专利名称：固相多肽合成亮丙瑞林的制备方法
技术领域：
本发明涉及亮丙瑞林的制备方法，尤其涉及固相多肽合成亮丙瑞林的制备方法。
背景技术：
亮丙瑞林，中文名称为醋酸亮丙瑞林，或简称其他名称亮丙瑞林，英文名为Leuprorelin，结构式为pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHC2H5，分子式C59H84N16O12·C2H4O2，分子量为1269.48。
亮丙瑞林临床用于治疗相关性激素病症，包括晚期前列腺癌、子宫内膜异位、中枢性性早熟症等。
醋酸亮丙瑞林是一种促性腺激素释放激素类似物，主要作用于垂体前叶，大剂量应用初期可以引起一过性黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)释放增多，后期则导致垂体敏感性降低，使LH、FSH和性激素分泌减少。醋酸亮丙瑞林用于治疗相关性激素病症，包括晚期前列腺癌、子宫内膜异位、中枢性性早熟症。
1974年日本武田化工的Fujino Masahiko等人首先发明促黄体激素释放激素的九肽酰胺类似物的合成工艺。并在日本、德国、美国等国家申请专利，专利号分别为JP19740027442、DE2446005、US4008209(液相法)。
目前的方法均存在着一定的缺陷，每一轮脱帽须用三氟醋酸，故接肽收率低，导致生产成本较高；三废污染多，并使用三氟醋酸进行纯化，污染环境，纯化收率一般在25％以下。因此目前的方法限制了醋酸亮丙瑞林的大规模生产和使用。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种固相多肽合成亮丙瑞林的制备方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。
本发明的方法包括如下步骤以.Wang或CTC树脂树脂起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护九肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，同步进行脱侧链保护基团及切肽，最后用乙胺/HOBT接上乙胺基，获得粗品，粗品经C18(或C8)柱分离纯化，制得亮丙瑞林精品。
按照本发明，依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护九肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团的方法包括如下步骤(1)制备Fmoc-Pro-Wang树脂取Wang树脂用DMF浸泡，使树脂充分溶胀，吹干，然后加入溶解于接肽试剂的Fmoc-Pro-OH(FW337.4)、TBTU/HBTU(FW321)、HOBT(FW153，)的混合物，20～30℃反应0.5～1.5小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Pro-Wang树脂；加入脱帽试剂，20～30℃反应5～30分钟，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干。
所说的Wang树脂取代量为0.5-1.1mmol/g；所说的接肽试剂为NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比，下同；所说的脱帽试剂为PIP∶DMF＝1∶2～5，体积比，下同；混合物中Wang树脂的重量体积浓度为5～20ml/g；TBTU/HBTU的摩尔数为树脂的2～6倍；HOBT＝的摩尔数为树脂的2～6倍；Fmoc-Pro-OH的摩尔数为树脂的2～6倍。
Wang树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；(2)制备Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂在步骤(1)的Fmoc-Pro-Wang树脂中，加入脱帽试剂，20～30℃反应5～30分钟，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Arg(Pbf)-OH(FW648.8)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，20～30℃反应0.5～1.5小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂；混合物中Fmoc-Pro-Wang树脂的重量体积浓度为5～20ml/g；TBTU/HBTU的摩尔数为树脂的2～6倍。
HOBT摩尔数为树脂的2～6倍；Fmoc-Arg(Pbf)-OH的摩尔数为树脂的2～6倍。
Fmoc-Pro-Wang树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂；(3)制备Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂在步骤(2)的Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂中，加入脱帽试剂，20～30℃反应5～30分钟，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Leu-OH(FW321)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，20～30℃反应0.5～1.5小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂；混合物中Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂的重量体积浓度为5～20ml/g；Fmoc-Leu-OH的摩尔数为树脂的2～6倍。
Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂；其余操作以及工艺条件同上；(4)制备Fmoc-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂在步骤(3)的Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂中，加入脱帽试剂，20～30℃反应5～30分钟，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-D-Leu-OH(FW354)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，20～30℃反应0.5～1.5小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂；混合物中Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂的重量体积浓度为5～20ml/g；Fmoc-D-Leu-OH的摩尔数为树脂的2～6倍。
Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂；其余操作以及工艺条件同上；(5)制备Fmoc-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂在步骤(4)的Fmoc-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂中，加入脱帽试剂，20～30℃反应5～30分钟，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Tyr(tBu)-OH(FW459.5)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，20～30℃反应0.5～1.5小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂；混合物中Fmoc-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂重量体积浓度为5～20ml/g；Fmoc-Tyr(tBu)-OH的摩尔数为树脂的2～6倍。
Fmoc-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂；其余操作以及工艺条件同上；(6)制备Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂在步骤(5)的Fmoc-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂中，加入脱帽试剂，20～30℃反应5～30分钟，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Ser(tBu)-OH(FW383.4)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，20～30℃反应0.5～1.5小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂；混合物中Fmoc-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂重量体积浓度为5～20ml/g；Fmoc-Ser(tBu)-OH的摩尔数为树脂的2～6倍。
Fmoc-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂；其余操作以及工艺条件同上；(7)制备Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂在步骤(6)的Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂中，加入脱帽试剂，20～30℃反应5～30分钟，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Trp-OH(FW426.5)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，20～30℃反应0.5～1.5小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂；混合物中Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂重量体积浓度为5～20ml/g；Fmoc-Trp-OH的摩尔数为树脂的2～6倍。
Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂；其余操作以及工艺条件同上；(8)制备Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂在步骤(7)的Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂中，加入脱帽试剂，20～30℃反应5～30分钟，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-His(Trt)-OH(FW619.7)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，20～30℃反应0.5～1.5小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂；混合物中Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂重量体积浓度为5～20ml/g；Fmoc-His(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2～6倍。
Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂；其余操作以及工艺条件同上；(9)制备pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂在步骤(8)的Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂中，加入脱帽试剂，20～30℃反应5～30分钟，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的pGlu-OH(FW129)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，20～30℃反应0.5～1.5小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂；混合物中Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂重量体积浓度为5～20ml/g；pGlu-OH的摩尔数为树脂的2～6倍。
Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂；其余操作以及工艺条件同上。
按照本发明，所说的切肽包括如下步骤将上述步骤(9)所获得的pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂加入预冷至0～10℃的切肽试剂(TFA/EDT/H2O/TIS＝680ml/18ml/18ml/3.6ml)中，20～30℃反应1～3小时，减压蒸除溶剂，加入乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗，P2O5真空干燥，获得切肽后的粗品；按照本发明，所说的乙胺/HOBT接上乙胺基的方法包括如下步骤将HOBT、水和乙胺的混合物冷冻干燥，获得HOBt-乙胺混合物；
将HOBt-乙胺混合物加入切肽后的粗品中，再加入DIC，20～30℃反应8～24小时，加乙醚沉淀，收集沉淀，用乙醚洗涤，获得亮丙瑞林粗品，收率80％；HOBT、水和乙胺的重量比例为HOBT∶水∶乙胺＝1∶50～100∶0.5～2；按照本发明，粗品经C18(或C8)柱分离纯化分离纯化的方法包括如下步骤将亮丙瑞林粗品溶于乙酸中，过滤，滤液经C18(或C8)柱纯化，流动相0.1MNH4Ac∶乙腈(7.5∶2.5)；流速为100-650ml/min；检测波长为280nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后去盐，冻干，获得成品(MW1209)，总收率27.6％(以Wang树脂的60mmol计)。
乙酸的重量浓度为0.5～10％，乙酸中亮丙瑞林粗品的重量浓度为1～50％。
本发明的亮丙瑞林工艺路线有下列特点，具备规模化生产能力，工艺稳定，原辅材料来源方便，生产周期短，生产成本低，三废少，收率高，质量稳定，生产成本低，极具市场竞争力，接肽收率高(每步接肽收率为≥99％)，降低了成本，采用切肽试剂(TFA/EDT/H2O/TIS)进行切肽，加入乙醚沉淀粗品的方法，避免使用氟化氢等剧毒试剂，三废污染少，且提高收率，采用C18(或C8)柱进行分离纯化，避免使用TFA(三氟醋酸)进行纯化，减少三废，纯化收率高达25％以上，每步接肽收率均在99％以上；切肽后收率为95.4％，总收率为21.9％。
具体实施例方式
实施例1实施例和前述过程中所采用的原料列表如下
实施例中所说的接肽试剂为NMM∶DMF＝1∶10，体积比；所说的脱帽试剂为PIP∶DMF＝1∶3.5，体积比；合成肽链制备Fmoc-Pro-Wang树脂1)取75gWang树脂(0.8mmol/g树脂，60mmol)，用1000mlDMF浸泡，使树脂充分溶胀，吹干。
2)取81g(FW337.4，240mmol)Fmoc-Pro-OH、77.1g(FW321，240mmol)TBTU/HBTU、36.6g(FW153，240mmol)HOBT，用750ml接肽试剂溶解，加入反应容器，25℃反应1小时。
3)吹干，分别用DMF、无水乙醇和DMF各洗涤三次，吹干，约得85g。
制备Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂1)加1000ml脱帽试剂，25℃反应15分钟，吹干，分别用DMF、无水乙醇和DMF各洗涤三次，吹干。
2)加入155.7g(FW648.8，240mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH、77.1g(FW321，240mmol)TBTU/HBTU、36.6g(FW153，240mmol)HOBT，用750ml接肽试剂溶解，加入反应容器，25℃反应1小时。
3)吹干，分别用DMF、无水乙醇和DMF各洗涤三次，吹干。
制备Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂加1000ml脱帽试剂，25℃反应15分钟，吹干，分别用DMF、无水乙醇和DMF各洗涤三次，吹干。加84.9g(FW354，240mmol)Fmoc-Leu-OH、77.1g(FW321，240mmol)TBTU/HBTU、36.6g(FW153，240mmol)HOBT，用750ml接肽试剂溶解，加入反应容器，25℃反应1小时。其余操作同上。
制备Fmoc-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂加1000ml脱帽试剂，25℃反应15分钟，吹干，分别用DMF、无水乙醇和DMF各洗涤三次，吹干。加84.9g(FW354，240mmol)Fmoc-D-Leu-OH、77.1g(FW321，240mmol)TBTU/HBTU、36.6g(FW153，240mmol)HOBT，用750ml接肽试剂溶解，加入反应容器，25℃反应1小时。其余操作同上。
制备Fmoc-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂加1000ml脱帽试剂，25℃反应15分钟，吹干，分别用DMF、无水乙醇和DMF各洗涤三次，吹干。加110.4g(FW459.5，240mmol)Fmoc-Tyr(tBu)-OH、77.1g(FW321，240mmol)TBTU/HBTU、36.6g(FW153，240mmol)HOBT，用750ml接肽试剂溶解，加入反应容器，25℃反应1小时。其余操作同上。
制备Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂加1000ml脱帽试剂，25℃反应15分钟，吹干，分别用DMF、无水乙醇和DMF各洗涤三次，吹干。加92.1g(FW383.4，240mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH、77.1g(FW321，240mmol)TBTU/HBTU、36.6g(FW153，240mmol)HOBT，用750ml接肽试剂溶解，加入反应容器，25℃反应1小时。
制备Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂加1000ml脱帽试剂，25℃反应15分钟，吹干，分别用DMF、无水乙醇和DMF各洗涤三次，吹干。加126.3g(FW426.5，240mmol)Fmoc-Trp-OH、77.1g(FW321，240mmol)TBTU/HBTU、36.6g(FW153，240mmol)HOBT，用750ml接肽试剂溶解，加入反应容器，25℃反应1小时。其余操作同上。
制备Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂加1000ml脱帽试剂，25℃反应15分钟，吹干，分别用DMF、无水乙醇和DMF各洗涤三次，吹干。加148.7g(FW619.7，240mmol)Fmoc-His(Trt)-OH、77.1g(FW321，240mmol)TBTU/HBTU、36.6g(FW153，240mmol)HOBT，用750ml接肽试剂溶解，加入反应容器，25℃反应1小时。加入1000ml脱帽试剂，25℃反应10分钟。
制备pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂加1000ml脱帽试剂，25℃反应15分钟，吹干，分别用DMF、无水乙醇和DMF各洗涤三次，吹干。加30.9g(FW129，240mmol)pGlu-OH、77.1g(FW321，240mmol)TBTU/HBTU、36.6g(FW153，240mmol)HOBT，用750ml接肽试剂溶解，加入反应容器，25℃反应1小时。
切肽将保护九肽转移至1000ml反应器中，加入事先配制好并预冷至约5℃的试剂(TFA/EDT/H2O/TIS＝680ml/18ml/18ml/3.6ml)，25℃搅拌2小时。减压除溶剂至小体积，加入1000ml冷乙醚沉淀，离心收集，用无水乙醚洗后，P2O5真空干燥。
乙胺化HOBt-乙胺的制备67.5gHOBT加6000ml水，加入67ml乙胺搅拌至HOBt溶解。冷冻干燥。将HOBt-乙胺转移到切肽后的粗品中，再加入DIC 48g，25℃搅拌过夜。乙醚沉淀。过滤，用乙醚洗涤三次，得亮丙瑞林粗品58g(48.0mmol)，收率80％。
分离纯化将亮丙瑞林粗品溶于5％乙酸中，过滤，滤液经C18柱纯化，流动相0.1MNH4Ac∶乙腈(7.5∶2.5)；流速为500ml/min；检测波长为280nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后去盐，冻干，约得20g白色块状物成品(MW1209，6.2mmol)，总收率27.6％(以Wang树脂的60mmol计)。
权利要求
1.一种固相多肽合成亮丙瑞林的制备方法，其特征在于，包括如下步骤以.Wang树脂或CTC树脂起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护九肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，同步进行脱侧链保护基团及切肽，最后用乙胺/HOBT接上乙胺基，获得粗品，粗品经C18(或C8)柱分离纯化，制得亮丙瑞林精品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护九肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团的方法包括如下步骤(1)制备Fmoc-Pro-Wang树脂取Wang树脂用DMF浸泡，使树脂充分溶胀，吹干，然后加入溶解于接肽试剂的Fmoc-Pro-OH(FW337.4)、TBTU/HBTU(FW321)、HOBT(FW153)的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Pro-Wang树脂；所说的接肽试剂为NMM∶DMF＝1∶5～15，下同；所说的脱帽试剂为PIP∶DMF＝1∶2～5，下同；混合物中Wang树脂的重量体积浓度为5～20ml/g；Fmoc-Pro-OH的的摩尔数为树脂的2～5倍；Wang树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂；(2)制备Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂在步骤(1)的Fmoc-Pro-Wang树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Arg(Pbf)-OH(FW648.8)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂；混合物中Fmoc-Pro-Wang树脂的重量体积浓度为5～20ml/g；Fmoc-Arg(Pbf)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；Fmoc-Pro-Wang树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂；(3)制备Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂在步骤(2)的Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Leu-OH(FW321)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂；混合物中Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂的重量体积浓度为5～20ml/g；Fmoc-Leu-OH的摩尔数为树脂的2～5倍。Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂；其余操作以及工艺条件同上；(4)制备Fmoc-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂在步骤(3)的Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-D-Leu-OH(FW354)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂；混合物中Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂的重量体积浓度为5～20ml/g；Fmoc-D-Leu-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂；其余操作以及工艺条件同上；(5)制备Fmoc-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂在步骤(4)的Fmoc-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Tyr(tBu)-OH(FW459.5)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂；混合物中Fmoc-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂重量体积浓度为5～20ml/g；Fmoc-Tyr(tBu)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；Fmoc-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂；其余操作以及工艺条件同上；(6)制备Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂在步骤(5)的Fmoc-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Ser(tBu)-OH(FW383.4)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂；混合物中Fmoc-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂重量体积浓度为5～20ml/g；Fmoc-Ser(tBu)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍。Fmoc-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂；其余操作以及工艺条件同上；(7)制备Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂在步骤(6)的Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Trp-OH(FW426.5)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂；混合物中Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂重量体积浓度为5～20ml/g；Fmoc-Trp-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂；其余操作以及工艺条件同上；(8)制备Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂在步骤(7)的Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹于，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-His(Trt)-OH(FW619.7)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂；混合物中Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂重量体积浓度为5～20ml/g；Fmoc-His(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍。Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂；其余操作以及工艺条件同上；(9)制备pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂在步骤(8)的Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的pGlu-OH(FW129)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂；混合物中Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂重量体积浓度为5～20ml/g；pGlu-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂；其余操作以及工艺条件同上。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，第一步的反应温度为20～30℃，反应时间为0.5～1.5小时，第二步的反应温度为20～30℃，反应时间为5～30分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的切肽包括如下步骤将上述步骤(9)所获得的pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂加入预冷至0～10℃的切肽试剂(TFA/EDT/H2O/TIS＝680ml/18ml/18ml/3.6ml)中，20～30℃反应1～3小时，减压蒸除溶剂，加入乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗，P2O5真空干燥，获得切肽后的粗品。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的乙胺/HOBT接上乙胺基的方法包括如下步骤将HOBT、水和乙胺的混合物冷冻干燥，获得HOBt-乙胺化合物；将HOBt-乙胺混合物加入切肽后的粗品中，再加入DIC或TBTU、HBTU，20～30℃反应8～24小时，加乙醚沉淀，收集沉淀，用乙醚洗涤，获得亮丙瑞林粗品，收率80％；HOBT、水和乙胺的重量比例为HOBT∶水∶乙胺＝1∶50～100∶0.5～2。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，粗品经C18或C8柱分离纯化分离纯化的方法包括如下步骤将亮丙瑞林粗品溶于乙酸中，过滤，滤液经C18或C8柱纯化，流动相0.1MNH4Ac∶乙腈(7.5∶2.5)；流速为100-650ml/min；检测波长为280nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后去盐，冻干，获得成品(MW1209)，总收率27.6％(以Wang树脂的60mmol计)。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，乙酸铵的重量浓度为0.01～10％。乙腈的重量浓度为10～40％。
全文摘要
本发明公开了一种固相多肽合成亮丙瑞林的制备方法。本发明的方法包括如下步骤以Wang树脂或CTC树脂起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护九肽树脂，其间依次脱去Fmoc－保护基团，同步进行脱侧链保护基团及切肽，最后用乙胺/HOBT接上乙胺基，获得粗品，粗品经C18(或C8)柱分离纯化，制得亮丙瑞林精品。本发明的方法，具备规模化生产能力，工艺稳定，原辅材料来源方便，生产周期短，收率高，质量稳定，生产成本低，接肽收率高，避免使用氟化氢等剧毒试剂，三废污染少，采用C18(或C8)柱进行分离纯化，纯化收率高达25％以上，每步接肽收率均在99％以上；切肽后收率为95.4％，总收率为21.9％。
文档编号C07K1/04GK1865280SQ20051002604
公开日2006年11月22日 申请日期2005年5月20日 优先权日2005年5月20日
发明者周达明 申请人:周达明