激法转化感受态细胞的具体操作为：
[0016] ①将重组质粒转移至装有感受态细胞的离心管中，轻轻混匀；
[0017] ②冰浴30min后，在42°C热激90s，冰浴3min ;
[0018] ③加入无抗生素的LB液体培养基，在37 °C下振荡培养Ih?3h ;
[0019] ④复苏后的菌液离心，吸取上清液，对留在离心管底部的菌液用移液枪吹打重 悬；
[0020] ⑤用移液枪将重悬菌液移入带有Amp抗生素且在37°C保温的LB固体培养基平板 上，用灭菌的涂布器涂布均匀；
[0021] ⑥将平板倒置于37°C恒温箱中培养12?16h。
[0022] 所述对含有重组质粒的菌体进行异丙基-D-硫代半乳糖苷诱导表达具体操作 为：
[0023] 挑取含有重组质粒的单菌落接种于带有Amp抗生素的液体LB培养基中，在37°C， 200prm下振荡培养过夜，再按1 %的体积比接种到带有Amp抗生素的新鲜LB培养基中， 在37°C，180rpm下，振荡培养至0D600达0. 6?I. 0 ;加入异丙基-β -D-硫代半乳糖苷， 在20°C下诱导4h ;经离心收集菌体，菌体用生理盐水洗涤，再加入细胞缓冲液，进行超声破 碎，然后在4°C，12000rpm下离心lOmin，得到粗酶液I。
[0024] 所述饱和硫酸铵沉淀具体操作为：
[0025] 冰浴下，向粗酶液I中加入（NH4)2SO4粉末至（NH 4)2SO4终质量浓度为30%，搅拌均 匀后离心，取上清液，继续加入（NH 4)2SO4粉末至（NH4)2SO 4终质量浓度为70%，搅拌均匀后， 4°C静置lh，然后离心取沉淀；将沉淀用缓冲液溶解后用30kDa超滤离心管进行酶液的浓缩 和脱盐，得到粗酶液II。
[0026] 所述DEAE-Sepharose阴离子交换层析的具体操作为：
[0027] 将粗酶液II过0. 22 μ m的滤膜，然后采用AKTA蛋白纯化系统，用NaCl以lmL/min 进行线性洗脱，检测各个洗脱峰的糖基转移酶酶活，将有酶活的部分进行合并收集，转入透 析袋，用PEG20000在4°C进行浓缩，得到酶液III。
[0028] 所述Sephadex-75凝胶过滤色谱纯化具体操作为：
[0029] 将酶液III注射到AKTA蛋白纯化系统，使用Sephadex-75凝胶柱进行纯化，用缓冲 液以lmL/min流速进行洗脱，检测各个洗脱峰的糖基转移酶酶活，合并收集有酶活的部分， 转入透析袋用PEG20000在4°C进行浓缩。
[0030] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0031] 本发明公开了克隆得到的苹果根皮苷糖基转移酶基因序列全长1452个碱基对， 该基因编码483个氨基酸。
[0032] 本发明一方面利用生物工程技术，在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达苹果 根皮苷糖基转移酶，用于催化生成根皮苷；另一方面采用饱和硫酸铵沉淀、阴离子 DEAE-Sepharose交换层析和Sephadex-75凝胶过滤色谱等分离纯化方法，具有简单易行， 周期短，重复性高，酶蛋白活力高等优点。
[0033] 经本发明方法分离纯化得到的重组苹果根皮苷糖基转移酶的活性最适pH值为 8. 5,活性最适温度为45°C，当金属离子在反应体系的终浓度为5mM时，Ca2+和Mg 2+对该重 组苹果根皮苷糖基转移酶有促进作用，Na+和K +作用不明显，Al 3+、Cu2+、Mn2+和Zn 2+有显著 的抑制作用，Cu2+的抑制作用最强。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 图1为采用DEAE-S印harose FF纯化重组糖基转移酶活性峰色谱图；
[0035] 图2为采用Superdex? 75凝胶色谱纯化重组糖基转移酶色谱图；
[0036] 图3为纯化后的重组苹果根皮苷糖基转移酶SDS-PAGE电泳图；
[0037] 图4为酶反应产物色谱图；
[0038] 图5为根皮苷标品质谱图；
[0039] 图6为酶反应产物质谱图；
[0040] 图7为pH对重组糖基转移酶酶活的影响结果图；
[0041] 图8为温度对重组糖基转移酶酶活的影响结果图；
[0042] 图9为金属离子对重组糖基转移酶酶活的影响结果图。
【具体实施方式】
[0043] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而 不是限定。
[0044] 本发明所提供的苹果根皮苷糖基转移酶基因克隆技术方案是：采用CTAB法 (CTAB，hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烧基三甲基溴化按，是一种阳离子去 污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。）提取苹果叶总RNA，以反 转录得到的cDNA为模板，用一对带有酶切位点的引物R) 1和RO1进行PCR扩增，用1. 0 %琼 脂糖凝胶电泳检测，在紫外光下割取目的基因条带，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行 PCR产物回收，将胶回收产物连接到pMD18-T载体，热激法转化感受态的大肠杆菌DH5 α，用 蓝白斑法筛选重组子，重组质粒提取采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，重组质粒 双酶切鉴定阳性克隆，测序。克隆得到的苹果根皮苷糖基转移酶基因序列全长1452个碱基 对，该基因编码483个氨基酸。
[0045] 本发明所提供的表达载体的构建技术方案是：用BamH I和Hind III将得到的苹 果根皮苷糖基转移酶基因进行双酶切，用T4连接酶与同样用BamH I和Hind III双酶切的 pET-32a(+)质粒连接。
[0046] 本发明提供的含有苹果根皮苷糖基转移酶基因的重组菌株的技术方案是：用 转化到DH5 α后所提的阳性重组质粒pET-32a-p2' GT热激法转化到感受态的大肠杆菌 BL21(DE3)中。
[0047] 本发明提供的重组根皮苷糖基转移酶制备技术方案是：将含有重组质粒的菌 体进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG)诱导表达，异源表达产物通过饱和硫酸铵 沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Sephadex-75凝胶过滤色谱纯化，采用肠激酶 (Enterokinase)切除载体标签蛋白，获得重组根皮苷糖基转移酶。
[0048] 1、基因扩增
[0049] 引物：
[0050] FOl (5' -ACGGGATCC ATG GGA GAC GTC ATT GTA CTG-3'）（划线部分为BamH I 酶切 位点）；
[0051] ROl (5, -CCCAAGCTT TTA TGT AAT GCT ACT AAC AAA GTT G-3'）（划线部分为 Hind III酶切位点）。
[0052] 以反转录得到的cDNA为模板，用FOl和ROl两个引物进行PCR扩增，Takara Premix Taq试剂盒，PCR反应体系如表1 :
[0053] 表I PCR反应体系
[0054]
【权利要求】
1. 一种重组苹果根皮苷糖基转移酶，其特征在于，该糖基转移酶具有如SEQ. ID. NO. 1 所示的氨基酸序列。
2. 根据权利要求1所述的一种重组苹果根皮苷糖基转移酶，其特征在于，编码所述重 组苹果根皮苷糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
3. -种重组苹果根皮苷糖基转移酶的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 采用CTAB法提取苹果叶总RNA，以反转录得到的cDNA为模板，用一对带有酶切位点 的引物F01和R01进行PCR扩增，经检测后获取目的基因条带，对PCR产物进行回收； 2) 将步骤1)得到的PCR产物连接到pMD18-T载体上，采用热激法转化感受态细胞后， 筛选重组子，得到重组质粒； 3) 对重组质粒双酶切鉴定阳性克隆、测序，得到重组苹果根皮苷糖基转移酶的基因序 列； 4) 对含有重组质粒的菌体进行异丙基-e -D-硫代半乳糖苷诱导表达，异源表达产物 通过饱和硫酸按沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Sephadex-75凝胶过滤色谱纯 化，再经肠激酶切除载体标签蛋白，获得纯化后的重组根皮苷糖基转移酶。
4. 根据权利要求3所述的一种重组苹果根皮苷糖基转移酶的分离纯化方法，其特征在 于，步骤1)所述的引物的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示，引物R01的核苷酸序列如 SEQ. ID. NO. 4所示；酶切所用的酶为BamH I和Hind III。
5. 根据权利要求3所述的一种重组苹果根皮苷糖基转移酶的分离纯化方法，其特征在 于，所述的感受态细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞。
6. 根据权利要求3所述的一种重组苹果根皮苷糖基转移酶的分离纯化方法，其特征在 于，所述热激法转化感受态细胞的具体操作为： ① 将重组质粒转移至装有感受态细胞的离心管中，轻轻混匀； ② 冰浴30min后，在42°C热激90s，冰浴3min ; ③ 加入无抗生素的LB液体培养基，在37 °C下振荡培养lh?3h ; ④ 复苏后的菌液离心，吸取上清液，对留在离心管底部的菌液用移液枪吹打重悬； ⑤ 用移液枪将重悬菌液移入带有Amp抗生素且在37°C保温的LB固体培养基平板上，用 灭菌的涂布器涂布均匀； ⑥ 将平板倒置于37°C恒温箱中培养12?16h。
7. 根据权利要求3所述的一种重组苹果根皮苷糖基转移酶的分离纯化方法，其特征在 于，所述对含有重组质粒的菌体进行异丙基_ 0-D-硫代半乳糖苷诱导表达具体操作为： 挑取含有重组质粒的单菌落接种于带有Amp抗生素的液体LB培养基中，在37°C， 200prm下振荡培养过夜，再按1 %的体积比接种到带有Amp抗生素的新鲜LB培养基中， 在37°C，180rpm下，振荡培养至0D600达0. 6?1. 0 ;加入异丙基-0 -D-硫代半乳糖苷， 在20°C下诱导4h ;经离心收集菌体，菌体用生理盐水洗涤，再加入细胞缓冲液，进行超声破 碎，然后在4°C，12000rpm下离心lOmin，得到粗酶液I。
8. 根据权利要求7所述的一种重组苹果根皮苷糖基转移酶的分离纯化方法，其特征在 于，所述饱和硫酸铵沉淀具体操作为： 冰浴下，向粗酶液I中加入（NH4)2S04粉末至（NH4) 2S04终质量浓度为30%，搅拌均匀后 离心，取上清液，继续加入（NH4)2S04粉末至（NH4) 2S04终质量浓度为70%，搅拌均匀后，4°C 静置lh，然后离心取沉淀；将沉淀用缓冲液溶解后用30kDa超滤离心管进行酶液的浓缩和 脱盐，得到粗酶液II。
9. 根据权利要求8所述的一种重组苹果根皮苷糖基转移酶的分离纯化方法，其特征在 于，所述DEAE-Sepharose阴离子交换层析的具体操作为： 将粗酶液II过0. 22 y m的滤膜，然后采用AKTA蛋白纯化系统，用NaCl以lmL/min进 行线性洗脱，检测各个洗脱峰的糖基转移酶酶活，将有酶活的部分进行合并收集，转入透析 袋，用PEG20000在4°C进行浓缩，得到酶液III。
10. 根据权利要求9所述的一种重组苹果根皮苷糖基转移酶的分离纯化方法，其特征 在于，所述Sephadex-75凝胶过滤色谱纯化具体操作为： 将酶液III注射到AKTA蛋白纯化系统，使用Sephadex-75凝胶柱进行纯化，用缓冲液以 lmL/min流速进行洗脱，检测各个洗脱峰的糖基转移酶酶活，合并收集有酶活的部分，转入 透析袋用PEG20000在4°C进行浓缩。
【文档编号】C12R1/19GK104480080SQ201410675756
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月21日 优先权日:2014年11月21日
【发明者】樊明涛, 徐颖, 张庭静 申请人:西北农林科技大学