专利名称：一种简易的蛋白回收装置的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种从电泳后聚丙烯酰铵凝胶中回收蛋白质的电洗脱装置，它的这一功能是通过一套有机玻璃元件的组合来实现的。
背景技术：
现阶段电洗脱法常用来从聚丙烯酰铵凝胶中回收蛋白质，其中最常见的类型为透析袋电洗脱法，该方法的具体步骤为将含有所需蛋白的凝胶区带切下，装入透析袋内并加入缓冲液浸泡，再将透析袋浸入缓冲液中进行电泳，由此带负电荷的蛋白质就会向正极方向迁移，离开凝胶进入透析袋内的缓冲液中，电泳后蛋白质就留在透析袋内缓冲液中。电洗脱后通一个反向电流(一般持续几十秒)，使吸附在透析袋上的样品进入缓冲液，这样就可以达到回收凝胶中所需特定大分子的目的。透析袋电洗脱法虽然设备简单，但操作比较麻烦且容易失败，同时存在洗脱后样品体积较大的弊端，后续的样品浓缩给试验带来不少麻烦。
目前市场上有各种专门的蛋白电洗脱装置微量电洗脱仪是一种快速回收电泳后凝胶中蛋白质的工具，其配备的离心超滤管能将回收后样品进行浓缩，该仪器操作较方便，不足之处在于每次处理量非常少，仅适合于微量样品的分离纯化。全凝胶洗脱电泳仪具有能够同时收集凝胶上的多条分子带的功能，避免了一般繁琐的切胶洗胶过程而直接将蛋白质分子从凝胶中转移到溶液中，比较适合于多个微量组分的分离纯化。“V”字形内槽电洗脱回收装置的原理是利用电洗脱过程中“V”字形内槽盐浓度远高于外槽盐浓度的特点，使样品在电泳过程中聚集于高低离子浓度界面，从而达到回收并浓缩所需样品的目的。它具有洗脱后样品体积小且不需透析膜的优点，但洗脱过程中高盐缓冲液与低盐缓冲液是相通的，这给具体操作带来很大难度，难以达到理想效果。
以上各种蛋白质回收装置虽然各有所长，但一个共同的缺点是处理的样品量都非常有限，达不到大量制备要求；且价格昂贵，以MILLIPORE(密理博)公司的微量电洗脱仪为例，市场价高达一千美金，其配套的超滤管价格不菲且只能一次性使用，因此使用成本非常高。
实用新型内容本实用新型的目的是针对现有各种蛋白回收方法存在的样品处理量少、回收后需进行浓缩且价格昂贵等不足，提供一套简易的蛋白回收装置，该装置可以同时回收多达6个电泳区带蛋白质样品，每次最大处理量达30ml凝胶。应用本装置可以从SDS-PAGE胶中回收蛋白质，用于免疫动物制备抗体或用于基质辅助的激光解吸离子化质谱分析(MALDI-MS)。
本实用新型的蛋白回收装置由电洗脱回收槽和6个规格一致的马鞍型收集器两部分组成附图1中，电洗脱回收槽由缓冲液槽(1)和位于中央的冷却水箱(2)组成，两者整合在一起，均由透明有机玻璃制成。缓冲液槽(1)规格为250mm×150mm×100mm，处于中央的冷却水箱(2)规格为250mm×50mm×40mm，其两端分别有进水口(6)和出水口(7)，使用时与循环冷却水器以橡皮管相连接。缓冲液槽(1)两端分别装有正电极(3)和负电极(4)，嵌于缓冲液槽底部的电极丝(5)采用耐电解腐蚀、耐高温、纯度≥99.95％的贵重金属铂制造，该电极丝(5)具有良好的导电性能且便于清洗，距离回收槽边缘15mm。缓冲液槽(1)底嵌有反光镜(8)。
附图2中，马鞍型收集器由透明有机玻璃制成。由椭圆形上槽(9)及连接的管A(11)和管B(12)组成，椭圆形上槽(9)长80mm，宽15mm，深15mm，两圆管间距离为55mm，高35mm，其中管A(11)末端与螺母(13)相连，其内有两个橡胶密封圈(14)，橡胶密封圈之间用于放置圆形透析膜(16)。管B(12)末端与膜帽(15)相连，该膜帽(15)用于收集样品，体积为800ul，膜帽(15)底部同样有两个橡胶密封圈(14)，密封圈(14)之间用于放置圆形透析膜(16)。本装置配备了3.5kD，6-8kD，12-14kD规格的圆形透析膜(16)，可以根据需要选择不同孔径的膜。
洗脱前将预先处理好的透析袋(17)紧包于管B(12)末端，用棉线扎紧，将45℃左右、1.0％的琼脂糖凝胶注满管B(12)，待胶凝固后取掉透析袋(17)，再套上盛满洗脱缓冲液的膜帽(15)，洗脱时大分子被收集于膜帽(15)内缓冲液中，可以方便地回收以作进一步分析和测试用。
本实用新型同时配备了80目、15mm×17mm钢筛(10)多片，电洗脱时取两片钢筛(10)在椭圆形上槽(9)、靠近管B(12)端围成盛放凝胶块的小池，这样能有效缩短洗脱时间并提高蛋白回收率。
本实用新型具有构造简单、操作方便、洗脱时间短、每次处理样品量大、回收后样品不必再进行浓缩等诸多优点，适于微量及大量制备蛋白质，其蛋白回收率可达90％以上。通过移动收集器上槽内两片钢筛(10)间的距离能调整本装置对样品的处理量，并且可以同时选用多个收集器，达到在基本相同的试验条件处理多个样品的目的。
附图1为本实用新型的电洗脱回收槽结构示意图附图2为本实用新型的马鞍型收集器示意图附图中1缓冲液槽，2冷却水箱，3正电极，4负电极，5电极丝，6进水口，7出水口，8反光镜，9椭圆形上槽，10钢筛，11管A，12管B，13螺母，14橡胶密封圈，15膜帽，16圆形透析膜，17透析袋具体实施例实施例一从SDS-PAGE胶中回收蛋白质，用于免疫动物制备抗体。
1、取配套的圆形透析膜(16)及透析袋(17)按常规方法进行预处理，处理方法为在2％的NaHCO3和1m mol/l的EDTA(pH8.0)中煮沸10分钟，双蒸水彻底清洗。
2、对收集器各部分进行彻底清洗，在螺母(13)及膜帽(15)的两橡胶密封圈(14)之间放上处理好的圆形透析膜(16)，再旋上螺母(13)，用蒸馏水检查两端是否漏水。
3、将处理好的透析袋(17)紧包于管B(12)末端，用棉线扎紧，用45℃左右、1.0％的琼脂糖凝胶注满管B(12)，待胶凝固后取掉透析袋(17)，再套上盛满缓冲液的膜帽(15)，使膜帽(15)内缓冲液与管末端琼脂糖凝胶接触，注意膜帽内不能由气泡，否则影响洗脱效果。
4、将含有待分离蛋白质的凝胶条带切成碎块，取两片配套的80目钢筛(10)在收集器椭圆形上槽(9)靠近管B(12)端围成一小槽，两片钢筛(10)间距离据样品量而定，凝胶碎块置于小槽后将收集器横跨于冷却水箱(2)上，其中管A(11)置于负极，管B(12)置于正极，在椭圆形收集器上槽(9)内加满电洗脱缓冲液。
5、在缓冲液槽(1)内倒入适当量的电泳缓冲液，利用回收槽底端反光镜(8)成像的功能，用自制弯头巴斯德吸管将收集器两端圆形透析膜(16)底部气泡吸掉，选用100-200伏进行电洗脱。
6、洗脱时间根据胶的浓度和蛋白质的分子量大小来决定，最后反向接通电源30-60秒使蛋白质离开圆形透析膜(16)。
7、洗脱结束后取下膜帽(15)，用加样枪反复吸打5次后吸出含有待回收蛋白质的缓冲液至1ml eppendorf离心管，12000RPM高速离心1分钟以除去可能残留的琼脂糖凝胶碎块，得到的含目的蛋白的溶液可根据需要直接免疫动物，也可按照常规的方法浓缩后使用。
8、每次电洗脱后两圆管端应更换圆形透析膜(16)，钢筛(10)使用后应及时清洗。
实施例二纯化回收SDS-PAGE凝胶蛋白条带，应用于基质辅助的激光解吸离子化质谱分析(MALDI-MS)
将SDS-PAGE和本装置以及MALDI-TOFMS结合起来在蛋白质组学研究中相当常见，因为这提供了一种快速精确的研究蛋白质的方法，而且即便是难以分析的蛋白如疏水膜蛋白或者是高分子量蛋白也可以用这个方法进行分离。选用MS缓冲液可以彻底清除SDS，得到高产而不含SDS的蛋白样品。蛋白纯化过程和前面基本相似，得到含有目的蛋白的溶液后需要进行以下步骤处理1.加入1/10体积的MS Buffer混匀，室温静置15分钟2.加入1/5体积的50％TCA，4℃度静置1小时3.4℃14000rpm离心30分钟，去上清4.加入500ul冰冷的丙酮混合，-20℃处理30分钟(过夜有助于提高得率)后4℃高速离心30分钟5.用相应的缓冲液重悬沉淀并进行后继的稀释步骤。
权利要求1.一种简易的蛋白回收装置，其特征是由电洗脱回收槽和六个马鞍形收集器组成，马鞍形收集器由椭圆形上槽(9)及两端连接的管A(11)和管B(12)组成。
2.根据权利要求1所述的简易蛋白回收装置，其特征在于收集器的管A(11)末端与螺母(13)相连，螺母(13)内两个橡胶密封圈(14)之间用于放置圆形透析膜(16)；管B(12)用于电洗脱时灌注琼脂糖凝胶，其末端与膜帽(15)相连，该膜帽(15)用于收集样品，体积为800ul，膜帽(15)内两个橡胶密封圈(14)之间用于放置圆形透析膜(16)。
3.根据权利要求1所述的简易蛋白回收装置，其特征在于其配备了15×17mm、80目钢筛(10)多片。
4.根据权利要求1所述的简易蛋白回收装置，其特征在于其配备了3.5kD，6-8kD，12-14kD三种规格的圆形透析膜(16)，可以根据需要选择不同孔径的膜。
专利摘要一种简易的蛋白回收装置，用于从电泳后聚丙烯酰铵凝胶中回收蛋白质，由回收槽和6个规格一致的马鞍形收集器组成。其中回收槽中央为冷却水箱，与回收槽整合在一起，两端有进出水口。马鞍形收集器由椭圆形上槽及两端连接的两个圆管组成，其中管B末端与膜帽相连，膜帽用于收集样品。该装置还配备了80目钢筛多片，用于在收集器上槽靠近管B端围成盛放凝胶块的小池，这样能有效缩短洗脱时间并提高蛋白回收率。该装置结构简单，操作方便，蛋白回收率高达90％以上，适于推广应用。
文档编号C07K14/00GK2908495SQ200520052370
公开日2007年6月6日 申请日期2005年11月8日 优先权日2005年11月8日
发明者周松华, 汪世平, 李文凯, 彭先楚 申请人:周松华, 汪世平