Nogo－a结合分子及其药物用途的制作方法

专利名称：Nogo－a结合分子及其药物用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及NogoA结合分子，例如单克隆抗体或其Fab片段。
背景技术：
由于存在包盖(ensheaths)轴突的抑制性髓鞘环境和瘢痕组织的形成，成人中枢神经系统(CNS)损伤后的神经再生是有限的。在过去几年中，关于CNS为何不能在损伤后自发修复自身的分子理解得到了重要的认识。髓鞘中的抑制性分子是轴突再生的主要障碍(特别是在损伤之后立即的抑制)。至今，将NogoA、髓鞘相关糖蛋白(MAG)和髓鞘少突细胞糖蛋白(myelin-oligodendrocyte glycoprotein，OMgp)表征为神经突生长的有力抑制物。另外，髓鞘也含有其它抑制性成分，例如硫酸软骨素蛋白聚糖。Nogo-A是浆膜(reticulon)蛋白家族成员，至少具有被称为氨基-Nogo和Nogo-66的两个生物学活性和药理学活性有别的结构域。前者的受体位点至今尚未知，Nogo-66通过神经元受体NgR体外和体内抑制神经元生长。除了Nogo-66，MAG和OMgp也以高亲合力与NgR结合并抑制神经突生长。
目前所寻求的增强神经修复的可能的新研究方法包括使用酶(软骨素酶ABC)消化瘢痕组织、使用包盖的嗅觉细胞和干细胞以及蛋白质生长因子来加强神经元生长的桥连技术(bridging techniques)。神经突生长抑制物通过调制细胞内信号介质(例如膜结合的鸟苷三磷酸酶(GTPase)Rho)的阻断作用似乎是抑制轴突生长的关键环节。环腺苷酸(cAMP)可以在体外克服髓鞘相关抑制并在体内诱导再生。使用NgR受体的肽抑制物(NEP1-40)在大鼠脊髓损伤后诱导神经元再生和功能恢复。
除了使用上述方法，也将注意力集中于使用某些单克隆抗体以中和中枢及外周神经系统的神经突生长抑制分子，具体为中和NogoA的神经突生长抑制活性。因此已显示，单克隆抗体IN-1或其IN-1Fab片段体外诱导神经突生长并体内增强出芽和再生(Schwab ME等人，(1996)Physio.Rev.76，319-370)。对NogoA不同结构域关于神经突生长抑制活性的测试已描述了该分子内几个抑制性结构域(Chen等人，(2000)Nature 403，434-439；GrandPre等人，(2000)Nature 403，439-444；Prinjha等人，(2000)Nature403，383-384)。
天然免疫球蛋白或抗体包括在每个上臂具有抗原结合位点的、通常为Y形的多聚分子。该结构的其余部分(特别为Y的茎)介导与免疫球蛋白相关的效应物功能。抗体由2条重链和2条轻链组成。重链和轻链都含有可变结构域和恒定部分。抗原结合位点由与轻链可变结构域结合的重链可变结构域组成。重链和轻链可变结构域具有相同的大体结构。更具体而言，抗体的抗原结合特性基本上由重链和轻链可变结构域中3个特定区域决定，所述特定区域被称为高变区或互补决定区(CDR)。这3个高变区与4个序列相对保守并且不直接涉及结合的构架区(FR)交替。CDR形成环并与构架区保持紧密靠近，其中构架区很大程度上采取了β折叠构型。重链CDR与结合的轻链CDR基本组成抗体分子的抗原结合位点。通常通过比较相同物种中产生的大量抗体的氨基酸序列确定FR或CDR区的组成。鉴定CDR和FR区的一般规则是本领域技术人员的普通知识，并且可见于例如网站http://www.bioinf.orq.uk/abs/。

发明内容
令人惊奇地发现针对人NiG的IgG型新单克隆人抗体(此后称为“3A6”)比现有技术的NogoA抗体具有更好的特性，尤其是关于与包括人在内的不同物种的NogoA的结合亲合力以及关于其在给定抗体浓度下较高的NogoA神经突生长中和活性，所述单克隆人抗体由Medarex Mice(具有人免疫球蛋白基因的基因重组小鼠)产生(Schwab ME等人，(1996)Physio.Rev.76，319-370)。此外，可以构建其它与所述抗体具有相同高变区的NogoA结合分子。
因此，本发明提供针对NogoA具体区域或表位的结合分子(此后称为“本发明的结合分子”或简称为“结合分子”)。本发明的结合分子优选以解离常数(Kd)＜1000nM、更优选以Kd＜100nM、最优选以Kd＜10nM结合人NogoA_342-357(人NiG中3A6的表位；＝SEQ ID NO6)、人NogoA(SEQ ID NO5)或人NiG(最有力的NogoA神经突生长抑制性片段，在人NogoA的186位氨基酸开始，并在1004位氨基酸结束，＝SEQID NO5)。可以通过标准方法(定量测定法)显示结合反应，包括例如在实施例6中描述的ELISA方法以及在实施例7中描述的生物传感器亲合力方法。另外，可以在例如如下所述的神经突生长测定中显示与人NogoA的结合以及几乎更重要的功效。
因此，在优选的实施方案中，与以对照抗体处理的大鼠小脑颗粒细胞的神经突数量相比，该结合分子(以100μg/ml、优选10μg/ml、更优选1.0μg/ml甚至更优选0.1μg/ml的浓度)将猴脑蛋白质提取物底物上的大鼠小脑颗粒细胞的神经突数量增加至少20％、优选50％。最优选80％，所述对照抗体不结合人NogoA、人NiG或NogoA_342-357多肽(即解离常数＞1000nM)。
在另一个优选的实施方案中，本发明的结合分子含有至少一个抗原结合位点，所述抗原结合位点依次含有高变区CDR-H1-3A6、CDR-H2-3A6和CDR-H3-3A6，及它们的直接等价物，所述CDR-H1-3A6具有氨基酸序列SEQ ID NO8，所述CDR-H2-3A6基因具有氨基酸序列SEQ ID NO9，所述CDR-H3-3A6具有氨基酸序列SEQ ID NO10。
在本发明的另一方面，本发明的结合分子含有至少一个抗原结合位点，所述抗原结合位点含有a)依次为高变区CDR-H1-3A6、CDR-H2-3A6和CDR-H3-3A6；所述CDR-H1-3A6具有SEQ ID NO8的氨基酸序列，所述CDR-H2-3A6具有SEQ ID NO9的氨基酸序列，所述CDR-H3-3A6具有氨基酸序列SEQ IDNO10；或
b)依次为高变区CDR-L1-3A6、CDR-L2-3A6和CDR-L3-3A6，所述CDR-L1-3A6具有SEQ ID NO11的氨基酸序列，所述CDR-L2-3A6具有SEQ ID NO12的氨基酸序列，所述CDR-L3-3A6具有SEQ ID NO13的氨基酸序列；或c)其直接等价物。
在本发明的另一方面，本发明的结合分子含有至少a)第一个依次含有高变区CDR-H1-3A6、CDR-H2-3A6和CDR-H3-3A6的结构域，所述CDR-H1-3A6具有SEQ ID NO8的氨基酸序列，所述CDR-H2-3A6具有SEQ ID NO9的氨基酸序列，所述CDR-H3-3A6具有氨基酸序列SEQ ID NO10；和b)第二个依次含有高变区CDR-L1-3A6、CDR-L2-3A6和CDR-L3-3A6的结构域，所述CDR-L1-3A6具有SEQ ID NO11的氨基酸序列，所述CDR-L2-3A6具有SEQ ID NO12的氨基酸序列，所述CDR-L3-3A6具有SEQ ID NO13的氨基酸序列；或c)其直接等价物。
另外，本发明也提供下列本发明的结合分子，所述结合分子含有至少一个抗原结合位点，其中抗原结合位点含有a)3A6(SEQ ID NO2)重链可变部分；或b)3A6(SEQ ID NO3)轻链可变部分，或其直接等价物。
当抗原结合位点含有第一个和第二个结构域两者时，二者可以位于同一多肽分子上，或优选各结构域可以在不同链上，第一个结构域为免疫球蛋白重链或其片段的部分，第二个结构域为免疫球蛋白轻链或其片段的部分。
本发明的结合分子的实例包括由B细胞或杂交瘤产生的抗体、以及人或嵌合或人源化抗体或其任何片段(例如F(ab′)2和Fab片段)以及单链或单结构域抗体。
单链抗体由通过肽接头共价连接的抗体重链和轻链可变结构域组成，所述肽接头通常由10至30个氨基酸、优选15至25个氨基酸组成。因此，这样的结构不含有重链和轻链的恒定部分，而且认为小的肽间隔应当比整个恒定部分抗原性更弱。“嵌合抗体”指其中重或轻链的恒定区或二者为人源而重链和轻链两者的可变结构域为非人(例如鼠)源的抗体。“人源化抗体”指其中高变区(CDR)为非人(例如鼠)源而该免疫球蛋白其它部分全部或基本全部(例如恒定区或可变区的高度保守部分，即构架区)为人来源。然而人源化抗体可以在邻近高变区的构架区中保留鼠序列的少数氨基酸。
高变区可以与任何种类(优选鼠或人起源)的构架区联合。在《Sequences of proteins of immunological interest》，Kabat E.A.等人，USdepartment of health and human services，Public health service，NationalInstitute of Health中描述了合适的构架区。结合分子人重链的恒定部分可以优选为IgG4型(包括亚型)，人轻链的恒定部分可以优选为κ或λ型，更优选为κ型。
在非人体系(例如小鼠)中可能出现针对天然存在于所有人中的蛋白质的单克隆抗体。作为其直接结果，当施用于人时，由杂交瘤产生的异基因抗体引起主要由该异基因免疫球蛋白恒定部分介导的不需要的免疫应答。这显然限制了这类抗体的使用，因为不能将其长时期施用。因此特别优选使用施用于人时可能不引起实质性同种异型应答的单链、单结构域、嵌合或人源化抗体。
根据前述观点，本发明更优选的结合分子选自嵌合抗体，所述嵌合抗体至少含有a)一条免疫球蛋白重链或其片段，其含有(i)依次含有高变区CDR-H1-3A6、CDR-H2-3A6和CDR-H3-3A6的可变结构域，和(ii)人重链恒定部分或其片段；所述CDR-H1-3A6具有氨基酸序列(SEQ ID NO8)，所述CDR-H2-3A6具有氨基酸序列(SEQ ID NO9)，所述CDR-H3-3A6具有氨基酸序列(SEQ ID NO10)，和b)一条免疫球蛋白轻链或其片段，其含有(i)依次含有高变区CDR-L1-3A6、CDR-L2-3A6和CDR-L3-3A6的可变结构域，和(ii)人轻链恒定部分或其片段；所述CDR-L1-3A6具有氨基酸序列(SEQ ID NO11)，所述CDR-L2-3A6具有氨基酸序列(SEQ ID NO12)，所述CDR-L3-3A6具有氨基酸序列(SEQ ID NO13)；或其直接等价物。
另外，本发明的结合分子可以选自含有抗原结合位点的单链结合分子，所述抗原结合位点含有a)第一个依次含有高变区CDR-H1-3A6、CDR-H2-3A6和CDR-H3-3A6的结构域；所述CDR-H1-3A6具有氨基酸序列(SEQ IDNO8)，所述CDR-H2-3A6具有氨基酸序列(SEQ ID NO9)，所述CDR-H3-3A6具有氨基酸序列(SEQ ID NO8)；和b)第二个依次含有高变区CDR-L1-3A6、CDR-L2-3A6和CDR-L3-3A6的结构域，所述CDR-L1-3A6具有氨基酸序列(SEQ ID NO11)，所述CDR-L2-3A6具有氨基酸序列(SEQ ID NO12)，所述CDR-L3-3A6具有氨基酸序列(SEQ ID NO13)；和c)与第一个结构域N末端和第二个结构域C末端或与第一个结构域C末端和第二个结构域N末端结合的肽接头；或其直接等价物。
众所周知，氨基酸序列的较小改变例如一个或几个氨基酸的缺失、添加或置换可能导致具有基本一致特性的原始蛋白质的等位形式。因此，术语“其直接等价物”指本发明的任何单结构域结合分子(分子X)(i)其中结合分子的每个高变区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3与CDR-H1-3A6(SEQ ID NO8)、CDR-H2-3A6(SEQ ID NO9)和CDR-H3-3A6(SEQ ID NO10)等价高变区至少50或80％同源，优选至少90％同源，更优选至少95、96、97、98、99％同源，而CDR-H1与CDR-H1-3A6等价，CDR-H2与CDR-H2-3A6等价，CDR-H3与CDR-H3-3A6等价；且(ii)能够优选以解离常数(Kd)＜1000nM、更优选以Kd＜100nM，最优选以Kd＜10nM结合人NogoA、人NiG或人NogoA_342-357，或每个结合位点具有至少两个结构域的本发明的结合分子(分子X′)(iii)其中每个高变区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3与CDR-H1-3A6(SEQ ID NO8)、CDR-H2-3A6(SEQ ID NO9)、CDR-H3-3A6(SEQ′ID NO10)、CDR-L1-3A6(SEQ ID NO11)、CDR-L2-3A6(SEQ ID NO12)和CDR-L3-3A6(SEQ ID NO13)等价高变区至少50或80％同源，优选至少90％同源，更优选至少95、96、97、98、99％同一，而CDR-H1与CDR-H1-3A6等价，CDR-H2与CDR-H2-3A6等价，CDR-H3与CDR-H3-3A6等价，CDR-L1与CDR-L1-3A6等价，CDR-L2与CDR-L2-3A6等价，CDR-L3与CDR-L3-3A6等价；且(iv)能够优选以解离常数(Kd)＜1000nM、更优选以Kd＜100nM，最优选以Kd＜10nM结合人NogoA、人NiG或人NogoA_342-357。
因此本发明的另一个实施方案是例如能够以解离常数＜1000nM结合人NogoA、人NiG或人NogoA_342-357、并含有至少一个抗原结合位点的结合分子，所述抗原结合位点含有●依次为高变区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中每个高变区与其等价高变区CDR-H1-3A6(SEQ ID NO8)、CDR-H2-3A6(SEQ ID NO9)和CDR-H3-3A6(SEQ ID NO10)至少50％、优选80、90、95、96、97、98、99％同源；或●依次为高变区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中每个高变区与其等价高变区CDR-L1-3A6(SEQ ID NO11)、CDR-L2-3A6(SEQ ID NO12)和CDR-L3-3A6(SEQ ID NO13)至少50％、优选80、90、95、96、97、98、99％同源。
另外，能够以解离常数＜1000nM结合人NogoA、人NiG或人NogoA_342-357并含有●依次含有高变区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的第一个抗原结合位点，其中每个高变区与其等价高变区CDR-H1-3A6(SEQ ID NO8)、CDR-H2-3A6(SEQ ID NO9)和CDR-H3-3A6(SEQ ID NO10)至少50％、优选80、90、95、96、97、98、99％同源；和
●依次含有高变区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的第二个抗原结合位点，其中每个高变区与其等价高变区CDR-L1-3A6(SEQ ID NO11)、CDR-L2-3A6(SEQ ID NO12)和CDR-L3-3A6(SEQ ID NO13)至少50％、优选80、90、95、96、97、98、99％同源。
可以在多种测定法中方便地测试所述解离常数，包括例如在实施例7中描述的生物传感器亲和力方法。另外，可以在如下所述的生物测定法中显示结合分子的结合和功能效果。
人重链恒定部分可以是γ1、γ2、γ3、γ4、α1、α2、δ或ε型，优选为γ型，更优选为γ4型，而人轻链恒定部分可以是κ或λ型(包括λ1、λ2和λ3亚型)，但是优选为κ型。Kabat等人(如上)给出了所有这些恒定部分的氨基酸序列。
本发明的结合分子的缀合物(例如酶或毒素或放射性同位素缀合物)也包括于本发明范围内。
除非在此另外说明，“多肽”包括任何肽或蛋白质，所述肽或蛋白质包含通过肽键彼此连接的氨基酸、具有在N末端起始并在C末端结束的氨基酸序列。本发明的多肽优选为单克隆抗体，更优选为嵌合(也称为V嫁接的)或人源化(也称为CDR嫁接的)单克隆抗体。人源化(CDR嫁接的)单克隆抗体可能或不可能含有另外引入受体抗体构架区(FR)序列中的突变。
此处所使用的多肽功能衍生物包括与本发明的多肽具有相同定性生物学活性的分子，即具有结合人NogoA、人NiG或人NogoA_342-357的能力。功能衍生物包括根据本发明的多肽的片段和肽类似物。片段含有根据本发明的多肽序列(例如指定序列)内的区域。使用术语“衍生物”定义根据本发明的多肽(例如指定序列)的氨基酸序列变体和共价修饰物。根据本发明的多肽(例如指定序列，例如轻链和重链高变区)的功能衍生物优选与根据本发明的多肽的氨基酸序列(例如指定序列)具有至少约65％、更优选至少约约75％、甚至更优选至少约85％、最优选至少约95、96、97、98、99％全序列同源性，并基本保留结合人NogoA、人NiG或人NogoA_342-357的能力。
术语“共价修饰”包括以有机蛋白质或非蛋白质衍生剂修饰根据本发明的多肽(例如指定序列)或其片段、与异源多肽序列融合和翻译后修饰。共价修饰的多肽(例如指定序列)仍然具有通过交联而结合人NogoA、人NiG或人NogoA_342-357的能力。传统上，通过将靶定的氨基酸残基与能够与所选侧链或末端残基反应的有机衍生试剂反应，或通过在所选重组宿主细胞内起作用的翻译后修饰的固定(harnessing)机制引入共价修饰。某些翻译后修饰是重组宿主细胞对所表达多肽的作用。谷氨酰胺和天冬酰胺酰残基经常脱酰胺基为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。另外，这些残基在弱酸性条件下脱氨基。其它翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化作用；丝氨酰、酪氨酸或苏氨酰残基的羟基基团的磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基基团的甲基化，见例如T.E.Creighton，《ProteinsStructure and Molecular Properties》，W.H.Freeman & Co.，SanFrancisco，第79-86页(1983)。共价修饰物例如包括融合蛋白质，所述融合蛋白质含有根据本发明的多肽(例如指定序列)及其氨基酸序列变体，例如免疫粘附素，以及异源信号序列的N末端融合物。
在此将关于天然蛋白质与其功能衍生物的“同源性”定义为比对序列并引入空位(如果有必要)以得到最大百分比同源性并且不考虑任何保守置换为序列同源性部分后，候选序列中与相应天然多肽残基一致的氨基酸残基的百分数。无论N或C末端延长或插入均不被解释为降低一致性或同源性。比对方法及计算机程序广为人知。
“氨基酸”指所有天然存在的例如L-α-氨基酸，并包括D-氨基酸。氨基酸以公知的单字母或三字母名称表示。
术语“氨基酸序列变体”指与根据本发明的多肽(例如指定序列)相比，其氨基酸序列有所不同的分子。根据本发明的多肽(例如指定序列)的氨基酸序列变体仍然具有结合人NogoA或人NiG或更优选NogoA_342-357的能力。置换变体是根据本发明的变体的多肽(例如指定序列)中至少去除一个氨基酸残基、并在相同位置将不同的氨基酸插入其位置的变体。这些置换可能是单一的，其中该分子中仅一个氨基酸被置换，或者它们可能是多重的，其中在同一分子中两个或更多氨基酸被置换。插入变体是根据本发明的变体的多肽(例如指定序列)中紧邻具体位置的氨基酸插入一个或多个氨基酸的变体。与氨基酸紧邻指与氨基酸α-羧基或α-氨基官能团连接。缺失变体是根据本发明的变体的多肽(例如指定序列)中去除一个或更多氨基酸的变体。通常，缺失变体将在分子的具体区域内缺失一个或两个氨基酸。
可以通过重组DNA技术产生本发明的结合分子。就此而言，必须构建一个或多个编码该结合分子的DNA分子，将该DNA分子置于适宜的控制序列下并转移到合适的宿主生物中表达。
因此在非常普遍的方式中提供(i)DNA分子，所述DNA分子编码本发明的单结构域结合分子、本发明的单链结合分子、本发明的结合分子的重或轻链及其片段；和(ii)本发明的DNA分子在通过重组方法产生本发明的结合分子中的用途。
本领域目前的技术水平是，基于在此提供的信息(即高变区的氨基酸序列和编码它们的DNA序列)，技术人员将能够合成本发明的DNA分子。在例如EP 239 400中描述了构建可变结构域基因的方法，可以简要概括如下克隆基因，所述基因编码无论何种特异性的单克隆抗体的可变结构域。确定编码构架区和高变区的DNA节段，并去除编码高变区的DNA节段从而以合适的限制位点在连接点将编码构架区的DNA节段融合在一起。可以在适当的位置通过标准方法诱变DNA分子而产生限制位点。通过根据上文给定的CDR-H1-3A6、CDR-H2-3A6、CDR-H3-3A6、CDR-L1-3A6、CDR-L2-3A6和CDR-L3-3A6序列合成DNA而制备双链合成CDR盒。给这些盒提供粘性末端，从而通过能够得到编码免疫球蛋白可变结构域的DNA分子的标准方案将其在接点与构架连接。
另外，没有必要为了获得编码本发明的单克隆抗体的DNA构建体而使用来自生产杂交瘤细胞系的mRNA。因此，PCT申请WO 90/07861提供了仅给出关于基因核苷酸序列书面信息时通过重组DNA技术生产单克隆抗体的完整说明书。
该方法包括合成许多寡核苷酸、通过PCR方法将其扩增、以及将其剪接以产生所需DNA序列。
可以通过公共途径获得含有合适的启动子或编码重链和轻链恒定部分的基因的表达载体。因此，一旦制备本发明的DNA分子，可以将其便利地转移到适宜的表达载体中。
也可以通过在例如WO 88/1649中描述的标准方法制备编码单链抗体的DNA分子。
在本发明的具体实施方案中，产生部分本发明的结合分子的重组方法包括如下所述的第一个和第二个DNA构建体第一个DNA构建体编码重链或其片段，并含有a)编码含有构架区和高变区二者之一的可变结构域的第一部分，所述高变区依次含有DNA-CDR-H1-3A6(SEQ ID NO14)、DNA-CDR-H2-3A6(SEQ ID NO15)和DNA-CDR-H3-3A6(SEQ ID NO16)，所述第一部分以编码该可变结构域第一个氨基酸的密码子开始，并以编码该可变结构域最后一个氨基酸的密码子结束，和b)编码重链恒定部分或其片段的第二部分，该部分以编码该重链恒定部分第一个氨基酸的密码子开始，并以编码该恒定部分或其片段最后一个氨基酸的密码子结束，随后为无义密码子。
第二部分优选编码人重链恒定部分，更优选人γ4-链恒定部分。第二部分可以是基因组来源的DNA片段(含有内含子)或cDNA片段(无内含子)。
第二个DNA构建体编码轻链或其片段，并含有a)编码含有构架区和高变区二者之一的可变结构域的第一部分，所述高变区依次含有DNA-CDR-L1-3A6(SEQ ID NO17)、DNA-CDR-L2-3A6(SEQ ID NO18)和DNA-CDR-L3-3A6(SEQ ID NO19)，所述第一部分以编码该可变结构域第一个氨基酸的密码子开始，并以编码该可变结构域最后一个氨基酸的密码子结束，和b)编码轻链恒定部分或其片段的第二部分，该部分以编码该轻链恒定部分第一个氨基酸的密码子开始，并以编码该恒定部分或其片段最后一个氨基酸的密码子结束，随后为无义密码子。
第二部分优选编码人轻链恒定部分，更优选人κ链恒定部分。
第一个或第二个DNA构建体有利地含有位于第一部分上游、编码部分前导肽的第三部分，所述第三部分以编码该前导肽第一个氨基酸的密码子开始，并以编码该前导肽最后一个氨基酸的密码子结束。该肽是表达这些链的宿主生物分泌它们所需要的，并且随后由宿主生物去除。第一个DNA构建体的第三部分优选编码前导肽，该前导肽具有SEQ ID NO21中所示重链前导序列的氨基酸序列(以-19位氨基酸起始，以-1位氨基酸结束)。同样，第二个DNA构建体的第三部分优选编码前导肽，该前导肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO23中所示的氨基酸序列(轻链，以-18位氨基酸起始，以-1位氨基酸结束)基本一致。
将每个DNA构建体置于合适的控制序列的控制下，具体而言为合适的启动子的控制下。可以使用任何种类的启动子，条件是其适合于该DNA构建体将转入以表达的宿主生物。然而，如果表达发生在哺乳动物细胞中，特别优选使用免疫球蛋白基因启动子。
可以在细胞培养或转基因动物中产生所需抗体。可以根据标准方法获得合适的转基因动物，所述标准方法包括将置于合适的控制序列下的第一个和第二个DNA构建体微注射到卵细胞中，将如此制备的卵细胞转移到适宜的假孕雌性动物中，并选择表达所需抗体的后代。
当不得不在细胞培养中制备抗体链时，必须首先将DNA构建体插入到单独的表达载体中或两个分离但是兼容的表达载体中，优选后一种可能性。
因此，本发明也提供能够在原核或真核细胞系中复制的表达载体，所述表达载体至少含有上述DNA构建体之一。
然后将每个含有DNA构建体的表达载体转移到合适的宿主生物中。将DNA构建体分别插入两个表达载体时，可以将其分别转移(即每个细胞一类载体)或共转化，优选后一种可能性。合适的宿主生物可以是细菌。酵母或哺乳动物细胞系，优选后者。更优选哺乳动物细胞系为淋巴起源(例如骨髓瘤、杂交瘤或常规永生化B细胞)、但是不表达任何内源性抗体重或轻链。
也优选宿主生物每个细胞含有该载体的大量拷贝。如果宿主生物是哺乳动物细胞系，可以通过根据标准方法扩增拷贝数达到所述需要的目标。扩增方法通常由选择增加的药物抗性组成，所述抗性由该表达载体编码。
在本发明的另一方面，提供产生本发明的多链结合分子的方法，该方法包括(i)培养以本发明的第一个和第二个DNA构建体转化的生物和(ii)从培养物中回收本发明的活性结合分子。
另外，可以分别回收重链和轻链，并在体外重折叠后重构为活性结合分子。重构方法为本领域所公知；在EP 120 674或EP 125 023中具体提供了方法实例。方法因此可以包括(i)培养以本发明第一个DNA构建体转化的第一种生物，并从培养物回收所述重链或其片段，和(ii)培养以本发明第二个DNA构建体转化的第二种生物，并从培养物回收所述轻链或其片段，和(iii)从由(i)中获得的重链或其片段和从(ii)中获得的轻链或其片段体外重构本发明的活性结合分子。
以类似的方式，也提供产生本发明的单链或单结构域结合分子的方法，该方法包括(i)培养以分别编码本发明的单链或单结构域结合分子的DNA构建体转化的生物，和(ii)从培养物回收所述分子。
本发明的结合分子显示很好的神经再生活性，例如颗粒细胞神经突生长模型中所示。
1.颗粒细胞神经突生长测定(体外)
如前所述(Spillmann等人，1998，Identification and characterizationof a bovine neurite growth inhibitor(bNI-220)，J Biol Chem-1998 Jul 24；273(30)19283-93)取脑组织(皮层和脑干)并新鲜制备蛋白质提取物用于各测定。于4℃将一块冰冻组织(例如0.25g)在3-4倍体积含有蛋白酶阻断剂(10μg/ml抑酶肽，5μg/ml亮抑酶肽，1μg/ml抑胃酶肽，1mMPMSF)的60mM Chaps-20mM Tris pH 8.0-1mM EDTA中匀浆。将匀浆物于4℃置于旋转器上30分钟，并在TLA 100.3转子(Beckman TL-100超速离心机)中于4℃以100000g离心45分钟。使用BioRad测定上清液蛋白质浓度。如前所述(Niederost等人，1999，Bovine CNS myelin containsneurite growth-inhibitory activity associated with chondroitin sulfateproteoglycans，J Neurosci.1999 Oct 15；19(20)8979-89)从出生后5-7天大鼠小脑组织的胰蛋白酶解离物中纯化小脑颗粒细胞。然后将本发明的结合分子在测试底物上预孵育30分钟并在加入细胞前去除。加入小脑颗粒细胞并孵育24小时。向培养皿中缓慢加入2ml 4％甲醛缓冲液终止实验。将如上所述制备的猴脑膜蛋白质提取物在Greiner 4孔皿(Greiner，Nuertingen，Germany)上以每cm2培养皿15μg蛋白质吸收过夜。接种神经元前用温暖的Hank溶液将皿洗三次。如上所述制备出生后5-7天大鼠的小脑颗粒细胞，并以50,000细胞/cm2接种。将细胞在无血清培养基中培养24小时、固定并用神经突标志物MAB 1b(Chemicon单克隆抗体，1∶200)免疫染色。以MAB 1b染色后使用DAPI(4’，6-二脒基-2-吲哚苯二氢氯化物，Molecular Probe)进行胞体染色。将抗Nogo-A mAb或对照IgG Ab在皿上预孵育30分钟用于抗体实验，随后去除。使用40×物镜以经过视野中心放置的线计数所有神经突横断面，在距孔边缘明确距离处为各孔随机取样四个区域。也计数所有接触该线的胞体，并如先前报导(Simonen等人，2003，Neuron 38，201-211)计算各孔每个胞体神经突的指数比(indexratio)。在编码的实验上以盲法完成所有计数，并以每胞体神经突的指数表示。结果以平均指数神经突/胞体表示。
通过与本发明的结合分子预孵育，可以观察到在上面制备的脊髓提取物的非容许环境中小脑颗粒细胞神经突生长增强。例如，下面给出颗粒细胞神经突生长模型中人3A6-IgG1和IgG4抗体的中和作用的典型特征

也可以通过测量下文简述的体内脊髓损伤模型中再生性萌发和神经突生长和功能恢复评估本发明分子的中和活性。
2.大鼠和猴的脊髓损伤模型(体内)通过在第八胸椎水平双侧横断脊髓背侧半部，显微手术损伤成年Lewis大鼠。Schnell和Schwab 1993(Eur.J.Neurosci.51156-1171)中描述了椎板切除术、麻醉和手术。
神经解剖学示踪通过向相对泵或移植物(graft)一侧的皮质内注射顺向示踪物生物素葡聚糖胺(BDA)示踪运动和感觉皮层脊髓束。BDA在10-14天内被输送至脊髓，如Brsamle等人所述(2000 J.Neuro sci.208061-8068)使用二氨基联苯胺(DAB)为底物显像。
脊髓损伤两周后破坏脊髓T8节段的大约40％，主要在背侧半部，包括两个主要的CST对照动物CST示踪显示该束中等程度的反应性萌发。该现象与文献中公知的适应损伤的自发性萌发相吻合。以本发明的结合分子或以泵递送的本发明结合分子处理的损伤大鼠可能表现出损伤位点萌发和受损轴突再生和受损神经突的神经突再生增强。另外，动物可能表现出感觉运动功能恢复提高。这类功能测试先前已有描述(Merkler等人，2001，J.Neuroscience 21，3665-73)。
3.抗体在成年猴CNS中的组织分布将抗体3A6以IgG纯化并在PBS中浓缩至3mg/ml。使用抗小麦生长素的小鼠血清来源的IgG(Chemicon Int.，Temecula/CA，USA)或mAB(AMS Biotechnology，Oxon/UK)作为对照处理。在该研究中使用两只成年雄性恒河猴(Macaca fascicularis)用于鞘内输注。
手术程序肌肉注射氯胺酮(Ketalar；Parke-Davis，5mg/kg，肌肉注射)诱导麻醉。肌肉注射阿托品(0.05mg/kg)以降低支气管分泌物。在股静脉内放置静脉内导管用于连续注入以异丙酚1％(Fresenius)和葡萄糖4％溶液的混合物(1体积的异丙酚和2体积的葡萄糖溶液)，诱导更深麻醉。然后将动物置于立体定位架中。在无菌条件下，从C2至Th1实施垂直中线皮肤切口。暴露筋膜切口和C2至Th1棘突。缩回脊柱旁肌肉并切开C6、C7和Th1椎板。然后实施完整C6椎板切除术和上部C7半椎板切除术。暴露硬脑膜，在第七和第八颈椎髓节段(对应于由第六颈椎板覆盖的脊髓部分的喙带(rostral zone))上方纵向切入。把与递送hNogo-A抗体的渗透泵(Alzet，2ML1；流量50μg/小时)连接的聚乙烯管(10cm长)插入硬脑膜下，沿喙(rostrally)推动数毫米并以缝合线附着于硬脑膜。在低于椎板切除术数厘米处主要由左侧背部肌肉组成的腔中放置并保护渗透泵。通过与肌肉缝合沿其轨道保护该管。缝合肌肉和皮肤，动物通常在中断异丙酚静脉灌注15-30分钟后从麻醉中恢复。以抗生素(氨苄青霉素10％，30mg/kg，皮下注射)对动物进行术后处理。一周内每日给以额外剂的卡洛芬。
植入渗透泵8天后将猴处死。首先如上所述以氯胺酮诱导镇静，随后通过腹腔注射致死剂量的戊巴比妥(90mg/kg)获得深麻醉。以0.4升0.9％盐水、随后为4升固定剂(4％多聚甲醛于0.1M磷酸盐缓冲液中，pH＝7.6)穿心灌注动物。以三个浓度递增的蔗糖溶液(10％于固定剂中，20和30％于磷酸盐缓冲液中)连续灌注。
组织学操作、免疫荧光和组织化学小心地解剖猴脑和脊髓，冷藏于30％蔗糖中，并在恒冷切片机中以40μm切片。使用人二级抗体(Jackson Laboratories)检测注入的mAB。可以使用下列抗体用于双标记兔AS472(经过亲合纯化)用于内源性Nogo-A(Chen，2000)；兔抗GFAP抗体用于星型胶质细胞；兔抗组织蛋白酶D(DAKO)抗体用于溶酶体定位。以相应的耦连TRITC或FITC的二级抗体或使用ABC-DAB系统(Vector)对所有抗血清显像。通过ZeissAxiophot上表面荧光或通过共聚焦显微镜(ZEISSLSM 410)分析切片。
在注入位点及其下方6cm处分析脊髓。在注入位点存在高水平的3A6。在更下方的脊髓，中央沟和索被强烈标记，而灰质和白质显示更加均一、然而却是特异并明显于背景的标记。类似的情况出现在表面和脑室强烈标记且Nono-A抗体良好地渗透到软组织中的前脑。
这些实验显示脊髓鞘内注入抗CNS细胞表面抗原的抗体引起该抗体通过CSF循环在内部(脑室、中央沟)和外部液体空间内的良好分布。该IgG抗体充分渗透到脑和脊髓组织中。尽管对照IgG被迅速洗出，抗Nogo-A抗体保留在组织中。
4.猴脊髓损伤中的神经修复和功能改善测试肌肉注射氯胺酮(Ketalar；Parke-Davis，5mg/kg，肌肉注射)诱导麻醉。肌肉注射阿托品(0.05mg/kg)以降低支气管分泌物。在股静脉内放置静脉内导管用于连续注入异丙酚1％(Fresenius)和葡萄糖4％溶液的混合物(1体积的异丙酚和2体积的葡萄糖溶液)，诱导更深麻醉。然后将动物置于立体定位架中。在无菌条件下，从C2至Th1实施垂直中线皮肤切口。暴露筋膜切口和C2至Th1棘突。缩回脊柱旁肌肉且切开C6、C7和Th1椎板。然后实施完整C6椎板切除术和上部C7半椎板切除术。为了在紧邻损伤处递送该分子，在硬脑膜下距损伤数毫米处沿喙固定附着于泵的聚乙烯管的自由尖端。
可以根据发表的操作实施动作手灵巧性(Behavioural manualDexterity)测试。让猴坐在塑胶玻璃改良的“Brinkman板”(10cm×20cm)前的灵长动物椅中训练手灵巧性，所述“Brinkman板”含有50个随机分布的孔，25个孔为水平朝向，25个为垂直朝向{Liu，1999 15428/id；Rouiller，199813239/id}。2.7.可以按照已描述的评估纤维的再生和萌发。注射到右侧半球中的顺向示踪物为生物素葡聚糖胺(BDA，Molecular Probe，10％于盐溶液中)。在左侧半球内，注射荧光顺向示踪物荧光素葡聚糖(Molecular Probe，10％于盐水中)。可以如先前的详细描述{Rouiller，19948322/id}实施示踪物显像的组织学处理。
因此本发明也提供(i)本发明的结合分子在哺乳动物神经系统(特别是人神经系统)的神经修复中的用途，(ii)哺乳动物神经系统(特别是人神经系统)的神经修复方法，该方法包括给需要这类治疗的患者施用有效量的本发明结合分子，或(iii)用于哺乳动物神经系统(特别是人神经系统)神经修复的药物组合物，该组合物包含本发明的结合分子和可药用载体或稀释剂。
具体而言，本发明的结合分子有益于神经纤维损伤后的轴突再生和萌发增加。因此本发明的分子具体对人受试者具有广泛效用。例如，本发明的结合分子有益于治疗多种外周(PNS)和中枢(CNS)神经系统疾病，即，更具体为神经变性疾病，例如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、Lewy样病理或其它普通痴呆、颅、脑或脊髓损伤后疾病、中风或脱髓鞘疾病。这类脱髓鞘疾病包括(但不限于)多发性硬化、单相脱髓鞘、脑脊髓炎、多灶性白质脑病、全脑炎、胼胝体脱髓鞘性脑病综合征(Marchiafava-Bignami病)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(pontinemyelmolysis)、肾上腺脑白质营养不良、Pelizaeus-Merzbacher病、海绵样变性、亚历山大病、嘉拿芬病(Canavan′s disease)、异染性白质营养不良和克腊伯氏病(Krabbe′s disease)。在一个实例中，施用本发明的结合分子可以用于治疗与NonoA蛋白质相关的脱髓鞘疾病。在另一个实施例中，可以将表达本发明的结合分子的细胞移植到脊髓损伤位点以促进遍及损伤位点的轴突生长。这类移植的细胞将提供损伤或创伤后恢复脊髓功能的方法。这类细胞可以包括嗅觉包盖细胞和胎儿神经或组织移植物的不同系的干细胞。
长时程延迟的Nono-A阻滞对中风后大鼠功能恢复和神经解剖学可塑性的影响是Shih-Yen Tsai，Anay Pradham，JoshRosales，Anis K.Mir，Martin E.Schwab，Gwendolyn L Kartje于2004年发表的摘要的主题。使用渗透泵将纯化的抗氨基Nogo-A抗体施用于大脑中动脉阻塞(MCAO)8周后的成年大鼠。使用熟练上肢伸展试验(skilled forelimb reaching test)和阶梯步行试验(ladder rung walking test)检查功能恢复。初步结果显示，即使在中风两个月后以抗氨基Nono-A阻滞处理，也能提高功能恢复。
此外，本发明的结合分子可用变性眼病的治疗，所述变性眼病可能直接或间接涉及视网膜或角膜细胞变性，一般包括缺血性视网膜病、前部缺血性视神经病、所有形式的视神经炎、老年黄斑病变、糖尿病视网膜病、黄斑囊状水肿(CME)、视网膜色素变性、斯特格病变(Stargardt′s disease)、Best′s vitelliform视网膜变性(Best′s vitelliform retinal degeneration)、莱伯先天性黑朦(Leber′s congenital amaurosis)和其它遗传性视网膜变性、病理性近视、早产儿视网膜病和莱伯遗传性视神经病(Leber′s hereditaryoptic neuropathy)、角膜移植和角膜屈光手术的后效、以及疱疹角膜炎。
另外，本发明的结合分子可用于精神病症(特别是精神分裂症和抑郁)的治疗。
对于这些适应症，合适的剂量当然将依赖于例如将采用的本发明具体分子、施用模式和所治疗疾病的性质和严重性。一般而言，剂量将优选在1μg/kg/天至1mg/kg/天范围内。在损伤位点作为治疗剂通过泵便利地施用或注射本发明的结合分子，例如，可通过颅内直接施用于CNS损伤位点或鞘内施用于脊髓损伤位点。
可以单独、或组合、或与其它制剂连续组合提供本发明的结合分子。例如，可以与抗炎症剂(作为中风或脊髓损伤后阻止进一步的神经元损伤和轴突再生抑制的方法，例如而不限于皮质类固醇)、神经营养因子(例如NGF。BDNF)或其它神经变性疾病药物(例如ExelonTM或左旋多巴)组合使用本发明的结合分子。其它合适的治疗中风的组合配偶体为Alteplase和Desmoteplase(DSPA，例如公开于WO90/09438)。在一个实施方案中，本发明提供含有本发明的结合分子和具体治疗中风的Desmoteplase的组合以及含有所述组合的药物组合物。如此处所用的，当两种制剂同时施用时，将该两种制剂组合施用，或者以两种制剂将同时起作用的方式单独施用。
目录号、属名或商品名确定的活性成分的结构可以从标准目录《TheMerck Index》的现行版本或从数据库，例如国际专利(例如IMS WorldPublications)或其它由IMS Health提供的数据库获得。其相应内容在此引用作为参考。任何本领域技术人员完全可以鉴定该活性成分，并且基于这些参考也能够在标准测试模型(体外和体内)中制造和测试这些药物适应症(pharmaceutical indication)和性能。
可以通过常规方式制造本发明的药物组合物。例如，优选以冻干形式提供本发明的含有本发明分子的组合物。将其溶解于合适的水性载体(例如注射用无菌水或无菌缓冲生理盐水)中用于即刻施用。
为了帮助构成合适的组合物，可以在同一容器中分别包装本发明结合分子和任选的增强本发明结合分子效果的另一种药物，并附带指导混合的说明或指示。上文提供了任选的第二种候选药物。
可以通过脊髓损伤模型在体内证明本发明的结合分子与生长因子(例如NGF)的组合的协同效应。
通过参考下列实施例，本发明将得到更详尽的理解。然而，不应将其解释为限制本发明的范围。
在下列实施例中所有温度为摄氏度(℃)。
实施例中关注的单克隆抗体是含有轻链可变部分(SEQ ID NO3)和重链可变部分(SEQ ID NO2)的本发明结合分子。
使用下列缩写ELISA酶联免疫吸附试验FACS 荧光活化细胞分选术FITC 异硫氰酸荧光素
HCMV 人巨细胞病毒启动子FBS胎牛血清IgG免疫球蛋白同种型GMAb单克隆抗体PBS磷酸盐缓冲盐水PCR聚合酶链式反应实施例1方法人Nogo-A表达构建体(pRK7-hNogo-A)的产生使用标准程序以双重过滤设置(duplicate filter sets)筛选构建在λgt10(Clontech)中的人cDNA文库。使用标准方案通过PCR从人全脑cDNA(Clontech)扩增人Nogo-A片段，随后克隆到pBluescript中、酶切并分离，或直接用作筛选探针。使用400bp XhoI/SmaI片段作为5′探针，以引物CA-NA-2F5′-AAG CAC CAT TGA ATT CTG CAG TTC C-3′(SEQ ID NO29)和CA-NA-3R5′-AAC TGC AGT ACT GAG CTC CTC CAT CTG C-3′(SEQ ID NO30)扩增3′探针。阳性克隆被分离、亚克隆并确定序列。为了获得全长人Nogo-A cDNA，使用人Nono-A序列中唯一的EcoR1限制位点组装重叠克隆，并亚克隆到Bluescript载体中，命名为Pbsnogoa。为了获得pRK7-hNogo-A，通过定向克隆将全长cDNA插入真核表达载体pRK-7中。
用于细菌生产的人NiG(hNiG)表达质粒(pET28a-hNiG)的产生使用引物组正向5′-GTC GCG GAT CCA TGG AGA CCC TTT TTGCTC TTC-3′(SEQ ID NO31)；反向5′-GTT CTC GAG TTA TGA AGTTTT ACT CAG-3′(SEQ ID NO32)从Pbsnogoa PCR扩增各自的编码区后，将编码的hNiG DNA片段与用于细菌表达的N端His-和T7-标签框内亚克隆到pET28a(Novagen)的BamHI/XhoI中。将最终的质粒命名为pET28a-hNiG。然后以1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在大肠杆菌(E.coli)B21中诱导hNiG的表达。
小鼠NiG外显子3(mNiG外显子3)表达质粒的产生以引物正向5′-GTG CGG ATC CAT GGA TTT GAA GGA GCA GC-3′(SEQ ID NO33)；反向5′-GTT TCT CGA GTG AAG TTT TAT TCA GCT C-3′(SEQ IDNO34)从小鼠基因组BAC模板扩增编码小鼠外显子3的区域，并亚克隆到pET28a的BamHI/XhoI克隆位点中。将最终的质粒构建体命名为pET28a-mNiG外显子3。
猴NiG的克隆从冰冻的猴脑组织分离聚腺苷酸化RNA，并使用寡聚dT引物合成cDNA。使用序列特异性引物和校正读码酶通过PCR扩增覆盖该cDNA 5′和3′区的两个重叠片段。使用人NiG cDNA的已知序列设计引物。用于扩增5′片段的引物为5′-TCCACCCCGGCCGCGCCCAA-3′(SEQ ID NO35)和5′-AATGATGGGCAAAGCTGTGCTG-3′(SEQ IDNO36)，用于扩增3′片段的引物为5′-GGTACAAAGATTGCTTATGAAACA-3′(SEQ ID NO37)和5′-AGCAGGGCCAAGGCAATGTAGG-3′(SEQ ID NO38)。然后亚克隆这两个片段，对每个片段至少测序4个独立克隆。使用上述引物通过重叠PCR组装全长cDNA，克隆得到的产物并再次测序。
如上定义的重组NogoNiG蛋白质的产生在大肠杆菌中表达细菌Nogo-A缺失文库。通过在含有0.75mg/ml溶菌酶的超声处理缓冲液(20mM Tris、50mMNaH2PO4、100mM NaCl，pH 8.0)中重复超声，或通过以B-PerTM(Pierce)或8M尿素溶解而提取蛋白质。根据Novagen周质蛋白质纯化方案从周质间隙获得表达的带有pelb前导序列的NiG。使用Co2+-TalonTM金属亲合树脂(Clontech)分批纯化pET28构建体上清液。在用树脂分批纯化的过程中以超声处理缓冲液逐渐取代8M尿素和B-PerTM而将该缓冲液溶解的裂解物置于非变性条件。以含有250mM咪唑的超声处理缓冲液在重力柱(BioRad)上洗脱蛋白质。通过在Superdex200 HiLoad 16/60上凝胶过滤进一步纯化NiG蛋白质。根据厂商(Amersham Pharmacia)说明用G琼脂糖柱分批纯化pGEX-6P构建体上清液。通过将溶解的GST-Nogo-66与PreScission蛋白酶孵育以及随后的HPLC纯化完成GST-Nogo-66的切割。通过IMAC纯化的重组Nogo的制备型SDS-PAGE，由BioRad Electro-Eluter以250mA洗脱1小时到50mM Tris，pH 7.4，100mM NaCl，0.2％(w/v)CHAPS中、以及随后30秒的反转电极极性实施凝胶电洗脱。使用Pierce考马斯染料并BSA作为标准蛋白质确定经色谱纯化的蛋白质的蛋白质浓度。基于银染凝胶(Merril CR，Dunau ML，Goldman D(1981)A rapid sensitive silver stainfor polypeptides in polyacrylamide gels.Analyt.Biochem.110201-207)的条带强度以BSA为标准蛋白质估计经凝胶洗脱的蛋白质的蛋白质浓度。
实施例2人3A6-IgG mAb的产生以相应于人Nogo-A特定序列的人NiG皮下免疫Medarex小鼠(以人免疫球蛋白基因重组)。通过标准杂交瘤技术以该小鼠脾细胞与杂交瘤细胞系融合产生3A6单克隆抗体。用人NiG 70μg/小鼠在颈背和胁腹皮下注射实施Medarex小鼠的免疫，浓度为1.9ml中1.5mg，并混合TiterMax佐剂。皮下注射180μl/小鼠，随后加强数次。在96孔板中实施使用ELISA确定血清中抗Nogo-A Ab效价，所述96孔板以PBS中8μg/ml人NiG于室温(RT)孵育4小时包被(100μl/孔)。将板轻弹并重新填充封闭缓冲液(PBS+5％BSA)200μl/孔，盖盖并于RT孵育1小时或于4度过夜，然后以自来水清洗4次，重新填充PBS并轻弹。在PBS+10％ FCS(100μl/孔)中稀释小鼠血清，于RT孵育2小时或于4度过夜。使用的小鼠血清稀释液为1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶30000。重复清洗步骤。在PBS/0.1％BSA/0.1％Nonidet 40(100μl/孔)中稀释山羊F(ab′)2抗人IgG Fc特异性HRP缀合Ab，并于RT孵育2小时或于4度过夜。重复清洗步骤。以100μl/孔添加BM蓝POD底物，于室温避光孵育15分钟，50μl/孔添加1M H2SO4以终止HRP底物反应。使用酶标测定仪于450nm测定O∶D。如上所述以ELISA进行杂交瘤和克隆的筛选。人NiG(8μg/ml，大肠杆菌)。ELISA对IgG同种分型(Isotyping)。进行实验以确定该抗体的IgG亚类。以人NiG包被板，以1∶10至1∶100的稀释度使用培养物上清液。通过使用一组小鼠抗人IgG亚类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)HRP缀合的mAb孵育4小时评估抗体反应性。使用抗MCP1 IgG1 mAb作为阳性对照。如上所述进行Elisa。从ELISA中具有最高抗人NiG血清效价的小鼠完成杂交瘤的产生，并选作融合。通过吸入CO2处死小鼠。无菌取脾脏并制备单细胞悬液。在无钙、镁的PBS中清洗。在PBS中清洗小鼠骨髓瘤细胞(PAIO)。与小鼠骨髓瘤细胞添加相等数量的5千万个小鼠脾细胞，并于RT以900RPM旋转10分钟。小心地完全去除上清液。于RT，2-3分钟内在轻微搅拌下逐滴添加1ml融合试剂PEG 4000(50∶50在PBS中)。于37度在水浴中温和振荡90秒。在5分钟内逐滴添加5至10ml RPMI1640培养基以稀释PEG，于RT放置10分钟。添加另外20ml无血清培养基并离心。重悬于适量HAT培养基(RPMI+10％FCS+20ml/升50×HAT)中。将融合细胞以100μl/孔置于含有Balb/c小鼠腹膜细胞饲养层(1ml/孔)的孔中。提前24小时制备小鼠腹膜细胞，并准备HAT培养基中1ml培养物和24孔Costar板。一只小鼠的产量足够一块24孔板＝约2000个细胞/孔。处死后，使用10ml注射器和18号(18gauge)针头以5ml 0.34M蔗糖清洗腹腔。将6只小鼠的集合收集到1管中，离心、重悬于HAT培养基中、并等分到孔中。培养基是具有Glutamax的RPMI 1640，含有100μM次黄嘌呤、1.6μM胸苷、0.4μM氨基蝶呤、50μMβ巯基乙醇、50μg/ml庆大霉素、10％热灭活的FCS。依赖于生长速度和杂交瘤外观，每3或4天更换培养基的50％，14天后通过省去氨基蝶呤将HAT培养基更换为HT培养基。筛选杂交瘤和克隆世代。当孔达到约80％汇合率时，在如上所述的ELISA中以1∶3的稀释度测试上清液。通过有限稀释从抗Nogo Ab阳性的杂交瘤进行单细胞克隆。通过有限稀释，以0.5个细胞/100μl/孔接种进行克隆。建立4×96个100μl孔。使用小鼠PE细胞作为饲养层。显微镜检查克隆生长，进行筛选前一天添加100μl培养基。个体杂交瘤的生长速率不同，但是培养物大约需要10天达到足够密集以产生重组的抗体。以1∶10、1∶100的稀释度完成上清液的筛选。培养扩增的阳性克隆并使其适于在滚瓶中生产的1％低血清条件，并使用A蛋白亲合从培养物上清液进行纯化。
实施例3小鼠3A6mAb和Fab 3A6的产生和纯化使用A蛋白琼脂糖Cl-4B柱(Pharmacia；11cm床高)。简言之，以4ml/分钟上样校正pH至8.1的培养物上清液，使用100mM Na2HPO4，pH 8.1以8ml/分钟将柱清洗至基线。最后使用50mM NaH2PO4(pH3.0)、140mM NaCl以8ml/分钟洗脱结合的物质，并立即以5N NaOH中和(pH7.0)并无菌过滤。于280nm监测吸光率。最终通过超滤和/或对PBS透析进一步浓缩纯化物质部分。在10kDa ULTRASETTETM切向流装置(Filtron Technology Corporation)上过滤所有用于纯化的缓冲液以去除可能的内毒素污染物。出于同样原因，以20％乙醇大量清洗A蛋白树脂，所有管道/泵在使用前以0.1M NaOH处理。使用1.35作为1mg/ml的参照吸收，在280nm分光光度测量蛋白质浓度。使用4-20％Novex梯度凝胶在还原条件下通过SDS-PAGE常规评定纯度。根据厂商(Endotell AG，Allschwil，Switzerland)说明，通过经典鲎变形细胞裂解物(LimulusAmoebocyte Lysate，LAL)反应测量内毒素含量。
Fab片段的产生将部分小鼠3A6mAb对100mM醋酸钠，pH 5.5、2mM EDTA彻底透析，并调节至浓度6mg/ml。在0.25mM半胱氨酸存在下通过木瓜蛋白酶酶切(1∶200w/w比)产生Fab片段。允许该反应于37℃进行16小时，然后通过大大过量添加特异性木瓜蛋白酶抑制剂E64(N-[N-(L-3-反式-carboxirane-2-羰基)-L-亮氨酰]-胍丁胺，(10μM)终止。然后将酶切的抗体通过A蛋白Sepharose Fast Flow柱以去除完整物质和Fc片段。将Fab片段对PBS大量透析并浓缩至大约3mg/ml。(木瓜蛋白酶和E64来自Roche Molecular Biochemicals)。
实施例4VL和VH区的HPLC、质谱分析和N端氨基酸测序a)还原和烷基化将纯化、干燥的3A6抗体溶解于40μl 8M尿素、0.4M NH4HCO3(pH 8.3)中。添加60μgDTT(Calbiochem)(预先溶解于10μl与蛋白质相同的缓冲液中)。在氩气下于50℃实施30分钟还原(DTT比蛋白质巯醇摩尔过量100倍)。将样品在还原后冷却至室温。添加溶解于与蛋白质相同的缓冲液的碘乙酰胺(Sigma Ultra，1-1149)304μg。于室温避光实施胺甲酰甲基化作用(Carboxamidomethylation)15分钟。添加1μl β-巯基乙醇猝灭该反应。
b)重链和轻链的分离通过具有DR5泵系统和二极管阵列UV探测器的Hewlett Packard 1090M HPLC System的反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离胺甲酰甲基化抗体重链和轻链。层析条件为填充R1/H材料的PerSeptiveBiosysterns Poros 2.1×100mm柱；流速为0.5ml/分钟；溶剂(A)水中0.1％TFA和(B)0.09％TFA/乙腈/水9∶1；于80℃在8分钟内梯度25-70％B；于218/280nm检测。
c)LC-ESI-MS使用装备Micromass Z型电喷雾电离源(ESI)的Q-Tof(Micromass，Manchester，UK)四极杆飞行时间混合串联质谱仪进行质谱分析。获取质量范围一般为m/z 500-2000。使用MassLynx软件记录并处理数据。使用马心脏肌红蛋白(MW 16951.5)的多电荷离子峰完成500-2500m/z范围的定标。
d)重链和轻链的HPLC-MS在使用以Perseptive BiosystemsPOROS R1/H填充的1mm×150mm LC预装柱的HP1100 HPLC系统(Hewlett Packard，Palo-Alto，CA，USA)上实施还原且胺甲酰甲基化的重链和轻链的分离。将该柱保持在60℃。使用安装Valco模型C6UW HPLC阀(Valco，Houston，TX，USA)和10μl注射环的CTC PAL自动取样器(CTC，Zwingen，Switzerland)将10μl的样品体积注射到柱上。由MassLynx软件(Micromass，Manchester，UK)控制HPLC。在214nm UV检测。洗脱液A是含有0.05％TFA的水。洗脱液B是含有0.045％TFA的水∶乙腈为1∶9的混合物。于80℃在20分钟内运行20％B至90％B的梯度。流速一般为60μl/分钟。将LC系统的总流量无任何分流地引入UV检测室、然后是ESI源。使用MassLynx软件(Micromass，Manchester，UK)控制HPLC系统并处理来自UV探测器的信号。检测到下列5个信号
表1

d)VL和VH区的N端氨基酸测序使用从HPLC收集的H+L链峰用于序列分析。在Hewlett Packard G1000A N端蛋白质测序系统上确定氨基酸序列。该系统对保留在微型吸附双相柱(miniature adsorptive biphasiccolumn)上的蛋白质样品实施自动化Edman化学法。使用优化的化学方法(双耦连3.0)增强化学效率、将滞后最小化从而将测序分析延伸至约50个残基。在装备三泵体系(ternary pumping system)和窄孔(2.1mm×25cm)PTH柱的联机Hewlett Packard HP1090 HPLC系统上实施PTH氨基酸分析。
结果从质量分析确定小鼠3A6-IgG1的同源重链和轻链。H链为单糖基化的。重链和轻链的总质量分析对二链显示单一质量。小鼠3A6-IgG1的HPLC色谱显示单峰。在继还原和烷基化后的HPLC纯化后，可以获得纯的重链和轻链。对轻链和重链实施N端序列降解。通过序列降解鉴定L链和H链N端序列的氨基酸。
轻链EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVS重链EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF实施例5人3A6mAb重链和轻链基因的克隆根据厂商说明使用TriPure试剂(Rochediagnostics，Germany，Cat.#1667157)从107个杂交瘤细胞(3A6克隆)制备总RNA。使用Oligotex Resin(Qiagen，Germany，cat.#70022)从上面制备的总RNA分离mRNA用于cDNA合成。
使用下列条件通过反转录产生cDNA2μl mRNA、2μl 10×反转录缓冲液、2μl(dT)20引物(10M)、0.5μl RNasin(Promega，40U/ml)、2μldNTP(各5mM)、1μl OmniscriptTM反转录酶(Qiagen，Cat#05110)，10.5μl ddH2O，反应于37℃1小时。使用校正读码酶ProofStartTMDNA聚合酶进行扩增编码VH和VL的cDNA的PCR。
轻链和重链的PCR反应混合物2μl cDNA、5μl 10×反应缓冲液、3μl dNTP(各5mM)、2μl 5′引物(10μM)(见表2)、2μl 3′引物(10μM)(见表2)、1μl ProofStart(Qiagen，Cat#202203)、36μl ddH2O。PCR条件95℃/5分钟，(95℃/40秒，53℃/1分钟，72℃1分钟)×35，72℃/10分钟。将产生的PCR产物直接连接到pCRbluntTOPO(Invitrogen)中。将该连接产物转染到TOP 10细胞(Invitrogen)中并挑取若干克隆。在ABI测序仪上测定3A6mAb重链(V-H，SEQ ID NO43)和3A6mAb轻链(V-L，SEQ ID NO44)可变部分的cDNA的核苷酸序列。对来自两个独立实验(RNA→cDNA→RT-PCR)的mAb3A6轻链cDNA的总共10个克隆进行测序和比对。随后的V-H和V-L的氨基酸序列显示于SEQ IDNO2(V-H)和SEQ ID NO3(V-L)中。用于VH和VLcDNA的PCR扩增的引物，所有引物由MWG Biotech，Germany合成。
表2

IgG4表达载体的克隆VH区的分子克隆使用引物#1和#2通过PCR从重组pCRII质粒扩增VHcDNA。以BstEII切割产生的PCR片段，并亚克隆到HCcassAAL的HincII/BstEII位点，产生中间质粒nogohccass。通过使用引物IgG4HC5′完成重链前导序列在-2位的氨基酸交换(谷氨酰胺取代天冬氨酸)。通过自动化测序核实正确序列，并通过XbaI/BamHI酶切释放VHcDNA片段。连接到经BamHI/XbaI酶切的hcMCPfin中产生最终的AnogoHC3A6表达构建体。
VL区的分子克隆使用引物#3和#4通过PCR从重组pCRII质粒扩增VLcDNA，由此引入MIuI和HindIII位点。通过引入HindIII限制位点，发生连接区的氨基酸交换(R→K)。这导致将J5型连接区改变为J2型。将产生的PCR片段亚克隆到pCRII-blunt中并核实序列。通过MIuI/HindIII酶切释放正确片段，并连接到表达载体LCvec-AAL160中，由此产生最终质粒AnogoLC3A6。

人3A6mAb的表征实施例6使用ELISA的3A6和Fab与人Nogo-A的结合以PBS中的0.4-2μg/ml Nogo蛋白质片段包被(100μl/孔)Greiner 96孔PS板(#655161)，盖盖并于室温孵育4小时。将板轻弹并以200μl/孔封闭缓冲液(PBS+2％BSA)重新填充，盖盖并于RT孵育1小时或于4℃过夜，然后用水清洗3次、用PBS清洗2一次。将不同浓度的人3A6IgG1、IgG4mAb或3A6Fab稀释于PBS+2％BSA(100μl/孔)中，并于RT孵育2小时或于4℃过夜。重复清洗步骤，添加PBS/0.1％ BSA/0.1％Nonidet 40中以1∶5000稀释的缀合马辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗人IgG(Jackson Immuno Research#109-036-098)或对于3A6Fab以1∶5000稀释于PBS/0.1％BSA/0.1％Nonidet 40的驴抗人HRP(Jackson ImmunoResearch 709-035-149)(100μl/孔)，于RT孵育2小时或于4℃过夜，重复清洗步骤。通过添加100μl/孔BM蓝POD(Roche#1484281)开始HRP反应，并于RT避光孵育15分钟。以50μl/孔添加1M H2SO4终止HRP底物反应，使用设定为450nm的酶标测定仪(Packard Spectra Count)确定光密度。
结果人3A6 lgG1、IgG4 mAb和3A6 Fab以0.01-10nM范围内的极低浓度与人NiG结合。
实施例7小鼠3A6-IgG1、3A6-IgG4和3A6 Fab对Nogo-A结构域的生物传感器亲合力测量根据厂商说明使用BlAcore 2000光学生物传感器(Biacore，Uppsala，Sweden)通过表面等离振子共振(SPR)测量小鼠3A6-IgG1 mAb、3A6-IgG4 mAb的亲合力和3A6 Fab的亲合力。使用胺耦连化学法将重组人NIG共价固定于CM5传感器芯片流动室上。简而言之，通过注射35μl含有0.025M NHS和0.1M EDC的溶液活化羧甲基化的葡聚糖底物。为了固定在传感器芯片上，将重组人NIG稀释于pH 4的0.01M柠檬酸缓冲液中，并以5μl/分钟的流速注射以达到允许亲合力测量的耦连水平。通过注射35μl 1M的乙醇胺盐酸溶液(pH 8.5)实施残余NHS酯基的失活。通过注射5μl 0.1M HCl再生传感器芯片表面。对于亲合力测量，以不同浓度(0.50nM至100nM范围内)于200μl/分钟的流速注射抗体。每次注射后传感器芯片表面以注射10μl 0.1M HCl再生而不损失该表面的结合活性。使用厂商提供的BlAevaluations 3.0软件确定动力学常数ka和kd以及亲合力常数KA和KD的数值。
BlAcore中的亲合力测量使用表面等离振子共振(SPR)技术(Biacore)实时测量小鼠3A6-lgG1 mAb、3A6-IgG4 mAb以及3A6来源的单价Fab片段对重组人NogoA的动力学和亲合力结合常数。对于该分析，将人NIG耦连到传感器芯片表面，并注射不同浓度的抗体。通过非线性曲线拟合从传感图获得结合相互作用的动力学参数。抗体与人NIG平衡的亲合力常数对于3A6-IgG4、3A6-IgG1、3A6Fab在KD 0.14nM至2.7nM范围。
实施例8使用Pepspot分析的3A6 mAb表位鉴定从Jerini Peptide Technologies，Berlin，Germany购买Pepspot膜。第一次孵育之前，将该膜以乙醇漂洗1分钟、以TBS漂洗3次，每次10分钟。每次以一级抗体孵育之前，于4℃将该膜在封闭缓冲液中孵育过夜。以TBS-T清洗10分钟后，于RT将该膜以封闭缓冲液中的一级抗体孵育3小时。抗体浓度为c(3A6)＝0.6nM。以TBS-T清洗三次(每次10分钟)后，将该膜于RT与1∶500 000稀释于封闭缓冲液中的相应二级抗体孵育2小时。以TBS-T清洗三次后，根据厂商说明将该膜与化学发光检测试剂(ECL Advance，Amersham Biosciences)孵育并对胶片曝光。
使用人和猴Nogo-A蛋白的蛋白质印迹分析根据标准方法进行蛋白质印迹分析。将10ng从大肠杆菌纯化的人NiG施加于各泳道，实施SDS-PAGE并转移至硝化纤维素膜。于4℃在封闭缓冲液中封闭过夜。抗体(1nM于0.5％封闭缓冲液中)与肽(10、100和1000倍摩尔过量的肽，人NiG肽表位HNQQELPTALTKLVKED、错乱肽(Scrambled peptide)H-ETQLAKLPVDLKTQEJerini PeptideTechnologies，Berlin，Germany)于RT孵育1小时后，将膜加入该溶液并在摇床上于RT孵育1小时。以TBS-T清洗三次(每次10分钟)后，将膜与以1∶100000稀释于封闭缓冲液的相应二级HRP标记抗体(来自JacksonImmuno Research的山羊抗人IgG Fab2)于RT孵育1小时。以TBS-T清洗三次后，根据厂商说明将该膜与化学发光检测试剂(ECL Advance，Amersham Biosciences)孵育并对胶片曝光15秒。根据标准方法进行恒河猴NiG的蛋白质印迹分析。将在IPTG诱导下表达猴NiG的大肠杆菌pET28-猴NiG细胞裂解液的等分试样施加于各泳道。将没有诱导表达的相同细胞的细胞裂解液上样作为阴性对照。实施SDS-PAGE并转移至硝化纤维素膜。于4℃在封闭缓冲液中封闭过夜。抗体(1nM于0.5％封闭缓冲液中，Roche Applied Science)与肽(10-、100-和1000倍摩尔过量的肽，序列NQQELPIALTKLVKEED，Jerini Peptide Technologies)于RT孵育1小时后，将膜加入该溶液并在摇床上于RT再孵育1小时。以TBS-T清洗三次(每次10分钟)后，将膜与以1∶100000稀释于封闭缓冲液的抗人HRP标记的二级抗体于RT孵育1小时。以TBS-T清洗三次后，根据厂商说明将该膜以化学发光检测试剂(ECL Advance，Amersham Biosciences)孵育并对胶片曝光15秒。
ELISA中3A6mAb与人和猴肽表位的结合将Greiner 96孔PS板以PBS中的8μg/ml错乱肽H-ETQLAKLPVDLKTQE、人NiG肽表位3A6 IgG4H-NQQELPTALTKLVKED和肽表位3A6 IgG4猴NiG、H-NQQELPIALTKLVKEED包被(100μl/孔)，盖盖并于室温孵育4小时。将板轻弹并以200μl/孔封闭缓冲液(PBS+5％BSA)重新填充，盖盖并于RT孵育1小时或于4摄氏度过夜孵育，然后用自来水清洗4次，以PBS重新填充并轻弹。将mAb 3A6 IgG4稀释于PBS+2％ BSA中(100μl/孔)，并于RT孵育2小时或于4℃过夜孵育。mAb稀释物10nM至0.001nM。重复清洗步骤。将二级Ab稀释于PBS/0.1％BSA/0.1％Nonidet 40中(100μl/孔)，于RT孵育2小时或于4℃过夜。重复清洗步骤。以100μl/孔添加BM蓝POD底物，并于室温避光孵育15分钟，以50μl/孔添加1M H2SO4以终止HRP底物反应。使用设定为450nm的酶标测定仪测定OD。
结果人3A6 mAb的表位定位表位定位得到人NiG蛋白质中的序列ELPTALTKLV。
蛋白质印迹中mAb 3A6与合成肽结合人NiG的竞争为了证实通过pepspot技术获得的结果，实施蛋白质印迹竞争实验。使用含有推定表位序列(NQQELPTALTKLVKED)的合成16肽用于与全长人NiG竞争结合3A6抗体。在与膜结合的人NiG孵育之前，使用合成肽与抗体的不同摩尔比将3A6抗体(1nM)与合成肽孵育1小时。该肽的10倍摩尔过量显示出对人NiG(大肠杆菌中产生)的检测信号的显著降低。100倍过量导致该信号的进一步降低，该肽的1000倍摩尔过量几乎完全抑制3A6与人NiG的结合。相反，具有相同氨基酸成分但是具有不同序列(错乱的)的肽的1000倍过量对该抗体与人NiG的结合没有任何影响。
mAb 3A6与猴NiG的结合与合成肽表位的竞争使用含有表位序列(NQQELPIALTKLVKEED)的合成17肽与大肠杆菌中表达的全长恒河猴NiG竞争结合3A6抗体。在与膜结合的猴NiG孵育之前，使用合成肽与抗体的不同摩尔比将3A6抗体(1nM)与合成肽孵育1小时。100倍过量导致信号的降低，该肽1000倍摩尔过量基本抑制了3A6与猴NiG的结合。相反，具有相同氨基酸成分但是具有不同序列(错乱的)的肽的1000倍过量对该抗体与人NiG的结合没有任何影响。
ELISA中3A6 IgG4与人和猴NiG肽表位的结合使用ELISA实施该mAb与表位和错乱序列的详细的结合分析。结果明确显示该mAb以浓度依赖的方式在极低浓度(0.001至1.0nM)与猴和人肽表位结合，所述浓度与其在BlAcore中对人NiG的0.14nM的KD相当。此外，结合是特异性的，错乱的对照肽没有结合。
序列表<110>诺瓦提斯公司<120>有机化合物<130>4-32761P1/UNZ<160>44<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>18
<212>PRT<213>褐家鼠<220>
<221>PEPTIDE<222>(1)..(18)<223>大鼠NogoA_342-357<400>1Ser Tyr Asp Ser Ile Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu1 5 10 15Glu Ala<210>2<211>221
<212>PRT<213>小鼠<220>
<221>CHAIN<222>(1)..(221)<223>具有前导序列的3A6重链的可变部分<400>2Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Gly Leu Leu Lys Gly Val1 510 15Gln Cys Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro2025 30Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Asp Phe Arg35 4045
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Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val180185190Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser195200205Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala210215220<210>3<211>238<212>PRT<213>小鼠<220>
<221>CHAIN<222>(1)..(238)
<223>具有前导序列的3A6轻链<400>3Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg Glu1 5 10 15Thr Ser Gly Asp Val Leu Leu Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Ile20 25 30Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu35 40 45Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro50 55 60Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser65 70 75 80Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr Cys100105110Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu115120125Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro130135140Ser Ser Glu Gln Lell Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu145150155160Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly165170175Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser180185190Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp195200205Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr210215220
Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225230235<210>4<211>3919<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)..(3579)<223>人NogoA<400>4atg gaa gac ctg gac cag tct cct ctg gtc tcg tcc tcg gac agc cca 48Met Glu Asp Leu Asp Gln Ser Pro Leu Val Ser Ser Ser Asp Ser Pro1 5 10 15
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aca aag ctt tct gct gaa cca gct ccg gat ttc tct gat tat tca gaa2160Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro Ala Pro Asp Phe Ser Asp Tyr Ser Glu705710715720atg gca aaa gtt gaa cag cca gtg cct gat cat tct gag cta gtt gaa2208Met Ala Lys Val Glu Gln Pro Val Pro Asp His Ser Glu Leu Val Glu725730735gat tcc tca cct gat tct gaa cca gtt gac tta ttt agt gat gat tca2256Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser740745750ata cct gac gtt cca caa aaa caa gat gaa act gtg atg ctt gtg aaa2304Ile Pro Asp Val Pro Gln Lys Gln Asp Glu Thr Val Met Leu Val Lys755760765gaa agt ctc act gag act tca ttt gag tca atg ata gaa tat gaa aat2352Glu Ser Leu Thr Glu Thr Ser Phe Glu Ser Met Ile Glu Tyr Glu Asn770775780aag gaa aaa ctc agt gct ttg cca cct gag gga gga aag cca tat ttg2400Lys Glu Lys Leu Ser Ala Leu Pro Pro Glu Gly Gly Lys Pro Tyr Leu785790795800gaa tct ttt aag ctc agt tta gat aac aca aaa gat acc ctg tta cct2448Glu Ser Phe Lys Leu Ser Leu Asp Asn Thr Lys Asp Thr Leu Leu Pro805810815
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gct ctc att tca ctc ttc agt gtt cct gtt att tat gaa cgg cat3474Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser Val Pro Val Ile Tyr Glu Arg His114511501155cag gca cag ata gat cat tat cta gga ctt gca aat aag aat gtt3519Gln Ala Gln Ile Asp His Tyr Leu Gly Leu Ala Asn Lys Asn Val116011651170aaa gat gct atg gct aaa atc caa gca aaa atc cct gga ttg aag3564Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gln Ala Lys Ile Pro Gly Leu Lys117511801185cgc aaa gct gaa tga aaacgcccaa aataattagt aggagttcat ctttaaaggg3619Arg Lys Ala Glu1190gatattcatt tgattatacg ggggagggtc agggaagaac gaaccttgac gttgcagtgc 3679agtttcacag atcgttgtta gatctttatt tttagccatg cactgttgtg aggaaaaatt 3739acctgtcttg actgccatgt gttcatcatc ttaagtattg taagctgcta tgtatggatt 3799taaaccgtaa tcatatcttt ttcctatctg aggcactggt ggaataaaaa acctgtatat 3859tttactttgt tgcagatagt cttgccgcat cttggcaagt tgcagagatg gtggagctag 3919<210>5
<211>1192<212>PRT<213>人<400>5Met Glu Asp Leu Asp Gln Ser Pro Leu Val Ser Ser Ser Asp Ser Pro1 5 10 15Pro Arg Pro Gln Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Arg Glu Pro Glu20 25 30Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp35 40 45Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly Leu Ser50 55 60Ala Ala Pro Val Pro Thr Ala Pro Ala Ala Gly Ala Pro Leu Met Asp65 70 75 80
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Glu Glu Ile Ile Val Lys Asn Lys Asp Glu Glu Glu Lys Leu Val Ser325330335Asn Asn Ile Leu His Asn Gln Gln Glu Leu Pro Thr Ala Leu Thr Lys340345350Leu Val Lys Glu Asp Glu Val Val Ser Ser Glu Lys Ala Lys Asp Ser355360365Phe Asn Glu Lys Arg Val Ala Val Glu Ala Pro Met Arg Glu Glu Tyr370375380Ala Asp Phe Lys Pro Phe Glu Arg Val Trp Glu Val Lys Asp Ser Lys385390395400Glu Asp Ser Asp Met Leu Ala Ala Gly Gly Lys Ile Glu Ser Asn Leu405410415Glu Ser Lys Val Asp Lys Lys Cys Phe Ala Asp Ser Leu Glu Gln Thr420425430Asn His Glu Lys Asp Ser Glu Ser Ser Asn Asp Asp Thr Ser Phe Pro435440445
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Ser Glu Leu Asn Glu Val Thr Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys565570575Met Asp Leu Val Gln Thr Ser Glu Val Met Gln Glu Ser Leu Tyr Pro580585590Ala Ala Gln Leu Cys Pro Ser Phe Glu Glu Ser Glu Ala Thr Pro Ser595600605Pro Val Leu Pro Asp Ile Val Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Ala Val610615620Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val Ile Gln Pro Ser Ser Ser Pro Leu Glu625630635640Ala Ser Ser Val Asn Tyr Glu Ser Ile Lys His Glu Pro Glu Asn Pro645650655Pro Pro Tyr Glu Glu Ala Met Ser Val Ser Leu Lys Lys Val Ser Gly660665670Ile Lys Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gln675680685
Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu690695700Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro Ala Pro Asp Phe Ser Asp Tyr Ser Glu705710715720Met Ala Lys Val Glu Gln Pro Val Pro Asp His Ser Glu Leu Val Glu725730735Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser740745750Ile Pro Asp Val Pro Gln Lys Gln Asp Glu Thr Val Met Leu Val Lys755760765Glu Ser Leu Thr Glu Thr Ser Phe Glu Ser Met Ile Glu Tyr Glu Asn770775780Lys Glu Lys Leu Ser Ala Leu Pro Pro Glu Gly Gly Lys Pro Tyr Leu785790795800
Glu Ser Phe Lys Leu Ser Leu Asp Asn Thr Lys Asp Thr Leu Leu Pro805810815Asp Glu Val Ser Thr Leu Ser Lys Lys Glu Lys Ile Pro Leu Gln Met820825830Glu Glu Leu Ser Thr Ala Val Tyr Ser Asn Asp Asp Leu Phe Ile Ser835840845Lys Glu Ala Gln Ile Arg Glu Thr Glu Thr Phe Ser Asp Ser Ser Pro850855860Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr Leu Ile Ser Ser Lys Thr Asp865870875880Ser Phe Ser Lys Leu Ala Arg Glu Tyr Thr Asp Leu Glu Val Ser His885890895Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ala Pro Asp Gly Ala Gly Ser Leu Pro Cys900905910Thr Glu Leu Pro His Asp Leu Ser Leu Lys Asn Ile Gln Pro Lys Val915920925
Glu Glu Lys Ile Ser Phe Ser Asp Asp Phe Ser Lys Asn Gly Ser Ala930935940Thr Ser Lys Val Leu Leu Leu Pro Pro Asp Val Ser Ala Leu Ala Thr945950955960Gln Ala Glu Ile Glu Ser Ile Val Lys Pro Lys Val Leu Val Lys Glu965970975Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp Arg Ser Pro980985990Ser Ala Ile Phe Ser Ala Glu Leu Ser Lys Thr Ser Val Val Asp Leu99510001005Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe Gly Ala101010151020Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val Ser102510301035
Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser104010451050Phe Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp105510601065Glu Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile107010751080Ser Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His108510901095Val Asn Cys Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp110011051110Asp Leu Val Asp Ser Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val Phe111511201125Thr Tyr Val Gly Ala Leu Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Leu113011351140Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser Val Pro Val Ile Tyr Glu Arg His114511501155
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Thr Leu Leu Ile Asp Arg Asp Leu Thr Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr100105110Ser Glu Met Gly Ser Ser Phe Ser Val Ser Pro Lys Ala Glu Ser Ala115120125Val Ile Val Ala Asn Pro Arg Glu Glu Ile Ile Val Lys Asn Lys Asp130135140Glu Glu Glu Lys Leu Val Ser Asn Asn Ile Leu His Asn Gln Gln Glu145150155160Leu Pro Thr Ala Leu Thr Lys Leu Val Lys Glu Asp Glu Val Val Ser165170175Ser Glu Lys Ala Lys Asp Ser Phe Asn Glu Lys Arg Val Ala Val Glu180185190Ala Pro Met Arg Glu Glu Tyr Ala Asp Phe Lys Pro Phe Glu Arg Val195200205Trp Glu Val Lys Asp Ser Lys Glu Asp Ser Asp Met Leu Ala Ala Gly210215220
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Lys His Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala Met Ser Val465470475480Ser Leu Lys Lys Val Ser Gly Ile Lys Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu485490495Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile500505510Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro Ala Pro515520525Asp Phe Ser Asp Tyr Ser Glu Met Ala Lys Val Glu Gln Pro Val Pro530535540Asp His Ser Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu Pro Val545550555560Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro Asp Val Pro Gln Lys Gln Asp565570575
Glu Thr Val Met Leu Val Lys Glu Ser Leu Thr Glu Thr Ser Phe Glu580585590Ser Met Ile Glu Tyr Glu Asn Lys Glu Lys Leu Ser Ala Leu Pro Pro595600605Glu Gly Gly Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Lys Leu Ser Leu Asp Asn610615620Thr Lys Asp Thr Leu Leu Pro Asp Glu Val Ser Thr Leu Ser Lys Lys625630635640Glu Lys Ile Pro Leu Gln Met Glu Glu Leu Ser Thr Ala Val Tyr Ser645650655Asn Asp Asp Leu Phe Ile Ser Lys Glu Ala Gln Ile Arg Glu Thr Glu660665670Thr Phe Ser Asp Ser Ser Pro Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr675680685Leu Ile Ser Ser Lys Thr Asp Ser Phe Ser Lys Leu Ala Arg Glu Tyr690695700
Thr Asp Leu Glu Val Ser His Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ala Pro Asp705710715720Gly Ala Gly Ser Leu Pro Cys Thr Glu Leu Pro His Asp Leu Ser Leu725730735Lys Asn Ile Gln Pro Lys Val Glu Glu Lys Ile Ser Phe Ser Asp Asp740745750Phe Ser Lys Asn Gly Ser Ala Thr Ser Lys Val Leu Leu Leu Pro Pro755760765Asp Val Ser Ala Leu Ala Thr Gln Ala Glu Ile Glu Ser Ile Val Lys770775780Pro Lys Val Leu Val Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr785790795800Glu Lys Glu Asp Arg Ser Pro Ser Ala Ile Phe Ser Ala Glu Leu Ser805810815
Lys Thr Ser<210>8<211>10<212>PRT<213>小鼠<220>
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<210>10<211>9<212>PRT<213>小鼠<220>
<221>BINDING<222>(1)..(9)<223>3A6重链的高变部分<400>10Pro Val Trp Met Tyr Ala Met Asp Tyr1 5<210>11<211>16
<212>PRT<213>小鼠<220>
<221>BINDING<222>(1)..(16)<223>3A6轻链的高变部分<400>11Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn1 5 10 15<210>12<211>7<212>PRT<213>小鼠
<220>
<221>BINDING<222>(1)..(7)<223>3A6轻链的高变部分<400>12Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser1 5<210>13<211>9<212>PRT<213>小鼠<220>
<221>BINDING<222>(1)..(9)<223>3A6轻链的高变部分<400>13Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gln Thr1 5<210>14<211>30<212>DNA<213>小鼠<220>
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<220>
<221>misc_binding<222>(1)..(21)<223>DNA-CDR′2-3A6<400>18ctggtgtcta aactggactc t 21<210>19<211>27<212>DNA<213>小鼠<220>
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Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Gly Leu Leu Lys Gly Val1 5 10 15cag tgt 54Gln Cys<210>21<21l>18<212>PRT<213>小鼠<400>21Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Gly Leu Leu Lys Gly Val1 5 10 15Gln Cys<210>22
<211>57<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>CDS<222>(1)..(57)<223>3A6的轻链前导序列<400>22atg agt cct gcc cag ttc ctg ttt ctg tta gtg ctc tgg att cgg gaa 48Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg Glu1 5 10 15acc agc ggt 57Thr Ser Gly<210>23
<211>19<212>PRT<213>小鼠<400>23Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg Glu1 5 10 15Thr Ser Gly<210>24<211>181<212>PRT<213>人<220>
<221>PEPTIDE<222>(1)..(181)<223>人Nig-D20<400>24Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Met Asp Leu Val Gln Thr Ser1 5 10 15Glu Val Met Gln Glu Ser Leu Tyr Pro Ala Ala Gln Leu Cys Pro Ser20 25 30Phe Glu Glu Ser Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val35 40 45Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Ala Val Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val50 55 60Ile Gln Pro Ser Ser Ser Pro Leu Glu Ala Ser Ser Val Asn Tyr Glu65 70 75 80
Ser Ile Lys His Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala Met85 90 95Ser Val Ser Leu Lys Lys Val Ser Gly Ile Lys Glu Glu Ile Lys Glu100105110Pro Glu Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile115120125Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro130135140Ala Pro Asp Phe Ser Asp Tyr Ser Glu Met Ala Lys Val Glu Gln Pro145150155160Val Pro Asp His Ser Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu165170175Pro Val Asp Leu Phe180<210>25
<211>3492<212>DMA<213>褐家鼠<220>
<221>CDS<222>(1)..(3492)<223>大鼠NogoA<400>25atg gaa gac ata gac cag tcg tcg ctg gtc tcc tcg tcc acg gac agc 48Met Glu Asp Ile Asp Gln Ser Ser Leu Val Ser Ser Ser Thr Asp Ser1 5 10 15ccg ccc cgg cct ccg ccc gcc ttc aag tac cag ttc gtg acg gag ccc 96Pro Pro Arg Pro Pro Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Thr Glu Pro20 25 30gag gac gag gag gac gag gag gag gag gag gac gag gag gag gac gac 144Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Asp35 40 45
gag gac cta gag gaa ctg gag gtg ctg gag agg aag ccc gca gcc ggg192Glu Asp Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly50 55 60ctg tcc gca gct gcg gtg ccg ccc gcc gcc gcc gcg ccg ctg ctg gac240Leu Ser Ala Ala Ala Val Pro Pro Ala Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp65 70 75 80ttc agc agc gac tcg gtg ccc ccc gcg ccc cgc ggg ccg ctg ccg gcc288Phe Ser Ser Asp Ser Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala85 90 95gcg ccc cct gcc gct cct gag agg cag cca tcc tgg gaa cgc agc ccc336Ala Pro Pro Ala Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Glu Arg Ser Pro100 105110gcg gcg ccc gcg cca tcc ctg ccg ccc gct gcc gca gtc ctg ccc tcc384Ala Ala Pro Ala Pro Ser Leu Pro Pro Ala Ala Ala Val Leu Pro Ser115 120125aag ctc cca gag gac gac gag cct ccg gcg agg ccc ccg cct ccg ccg432Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro Pro Pro Pro130135140cca gcc ggc gcg agc ccc ctg gcg gag ccc gcc gcg ccc ccttcc acg480Pro Ala Gly Ala Ser Pro Leu Ala Glu Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr145150155160
ccg gcc gcg ccc aag cgc agg ggc tcc ggc tca gtg gat gag acc ctt528Pro Ala Ala Pro Lys Arg Arg Gly Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu165 170 175ttt gct ctt cct gct gca tct gag cct gtg ata ccc tcc tct gca gaa576Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Pro Ser Ser Ala Glu180185190aaa att atg gat ttg atg gag cag cca ggt aac act gtt tcg tct ggt624Lys Ile Met Asp Leu Met Glu Gln Pro Gly Asn Thr Val Ser Ser Gly195 200205caa gag gat ttc cca tct gtc ctg ctt gaa act gct gcc tct ctt cct672Gln Glu Asp Phe Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro210215220tct cta tct cct ctc tca act gtt tct ttt aaa gaa cat gga tac ctt720Ser Leu Ser Pro Leu Ser Thr Val Ser Phe Lys Glu His Gly Tyr Leu225230235240ggt aac tta tca gca gtg tca tcc tca gaa gga aca att gaa gaa act768Gly Asn Leu Ser Ala Val Ser Ser Ser Glu Gly Thr Ile Glu Glu Thr245250255tta aat gaa gct tct aaa gag ttg cca gag agg gca aca aat cca ttt816Leu Asn Glu Ala Ser Lys Glu Leu Pro Glu Arg Ala Thr Asn Pro Phe260 265270
gta aat aga gat tta gca gaa ttt tca gaa tta gaa tat tca gaa atg 864Val Asn Arg Asp Leu Ala Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met275 280285gga tca tct ttt aaa ggc tcc cca aaa gga gag tca gcc ata tta gta 912Gly Ser Ser Phe Lys Gly Ser Pro Lys Gly Glu Ser Ala Ile Leu Val290295300gaa aac act aag gaa gaa gta att gtg agg agt aaa gac aaa gag gat 960Glu Asn Thr Lys Glu Glu Val Ile Val Arg Ser Lys Asp Lys Glu Asp305310315320tta gtt tgt agt gca gcc ctt cac agt cca caa gaa tca cct gtg ggt1008Leu Val Cys Ser Ala Ala Leu His Ser Pro Gln Glu Ser Pro Val Gly325330 335aaa gaa gac aga gtt gtg tct cca gaa aag aca atg gac att ttt aat1056Lys Glu Asp Arg Val Val Ser Pro Glu Lys Thr Met Asp Ile Phe Asn340345350gaa atg cag atg tca gta gta gca cct gtg agg gaa gag tat gca gac1104Glu Met Gln Met Ser Val Val Ala Pro Val Arg Glu Glu Tyr Ala Asp355360365ttt aag cca ttt gaa caa gca tgg gaa gtg aaa gat act tat gag gga1152Phe Lys Pro Phe Glu Gln Ala Trp Glu Val Lys Asp Thr Tyr Glu Gly370375380
agt agg gat gtg ctg gct gct aga gct aat gtg gaa agt aaa 9tg gac1200Ser Arg Asp Val Leu Ala Ala Arg Ala Asn Val Glu Ser Lys Val Asp385390395400aga aaa tgc ttg gaa gat agc ctg gag caa aaa agt ctt ggg aag gat1248Arg Lys Cys Leu Glu Asp Ser Leu Glu Gln Lys Ser Leu Gly Lys Asp405410415agt gaa ggc aga aat gag gat gct tct ttc ccc agt acc cca gaa cct1296Ser Glu Gly Arg Asn Glu Asp Ala Ser Phe Pro Ser Thr Pro Glu Pro420425430gtg aag gac agc tcc aga gca tat att acc tgt gct tcc ttt acc tca1344Val Lys Asp Ser Ser Arg Ala Tyr Ile Thr Cys Ala Ser Phe Thr Ser435440445gca acc gaa agc acc aca gca aac act ttc cct ttg tta gaa gat cat1392Ala Thr Glu Ser Thr Thr Ala Asn Thr Phe Pro Leu Leu Glu Asp His450455460act tca gaa aat aaa aca gat gaa aaa aaa ata gaa gaa agg aag gcc1440Thr Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Arg Lys Ala465470475480caa att ata aca gag aag act agc ccc aaa acg tca aat cct ttc ctt1488Gln Ile Ile Thr Glu Lys Thr Ser Pro Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu485490495
gta gca gta cag gat tct gag gca gat tat gtt aca aca gat acc tta1536Val Ala Val Gln Asp Ser Glu Ala Asp Tyr Val Thr Thr Asp Thr Leu500505510tca aag gtg act gag gca gca gtg tca aac atg cct gaa ggt ctg acg1584Ser Lys Val Thr Glu Ala Ala Val Ser Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr515520525cca gat tta gtt cag gaa gca tgt gaa agt gaa ctg aat gaa gcc aca1632Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu Ser Glu Leu Asn Glu Ala Thr530535540ggt aca aag att gct tat gaa aca aaa gtg gac ttg gtc caa aca tca1680Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Val Asp Leu Val Gln Thr Ser545550555560gaa gct ata caa gaa tca ctt tac ccc aca gca cag ctt tgc cca tca1728Glu Ala Ile Gln Glu Ser Leu Tyr Pro Thr Ala Gln Leu Cys Pro Ser565570575ttt gag gaa gct gaa gca act ccg tca cca gtt ttg cct gat att gtt1776Phe Glu Glu Ala Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val580585590atg gaa gca cca tta aat tct ctc ctt cca agc gct ggt gct tct gta1824Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Leu Leu Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val595600605
gtg cag ccc agt gta tcc cca ctg gaa gca cct cct cca gtt agt tat1872Val Gln Pro Ser Val Ser Pro Leu Glu Ala Pro Pro Pro Val Ser Tyr610615620gac agt ata aag ctt gag cct gaa aac ccc cca cca tat gaa gaa gcc1920Asp Ser Ile Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala625630635640atg aat gta gca cta aaa gct ttg gga aca aag gaa gga ata aaa gag1968Met Asn Val Ala Leu Lys Ala Leu Gly Thr Lys Glu Gly Ile Lys Glu645650655cct gaa agt ttt aat gca gct gtt cag gaa aca gaa gct cct tat ata2016Pro Glu Ser Phe Asn Ala Ala Val Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile660665670tcc att gcg tgt gat tta att aaa gaa aca aag ctc tcc act gag cca2064Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Thr Glu Pro675680685agt cca gat ttc tct aat tat tca gaa ata gca aaa ttc gag aag tcg2112Ser Pro Asp Phe Ser Asn Tyr Ser Glu Ile Ala Lys Phe Glu Lys Ser690695700gtg ccc gaa cac gct gag cta gtg gag gat tcc tca cct gaa tct gaa2160Val Pro Glu His Ala Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Glu Ser Glu705710715720
cca gtt gac tta ttt agt gat gat tcg att cct gaa gtc cca caa aca2208Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro Glu Val Pro Gln Thr725730735caa gag gag gct gtg atg ctc atg aag gag agt ctc act gaa gtg tct2256Gln Glu Glu Ala Val Met Leu Met Lys Glu Ser Leu Thr Glu Val Ser740745750gag aca gta gcc cag cac aaa gag gag aga ctt agt gcc tca cct cag2304Glu Thr Val Ala Gln His Lys Glu Glu Arg Leu Ser Ala Ser Pro Gln755760765gag cta gga aag cca tat tta gag tct ttt cag ccc aat tta cat agt2352Glu Leu Gly Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Gln Pro Asn Leu His Ser770775780aca aaa gat gct gca tct aat gac att cca aca ttg acc aaa aag gag2400Thr Lys Asp Ala Ala Ser Asn Asp Ile Pro Thr Leu Thr Lys Lys Glu785790795800aaa att tct ttg caa atg gaa gag ttt aat act gca att tat tca aat2448Lys Ile Ser Leu Gln Met Glu Glu Phe Asn Thr Ala Ile Tyr Ser Asn805810815gat gac tta ctt tct tct aag gaa gac aaa ata aaa gaa agt gaa aca2496Asp Asp Leu Leu Ser Ser Lys Glu Asp Lys Ile Lys Glu Ser Glu Thr820825830
ttt tca gat tca tct ccg att gag ata ata gat gaa ttt ccc acg ttt2544Phe Ser Asp Ser Ser Pro Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr Phe835840845gtc agt gct aaa gat gat tct cct aaa tta gcc aag gag tac act gat2592Val Ser Ala Lys Asp Asp Ser Pro Lys Leu Ala Lys Glu Tyr Thr Asp850855860cta gaa gta tcc gac aaa agt gaa att gct aat atc caa agc ggg gca2640Leu Glu Val Ser Asp Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ile Gln Ser Gly Ala865870875880gat tca ttg cct tgc tta gaa ttg ccc tgt gac ctt tct ttc aag aat2688Asp Ser Leu Pro Cys Leu Glu Leu Pro Cys Asp Leu Ser Phe Lys Asn885890895ata tat cct aaa gat gaa gta cat gtt tca gat gaa ttc tcc gaa aat2736Ile Tyr Pro Lys Asp Glu Val His Val Ser Asp Glu Phe Ser Glu Asn900905910agg tcc agt gta tct aag gca tcc ata tcg cct tca aat gtc tct gct2784Arg Ser Ser Val Ser Lys Ala Ser Ile Ser Pro Ser Asn Val Ser Ala915920925ttg gaa cct cag aca gaa atg ggc agc ata gtt aaa tcc aaa tca ctt2832Leu Glu Pro Gln Thr Glu Met Gly Ser Ile Val Lys Ser Lys Ser Leu930935940
acg aaa gaa gca gag aaa aaa ctt cct tct gac aca gag aaa gag gac2880Thr Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp945950955960aga tcc ctg tca gct gta ttg tca gca gag ctg agt aaa act tca gtt2928Arg Ser Leu Ser Ala Val Leu Ser Ala Glu Leu Ser Lys Thr Ser Val965970975gtt gac ctc ctc tac tgg aga gac att aag aag act gga gtg gtg ttt2976Val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe980985990ggt gcc agc tta ttc ctg ctg ctg tct ctg aca gtg ttc agc att gtc3024Gly Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val9951000 1005agt gta acg gcc tac att gcc ttg gcc ctg ctc tcg gtg actatc 3069Ser Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val ThrIle101010151020agc ttt agg ata tat aag ggc gtg atc cag gct atc cag aaa tca3114Ser Phe Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser102510301035gat gaa ggc cac cca ttc agg gca tat tta gaa tct gaa gtt gct3159Asp Glu Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala104010451050
ata tca gag gaa ttg gtt cag aaa tac agt aat tct gct ctt ggt3204Ile Ser Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly105510601065cat gtg aac agc aca ata aaa gaa ctg agg cgg ctt ttc tta gtt3249His Val Asn Ser Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val107010751080gat gat tta gtt gat tcc ctg aag ttt gca gtg ttg atg tgg gtg3294Asp Asp Leu Val Asp Ser Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val108510901095ttt act tat gtt ggt gcc ttg ttc aat ggt ctg aca cta ctg att3339Phe Thr Tyr Val Gly Ala Leu Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile110011051110tta gct ctg atc tca ctc ttc agt att cct gtt att tat gaa cgg3384Leu Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser Ile Pro Val Ile Tyr Glu Arg111511201125cat cag gtg cag ata gat cat tat cta gga ctt gca aac aag agt3429His Gln Val Gln Ile Asp His Tyr Leu Gly Leu Ala Asn Lys Ser113011351140gtt aag gat gcc atg gcc aaa atc caa gca aaa atc cct gga ttg3474Val Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gln Ala Lys Ile Pro Gly Leu114511501155
aag cgc aaa gca gat tga3492Lys Arg Lys Ala Asp1160<210>26<211>1163<212>PRT<213>褐家鼠<400>26Met Glu Asp Ile Asp Gln Ser Ser Leu Val Ser Ser Ser Thr Asp Ser1 5 10 15Pro Pro Arg Pro Pro Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Thr Glu Pro20 25 30Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Asp35 40 45
Glu Asp Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly50 55 60Leu Ser Ala Ala Ala Val Pro Pro Ala Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp65 70 75 80Phe Ser Ser Asp Ser Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala85 90 95Ala Pro Pro Ala Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Glu Arg Ser Pro100 105110Ala Ala Pro Ala Pro Ser Leu Pro Pro Ala Ala Ala Val Leu Pro Ser115120 125Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro Pro Pro Pro130135 140Pro Ala Gly Ala Ser Pro Leu Ala Glu Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr145150155160Pro Ala Ala Pro Lys Arg Arg Gly Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu165170175
Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Pro Ser Ser Ala Glu180185190Lys Ile Met Asp Leu MetGlu Gln Pro Gly Asn Thr Val Ser Ser Gly195200205Gln Glu Asp Phe Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro210215220Ser Leu Ser Pro Leu Ser Thr Val Ser Phe Lys Glu His Gly Tyr Leu225230235240Gly Asn Leu Ser Ala Val Ser Ser Ser Glu Gly Thr Ile Glu Glu Thr245250255Leu Asn Glu Ala Ser Lys Glu Leu Pro Glu Arg Ala Thr Asn Pro Phe260265270Val Asn Arg Asp Leu Ala Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met275280285
Gly Ser Ser Phe Lys Gly Ser Pro Lys Gly Glu Ser Ala Ile Leu Val290295300Glu Asn Thr Lys Glu Glu Val Ile Val Arg Ser Lys Asp Lys Glu Asp305310315320Leu Val Cys Ser Ala Ala Leu His Ser Pro Gln Glu Ser Pro Val Gly325330335Lys Glu Asp Arg Val Val Ser Pro Glu Lys Thr Met Asp Ile Phe Asn340345350Glu Met Gln Met Ser Val Val Ala Pro Val Arg Glu Glu Tyr Ala Asp355360365Phe Lys Pro Phe Glu Gln Ala Trp Glu Val Lys Asp Thr Tyr Glu Gly370375380Ser Arg Asp Val Leu Ala Ala Arg Ala Asn Val Glu Ser Lys Val Asp385390395400Arg Lys Cys Leu Glu Asp Ser Leu Glu Gln Lys Ser Leu Gly Lys Asp405410415
Ser Glu Gly Arg Asn Glu Asp Ala Ser Phe Pro Ser Thr Pro Glu Pro420425430Val Lys Asp Ser Ser Arg Ala Tyr Ile Thr Cys Ala Ser Phe Thr Ser435440445Ala Thr Glu Ser Thr Thr Ala Asn Thr Phe Pro Leu Leu Glu Asp His450455460Thr Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Arg Lys Ala465470475480Gln Ile Ile Thr Glu Lys Thr Ser Pro Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu485490495Val Ala Val Gln Asp Ser Glu Ala Asp Tyr Val Thr Thr Asp Thr Leu500505510Ser Lys Val Thr Glu Ala Ala Val Ser Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr515520525
Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu Ser Glu Leu Asn Glu Ala Thr530535540Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Val Asp Leu Val Gln Thr Ser545550555560Glu Ala Ile Gln Glu Ser Leu Tyr Pro Thr Ala Gln Leu Cys Pro Ser565570575Phe Glu Glu Ala Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val580585590Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Leu Leu Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val595600605Val Gln Pro Ser Val Ser Pro Leu Glu Ala Pro Pro Pro Val Ser Tyr610615620Asp Ser Ile Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala625630635640Met Asn Val Ala Leu Lys Ala Leu Gly Thr Lys Glu Gly Ile Lys Glu645650655
Pro Glu Ser Phe Asn Ala Ala Val Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile660665670Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Thr Glu Pro675680685Ser Pro Asp Phe Ser Asn Tyr Ser Glu Ile Ala Lys Phe Glu Lys Ser690695700Val Pro Glu His Ala Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Glu Ser Glu705710715720Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro Glu Val Pro Gln Thr725730735Gln Glu Glu Ala Val Met Leu Met Lys Glu Ser Leu Thr Glu Val Ser740745750Glu Thr Val Ala Gln His Lys Glu Glu Arg Leu Ser Ala Ser Pro Gln755760765
Glu Leu Gly Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Gln Pro Asn Leu His Ser770775780Thr Lys Asp Ala Ala Ser Asn Asp Ile Pro Thr Leu Thr Lys Lys Glu785790795800Lys Ile Ser Leu Gln Met Glu Glu Phe Asn Thr Ala Ile Tyr Ser Asn805810815Asp Asp Leu Leu Ser Ser Lys Glu Asp Lys Ile Lys Glu Ser Glu Thr820825830Phe Ser Asp Ser Ser Pro Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr Phe835840845Val Ser Ala Lys Asp Asp Ser Pro Lys Leu Ala Lys Glu Tyr Thr Asp850855860Leu Glu Val Ser Asp Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ile Gln Ser Gly Ala865870875880Asp Ser Leu Pro Cys Leu Glu Leu Pro Cys Asp Leu Ser Phe Lys Asn885890895
Ile Tyr Pro Lys Asp Glu Val His Val Ser Asp Glu Phe Ser Glu Asn900 905910Arg Ser Ser Val Ser Lys Ala Ser Ile Ser Pro Ser Asn Val Ser Ala915920925Leu Glu Pro Gln Thr Glu Met Gly Ser Ile Val Lys Ser Lys Ser Leu930935940Thr Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Pro ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp945950955960Arg Ser Leu Ser Ala Val Leu Ser Ala Glu Leu Ser Lys Thr Ser Val965970975Val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe980985990Gly Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val99510001005
Ser Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile1010 1015 1020Ser Phe Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser1025 1030 1035Asp Glu Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala1040 1045 1050Ile Ser Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly1055 1060 1065His Val Asn Ser Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val1070 1075 1080Asp Asp Leu Val Asp Ser Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val1085 1090 1095Phe Thr Tyr Val Gly Ala Leu Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile1100 1105 1110Leu Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser Ile Pro Val Ile Tyr Glu Arg1115 1120 1125
His Gln Val Gln Ile Asp His Tyr Leu Gly Leu Ala Asn Lys Ser1130 11351140Val Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gln Ala Lys Ile Pro Gly Leu1145 1150 1155Lys Arg Lys Ala Asp1160<210>27<211>25<212>PRT<213>褐家鼠<220>
<221>PEPTIDE<222>(1)..(25)
<223>大鼠PEP4<400>27Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn1 5 10 15Ser Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu20 25<210>28<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>富含PRO/SER的肽<220>
<221>PEPTIDE<222>(1)..(17)<223>合成肽<400>28Pro Ser Ser Pro Pro Pro Ser Ser Pro Pro Pro Ser Ser Pro Pro Pro1 5 10 15Ser<210>29<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CA-NA-2F<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(25)<223>CA-NA-2F引物<400>29aagcaccatt gaattctgca gttcc 25<210>30<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CA-NA-3R
<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(28)<223>
<400>30aactgcagta ctgagctcct ccatctgc28<210>31<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5′正向<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(33)<223>正向引物<400>31gtcgcggatc catggagacc ctttttgctc ttc 33<210>32<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5′反向<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(27)<223>反向引物<400>32gttctcgagt tatgaagttt tactcag 27<210>33<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5′正向-1<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(29)
<223>引物<400>33gtgcggatcc atggatttga aggagcagc 29<210>34<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5′反向-1<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(28)<223>引物
<400>34gtttctcgag tgaagtttta ttcagctc28<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5′引物<220>
<221>prime_bind<222>(1)..(20)<223>引物
<400>35tccaccccgg ccgcgcccaa 20<210>36<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5′引物2<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(22)<223>引物<400>36aatgatgggc aaagctgtgc tg 22
<210>37<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>3′引物<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(24)<223>引物<400>37ggtacaaaga ttgcttatga aaca24
<210>38<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>3′引物2<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(22)<223>引物<400>38agcagggcca aggcaatgta gg 22<210>39
<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5′-VL前导序列<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(28)<223>引物<400>39aatatgagtc ctgcccagtt cctgtttc28<210>40<211>32
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>3′-Ck<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(32)<223>引物<400>40ttaggaattc ctaacactct cccctgttga ag 32<210>41<211>31<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>5′-VH前导序列<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(31)<223>引物<400>41aatatggatt ttgggctgat tttttttatt g31<210>42<211>24<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>3′-CH铰链<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(24)<223>引物<400>42aattgggcaa cgttgcaggt gacg 24<210>43<211>663<212>DNA<213>小鼠
<220>
<221>misc_binding<222>(1)..(663)<223>3A6的重链的DNA可变部分<400>43atggattttg ggctgatttt ttttattgtt ggtcttttaa aaggggtcca gtgtgaggtg 60aagcttctcg agtctggagg tggcctggtg cagcctggag gatccctgaa actctcctgt120gtagtctcag gattcgattt tagaagaaat tggatgagtt gggtccggca ggctcctggg180aaagggctag aatggattgg agaaattaat ccagatagca gtaagataaa ctatacgcca240tctctaaagg ataaattcat catctccaga gacaatgcca agaatacgct gtacctgcaa300gtgagcacag tgagatctga ggacacagcc ctttattact gtgtgagacc ggtctggatg360tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctcagc caaaacgaca420cccccatctg tctatccact ggcccctgga tctgctgccc aaactaactc catggtgacc480ctgggatgcc tggtcaaggg ctatttccct gagccagtga cagtgacctg gaactctgga540tccctgtcca gcggtgtgca caccttccca gctgtcctgc agtctgacct ctacactctg600
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<221>misc_binding<222>(1)..(717)<223>3A6的轻链的可变部分<400>44atgagtcctg cccagttcct gtttctgtta gtgctctgga ttcgggaaac cagcggtgat 60gttctgttga cccagactcc tctcactttg tcgataacca ttggacaacc agcctccatc 120
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1.结合分子，该结合分子能够以解离常数＜1000nM结合人NogoA多肽(SEQ ID NO5)或人NiG(SEQ ID NO7)或人NiG-D20(SEQ IDNO24)或人NogoA 342-357(SEQ ID NO6)。
2.结合分子，该结合分子能够以解离常数＜1000nM结合人NogoA多肽(SEQ ID NO5)或人NiG(SEQ ID NO7)或人NiG-D20(SEQ IDNO24)或人NogoA 342-357(SEQ ID NO6)，并含有至少一个抗原结合位点，所述抗原结合位点含有●依次的高变区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中每个高变区与其等价高变区CDR-H1-3A6(SEQ ID NO8)、CDR-H2-3A6(SEQ ID NO9)和CDR-H3-3A6(SEQ ID NO10)至少50％同源；或●依次的高变区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中每个高变区与其等价高变区CDR-L1-3A6(SEQ ID NO11)、CDR-L2-3A6(SEQ ID NO12)和CDR-L3-3A6(SEQ ID NO13)至少50％同源。
3.结合分子，该结合分子能够以解离常数＜1000nM结合人NogoA多肽(SEQ ID NO5)或人NiG(SEQ ID NO7)或人NiG-D20(SEQ IDNO24)或人NogoA 342-357(SEQ ID NO6)，并含有●第一个抗原结合位点，其依次含有高变区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中每个高变区与其等价高变区CDR-H1-3A6(SEQ ID NO8)、CDR-H2-3A6(SEQ ID NO9)和CDR-H3-3A6(SEQ ID NO10)至少50％同源；和●第二个抗原结合位点，依次含有高变区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中每个高变区与其等价高变区CDR-L1-3A6(SEQI D.NO11)、CDR-L2-3A6(SEQ ID NO12)和CDR-L3-3A6(SEQ ID NO13)至少50％同源。
4.结合分子，该结合分子含有至少一个抗原结合位点，所述抗原结合位点含有●依次的高变区CDR-H1-3A6(SEQ ID NO8)、CDR-H2-3A6(SEQID NO9)和CDR-H3-3A6(SEQ ID NO10)；或●依次高变区CDR-L1-3A6(SEQ ID NO11)、CDR-L2-3A6(SEQ IDNO12)和CDR-L3-3A6(SEQ ID NO13)；或●它们的直接等价物。
5.结合分子，该结合分子含有●第一个抗原结合位点，其依次含有高变区CDR-H1-3A6(SEQ IDNO8)、CDR-H2-3A6(SEQ ID NO9)和CDR-H3-3A6(SEQ ID NO10)；和●第二个抗原结合位点，其依次含有高变区CDR-L1-3A6(SEQ IDNO11)、CDR-L2-3A6(SEQ ID NO12)和CDR-L3-3A6(SEQ ID NO13)；或●它们的直接等价物。
6.根据权利要求1至5的结合分子，该结合分子至少含有●一个免疫球蛋白重链或其片段，该免疫球蛋白重链或其片段含有(i)可变结构域，所述可变结构域依次含有高变区CDR-H1-3A6(SEQ ID NO8)、CDR-H2-3A6(SEQ ID NO9)和CDR-H3-3A6(SEQ ID NO10)和(ii)人重链恒定部分或其片段；和●一个免疫球蛋白轻链或其片段，该免疫球蛋白轻链或其片段含有(i)可变结构域，所述可变结构域依次含有高变区CDR-L1-3A6(SEQ ID NO11)、CDR-L2-3A6(SEQ ID NO12)和CDR-L3-3A6(SEQ ID NO13)和(ii)人轻链恒定部分或其片段；或●它们的直接等价物。
7.根据权利要求6的结合分子，其中人重链恒定部分或其片段为γ4型且人轻链恒定部分或其片段为κ型。
8.根据权利要求1至7的结合分子，该结合分子是人或嵌合型或人源化单克隆抗体。
9.结合分子，该结合分子含有如SEQ ID NO2和SEQ ID NO3所示的多肽序列。
10.多核苷酸，该多核苷酸含有编码根据权利要求1至9中任一项的结合分子的多核苷酸。
11.多核苷酸，该多核苷酸含有●如SEQ ID NO14、SEQ ID NO15和SEQ ID NO16中所示多核苷酸序列；或●如SEQ ID NO17、SEQ ID NO18和SEQ ID NO19中所示多核苷酸序列。
12.表达载体，该表达载体含有根据权利要求10或11多核苷酸。
13.表达系统，该表达系统含有根据权利要求10或11的多核苷酸，其中当所述表达系统或其部分存在于合适的宿主细胞中时，表达系统或其部分能够产生权利要求1至9中任一项的多肽。
14.分离的宿主细胞，该宿主细胞含有根据权利要求13的表达系统。
15.根据权利要求1至9中任一项的结合分子作为药物的用途。
16.根据权利要求1至9中任一项的结合分子在神经修复治疗中的用途。
17.药物组合物，该药物组合物含有与至少一种可药用载体或稀释剂联合的根据权利要求1至9中任一项的结合分子。
18.治疗神经修复相关疾病的方法，包括给需要这类治疗的受试者施用有效量的根据权利要求1至9中任一项的结合分子。
19.治疗神经修复相关疾病的方法，包括给需要这类治疗的受试者施用有效量的根据权利要求1至9中任一项的结合分子。
全文摘要
本发明提供能够以解离常数＜1000nM结合人NogoA多肽或人NiG或人NiG－D20或人NogoA 342－357的结合分子、编码该结合分子的多核苷酸；含有所述多核苷酸的表达载体；含有能够产生结合分子的多核苷酸的表达系统；含有如上定义的表达系统的分离的宿主细胞；该结合分子作为药物的用途，特别是在神经修复治疗中的用途；含有所述结合分子的药物组合物；以及治疗神经修复相关疾病的方法。
文档编号C07K16/08GK1878792SQ200480033267
公开日2006年12月13日 申请日期2004年9月17日 优先权日2003年9月19日
发明者C·巴尔斯克, S·弗伦泽尔, A·K·米尔, M·E·施瓦布, A·维塔利蒂 申请人:诺瓦提斯公司, 苏黎士大学