结合br3的多肽及其用途的制作方法

专利名称：结合br3的多肽及其用途的制作方法
专利说明结合BR3的多肽及其用途 发明领域 本发明涉及结合BR3的抗体和多肽及其用途。

背景技术：
BAFF(也称为BlyS、TALL-I、THANK、TNFSF13B或zTNF4)是B细胞存活和成熟所必需的TNF配体超家族的成员(在Mackay & Browning(2002)Nature Rev.Immunol.2，465-475中进行了综述)。转基因小鼠中BAFF的过表达导致B细胞增生和严重自身免疫性疾病的发生(Mackay，etal.(1999)J.Exp.Med.190，1697-1710；Gross，et al.(2000)Nature 404，995-999；Khare，et al.(2000)Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.97，3370-33752-4)。在患有多种自身免疫性病症的人类患者中，BAFF水平有升高，该自身免疫性病症例如全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、Wegener’s肉芽肿病和Sjogren’s综合征(Cheema，G.S，et al.，(2001)Arthritis Rheum.44，1313-1319；Groom，J.，et al，(2002)J.Clin.Invest.109，59-68；Zhang，J.，et al.，(2001)J.Immunol.166，6-10；Krumbholz et al.，ANCA Workshop，Prague，Czech Republic，2003)。此外，BAFF水平与疾病的严重程度相关，这表明BAFF在这些疾病的发病机制中起直接作用。在胶原诱导的关节炎(CIA)、狼疮(例如，BWF1小鼠)、多发性硬化症(例如，实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE))的动物模型中，BAFF阻断导致所述疾病的缓解。在慢性移植物抗宿主疾病(cGVHD)模型中，BR3Fc治疗显著抑制了与cGVHD相关的脾大，这不是通过防止B细胞活化，而是通过抑制B细胞存活实现的(Kalled，SL et al.(2005)Curr DirAutoimmun.8206-42)。因此，BAFF阻断有可能在其它具有强的B细胞组分的自身免疫性动物模型中提供有效性。
另外，已报道了CD4+和CD8+T细胞可被重组体BAFF共刺激，以产生I型和II型细胞因子，并增加CD25表达(Ng，LG，et al.2004.JImmunol 173807)。此外，报道了BAFF-RFc阻断BAFF-介导的人T细胞增殖(Huard，B，et al.，(2000)J Immunol 1676225)。此外，某些患有B-淋巴恶性肿瘤的患者具有升高的BAFF水平(Kern，C et al.，(2004)Blood103(2)679-88)。根据一篇报导，加入可溶性BAFF或APRIL使B-CLL细胞免于自发的和药物诱导的细胞凋亡并刺激NF-κB活化。相反，加入可溶性BCMA-Fc或抗-BAFF和抗APRIL抗体增强B-CLL细胞凋亡(Kern，C et al.，同上)。BAFF可以作为恶性B细胞的必要自分泌存活因子(Mackay F，et al.，(2004)Curr Opin Pharmacol.4(4)347-54)。因此，BAFF与多种疾病状态相关。
BAFF结合TNF受体超家族的三个成员，TACI、BCMA和BR3(也称为BAFF-R)(Gross，et al.，同上；8.Thompson，J.S.，et al.，(2001)Science293，2108-2111.Yan，M.，et al.；.(2001)Curr.Biol.11，1547-1552；Yan，M.，et al.，(2000)Nat.Immunol.1，37-41.Schiemann，B.，et al.，(2001)Science293，2111-2114)。在这三个成员中，只有BR3对BAFF是特异性的；其它两种还结合相关的TNF家族成员，APRIL。BAFF和受体敲除或突变小鼠的表型比较表明通过BR3的信号转导介导了BAFF的B细胞存活功能(Thompson，et al.，同上；Yan，(2002)，同上；Schiemann，同上)。相反，TACI表现出起抑制性受体的作用(Yan，M.，(2001)Nat.Immunol.2，638-643)，而BCMA的作用较不明确(Schiemann，同上)。
BR3是在B细胞表面表达的184-残基III型跨膜蛋白(Thompson，et al.，同上；Yan，(2002)，同上)。胞内区不具有与公知的结构域或蛋白-蛋白相互作用基序相似的序列。多方面的研究提供了强有力的证据表明BR3是主要受体，通过它B细胞接受BAFF介导的存活信号(在Kalled，S.，et al.，Curr Dir Autoimmun.2005；8206-42中进行了综述)。这已由新近产生的BAFF-R敲除小鼠所证实，其中这些BAFF-R-/-小鼠(Shulga-Morkskaya，S.et al.，(2004)J Immunol.15；173(4)2331-41)。BR3在包括多发性骨髓瘤和非何杰金氏淋巴瘤在内的多种疾病组织中表达(Novak，AJ(2004)Blood1042247-2253；Novak，AJ(2004)Blood 103689-694)。
发明概述 本发明提供了新的BR3结合多肽，其包括BR3结合免疫粘附素、抗体和缺乏Fc区的肽，以及它们在本发明方法中的出乎意料的有益特性，包括，例如，它们作为去除B细胞、刺激B细胞增殖和存活、用于治疗应用或诊断应用或研究应用的有效试剂的用途。
本发明提供了BR3结合多肽，该多肽具有如下特性的任一种、或任意组合或全部(1)以如下表观Kd值结合人BR3胞外结构域序列500nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、10nM或更低、5nM或更低、或1nM或更低；(2)以如下表观Kd值结合人BR3胞外结构域序列并结合小鼠BR3胞外结构域序列500nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、10nM或更低、5nM或更低、或1nM或更低；(3)具有人BR3上的包含特异性残基的功能性表位；(4)抑制人BR3与人BAFF结合；(5)在人效应细胞存在下具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，或者与野生型IgG相比，在人效应细胞存在下具有增强的ADCC，或者与野生型IgG或天然序列IgG Fc相比，在人效应细胞存在下具有减弱的ADCC；(6)来源于本文公开的任何一种抗体；(7)与具有野生型或天然序列IgG Fc的多肽或母体多肽相比，以更高的亲和性结合人Fc新生受体(FcRn)；以及(8)当与基线水平或未用这种抗体处理的阴性对照相比，在体外或体内杀死或去除B细胞，优选杀死或去除至少20％的B细胞。BR3结合多肽包括结合与Fc结构域融合的BR3(例如，来源于噬菌体展示)的肽(例如，肽体(peptibody))。
在一实施方案中，与用不结合B细胞表面抗原的对照抗体进行的处理比较或与处理前的基线水平比较，本发明的抗体可去除小鼠体内如下细胞群的任一种、任意组合或所有细胞群中的至少20％B细胞(1)血液中的B细胞，(2)淋巴结中的B细胞，(3)脾中的滤泡B细胞，以及(4)脾中的边缘区B细胞。在其它实施方案中，B细胞去除率为25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。
本发明还提供了激动型BR3结合多肽，其具有如下特性的任一种、任意组合或全部(1)以如下表观Kd值结合人BR3胞外结构域序列500nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、10nM或更低、5nM或更低、或1nM或更低；(2)具有人BR3上的包含特异性残基的功能性表位；(3)在体外刺激B细胞增殖；(4)抑制人BR3结合人BAFF；(5)来源于本文公开的任一种抗体；(6)与具有野生型或天然序列IgG Fc的多肽或母体多肽相比，以更高的亲和性结合人Fc新生受体(FcRn)；以及(7)在体内刺激B细胞增殖或B细胞存活。根据一实施方案，与野生型IgG1或天然IgG1Fc序列或9.1RF抗体相比，该激动型抗体具有更弱的或没有ADCC功能。根据一实施方案，本发明的激动型抗体在Fc区具有至少如下置换D265A/N297A(EU编号系统)。根据一实施方案，该激动型抗体具有人IgG4的IgG Fc序列。
根据一实施方案，本发明的BR3结合多肽具有针对人BR3的包含残基F25、V33和A34的功能性表位，其中该单克隆抗体不为9.1抗体或2.1抗体。根据另一实施方案，该功能性表位还包含残基R30。根据一实施方案，本发明的BR3结合多肽具有针对人BR3的包含残基P21和A22的功能性表位。根据一实施方案，本发明的BR3结合多肽具有针对人BR3的包含残基L38和L39的功能性表位，其中该抗体不是9.1抗体。根据一实施方案，该BR3结合多肽具有针对人BR3的包含残基G36的功能性表位，其中该抗体不是2.1抗体。根据一实施方案，本发明的BR3结合多肽具有针对人BR3的包含残基V29和L28的功能性表位。根据另一实施方案，该功能性表位还包含L28和V29。根据一实施方案，具有针对人BR3的包含L38、R39、P21和A22中任一残基、任意组合或所有残基的功能性表位的抗BR3抗体为拮抗性BR3结合抗体。根据另一实施方案，具有针对人BR3的包含G36的功能性表位的抗BR3抗体为激动型性BR3结合抗体。
本发明提供了表2的抗体、来源于这些抗体的BR3结合抗体、以及结合BR3并具有H1、H2、H3、L1、L2或L3区的抗体，其中该H1、H2、H3、L1、L2或L3区与附图中描述的抗体序列的任一划线部分或与序列表中描述的CDR或高变区有至少70％同源性。根据一实施方案，本发明的抗体结合BR3并具有H1、H2和H3区，其中该H1、H2和H3区分别与表2中任一抗体的H1、H2和H3区有至少70％同源性。根据一实施方案，本发明的抗体结合BR3并具有L1、L2和L3区，其中该L1、L2和L3区分别与表2中任一抗体的L1、L2和L3区有至少70％同源性。根据一实施方案，本发明的抗体结合BR3并具有VH结构域，其中该VH结构域与表2中任一抗体的VH结构域具有至少70％同源性。
本发明提供了包含H3高变区(HVR3)的人源化抗BR3抗体，该H3高变区含有残基QVRRALDY(SEQ ID NO212)。根据另一实施方案，BR3结合抗体包含(1)含有残基QVRRALDY(SEQ ID NO212)的H3高变区(HVR3)；和(2)含有残基RDTSKNTF(SEQ ID NO210)的重链框架3区(HC-FR3)。在一实施方案中，所述BR3结合抗体还包含HVR1和HVR2，其中该HVR1和HVR2分别包含SEQ ID NO35-36中任一抗体序列的编号为26-35的残基和编号为49-65的残基(Kabat编号)。在另一实施方案中，所述抗BR3抗体还在H1高变区(HVR1)包含残基GFTVTAYYMS(SEQ ID NO214)和在H2高变区(HVR2)包含残基GFIRDKANGYTTEYNPSVKG(SEQ ID NO213)。根据一实施方案，所述抗体还在LVR1包含残基KSSQSLL YSSNQNNYLA(SEQ ID NO232)、在LVR2包含残基WASTRES(SEQ ID NO233)和在LVR3包含残基QQSQISPPT(SEQ ID NO231)。
根据另一实施方案，抗-BR3结合抗体包含(1)含有QVRRALDY(SEQ ID NO212)的H3高变区(HVR3)；(2)含有RDTSKNTL(SEQ IDNO211)的重链框架3区(HC-FR3)。在一实施方案中，所述BR3结合抗体包含SEQ ID NO37-73中任一抗体序列的编号为26-35和49-65的残基(Kabat编号)。根据一实施方案，所述抗体还在LVR1包含残基KSSQSLLYSSNQNNYLA(SEQ ID NO232)，在LVR2包含残基WASTRES(SEQ ID NO233)和在LVR3包含残基QQSQISPPT(SEQ IDNO231)。
根据另一实施方案，抗-BR3结合抗体包含含有式I的L2高变区(LVR2) W-A-X3-X4-X5-X6-S(SEQ ID NO215)(式I)， 其中X3为Q或S；X4为H、I或T；X5为L或R以及X6为D或E，且其中式I不是WASTRES(SEQ ID NO233)。根据一实施方案，所述抗-BR3抗体还包含含有QVRRALDY(SEQ ID NO212)的H3高变区(HVR3)。根据一实施方案，所述LVR2包含选自SEQ ID NO23和25的抗体序列的编号为50-56(Kabat编号)的残基。根据一实施方案，所述抗体还在HVR1包含残基GFTVTAYYMS(SEQ ID NO214)和在HVR2中包含残基GFIRDKANGYTTEYNPSVKG(SEQ ID NO213)。根据一实施方案，所述抗体还在LVR1中包含残基KSSQSLLYSSNQNNYLA(SEQ IDNO232)和在LVR3中包含残基QQSQISPPT(SEQ ID NO231)。
根据另一实施方案，抗-BR3结合抗体包含含有式II的H1高变区(HVR1) X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Y-X9-X10(SEQ ID NO216)(式II)， 其中X1为G或D，S，A，V，E或T；X2为L，S，W，P，F，A，V，I，R，Y或D；X3为P，T，A，N，S，I，K，L或Q；X4为M，R，V，Y，G，E，A，T，L，W或D；X5为A，S，T，G，I，R，P，N，D，Y或H；X6为G，A，S，P或T；X7为F，H，Y，R，S，V或N；X9为T，I，M，F，W或V；X10为T，G，S或A，且其中式II不是GFTVTAYYMS(SEQ ID NO214)。根据一实施方案，所述抗体还包含含有QVRRALDY(SEQ ID NO212)的H3高变区(HVR3)。根据一实施方案，所述HVR1包含选自SEQ ID NO24、26-34、36和38-73中的抗体序列的编号为26-35(Kabat编号)的残基。根据一实施方案，所述抗体还在LVR2中包含残基WASTRES(SEQ ID NO233)。根据一实施方案，所述抗体还在LVR1中包含残基KSSQSLLYSSNQNNYLA(SEQ IDNO232)、在LVR2中包含残基WASTRES(SEQ ID NO233)和在LVR3中包含残基QQSQISPPT(SEQ ID NO231)。根据一实施方案，所述抗体还在HVR2中包含残基GFIRDKANGYTTEYNPSVKG(SEQ ID NO213)。
根据另一实施方案，本发明的BR3结合抗体为包含如下部分的抗体(1)含有QVRRALDY(SEQ ID NO212)的H3高变区(HVR3)和(2)选自Hu9.1-73、Hu9.1-70、Hu9.1-56、Hu9.1-51、Hu9.1-59、Hu9.1-61、Hu9.1-A、Hu9.1-B和Hu9.1-C抗体的LVR2中编号为50-56的残基和HVR1中编号为26-35的残基。根据一实施方案，所述抗体还在HVR2中包含残基GFIRDKANGYTTEYNPSVKG(SEQ ID NO213)。根据一实施方案，所述抗体还在LVR1中包含残基KSSQSLLYSSNQNNYLA(SEQ ID NO232)和在LVR3中包含残基QQSQISPPT(SEQ ID NO231)。
本发明还提供了包含HVR3的抗-BR3抗体，其中该HVR3含有选自SEQ ID NO7-13和16-18的抗体序列中编号为94-102(Kabat编号)的残基。根据一实施方案，该抗体还包含HVR1和HVR2，该HVR1和HVR2分别含有SEQ ID NO7-13和16-18中任一抗体序列的残基26-35和残基49-65(Kabat编号)。根据一实施方案，所述抗体的LVR1、LVR2和LVR3分别含有SEQ ID NO3抗体序列的残基24-34和残基50-56和残基89-97(Kabat编号)。
根据一实施方案，所述抗-BR3包含含有SEQ ID NO22、24和26-73中任一可变重链序列的可变重链结构域。根据一实施方案，所述抗-BR3包含含有SEQ ID NO21、23和25中任一可变轻链序列的可变轻链结构域。根据另一实施方案，所述抗体包含序列SEQ ID NO74。根据另一实施方案，所述抗体包含序列SEQ ID NO76，其中X为A，W，H，Y，S或F。根据一具体实施方案，所述抗体包含SEQ ID NO75序列。
本发明提供了包含HVR3的抗-BR3抗体，该HVR3包含式III X1-X2-X3-X4-X5-G-X7-MDY(SEQ ID NO218)(式III)， 其中X1为N，T或R；X2为A，S，T，L，N或P；X3为N，H或L；X4为P，Y，F，N，T或L；X5为Y，T或D；以及X7为A或E。根据一实施方案，式III不为TPHTYGAMDY(SEQ ID NO235)。根据一实施方案，式III为NSNFYGAMDY(SEQ ID NO219)。根据一实施方案，所述抗体还包含含有残基RDTSKNTF(SEQ ID NO210)或RDTSKNTL(SEQ IDNO211)的HC-FR3。根据一实施方案，所述抗体的LVR1、LVR2和LVR3分别含有抗体序列SEQ ID NO3的残基24-34、残基50-56和残基89-97(Kabat编号)。根据一实施方案，所述抗体的HVR1和HVR2分别含有抗体序列SEQ ID NO4的残基26-35和残基49-65(Kabat编号)。
此外，本发明提供了包含HVR3的抗-BR3抗体，该HVR3含有式III X1-X2-X3-X4-X5-G-X7-MDY(SEQ ID NO218)(式III)， 其中X1为N，T或R；X2为A，S，T，L，N或P；X3为N，H或L；X4为P，Y，F，N，T或L；X5为Y，T或D；以及X7为A或E，且所述抗体还包含含有残基RDTSKNTF(SEQ ID NO210)或RDTSKNTL(SEQ IDNO211)的HC-FR3。根据一实施方案，当HC-FR3包含RDTSKNTF(SEQID NO210)时，则该抗体的HVR3包含SEQ ID NO6-9和16-17中任一抗体序列的残基94-102(Kabat编号)。根据一实施方案，当HC-FR3包含RDTSKNTL(SEQ ID NO211)时，则该抗体的HVR3包含SEQ ID NO5和10-13中任一抗体序列的残基94-102(Kabat编号)。根据一实施方案，所述抗体的LVR1、LVR2和LVR3分别包含SEQ ID NO3抗体序列的残基24-34、残基50-56和残基89-97(Kabat编号)。根据一实施方案，所述抗体的HVR1和HVR2分别包含SEQ ID NO4抗体序列的残基26-35和残基49-65(Kabat编号)。
在一实施方案中，式III的序列为式IV X1-X2-X3-X4-X5-GAMDY(SEQ ID NO218)(式IV)， 其中X1为N，T或R；X2为S，T，L，N或P；X3为N或L；X4为P，Y，F，N或L；X5为Y或D。
根据一实施方案，所述抗-BR3抗体包含含有式IV序列的HVR3和含有SEQ ID NO210序列的HC-FR3。在另一实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO14的轻链序列。另一实施方案中，所述抗体包含具有D265A/N297A(EU编号)突变的Fc区。
根据一实施方案，所述抗-BR3包含含有SEQ ID NO4-13和16-18中任一可变重链序列的可变重链结构域。根据一实施方案，所述抗-BR3包含含有SEQ ID NO3的可变轻链序列的可变轻链结构域。根据另一实施方案，所述抗体包含SEQ ID NO14的序列。根据另一实施方案，所述抗体包含SEQ ID NO15的序列。
本发明提供了包含可变轻链序列SEQ ID NO77和可变重链序列SEQ ID NO78的抗-BR3抗体及其变体。根据一实施方案，抗-BR3抗体包含SEQ ID NO79的可变轻链序列。根据另一实施方案，抗-BR3抗体包含SEQ ID NO80-85中任一可变重链序列。根据一实施方案，抗-BR3抗体包含HVR1，该HVR1含有SEQ ID NO80或82中任一抗体序列的编号为26-35的残基(Kabat编号)。根据一实施方案，抗-BR3抗体包含HVR2，该HVR2含有SEQ ID NO80、84或85中任一抗体序列的编号为49-65的残基(Kabat编号)。根据一实施方案，抗-BR3抗体包含HVR3，该HVR3含有SEQ ED NO80、82或83中任一抗体序列的编号为94-102的残基(Kabat编号)。在另一实施方案中，所述抗-BR3抗体包含(1)含有SEQ ID NO81-85中任一抗体序列的残基94-102(Kabat编号)的HVR3和(2)含有RDTSKNTF(SEQ ED NO210)的重链框架3区(HC-FR3)。根据一实施方案，抗-BR3抗体包含SEQ ID NO80-85中任一抗体序列的编号为26-35、49-65和94-102的残基。根据一实施方案，所述抗-BR3抗体包含LVR1，该LVR1含有SEQ ID NO79抗体序列的编号为24-34(Kabat编号)的残基。根据一实施方案，所述抗-BR3抗体包含LVR2，该LVR2含有SEQ ED NO79抗体序列的编号为50-56(Kabat编号)的残基。根据一实施方案，所述抗-BR3抗体包含LVR3，该LVR3含有SEQ ID NO79抗体序列的编号为89-97(Kabat编号)的残基。根据一实施方案，抗-BR3抗体的LVR1、LVR2和LVR3分别含有SEQ ED NO79的编号为24-34、50-56和89-97(Kabat编号)的残基。
根据一实施方案，所述抗-BR3包含含有SEQ ID NO 78和80-85中任一可变重链序列的可变重链结构域。根据一实施方案，所述抗-BR3包含含有SEQ ID NO77和79的可变轻链序列的可变轻链结构域。
本发明提供了包含HVR3的抗-BR3抗体，该HVR3含有SEQ IDNO87-94中任一抗体序列的编号为95-102的残基。本发明提供了包含HVR2的抗-BR3抗体，该HVR2含有SEQ ID NO 87-94，98，100，102，104，106，107，109-110，112，114，116，118，120，122，124-127，129和193中任一抗体序列的编号为49-58的残基。本发明提供了包含HVR1的抗-BR3抗体，该HVR1含有SEQ ID NO87-94，98，100，102，104，106，107，109-110，112，114，116，118，120，122，124-127，129和193中任一抗体序列的编号为24-34的残基。本发明提供了包含LVR1的抗-BR3抗体，该LVR1含有SEQ ED NO86，97，99，101，103，105，108，111，113，115，117，119，121，123，128和194-207中任一抗体序列的编号为24-34的残基。本发明提供了包含LVR2的抗-BR3抗体，该LVR2含有SEQ ID NO86，97，99，101，103，105，108，111，113，115，117，119，121，123，128和194-207中任一抗体序列的编号为50-56的残基。本发明提供了包含LVR3的抗-BR3抗体，该LVR3含有SEQ ID NO86，97，99，101，103，105，108，111，113，115，117，119，121，123，128和194-207中任一抗体序列的编号为89-97的残基。根据一实施方案，该LVR1、LVR2和LVR3含有SEQ ED NO86，97，99，101，103，105，108，111，113，115，117，119，121，123，128和194-207中任一抗体序列的24-34、50-56和89-97残基。根据一实施方案，该HVR1、HVR2和HVR3含有SEQ ID NO 87-94，98，100，102，104，106，107，109-110，112，114，116，118，120，122，124-127，129和193中任一抗体序列的编号为24-34、49-58和95-102的残基。在一实施方案中，所述抗-BR3抗体包含可变重链结构域，该可变重链结构域含有SEQ ID NO 87-94，98，100，102，104，106，107，109-110，112，114，116，118，120，122，124-127，129和193中的任一VH序列。在一实施方案中，所述抗-BR3抗体包含可变轻链结构域，该可变轻链结构域含有SEQ ID NO86，97，99，101，103，105，108，111，113，115，117，119，121，123，128和194-207中的任一VL序列。
本发明提供了包含含有RVCYN-X6-LGVCAGGMDY(SEQ EDNO220)(式V)的HVR3的抗-BR3抗体，其中X6为R或H。
本发明提供了包含LVR1的抗-BR3抗体，该LVR1含有式VI RAS-X4-X5-X6-X7-X8-X9-VA(式VI)， 其中X4为Q或E；X5为D或E；X6为I或E；X7为S或A，X8为S或T以及X9为A或S。
本发明提供了包含LVR2的抗-BR3抗体，该LVR2含有式VII X1-X2-A-S-X5-L-X7-S(式VII)，其中X1为Y或F；X2为S，A或G；X5为N，F或Y；以及X7为F或Y。
本发明提供了包含LVR3的抗-BR3抗体，该LVR3含有式VIII Q-X2-S-X4-X5-X6-PPT(式VIII)， 其中X2为Q或H；X4为G，L，R，H，Y，Q或E；X5为N，T，M，S，A，T，I或V；以及X6为T或S。根据一实施方案，所述抗-BR3抗体包含含有式I、式II和式III序列的轻链。根据另一实施方案，所述抗-BR3抗体包含含有式I、式II和式III序列的轻链并包含含有式V或SEQ ID NO220序列的HVR3。
本发明提供了包含H3、H1和H2的抗-BR3结合抗体，该H3含有RVCYNRLGVCAGGMDY(SEQ ID NO221)；该H1含有残基SGFTISSNSIH(SEQ ID NO222)，以及该H2含有AWITPSDGNTD(SEQID NO223)。在另一实施方案中，所述抗-BR3抗体包含H3、H1和H2，该H3含有RVCYNRLGVCAGGMDY(SEQ ID NO221)；该H1含有残基SGFTISSSSIH(SEQ ID NO224)；以及该H2含有AWVLPSVGFTD(SEQID NO225)。
根据一实施方案，所述抗-BR3包含可变重链，该可变重链含有SEQID NO 87-96，98，100，102，104，106，107，109-110，112，114，116，118，120，122，124-127，129和193中的任一可变重链序列。根据一实施方案，所述抗-BR3包含可变轻链，该可变轻链含有SEQ ID NO86，97，99，101，103，105，108，111，113，115，117，119，121，123，128和194-207中的任一可变轻链序列。
在一实施方案中，所述BR3结合抗体可竞争性抑制由保藏为3.1(ATCC Deposit PTA-6622)或12B12.1(ATCC Deposit PTA-6624)的杂交瘤产生的抗体与人BR3胞外结构域的结合。在另一实施方案中，所述抗体包含由保藏为3.1(ATCC Deposit PTA-6622)或12B12.1(ATCC DepositPTA-6624)的杂交瘤产生的抗人BR3胞外结构域的抗体的可变区序列。在另一实施方案中，所述抗体包含由保藏为3.1(ATCC Deposit PTA-6622)或12B12.1(ATCC Deposit PTA-6624)的杂交瘤产生的抗体的高变区序列。在另一实施方案中，抗体是由保藏为3.1(ATCC Deposit PTA-6622)或12B12.1(ATCC Deposit PTA-6624)的杂交瘤产生的人源化形式的抗体。
在一实施方案中，所述BR3结合抗体可竞争性抑制由保藏为3.1(ATCC Deposit PTA-6622)或12B12.1(ATCC Deposit PTA-6624)的杂交瘤产生的抗体与人BR3的结合。在另一实施方案中，所述抗体包含由保藏为3.1(ATCC Deposit PTA-6622)或12B12.1(ATCC Deposit PTA-6624)的杂交瘤产生的抗人BR3的抗体的可变区序列。在另一实施方案中，所述抗体包含由保藏为3.1(ATCC Deposit PTA-6622)或12B12.1(ATCCDeposit PTA-6624)的杂交瘤产生的抗体的高变区序列。在另一实施方案中，抗体是由保藏为3.1(ATCC Deposit PTA-6622)或12B12.1(ATCCDeposit PTA-6624)的杂交瘤产生的抗体的人源化形式。
在一实施方案中，本发明所述抗体与此处具体描述的任一种抗体结合相同的表位。在另一实施方案中，本发明所述抗体包含所保藏的抗体的序列。
本发明提供了具有改变的Fc效应功能的BR3结合抗体和免疫粘附素，该Fc效应功能例如ADCC、CDC和FcRn结合。在一实施方案中，关注与野生型人IgG1相比具有增强的ADCC活性的抗体和免疫粘附素。根据另一实施方案，关注与野生型人IgG1相比具有减弱的ADCC活性的抗体和免疫粘附素。根据另一实施方案，关注与野生型人IgG1相比具有增强的FcRn结合亲和性的抗体和免疫粘附素。根据一实施方案，所述抗体或免疫粘附素在Fc区中具有选自如下位点的至少一个置换Fc区的238，239，246，248，249，252，254，255，256，258，265，267，268，269，270，272，276，278，280，283，285，286，289，290，292，293，294，295，296，298，301，303，305，307，309，312，315，320，322，324，326，327，329，330，331，332，333，334，335，337，338，340，360，373，376，378，382，388，389，398，414，416，419，430，434，435，437，438和439，其中Fc区中残基的编号是基于EU编号系统。根据一实施方案，残基434是选自A，W，Y，F和H的残基。根据另一实施方案，所述抗体或免疫粘附素具有如下置换S298A/E333A/K334A。根据另一实施方案，所述抗体或免疫粘附素具有如下置换K332A。根据另一实施方案，所述抗体或免疫粘附素包含SEQID NO134序列，其中X为选自A，W，H，Y和F的任意氨基酸。根据另一实施方案，所述抗体或免疫粘附素具有如下置换的任意一种或其任意组合K246H、H268D、E283L、S324G、S239D和I332E。根据另一实施方案，本发明的抗体或免疫粘附素至少具有如下置换D265A/N297A。
根据本发明的一实施方案，所述BR3结合多肽与细胞毒剂或化学治疗剂偶联(conjugated)。
根据另一实施方案，所述抗体为单克隆抗体。根据另一实施方案，所述抗体为人源化抗体。根据另一实施方案，所述抗体为人抗体。根据另一实施方案，所述抗体为嵌合抗体。根据另一实施方案，所述抗体选自Fab、Fab’、F(ab)’2、单链Fv(scFv)、Fv片段；双抗体(diabody)和线状抗体。根据另一实施方案，所述抗体为多特异性抗体，如双特异性抗体。
还提供了包含任一前述实施方案中的抗体或多肽和载体的组合物。在一实施方案中，该载体是药物可接受的载体。可在制品或试剂盒中提供了这些组合物。
本发明还提供了在组氨酸缓冲液中含有抗-BR3抗体的液体制剂。根据一实施方案，该缓冲液是组氨酸硫酸盐缓冲液。根据另一实施方案，将本发明的制剂或组合物包装为预填充注射器。
本发明还提供了编码本文公开的任一抗体序列的分离的核酸，包括用于表达该抗体的表达载体。
本发明的另一方面提供了包含前述核酸的宿主细胞和产生所述抗体的宿主细胞。在后者的一个优选实施方案中，该宿主细胞是CHO细胞。本发明提供了产生这些抗体的方法，该方法包括培养产生抗体的宿主细胞并从该细胞培养物中回收该抗体。
本发明的还一方面是包括容器和容器中所含的组合物以及包装说明书的制品，其中该组合物包含任一前述实施方案中的抗体。根据一实施方案，该制品为包含本发明BR3结合抗体的诊断试剂盒。
本发明还提供了通过将BR3结合抗体、其多肽或功能性片段对哺乳动物给药来治疗本发明所公开的疾病的方法，该哺乳动物例如为接受骨髓移植的人类患者和患有诸如自身免疫性疾病、癌症、B细胞瘤、BR3阳性癌或免疫缺陷病等疾病的人类患者。在治疗自身免疫性疾病、B肿瘤或BR3阳性癌的一个优选实施方案中，待给药的BR3结合多肽或抗体优选为拮抗性BR3-结合抗体或多肽，或者不为激动型BR3结合抗体或多肽。在治疗免疫缺陷病的一个优选实施方案中，待使用的BR3结合抗体或多肽为本发明的激动型BR3结合抗体或多肽。根据一实施方案，本发明的待治疗的癌症选自非何杰金氏氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、(包括滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤和套细胞淋巴瘤)。
在治疗自身免疫性疾病、癌症、B细胞瘤或BR3阳性癌的方法的一个实施方案中，所述抗体为与本发明的9.1RF抗体相比，在pH6.0时具有增强的结合FcRn能力的BR3-结合抗体。在治疗自身免疫性疾病、B细胞瘤或BR3阳性癌的方法的一个实施方案中，所述BR3结合抗体为与9.1RF抗体相比，在人效应细胞存在下具有增强的ADCC效应功能的BR3-结合抗体。
在一实施方案中，所述BR3阳性癌为B细胞淋巴瘤或白血病，包括非何杰金氏氏淋巴瘤(NHL)或淋巴细胞为主型何杰金氏病(LPHD)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)或小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)。根据另一实施方案，所述BR3阳性癌为多发性骨髓瘤。在另外的实施方案中，所述治疗方法还包括对所述患者给予至少一种化学治疗剂，其中对于非何杰金氏氏淋巴瘤(NHL)，所述化学治疗剂选自多柔比星、环磷酰胺、长春新碱和泼尼松龙。
本发明还提供了治疗自身免疫性疾病的方法，其包括将治疗有效剂量的本发明的BR3结合抗体或多肽对患有自身免疫性疾病的患者给药。根据一实施方案，该自身免疫性疾病选自类风湿性关节炎，幼年型类风湿性关节炎，包括全身性红斑狼疮(SLE)在内的狼疮，Wegener’s病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎在内的炎症性肠病，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，血栓性血小板减少性紫癜(TTP)，自身免疫性血小板减少症，多发性硬化症，银屑病，包括IgA肾病、IgM多发性神经病和IgG神经病在内的Ig神经病，重症肌无力，包括ANCA-相关的血管炎在内的血管炎，糖尿病，Reynaud’s综合征，干燥综合征，视神经脊髓炎(NMO)，包括副肿瘤性天疱疮、寻常型天疱疮和落叶性天疱疮在内的天疱疮，多发性肌炎/皮肌炎和肾小球炎。当该自身免疫性疾病为类风湿性关节炎时，所述抗体可与另一治疗剂联合给药。根据一实施方案，该另一治疗剂为氨甲喋呤。
在这些自身免疫性疾病、B细胞瘤、BR3阳性癌的治疗方法中，可将所述BR3结合抗体单独给药或与另一治疗剂联合给药，该另一治疗剂例如为另一抗体、另一B细胞去除剂、化学治疗剂、免疫抑制剂或另一种调节人免疫应答的生物剂(例如，生物应答调节剂)。该另一抗体可以是结合CD20或不同B细胞抗原、或NK或T细胞抗原的抗体。在一实施方案中，该抗-CD20抗体选自利妥昔单抗(RITUXAN_)、m2H7(鼠2H7)、hu2H7(人源化2H7)及其所有的功能性变体、hu2H7.v16(v代表变种)、v31、v96、v114和v115(例如，参见WO 2004/056312)。在一实施方案中，该另一抗体为放射标记的抗-CD20抗体。在其它实施方案中，该CD20结合抗体与包括毒素或放射性同位素在内的细胞毒剂偶联。在其它实施方案中，该第二种治疗剂选自白介素(例如，IL-2、IL-12)、干扰素、氟达拉滨、环磷酰胺、靶向TNF-α的抗体(例如Enbrel_、Remicade_和Humira_)、集落刺激因子(例如，CSF、GM-CSF、G-CSF)。在另一实施方案中，该另一抗体或生物剂可以是另一种BAFF拮抗剂(例如，BR3抗体、抗BAFF抗体、TACI-Fc、BCMA-Fc和BR3-Fc)。根据一实施方案，作为用于自身免疫性疾病或癌症的另一治疗剂进行给药的该BAFF拮抗剂不具有ADCC活性。在另一实施方案中，该另一治疗剂选自抗-VEGF抗体(例如，AvastinTM抗体)、抗-CD64抗体、抗-C32a抗体、抗CD16抗体、抗-INFα抗体、抗-CD79a抗体、抗-CD70b抗体、抗-CD52抗体、抗-CD40抗体、CTLA4-Ig、抗-CD22抗体、抗-CD23抗体、抗CD80抗体、抗HLA-DR抗体、抗-MHCII(IA)抗体、抗-IL-7抗体、抗-IL-2抗体、抗-IL-4抗体、抗-IL-21抗体和抗-IL-10抗体。B细胞去除剂的具体示例包括，但不限于前述的抗-CD20抗体、阿仑单抗(抗CD52抗体)和依帕珠单抗(Epratuzumab)或CMC-544(Wyeth)(抗CD22抗体)。在另一实施方案中，该另一治疗剂为去除B细胞的小分子或IAP抑制剂。
在另一方面，本发明提供了治疗自身免疫性疾病的方法，该自身免疫性疾病选自皮肌炎、Wegner’s肉芽肿病、ANCA相关的血管炎(AAV)、再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)或因子VIII缺乏、血友病A、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症、Castleman’s综合征、Goodpasture’s综合征、实体器官移植排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、IgM介导的、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性肝炎、淋巴间质性肺炎(LIP)、闭塞性毛细支气管炎(非移植的)vs.NSIP，格林-巴利综合征、大血管血管炎(large vessel vasculitis)、巨细胞(Takayasu’s)动脉炎、中等血管血管炎(medium vessel vasculitis)、川畸病、结节性多动脉炎，该方法包括将有效量的BR3结合抗体对患有所述疾病的患者给药。
本发明还提供了治疗哺乳动物的免疫缺陷病的方法，该方法包括将以治疗有效剂量的本发明的激动型BR3结合抗体或多肽给药的步骤。
本发明提供了采用本发明的抗体分离BR3的方法。本发明还提供了筛选B细胞增殖抑制剂的方法，该方法包括如下步骤(a)用BR3激动型抗体刺激B细胞；(b)给予候选化合物；以及(c)检测BR3活性，如B细胞增殖。本发明还提供了鉴别并监测BR3途径的下游标志物的方法，该方法包括如下步骤(a)用BR3激动型抗体刺激B细胞以及(b)检测该细胞的基因表达和/或蛋白活性的变化。
本发明还提供了诊断适于用BR3结合治疗性拮抗剂治疗的自身免疫性疾病或癌症的方法，该方法包括(a)使来自测试个体的生物样品与本发明的BR3结合抗体或多肽接触；(b)测定该生物样品中的BR3多肽水平；以及(c)将该生物样品中的BR3多肽水平与BR3蛋白的标准水平进行比较；其中与该BR3蛋白的标准水平相比，BR3蛋白的出现或其水平的增加表明适于用BR3结合治疗剂进行治疗的自身免疫疾病或癌症。
本发明还提供了检测BR3多肽的方法，该方法包括如下步骤在测试样品或个体中结合本发明的抗-BR3抗体或免疫粘附素，并将被结合的抗体或免疫粘附素与对照抗体或免疫粘附素比较。在一实施方案中，所述抗体或免疫粘附素用在选自FACS分析法、免疫组织化学测定法(IHC)和ELISA测定法的测定中。非BAFF阻断性抗-BR3抗体具有检测BR3是否与配体相结合的并可用于测定游离的和结合的BR3。
附图的简要说明

图1显示了根据Kabat编号系统进行编号的2.1嫁接的抗-BR3抗体的可变区序列。黑体字母表示与人共有的III序列相比的R71A、N73T和L78A变化。划线部分指的是包含CDR序列的区域(H1，H2，H3，L1，L2和L3)。
图2显示了根据Kabat编号系统进行编号的9.1嫁接的抗-BR3抗体的可变区序列。黑体字母表示与人共有的III序列相比的R71A、N73T和L78A变化。划线部分指的是包含CDR序列的区域(H1，H2，H3，L1，L2和L3)。
图3显示了根据Kabat编号系统进行编号的11G9嫁接的抗-BR3抗体的可变区序列。划线部分指的是包含CDR序列的区域(H1，H2，H3，L1，L2和L3)。黑体字母表示与人共有的III序列相比的R71A、N73T和L78A变化。
图4显示了将9.1嫁接的抗-BR3抗体的CDR区进行软随机化的结果和筛选。除了在所示的L2和H1区中的残基进行了改变，所列抗体的可变区与该9.1嫁接的可变区序列相同。
图5显示了小鼠VH框架区与人”RF”和”RL”框架区的比较。
图6显示了与具有被修饰框架的嫁接的Fabs进行的抗原结合。
图7显示了第5轮时从2.1-RL和2.1-RF CDR修复文库中选定的序列。除了在所示的H3区中的残基的改变以外，所列抗体的可变区与2.1-RF或2.1-RL的可变区相同。
图8显示了第5轮时从9.1-RL和9.1-RF CDR修复文库中选定的序列。除了在所示的H1区中的残基的改变以外，所列抗体的可变区与9.1-RF或9.1-RL的可变区相同。
图9显示了第5轮时从11G9-RF CDR修复文库中选定的序列。除了在所示的H1、H2和H3区中的残基的改变以外，所列抗体的可变区与11G9-RF的可变区相同。
图10显示了所选的抗-BR3人源化的Mab(单克隆抗体)的BIAcore分析。
图11显示了在溶液中与增加量的(A)含有小鼠BR3 ECD的多肽或(B)含有人BR3 ECD的多肽结合的所选的F(ab)′2噬菌体克隆的溶液结合竞争性ELISA的结果。
图12显示了根据Kabat编号系统进行编号的来自噬菌体-衍生的抗-BR3抗体的氨基酸序列。“LN”指的是在编号为95-102的残基之间并包括该残基的残基数。“#”指在筛选过程中选择的克隆次数的数字。“克隆”指所指定的噬菌体克隆数。未显示CDR-H2的残基I51、P52a、G55、T57。包含每一抗体的剩余的残基(1-23、35-49、57-88和98-107)如图15中的V3所述。“X”表示该序列是未知的。
图13显示了采用溶液结合竞争性ELISA的所选的F(ab)’2噬菌体的IC50值以及在BAFF存在下与mBR3或hBR3的胞外区结合的F(ab)’2噬菌体的百分比。
图14显示了表示在增加的BAFF浓度存在下抑制F(ab)’2噬菌体与mBR3-Fc包被的小孔相结合的ELISA分析。
图15显示了根据Kabat编号系统进行编号的噬菌体-衍生的V3抗-BR3抗体的可变区序列。
图16显示了(A)来自V3-衍生的克隆的序列，和(B)F(ab)’2噬菌体的IC50值以及对具有杂交mBAFF的BR3的阻断结合。未显示LC-CDR2的残基51(A)、52(S)和54(L)。
图17显示了来自V3-1衍生的克隆的残基及其IC50值。
图18显示了亲和性改进的V3-46s噬菌体克隆及它们结合小鼠BR3和人BR3的噬菌体IC50值。氨基酸显示了采用Kabat编号系统的SEQ IDNOS194-207的编号为27-32(“L1”)、49-55(“L2”)和88-94(“L3”)的残基。
图19显示了抗-BR3 mAb与BJAB细胞的竞争性结合和直接结合。(A)BAFF竞争性结合分析。(B)直接结合分析。同种型对照显示没有结合，以及检测到抗体与小鼠IgG1、IgG2a和IgG2b等效结合。
图20显示了使用与BJAB细胞(人BR3)(分别为图A和图B)和BHK细胞(鼠BR3)(分别为图C和图D)结合的V3-1m和B9C11进行的竞争性结合分析和直接结合分析的结果。
图21显示了用于表征抗-人BR3 mAb的竞争性ELISA。该mAb是在所示浓度下，与恒定量的生物素化的mAb 9.1(图A)、2.1(图B)、11G9(图C)或1E9(图D)进行孵育。
图22显示了V3-1m、B 9C11和P1B8与鼠BR3的竞争性结合。采用生物素化的V3-1m(图A)和生物素化的B9C11(图B)实施竞争性ELISA。
图23显示了抗体2.1、11G9和9.1抑制来自两种不同供体的B细胞增殖(分别为图A和图B)。
图24显示了抗体V3-1m抑制由(A)抗IgM(5μg/ml)+BAFF(2ng/ml)或(B)抗IgM(5μg/ml)+BAFF(10ng/ml)刺激的B细胞增殖。
图25显示了9.1-RF阻断BAFF-依赖性人B细胞增殖且不激发。(A)用抗IgM+BAFF+9.1-RF处理的人原始B细胞。(B)用抗IgM+9.1-RF处理的人原始B细胞。
图26显示了2.1-46刺激B细胞增殖。(A)用抗IgM+BAFF+2.1-46处理的细胞。(B)用抗IgM+2.1-46处理的细胞。
图27显示了基于鸟枪法ala-筛选(shotgun ala-scanning)结果的BR3与抗体11 G9、2.1、9.1和V3-1之间相互作用的多个点的示意图。圈起来的残基表示O-键连的糖基化的潜在位点。
图28显示了使用抗B细胞标志物的抗体，在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者的外周血中的B细胞群。图A、C和D显示了使用抗-CD19抗体以及或者抗-CD27抗体、抗-CD20抗体或者抗-CD5抗体的FACS分析。图B为显示BR3在恶性细胞群中表达的直方图。方框表示该恶性细胞群。
图29显示了使用人源化的抗-BR3抗体以及(A)BJAB细胞、(B)Ramos细胞或(C)WIL2s细胞的ADCC活性分析的结果。
图30显示了在用V3-1、BR3-Fc或对照抗体处理7天后，在血液(图A-C)、淋巴结(图D-F)和脾(图G-I)中的小鼠B细胞的流式细胞计量分析。
图31显示了用V3-1、BR3-Fc或对照抗体处理后第1、3、7和15天时，(A)在1ml血液中所含的小鼠B细胞的的绝对数；(B)在淋巴结中的B细胞的％；(C)在脾中的滤泡B细胞(FO-CD21+CD23+)或(D)边缘区B细胞(MZ-CD21高CD23低)的绝对数。
图32显示了在用对照抗体、BR3-Fc或V3-1处理后第15天时小鼠体内的B细胞群。(A-1至A-6)处理后在小鼠的脾或淋巴集结中的B细胞群的FACS分析；(B)处理后脾中的浆母细胞的直方图；(C)处理后淋巴集结中的生发中心细胞的直方图。
图33显示了在用具有ADCC活性和BAFF阻断能力的抗-BR3抗体、无阻断能力的抗-BR3抗体、Fc-缺陷的突变的抗-BR3抗体或BR3-Fc处理后第6天，在BALB/c小鼠的血液(图A)和脾(图B)中B细胞的减少。
图34显示了用抗-BR3抗体、mV3-1、mBR3-Fc和对照抗体处理NZBxW F1小鼠(狼疮性肾炎模型)的结果。(A)显示了与对照小鼠比较，抗-BR3抗体处理的小鼠和BR3-Fc处理的小鼠的进程的随时间减少。(B)显示了在用BR3-Fc(p＜0.01)、对照(p＜0.03)和mV3-1(p＜0.001)处理的小鼠中，每ml血液中的B细胞数。(C)显示了用BR3-Fc、对照和mCB1(p＜0.00001)处理的小鼠的脾中总的B细胞数。在(B)和(C)中的水平线表示该组的平均水平。将数据表达为个体小鼠数据点(n＝25) 图35显示了用人PBMC和抗BR3抗体或mBR3-Fc处理的SCID模型小鼠中的B细胞去除(第4天)。(A)活化的/GC B细胞的百分比(CD19高/CD38int)，(B)活化的/GC B细胞的数目，(C)浆母细胞的百分比(CD19低/CD38高/CD139阴性neg)，(D)浆母细胞数以及(E)活化的/GC细胞的百分比CD19高/CD38+)。
图36显示了平衡时(pH6.0和pH7.4)，9.1RF(图A)、9.1RF N434A(图B)和9.1RF N434W(图C)抗体与人或短尾猴FcRn的结合。Req为平衡时来自芯片的反应单位。
图37显示了使用与抗-BR3抗体或Herceptin(赫赛汀)_抗体(阳性对照)结合的Fcγ受体的ELISA分析。图AFcγRI。图B；FcγRIIA。图CFcγRIIB。图DFcγRIII(F158)。图EFcγRIII(V158)。
图38显示了用抗-BR3抗体(V3-1)与抗-CD20(2H7)处理后第1小时、第1天、第8天或第15天时在血液(图A)和淋巴结(图B)中B细胞水平的分析。
图39显示了用抗-BR3抗体(V3-1)与抗-CD20抗体处理后第1天、第8天和第15天时在滤泡B细胞(图A)和边缘区B细胞(图B)中B细胞水平的分析。
图40显示了用9.1RF处理的短尾猴的血液(图A)和组织(图B)中的B细胞去除。数据来自ATA-猴(5只短尾猴用20mg/kg处理；3只短尾猴用2mg/kg处理)。
图41显示了用9.1RF或9.1RF N434W处理的短尾猴的血液中B细胞群水平随时间的变化(A)CD20+/CD21+细胞，(B)CD21+/CD27+细胞和(C)CD21+/CD27-细胞。
发明的详细说明 术语“BAFF”、“BAFF多肽”、“TALL-1”或“TALL-1多肽”、“BLyS”用在本文时包括“天然序列BAFF多肽”和“BAFF变体”。“BAFF”是对由SEQ ID NO143或SEQ ID NO144中任何一种氨基酸序列编码的多肽及其同源物、片段和变体的命名，它们具有天然序列BAFF的生物活性。BAFF的生物活性可选自促进B细胞存活、促进B细胞成熟、以及结合到BR3、BCMA或TACI。BAFF变体优选与BAFF多肽的天然序列具有至少80％或直至100％之间的任何连续整数百分比的氨基酸序列一致性，包括更优选的至少90％以及甚至更优选的至少95％的氨基酸序列一致性。“天然序列”BAFF多肽包括与从天然衍生的相应BAFF多肽的氨基酸序列相同的多肽。例如，BAFF在被furin型蛋白酶从细胞表面切割后以可溶形式存在。可从自然界中分离或通过重组和/或合成的方式生产这些天然序列BAFF多肽。术语“天然序列BAFF多肽”特别包括该多肽的天然存在的截短的或分泌的形式(例如胞外区序列)、天然存在的变体形式(例如选择拼接形式)和天然存在的等位变体(allelic variant)。术语“BAFF”包括描述在如下文献中的多肽Shu et al.，J.Leukocyte Biol.，65680(1999)；GenBank登记号AF136293；1998年5月7日公开的WO 98/18921；1998年10月7日公开的EP 869,180；1998年6月25日公开的WO 98/27114；1999年3月18日公开的WO 99/12964；1999年7月8日公开的WO 99/33980；Moore et al.，Science，285260-263(1999)；Schneider et al.，J.Exp.Med.，1891747-1756(1999)；Mukhopadhyay et al.，J.Biol.Chem.，27415978-15981(1999)。
术语“BAFF拮抗剂”用在本文时具有最广泛的意义，包括如下的任何分子(1)结合天然序列BAFF多肽或结合天然序列BR3多肽以部分或全部阻断BR3与BAFF多肽的相互作用的分子，以及(2)部分或全部阻断、抑制或消除天然序列BAFF信号转导的分子。天然序列BAFF多肽信号转导尤其促使B细胞存活和B细胞成熟。抑制、阻断或消除BAFF信号转导尤其导致B细胞数量的减少。本发明的BAFF拮抗剂在体外或体内可部分或全部阻断、抑制或消除BAFF多肽的一种或多种生物活性。在一个实施方案中，生物学上有活性的BAFF增强了如下体外或体内事件的任何一种或任何组合增强B细胞存活、增加IgG和/或IgM产生的水平或刺激B细胞增殖。
术语“TACI拮抗剂”用在本文时具有最广泛的意义，包括如下的任何分子(1)结合天然序列BAFF多肽或结合天然序列TACI多肽以部分或全部阻断TACI与BAFF多肽的相互作用的分子，以及(2)部分或全部阻断、抑制或消除天然序列BAFF信号转导分子。
术语“BCMA拮抗剂”用在本文时具有最广泛的意义，包括如下的任何分子(1)结合天然序列BAFF多肽或结合天然序列BCMA多肽以部分或全部阻断BCMA与BAFF多肽的相互作用的分子，以及(2)部分或全部阻断、抑制或消除天然序列BAFF信号转导的分子。
如上所述，BAFF拮抗剂可在体外或体内以直接或间接的方式部分或全部地阻断、抑制或消除BAFF信号转导。例如，BAFF拮抗剂可直接结合BAFF。例如，关注这样的抗BAFF的抗体，它在包含残基162-275和/或选自人BAFF的162、163、206、211、231、233、264和265残基的邻近残基的人BAFF区域内结合，以致于该抗体立体阻碍了BAFF结合到BR3。在另一个实施例中，直接结合物为如下多肽其包含诸如TACI、BR3和BCMA的BAFF受体的胞外区或包含ECD的盒式最小区域(对应于人BR3的残基19-35)。作为选择，BAFF拮抗剂可在体外、原位或体内在天然序列BR3的BAFF结合区结合到其胞外区以部分或全部阻断、抑制或消除BAFF结合到BR3。例如，这种间接拮抗剂为抗BR3的抗体，它在包含人BR3的残基23-38或这些残基的临近区域的BR3区域处结合，以致于人BR3结合到BAFF上受到立体阻碍。可以是BAFF拮抗剂的BAFF结合Fc蛋白的其它例子可参见WO 02/66516、WO 00/40716、WO 01/87979、WO 03/024991、WO 02/16412、WO 02/38766、WO 02/092620和WO 01/12812。BAFF拮抗剂包括WO 02/24909中图20所列出的以及WO 2003/024991和WO 02/092620中描述的BAFF结合序列、结合BAFF的这些序列的片段和包含这些序列的融合蛋白(例如Fc融合蛋白)。
术语“BR3”、“BR3多肽”或“BR3受体”用在本文时包括“天然序列BR3多肽”和“BR3变体”(这在本文有进一步的定义)。“BR3”是对包含SEQ ID NO145-149中任何一种的多肽及其变体或片段的命名。可从诸如人组织类型或从其它来源的多种来源中分离或通过重组和/或合成的方法制备本发明的BR3多肽。术语BR3包括描述在WO02/24909和WO 03/14294中的BR3多肽。
“天然序列”BR3多肽包括与从天然衍生的相应BR3多肽的氨基酸序列相同的多肽。可从自然界中分离或通过重组和/或合成的方法生产这些天然序列BR3多肽。术语“天然序列BR3多肽”特别包括多肽的天然存在的截短的、可溶的或分泌的形式(例如胞外区序列)、天然存在的变体形式(例如选择拼接形式)和天然存在的等位变体。本发明中的BR3多肽包括包含人BR31至184氨基酸残基的连续序列的或由其组成的BR3多肽。
BR3“胞外区”或“ECD”指基本上无跨膜和胞质结构域的BR3多肽形式。BR3的ECD形式包括含有BR3的氨基酸1至77、2至62、2-71、1-61、8-71、17-42、19-35或2-63中的任何一种。
“BR3变体”指与BR3 ECD的残基19-35具有至少60％的氨基酸序列一致性并且结合天然序列BAFF多肽的BR3多肽。(参见Gordon，N.C.，et al.，(2003)Biochemistry 425977-5983)。任选的，BR3变体包括单一的半胱氨酸富集结构域。这些BR3变体多肽包括，例如，在BR3多肽的全长氨基酸序列的N端和/或C端以及在一个或多个内部结构域中增加或删除一个或多个氨基酸残基。还关注结合天然序列BAFF多肽的BR3 ECD的片段。根据实施方案，BR3变体多肽与对应于人BR3残基19-35的部分具有至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的氨基酸序列一致性。
对于人BR3多肽的残基或其具体片断，BR3变体多肽不包括天然BR3多肽序列。通常，BR3变体多肽的长度为至少约17个氨基酸或更长。
术语“抗体”具有最广泛的意义，特别包括，例如，单克隆抗体、多克隆抗体、具有多表位特异性的抗体、单链抗体、多特异性抗体和抗体片段。根据一些实施方案，本发明中的多肽被融合进例如可变结构域或CDR中的抗体结构，以致于抗体可结合并抑制BAFF结合到BR3或BAFF信号途径。包括本发明的多肽的抗体可以是嵌合的、人源化的或人的。包括本发明的多肽的抗体可以是抗体片段。下面较为详细地叙述了这些抗体和制备它们的方法。作为选择，可用本发明的多肽免疫动物生产本发明的抗体。因此，关注直接针对本发明的多肽的抗体。
用在本文时，术语“抗BR3”和“结合BR3”可互换使用并表明了该抗体或多肽结合BR3多肽。优选地，抗-BR3抗体结合到BR3多肽的具有选自SEQ ID NO145-149的氨基酸序列的表位，不结合到人TACI或人BCMA。优选地，抗-BR3抗体作为Fab在25℃下的BIAcore测定中以表观Kd值500nM或更小、100nM或更小、50nM或更小、10nM或更小、5nM或更小或1nM或更小结合人BR3胞外区序列。在一个实施方案中，该抗体或多肽以0.001pM和500nM之间的表观Kd结合到BR3。
根据本发明，“拮抗性抗BR3抗体”指结合BR3多肽并抑制BR3信号转导(例如，抑制BR3相关的B细胞增殖、B细胞存活或抑制B细胞增殖和存活)的抗体。
根据本发明，“激动型抗BR3抗体”指结合BR3多肽和刺激BR3信号转导(例如，BR3相关的B细胞增殖、B细胞存活或B细胞增殖和存活)的抗体。
“CD20”抗原为具有分子量约35kD的非糖基化的、跨膜磷蛋白，它存在于外周血或淋巴器官中多于90％的B细胞表面。在前B细胞发育早期表达CD20，一直保持到浆细胞分化；在人干细胞、淋巴祖细胞或正常浆细胞中没有发现CD20。CD20存在于正常B细胞和恶性B细胞中。CD20在文献中的其它名称包括“限于B淋巴细胞的分化抗原”和“Bp35”。CD20抗原描述在，例如，Clark and Ledbetter，Adv.Can.Res.5281-149(1989)和Valentine et al.J.Biol.Chem.264(19)11282-11287(1989)中。
CD20结合抗体和抗-CD20抗体在本文可互换使用，其包括以足够的亲和力结合CD20的所有抗体，以致于该抗体可用作靶向表达该抗原的细胞的治疗剂，它不与诸如下文测定中的阴性对照蛋白的其它蛋白进行显著的交叉反应。还关注抗体的一个臂结合CD20的双特异性抗体。这种定义的CD20结合抗体还包括前述抗体的功能性片段。结合CD20的抗体以Kd＜10nM结合CD20。在优选的实施方案中，以Kd＜7.5nM，更优选＜5nM，还更优选在1-5nM之间，最优选＜1nM结合。
结合CD20抗原的抗体的实例包括“C2B8”，现在称为“利妥昔单抗”(“RITUXAN_”)(第5,736,137号美国专利，在此特别引入作为参考)；命名为“Y2B8”或“替伊莫单抗”ZEVALIN_的钇-[90]-标记的2B8鼠抗体(第5,736,137号美国专利，在此特别引入作为参考)；鼠IgG2a“B1”，也称作“托西莫单抗”(Beckman Coulter)，任选地用131I标记以产生“131I-B1”抗体(碘I131托西莫单抗，BEXXARTM)(第5,595,721号美国专利，在此特别引入作为参考)；鼠单克隆抗体“1F5”(Press et al.Blood 69(2)584-591，1987)和包括“框架被修补的”或人源化1F5的变体(WO 03/002607，Leung，S.)；ATCC保藏HB-96450)；鼠2H7和嵌合2H7抗体(第5,677,180号美国专利，在此特别引入作为参考)；人源化2H7；huMax-CD20(Genmab，Denmark)；AME-133(AppliedMolecular Evolution)；A20抗体或诸如嵌合或人源化A20抗体的变体(分别为cA20和hA20)(US 2003/0219433，Immunomedics(免疫医学))；可从International Leukocyte Typing Workshop(国际白细胞分类小组)获得的单克隆抗体L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2(McMichael，Ed.，p.440，Oxford University Press(1987))。
术语“利妥昔单抗”或“RITUXAN_”在本文指直接针对CD20抗原的遗传工程化的嵌合鼠/人单克隆抗体，在第5,736,137号美国专利(在此特别引入作为参考)中命名为“C2B8”，并包括保留了结合CD20能力的其片段。
在具体实施方案中，抗CD20的抗体结合人和灵长类CD20。在具体的实施方案中，结合CD20的抗体是人源化的或嵌合的。结合CD20的抗体包括利妥昔单抗(RITUXAN_)、m2H7(鼠2H7)、hu2H7(人源化2H7)和所有抗体的功能性变体，包括但不限于hu2H7.v16(v代表变种)、v31、v73、v75、缺乏海藻糖的变体、以及WO 2004/056312中描述的其它2H7变体。除非说明，本文公开的人源化2H7v.16和其变体的序列为成熟多肽，即，没有前导序列。
有关CD20抗体的专利和专利出版物包括第5,776,456、5,736,137、5,843,439、6,399,061和6,682,734号美国专利，以及第US2002/0197255A1、US 2003/0021781A1、US 2003/0082172 A1、US2003/0095963 A1、US 2003/0147885 A1(Anderson et al.)号美国专利申请；第6,455,043B1号美国专利和WO 00/09160(Grillo-Lopez，A.)；WO 00/27428(Grillo-Lopez and White)；WO 00/27433(Grillo-Lopez andLeonard)；WO 00/44788(Braslawsky et al.)；WO 01/10462(Rastetter，W.)；WO 01/10461(Rastetter and White)；WO 01/10460(White andGrillo-Lopez)；US 2001/0018041A1、US 2003/0180292A1、WO 01/34194(Hanna and Hariharan)；第US 2002/0006404号美国专利申请和WO 02/04021(Hanna and Hariharan)；第US 2002/0012665A1号美国专利申请和WO 01/74388(Hanna，N.)；第US 2002/0058029A1号美国专利申请(Hanna，N.)；第US 2003/0103971A1号美国专利申请(Hariharanand Hanna)；第US 2002/0009444A1号美国专利申请和WO 01/80884(Grillo-Lopez，A.)；WO 01/97858(White，C)；第US 2002/0128488A1号美国专利申请和WO 02/34790(Reff，M.)；WO 02/060955(Braslawsky etal.)；WO 2/096948(Braslawsky et al.)；WO 02/079255(Reff and Davies)；第6,171,586B1号美国专利和WO 98/56418(Lam et al.)；WO 98/58964(Raju，S.)；WO 99/22764(Raju，S.)；WO 99/51642、第6,194,551B1号美国专利、第6,242,195B1号美国专利、第6,528,624B1号美国专利和第6,538,124号美国专利(Idusogie et al.)；WO 00/42072(Presta，L.)；WO 00/67796(Curd et al.)；WO 01/03734(Grillo-Lopez et al.)；第US2002/0004587A1号美国专利申请和WO 01/77342(Miller and Presta)；第US 2002/0197256号美国专利申请(Grewal，I.)；第US 2003/0157108A1号美国专利申请(Presta，L.)；第6,565,827B1、6,090,365B1、6,287,537B1、6,015,542、5,843,398和5,595,721号美国专利(Kaminskiet al.)；第5,500,362、5,677,180、5,721,108、6,120,767、6,652,852B1号美国专利(Robinson et al.)；第6,410,391B1号美国专利(Raubitschek etal.)；第6,224,866B1号美国专利和WO 00/20864(Barbera-Guillem，E.)；WO 01/13945(Barbera-Guillem，E.)；WO 00/67795(Goldenberg)；第US2003/0133930A1号美国专利申请和WO 00/74718(Goldenberg andHansen)；WO 00/76542(Golay et al.)；WO 01/72333(Wolin andRosenblatt)；第6,368,596B1号美国专利(Ghetie et al.)；第6,306,393号美国专利和第US 2002/0041847A1号美国专利申请(Goldenberg，D.)；第US 2003/0026801A1号美国专利申请(Weiner and Hartmann)；WO 02/102312(Engleman，E.)；第2003/0068664号美国专利申请(Albitaret al.)；WO 03/002607(Leung，S.)；WO 03/049694、US 2002/0009427A1、和US 2003/0185796A1(Wolin et al.)；WO 03/061694(Sing and Siegall)；US 2003/0219818A1(Bohen et al.)；US 2003/0219433A1和WO03/068821(Hansen et al.)；US 2003/0219818A1(Bohen et al.)；US 2002/0136719A1(Shenoy et al.)；WO 2004/032828(Wahl et al.)，在此特别引入上述所有文献作为参考。还参见第5,849,898号美国专利和第330,191号欧洲专利申请(Seed et al.)；第4,861,579号美国专利和EP332,865A2(Meyer and Weiss)；USP 4,861,579(Meyer et al.)；WO 95/03770(Bhat et al.)；US 2003/0219433A1(Hansen et al.)。
CD20抗体可以是未修饰的抗体或偶联到诸如放射性同位素或毒素的细胞毒性化合物上。这些抗体包括连接到放射性同位素钇-90的抗体ZevalinTM(IDEC Pharmaceuticals，San Diego，CA)和连接到I-131的BexxarTM(Corixa，WA)。人源化的2H7变体包括在FR具有氨基酸置换和在嫁接的CDR中有变化的亲和成熟变体。在CDR或FR中置换的氨基酸不限于在供体或受体抗体中存在的氨基酸。在其它实施方案中，本发明抗-CD20抗体还包括在Fc区域的氨基酸残基变化，其导致了改进的效应功能，包括增强的CDC和/或ADCC功能和B细胞致死(本文也称作B细胞去除)。具体地，已鉴定出三种突变可改善CDC和ADCC活性S298A/E333A/K334A(本文也称作三丙氨酸突变或变体，Fc区域的编号依EU编号系统；Kabat et al.，同上)，如上述Idusogie et al.(2001)和上述Shields et al.所描述。
本发明中其它抗-CD20抗体包括具有改善稳定性的特异变化的那些抗体。在一个实施方案中，嵌合抗-CD20抗体具有鼠V区和人C区。一种这样的特异性抗-CD20抗体为Rituxan_(Rituximab_；Genentech，Inc.)。利妥昔单抗和hu2H7可通过补体依赖的细胞毒性(CDC)和抗体依赖的细胞毒性(ADCC)介导B细胞溶解。在第6,194,551B1和WO 99/51642号美国专利中描述了具有改变的Fc区氨基酸序列和增强的或降低的C1q结合能力的抗体变体。这些专利中的内容在此特别引入作为参考。还见Idusogie et al.J.Immunol.1644178-4184(2000)。
凋亡抑制剂(IAP)指抑制凋亡的蛋白家族(Deveraux，et al.，(1999)Genes Dev 13(3)239-252)。IAP的实例包括黑素瘤IAP(ML-IAP)和人X染色体连锁的IAP(XIAP)、细胞IAP1(cIAP-1)和细胞IAP2(cIAP-2)，它们抑制caspase 3、caspase 7和caspase 9的活性(Deveraux et al.，J ClinImmunol(1999)，19388-398；Deveraux et al，(1998)EMBO J.17，2215-2223；Vucic et al.，(2000)Current Bio 101359-1366)。
IAP抑制剂的实例包括直接针对XIAP、cIAP-1、cLAP-2或ML-LAP的反义寡核苷酸，Smac/DIABLO衍生的肽或阻断IAP和其caspase相互作用的其它分子、以及抑制IAP介导的抑制caspase活性的分子(Sasaki et al，Cancer Res.，2000，60(20)5659；Lin et al，BiochemJ.，2001，353299；Hu et al，Clin.Cancer Res.，2003，9(7)2826；Arnt et al，J.Biol.Chem.，2002，277(46)44236；Fulda et al，Nature Med.，2002，8(8)808；Guo et al，Blood，2002，99(9)3419；Vucic et al.，J.Biol.Chem.，2002，277(14)12275；Yang et al，Cancer Res.，2003，63(4)831)；WO 2005/097791，WO 2005/094818，US 2005/0197403以及US6,673,917)。
本文中“B细胞表面标志物”或“B细胞表面抗原”为表达在B细胞表面并可被与其结合的拮抗剂靶向的抗原。B细胞表面标志物的实例包括但不限于CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD40、CD52、D53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86、CD180(RP105)、FcRH2(LRTA4)、CD79A、C79B、CR2、CCR6、CD72、P2X5、HLA-DOB、CXCR5(BLR1)、FCER2、BR3(aka BAFF-R)、TACI、BTLA、NAG14(aka LRRC4)、SLGC16270(ala LOC283663)、FcRH1(LRTA5)、FcRH5(LRTA2)、ATWD578(akaMGC15619)、FcRH3(LRTA3)、FcRH4(LRTA1)、FcRH6(akaLOC343413)以及BCMA(aka TNFRSF17)、HLA-DO、HLA-DrIO和II型MHC。
根据优选的实施方案，本发明中的抗体不包括保藏和表述在WO02/24909中的9.1抗体和2.1抗体。
根据一个优选的实施方案，“表观Kd”或“表观Kd值”用在本文时指通过诸如进行BIAcore_测定的表面等离子体共振(surfaceplasmon resonance)测定。在一个优选的实施方案中，本发明中BR3-结合抗体的表观Kd值通过进行表面等离子体激元共振测定，其中，将BR3 ECD固定在传感芯片上并使Fab形式的抗-BR3抗体流过固定了BR3 ECD的芯片，或者将IgG形式的抗-BR3抗体固定在传感芯片上并使BR3 ECD流过固定了IgG的传感芯片，例如，如本文实施例8所述。根据一个优选的实施方案，传感芯片固定有蛋白，使得在芯片上具有约10个反应单位(RU)的偶合蛋白。在另一个优选的实施方案中，本发明FcRn-结合抗体的表观Kd值通过进行表面等离子体激元共振测定，其中将FcRn多肽固定至传感芯片并使抗体流过该芯片，例如，如实施例16所描述的。
根据本发明，“功能性表位”指在能量上有助于抗体结合的抗原的氨基酸残基。抗原的在能量上起作用的残基的任何一种突变(例如，通过丙氨酸突变或同源突变的野生型BR3突变)会破坏抗体结合到抗原。在本发明的一个优选的实施方案中，可采用噬菌体展示BR3的丙氨酸突变体或其部分(例如，期望研究的区域是胞外区或残基17-42)，通过鸟枪丙氨酸扫描法测定包含在抗BR3抗体的功能性表位中的残基。根据一个优选的实施方案，可依照实施例9中描述的方法测定功能性表位。
术语“可变的”指可变结构域的某些片断在抗体氨基酸序列之间有很大不同。可变区介导抗原结合并限定了特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性并不是均匀地分布在可变结构域的110个氨基酸长度上。相反地，V结构域包含由被称作“高变区”的差异极大的短区域间隔的相对恒定的称为框架区(FR)的相对恒定部分，其中每个框架区具有15-30个氨基酸，每个高变区具有9-12氨基酸。每个天然重链和轻链的可变结构域包括四个FR，它主要采取β片层结构，并通过三个高变区连接，它们形成环状(loop)连接，在某些情况下形成部分β片层结构。每条链的高变区通过FR紧密结合在一起，与另一条链的高变区一起有助于形成抗体的抗原结合部位(见，Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫上关注的蛋白序列)，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体结合抗原，但显示了不同的效应作用，如抗体依赖的细胞毒性(ADCC)中的抗体参与。
术语“高变区”用在本文时指负责结合抗原的抗体的氨基酸残基。高变区通常包括“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，在VL中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)附近，在VH中的约31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)附近(Kabat et al.，Sequences ofProteins of Immunological Interest(免疫上关注的蛋白序列)，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))和/或来自“高变环(hypervariable loop)”的那些残基(例如，在VL中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，VH中的26-32(H1)、52A-55(H2)和96-101(H3)(Chothia and Lesk J.Mol Biol.196901-917(1987))。
高变区可包括如下“延伸的高变区”VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97(L3)以及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。可变结构域残基根据上述Kabat et al.对这些定义进行编号。
“框架”或“FR”残基指那些不同于本文所定义的高变区残基的可变结构域残基。例如，轻链框架1(LC-FR1)、框架2(LC-FR2)、框架3(LC-FR3)、框架4(LC-FR4)区分别包含抗体的编号为1-23、35-49、57-88和98-107(Kabat编号系统)的残基。在另一个实例中，重链框架1(HC-FR1)、重链框架2(HC-FR2)、重链框架3(HC-FR3)、重链框架4(HC-FR4)分别包含抗体的残基1-25、36-48、66-92和103-113(Kabat编号系统)。
根据一个实施方案，对应于来源于抗体9.1、2.1和11G9的抗体轻链CDR区的大多数残基的残基在图1-3中加了下划线。根据另一个实施方案，对应于来源于抗体V3的抗体重链和轻链CDR区的大多数残基的残基在图15中加了下划线。
本文提到的“共有序列”或共有V结构域序列指由比较已知的人免疫球蛋白可变区序列的氨基酸序列所得到的人工序列。基于这些比较，制备了如下重组核酸序列其编码与人和人H链亚群III V结构域序列共有的V结构域氨基酸。共有V序列不具有任何已知的抗体结合特异性或亲和性。
术语“单克隆抗体”用在本文时指一群大体同质抗体中的抗体，即，除了单克隆抗体生产过程中存在的可能的变体(这些变体通常以较小量存在)之外，构成该群的各个抗体相同和/或结合相同表位。这些单克隆抗体通常包括包含结合靶蛋白的多肽序列的抗体，其中靶结合多肽序列通过包括如下步骤的方法获得从多种多肽序列中选择单一的靶结合多肽序列。例如，选择方法可以是从诸如一群杂交瘤细胞克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的多种克隆中选择单克隆。应当理解，所选择的靶结合序列还可进一步改变，例如，为了改善对靶亲和力、为了人源化靶结合序列、改善其在细胞培养基中的生成、减少其在体内的免疫原性、产生多特异性抗体等，并且，改变了靶结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体制剂中的每个单克隆抗体直接针对抗原的单一决定簇，而多克隆抗体的制剂通常包括直接针对不同决定簇(表位)的不同的抗体。除了它们的特异性外，单克隆抗体的制备具有的优势为它们通常不被其它免疫球蛋白所污染。修饰语“单克隆的”指从大体相似的抗体群中获得的抗体的特性，而不应理解为通过特定的方法生产所需的抗体。例如，本发明所用的单克隆抗体可通过多种方法制备，包括杂交瘤方法(例如Kohler et al.，Nature，256495(1975)；Harlow et al.，AntibodiesALaboratory Manual(抗体实验室手册)，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2nd ed.1988)；Hammerling et al.，Monoclonal Antibodies andT-Cell Hybridomas(单克隆抗体和T细胞杂交瘤细胞)563-681，(Elsevier，N.Y.，1981)、重组DNA方法(见，例如第4,816,567号美国专利)、噬菌体展示技术(参见，例如Clackson et al.，Nature，352624-628(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)；Sidhu et al.，J.Mol.Biol.338(2)299-310(2004)；Lee et al.，J.Mol Biol.340(5)1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101(34)12467-12472(2004)；以及Lee et al.，J.Immunol.Methods 284(1-2)119-132(2004)和从具有编码人免疫球蛋白序列的部分或全部人免疫球蛋白位点或基因的动物中生产人或人样抗体(参见，例如WO 98/24893、WO/9634096、WO/9633735和WO/9110741，Jakobovitset al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551(1993)；Jakobovits et al.，Nature，362255-258(1993)；Bruggemann et al.，Year in Immuno.，733(1993)；美国专利5,545,806，5,569,825，5,591,669(都授予GenPharm)；5,545,807；WO 97/17852，美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，以及Marks et al.，Bio/Technology，10779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature，368856-859(1994)；Morrison，Nature 368812-813(1994)；Fishwild et al.，Nature Biotechnology，14845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology，14826(1996)；andLonberg and Huszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)。
本文中单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)以及这些抗体的片段，在“嵌合”抗体中部分重链和轻链与来源于特定物种的抗体或属于特定抗体类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，而部分剩余的链与来源于另一物种的抗体或属于另一抗体类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，只要它们显示了所需的生物活性(第4,816,567号美国专利；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984))。制备嵌合抗体的方法为本领域所公知。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其它抗原结合序列)，它们包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列。在一些实施方案中，人源化抗体为人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的互补决定区(CDR)中的残基被来自诸如小鼠、大鼠或兔子的非人物种(供体抗体)CDR的残基替代，这些残基具有期望特异性、亲和力和容量。在一些实例中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被对应的非人残基替代。而且，人源化抗体可包含既不在受体抗体中也不在供体CDR中或框架序列中存在的残基。通常为了进一步改善和最大化抗体性能做出这些修饰。通常，人源化抗体包含至少一个可变结构域的基本上所有部分，其中所有或基本上所有高变环来源于非人免疫球蛋白，所有或基本上所有FR区来源于人免疫球蛋白序列，尽管FR区可能包括一种或多种氨基酸置换，例如，以改善结合亲和力。在一些实施方案中，FR中的这些氨基酸置换的数目通常在H链中不大于6，在L链中不大于3。在一个优选的实施方案中，人源化抗体还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白或人共有恒定序列。进一步的细节见Joneset al.，Nature，321522-525(1986)；Reichmann et al.，Nature，332323-329(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol，2593-596(1992)。人源化抗体包括PRMATIZED_抗体，其中该抗体的结合抗原区来源于例如通过用感兴趣抗原免疫猕猴而产生的抗体。制备人源化抗体的方法为本领域所公知。
采用本领域公知的不同的方法，包括噬菌体展示文库，也可生产人抗体。Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks etal.，J.Mol.Biol.，222581(1991)。Cole等人和Boerner等人的方法也适合于制备人单克隆抗体。Cole et al.，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy(单克隆抗体和癌症治疗)，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner etal.，J.Immunol，147(1)86-95(1991)。又见Lonberg and Huszar，Int.Rev.Immunol.1365-93(1995)。PCT公开号WO 98/24893、WO 92/01047、WO 96/34096、WO 96/33735；第0598877号欧洲专利；第5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、5,885,793、5,916,771和5,939,598号美国专利。
“抗体片段”包括全长抗体的一部分，通常为其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片断；双抗体；线状抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“Fv”为包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这种片断包括一个重链和一个轻链可变结构域以紧密、非共价连接的二聚体。这两个结构域的折叠形成六个高变环(从H和L链各形成3个环)，这有助于氨基酸残基结合抗原以及使得对抗体有抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或仅包括特异于抗原的三个CDR的Fv的一半)就具有识别和结合抗原的能力，尽管与完整结合位点相比有较低的亲和力。
本发明BR3结合抗体的“功能性片段”为保留了与衍生该片断的全长链的分子大体相同的与BR3结合的亲和力，并且在选自如下的至少一种测定中具有活性的片段去除B细胞、抑制B细胞增殖或抑制BAFF结合到BR3(通过诸如本文描述的那些体外或体内测定法测定)。
抗体“效应功能”指归因于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性，随抗体的同种型不同。抗体效应功能的实例包括C1q结合和补体依赖的细胞毒性、Fc受体结合、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)的和B细胞活化。“天然序列Fc区”包含与自然界中发现的Fc区氨基酸序列相同的氨基酸序列。Fc序列的实例描述在SEQID NO133，135-141中，它包括天然序列人IgG1 Fc区(非A和A同种异型，分别为SEQ ID NO133和135)、天然序列人IgG2 Fc区(SEQ IDNO136)、天然序列人IgG3 Fc区(SEQ ID NO137)和天然序列人IgG4Fc区(SEQ ID NO138)以及其天然存在的变体。天然序列鼠Fc区的实例描述在SEQ ID NO139-142(分别为IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)中。
“变体Fc区”包含这样的氨基酸序列，其与天然序列Fc区的氨基酸序列的区别在于至少一个根据本文定义的“氨基酸修饰”。优选地，与天然序列Fc区或母体多肽的Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸置换，例如，在天然序列Fc区或母体多肽的Fc区有约1至10个氨基酸置换，优选约1至5个氨基酸置换。在一个实施方案中，本文中变体Fc区与天然序列Fc区(例如SEQ ID NO133)有至少约80％、85％、90％、95％或99％的同源性。根据另一个实施方案，本文中变体Fc区与母体多肽的Fc区有至少约80％、85％、90％、95％或99％的同源性。
就本文鉴定的多肽和抗体序列而言，“百分比(％)氨基酸序列一致性”或“同源性”定义为在把任何保守置换看作序列一致性的一部分时进行序列比对后，与所比较多肽的氨基酸残基相同的候选序列中的氨基酸残基的百分数。可通过本领域技术人员公知的不同的方法获得为确定百分比氨基酸序列一致性目的而进行的比对，例如，采用诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件的公众可获得的计算机软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的适合参数，包括获得所比较序列全长最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，采用序列比较计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列一致性的值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.创作，其源码与用户文件说明一起提交给美国版权局(U.S.Copyright Office，Washington D.C.，20559)，并以美国版权登记号TXU510087在美国版权局登记。公众可从Genentech，Inc.，South San Francisco，California获得ALIGN-2程序。ALIGN-2程序采用UNIX操作系统编译，优选数字的UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定而不加以改变。
术语“包含Fc区的多肽”指包含Fc区的诸如抗体或免疫附着因子(见下文定义)的多肽。Fc区的C端赖氨酸(根据EU编号系统残基447)可被除去，例如，在纯化多肽过程中或通过重组设计编码多肽的核酸。因此，包含具有本发明Fc区的多肽(包括抗体)的组合物可包括所有K447残基被除去的多肽群、没有除去K447残基的多肽群或具有和没有K447残基的多肽混合物的多肽群。
贯穿本说明书和权利要求，当提到可变结构域的残基时，通常采用Kabat编号系统(大概为轻链的残基1-107和重链的残基1-113)(例如Kabat et al.，Sequences of Immunological Interest.(免疫学关注的序列)5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。当提到免疫球蛋白重链恒定区的残基时，通常采用“EU编号系统”或“EU索引”(例如EU索引的报道见于Kabat et al.，Sequencesof Proteins of Immunological Interest(免疫上关注的蛋白的序列)，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)在此特别引入作为参考)。除非本文有其他说明，提及抗体可变结构域的残基编号指通过Kabat编号系统编号的残基。除非本文有其他说明，提及抗体恒定结构域的残基编号指通过EU编号系统编号的残基(例如，见第60/640,323号美国临时申请，EU编号图)。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合抗体Fc区的受体。在一个实施方案中，本发明中FcR为结合IgG抗体的受体(γ受体)，它包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类受体，包括这些受体的等位变体和选择拼接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相同的氨基酸序列，主要在其胞质结构域处不同。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(motif)(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域包含基于免疫受体酪氨酸础的抑制基序(ITIM)。(参见综述M.in Daёron，Annu.Rev.Immunol.15203-234(1997))。该术语包括同种异型，如FcγRIIIA同种异型FcγRIIIA-Phe158、FcγRIIIA-Val158、FcγRIIA-R131和/或FcγRIIA-H131。FcR的综述见于Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol9457-92(1991)；Capel et al.，Immunomethods 425-34(1994)；以及deHaas et al.，J.Lab.Clin.Med.126330-41(1995)。本文的术语“FcR”包括将来鉴定出的其它FcR。该术语还包括新生儿受体FcRn，它负责将母亲的IgG转移至胎儿(Guyer et al.，J.Immunol.117587(1976)以及Kim et al.，J.Immunol.24249(1994))。
术语“FcRn”指新生儿Fc受体(FcRn)。FcRn结构上类似于主要组织相容性复合物(MHC)，它由非共价结合到β2-微球蛋白上的α链构成。新生儿Fc受体FcRn的诸多功能的综述见于Ghetie and Ward(2000)Annu.Rev.Immunol.18，739-766。FcRn在将免疫球蛋白IgG从母亲被动输送给婴儿的过程中起作用，并调控血清IgG水平。FcRn可作为补救受体起作用，在细胞内和穿过细胞时它可结合和运输完整形式的摄入的IgG，从默认的降解通路中援救出IgG。
WO 00/42072(Presta)and Shields et al.J.Biol.Chem.9(2)6591-6604(2001)描述了与FcR具有增强或减弱结合的抗体变体。在此特别引入这些出版的内容作为参考。
人IgG Fc区的“CH1结构域”(也称作“H1”结构域的“C1”)通常从约氨基酸118延伸至215(EU编号系统)。
“铰链区”通常定义为人IgG1的从Glu216至Pro230的一段(Burton，Molec.Immunol.22161-206(1985))。可通过将形成重链间二硫键的第一和最后一个半胱氨酸残基置于相同位置，将与其它IgG同种型的铰链区与IgG1序列比对。
Fc区的“低铰链区(lower hinge region)”通常定义为紧接着铰链区C端的残基，即Fc区的残基233至239。在先前的报道中，结合FcR通常归因于IgG Fc区的低铰链区的氨基酸残基。
人IgG Fc区的“CH2结构域”(也称作“H2”结构域的“C2”)通常从约氨基酸231延伸至340。CH2结构域是独特的，因为它不与其它的结构域紧密配对。相反地，两条N连接的分枝的糖链介于完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。据推测，糖类可提供结构域之间配对的替代并帮助稳定CH2结构域。Burton，Molec.Immunol.22161-206(1985)。
“CH3结构域”(也称作“H3”结构域的“C2”)包括Fc区中从CH2结构域C端延伸的区段(即，从约氨基酸残基341至抗体序列的C末端，该末端通常在IgG的氨基酸残基446或447处)。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应功能”。示例性的“效应功能”包括C1q结合、补体依赖的细胞毒性、Fc受体结合、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体，BCR)的下调等。这些效应功能通常需要Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)的联合，并可采用如本文描述的各种分析法评估。
“C1q”为包括针对免疫球蛋白的Fc区的结合位点的多肽。C1q与两个丝氨酸蛋白酶C1r和C1s一起形成复合物C1，它为补体依赖的细胞毒性(CDC)途径的第一个组分。人C1q可从例如Quidel，San Diego，CA购得。
术语“结合结构域”指与另一个分子结合的多肽区域。对于FcR，结合结构域包括负责结合Fc区的多肽链部分(例如其α链)。一个有用的结合结构域为FcRα链的胞外区。
与母体多肽或包含天然序列Fc区的多肽相比，具有有“改变的”FcR结合亲和力或ADCC活性的变体IgG Fc的多肽为那些具有增加的或减少的FcR结合活性(例如FcγR或FcRn)和/或ADCC活性的多肽。
对FcR“显示增加的结合”的变体Fc以比母体多肽或天然序列IgGFc更高的亲和力(例如，较低的表观Kd或IC50值)结合至少一个FcR。根据一些实施方案，与母体多肽相比改进的结合为约3倍，优选5、10、25、50、60、100、150、200、高至500倍或约25％至1000％改进的结合。对FcR“显示减少的结合”的多肽变体以比母体多肽更低的亲和力(例如，较高的表观Kd或较高的IC50值)结合至少一个FcR。与母体多肽相比结合的减少可为约40％或更多。在一个实施方案中，对FcR显示减少的结合的Fc变体对FcR具有很少或没有明显结合，例如与天然序列IgG Fc区相比对有0-20％的结合，如本文实施例中所测定的。
“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指一种细胞毒性形式，其中分泌的Ig结合到存在于特定细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)的Fc受体(FcR)上使得这些细胞毒性效应细胞特异地结合到携带抗原的靶细胞上并随后以细胞毒素杀死靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞且对这种杀伤是绝对需要的。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，仅表达FcγRIII，然而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞中FcR的表达总结在Ravetch andKinet，Annu.Rev.Immunol9457-92(1991)的第464页表3中。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，如第5,500,362或5,821,337号美国专利和下文实施例中所描述的。这些分析中有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。作为选择，或补充，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如，在诸如Clynes et al.PAAS(USA)95652-656(1998)中公开的动物模型中进行。
当具有变体Fc区多肽的量和具有野生型Fc区多肽或母体多肽的量在测定中基本相同时，与具有野生型IgG Fc的多肽或母体多肽相比，包含变体Fc区的多肽在体外或体内可更有效调节ADCC，则包含变体Fc区的多肽“显示增加的ADCC”或在存在人效应细胞时可更有效调节抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。通常采用本文公开的体外ADCC测定法鉴定这些变体，但也关注测定ADCC活性的其它测定法或方法(例如，在动物模型中)等。在一个实施方案中，与野生型Fc(或母体多肽)相比，优选的变体为约5倍至100倍，例如，从约25至50倍可更有效调节ADCC。
“补体依赖的细胞毒性”或“CDC”指存在补体时溶解靶细胞。经典补体途径的活化作用从补体系统(C1q)的第一个组分结合到结合了其相关抗原的抗体(适合的亚类)上开始。为了评估补体活化作用，可进行CDC测定，例如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods202163(1996)中所描述的。
在第6,194,551B1号美国专利和WO 99/51642中描述了具有改变的Fc区氨基酸序列和增加的或减少的C1q结合能力的多肽变体。在此特别引入这些专利出版的内容作为参考。还参见Idusogie et al.J.Immunol.1644178-4184(2000)。
“人效应细胞”为表达一种或多种FcR并且执行效应功能的白细胞。根据一个实施方案，该细胞至少表达FcγRIII并且执行ADCC效应功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。可从自然来源中，例如从本文描述的血液或PBMCs中分离效应细胞。
测定结合到FeRn的方法是公知的(参见例如Ghetie 1997，Hinton2004)，并描述在下文的实施例中。可在体内分析对人FcRn的结合以及人FcRn高亲和性结合多肽的血清半衰期，例如在表达人FcRn的转基因老鼠或转染的人细胞系中，或在给予了Fc变体多肽的灵长类中进行。在一个实施方案中，具有变体IgG Fc的多肽，尤其是本发明的抗体，与具有野生型IgG Fc的多肽相比，对人FcRn显示了增加至少2倍、5倍、10倍、50倍、60倍、70倍、80倍、100倍、125倍、150倍的结合亲和力。在特定的实施方案中，对人FcRn的结合亲和力增加了约170倍。
对FcRn的结合亲和力，在一个实施方案中，所述多肽的EC50或表观Kd(在pH6.0)小于1μM，更优选小于或等于100nM，更优选小于或等于10nM。在一个实施方案中，对于对FcγRIII(F158，即低亲和力同种型)增加的结合亲和力，EC50或表观Kd小于或等于10nM，对FcγRIII(V158，高亲和力同种型)，EC50或表观Kd小于或等于3nM。根据另一个实施方案，如果在测试抗体和对照抗体结合曲线的中点处的吸收值的比率(例如A450nm(抗体)/A450nm(对照Ab))小于或等于40％，那么认为，相对于对照抗体(例如Herceptin_抗体)，抗体结合到Fc受体的减少相对于对照抗体是显著的。根据另一个实施方案，如果在测试抗体和对照抗体结合曲线的中点处的吸收值的比率(例如A450nm(抗体)/A450nm(对照Ab))大于或等于125％，那么认为，相对于对照抗体(例如Herceptin_抗体)，抗体结合到Fc受体的增加相对于对照抗体是显著的。参见，例如实施例16。
“母体多肽”或“母体抗体”为包含可从其产生变体多肽或抗体并且将该变体多肽或抗体与其进行比较的氨基酸序列的多肽或抗体。典型的母体多肽或母体抗体缺少本文公开的一种或多种Fc区修饰，且与本文公开的多肽变体相比在效应功能上不同。母体多肽可包含天然序列Fc区或具有预先存在的氨基酸序列修饰(如增加、删除和/或置换)的Fc区。
“融合蛋白”和“融合多肽”指具有共价连接到一起的两部分多肽序列的多肽。在大多数实施方案中，每个部分为通常并不天然互相结合的多肽序列和/或具有不同的特性。该特性可以是生物学特性，如体外或体内活性。该特性也可以是简单的化学或物理特性，如结合到靶分子、反应中的催化作用等。两部分可通过单一肽键直接连接或通过含有一个或多个氨基酸残基的肽连接物连接。通常，两部分彼此同框连接。
“分离的”抗体或多肽为从产生它的环境的组分中已经鉴定和分离和/或回收的抗体或多肽。污染组分可例如为干扰抗体诊断或治疗用途的物质，包括酶、激素和蛋白质的或非蛋白质的溶解物。在一个优选的实施方案中，抗体或多肽被纯化到(1)大于如Lowry方法测定的95％抗体重量比，最优选大于99％重量比，(2)采用旋杯式顺序分析仪足以获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)在还原或非还原条件下采用考马斯蓝染色，或优选银染的SDS-PAGE均一性。因为不存在抗体自然环境的至少一种组分，分离的抗体或多肽包括重组细胞内原位抗体或多肽。然而，通常分离的抗体或多肽通过至少一个纯化步骤制备。
“分离的”多肽编码核酸或其它多肽编码核酸为被鉴定并与至少一种污染核酸分子分离的核酸分子，该污染核酸分子通常在该多肽编码核酸的自然来源中与其结合。分离的多肽编码核酸分子形式上或结构上不同于自然界中存在的核酸分子。分离的多肽编码核酸分子因此不同于存在于天然细胞中的该特定多肽编码核酸分子。然而，分离的多肽编码核酸分子包括包含在通常表达所述多肽的细胞中的该多肽编码核酸分子，例如，该核酸分子与天然细胞的在染色体位置上不同。
术语“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所需的DNA序列。适合于原核生物的控制序列，例如，包括启动子、任选地操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞采用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
当核酸被置于与另一个核酸序列处于功能相关时，该核酸是“可操作地连接的”。例如，编码前序列或分泌性前导序列的DNA被认为是可操作地连接到编码多肽的DNA，仅当其表达为参与该多肽分泌的前蛋白；启动子或增强子可操作地连接到编码序列，仅当其可影响序列的转录；核糖体结合位点可操作地连接到编码序列，仅当其被置于在有助于翻译的位置。通常“可操作地连接的”指连接的DNA序列是连续的，在分泌性引导序列的情况下，阅读相是一致的。然而，增强子不必一定是连续的。通过在方便的限制性位点处连接实现该连接。如果不存在这样的位点，根据常规的操作采用合成的寡核苷酸接头或连接物。
“载体”包括穿梭载体和表达载体。通常，质粒构建体还包括复制起点(例如Co1E1复制起点)和选择标记(例如氨苄青霉素或四环素抗性)，其分别用于细菌中质粒的复制和选择。“表达载体”指包含在细菌或真核细胞中用于表达包括本发明抗体片段在内的抗体所必须的控制序列或调控元件的载体。下文公开了适合的载体。
生产本发明BR3结合抗体的细胞包括已将编码抗体的核酸引入其中的细菌和真核宿主细胞。下文公开了适合的宿主细胞。
本领域普通技术人员容易确定“严紧性”的杂交反应，通常，它是依据探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算。通常，较长的探针需要较高温度来正确退火，而较短的探针需要较低温度。当互补链在低于它们的融化温度的环境中存在时，杂交通常取决于变性DNA再退火的能力。探针和杂交序列之间期望的同源性越高，采用的相对温度就越高。结果，较高的相对温度趋向使得反应条件较严紧，而较低温度则较不严紧。对杂交反应严紧性的另外的详细资料和说明见于Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学现行规程)，Wiley Interscience Publishers，(1995)。
“严紧条件”或“高严紧条件”，如本文所定义的，通过如下进行确定(1)洗涤时采用低离子强度和高温，例如0.015 M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，在50C；(2)在杂交过程中采用诸如甲酰胺的变性剂，例如50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/具有750mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5，75mM柠檬酸钠，在42C；或(3)在42C、如下溶液中过夜杂交采用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50 mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt’s溶液、超声处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，在42C下在0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中洗涤十分钟，随后在55C下含有EDTA的0.1×SSC中高严紧性洗涤十分钟。
“中等严紧性条件”的鉴定描述见于Sambrook et al.，MolecularCloningA Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)，New YorkColdSpring Harbor Press，1989，它包括采用比上述较少严紧的洗涤溶液和杂交条件(例如，温度、离子强度和％SDS)。中等严紧性杂交的实例为37℃在如下溶液中过夜孵育包括20％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15 mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性的剪切的鲑鱼精DNA，随后在约37-50C下1×SSC中洗涤滤膜。技术人员知道如何调节温度、离子强度等以适应诸如探针长度等的调节因素。
术语“表位标记的”用在本文时指包含融合到“标记多肽”的多肽的嵌合多肽。标记多肽有足够的残基以提供可针对其而制备抗体的表位，而且，它足够短以致于不干扰与它融合的多肽的活性。标记多肽还优选是相当独特的，以致于该抗体基本不与其它表位交叉反应。适合的标记多肽通常具有至少6个氨基酸残基，通常在约8和50个氨基酸残基之间(优选在约10和20个氨基酸残基之间)。本发明关注表位标记的多肽和抗体。
就本发明抗-BR3多肽或抗体而言，“生物学上有活性的”和“生物学活性”和“生物学特征”指所述抗体或多肽结合BR3。根据一个优选的实施方案，所述抗体结合人BR3多肽。
在另一个实施方案中，本发明的抗BR3-多肽或抗体还具有下述活性的任何一种、任何组合或全部(1)以500nM或更小、100nM或更小、50nM或更小、10nM或更小、5nM或更小或1nM或更小的表观Kd值结合人BR3的胞外区序列；(2)以500nM或更小、100nM或更小、50nM或更小、10nM或更小、5nM或更小或1nM或更小的表观Kd值结合人BR3的胞外区序列和结合啮齿类BR3的胞外区序列；(3)抑制人BR3结合人BAFF。根据抗体所期望的用途，所述抗体还包括任何一种如下活性(1)与野生型或天然序列IgG Fc相比，在存在人效应细胞具有抗体依赖的细胞毒性(ADCC)；(2)与野生型或天然序列IgG Fc相比，在存在人效应细胞时具有增加的ADCC或(3)与野生型或天然序列IgG Fc相比，在存在人效应细胞时具有减少的ADCC。根据另一个实施方案，本发明的抗体以比具有野生型或天然序列IgG Fc的多肽或母体多肽更高的亲和力结合人Fc新生儿受体(FcRn)。
就本发明拮抗性抗-BR3多肽或抗体而言，“生物学上有活性的”和“生物学活性”和“生物学特征”指抗体或多肽具有下述活性的任何一种、任何组合或全部(1)抑制B细胞增殖；(2)抑制B细胞存活；(3)杀死或去除体内B细胞。根据一个实施方案，当与未用这种抗BR3抗体或多肽处理的基准水平或适合的阴性对照相比时，去除B细胞至少20％。根据另一个实施方案，与野生型或天然序列IgG Fc相比，在存在人效应细胞时拮抗性抗体具有抗体依赖的细胞毒性(ADCC)，或与野生型或天然序列IgG Fc相比，在存在人效应细胞时该拮抗性抗体具有增加的ADCC。
就本发明激动型抗-BR3多肽或抗体而言，“生物学上有活性的”和“生物学活性”和“生物学特征”指该抗体或多肽具有一种或两种如下活性(1)刺激B细胞增殖和(2)刺激B细胞存活。根据一个实施方案，与野生型或天然序列IgG Fc相比，在存在人效应细胞时该激动型抗体具有减弱的ADCC。
除非其他说明，本发明具体公开的氨基酸序列为连续的氨基酸序列。
例如，可采用用于保守和非保守突变的任何方法和指导，产生本文描述的本发明的多肽中变化。变化可以是置换、删除或插入一个或多个编码多肽的密码子，这导致了多肽氨基酸序列的改变。氨基酸置换可以是用具有相似结构和/或化学特性的一种氨基酸替代另一种氨基酸的结果，如用丝氨酸替代亮氨酸，即保守的氨基酸替代。插入或删除可任选地在约1至5个氨基酸范围内。通过在序列中系统地插入、删除或置换氨基酸并测定所得变体的活性来确定允许的变化，其中该活性为全长或成熟天然序列显示的活性。
术语“保守的”氨基酸置换用在本发明中时指氨基酸置换为功能上等同的氨基酸的置换。保守的氨基酸变化导致了所得肽的氨基酸结构或功能的最小改变。例如，一个或多个相似极性的氨基酸作为功能上的等同物，其导致肽的氨基酸序列内的沉默变化。通常，认为组内的置换是结构和功能保守的。然而，技术人员知道特定残基的作用是通过其所在的分子的三维结构内的环境而确定的。例如，Cys残基可能以氧化(二硫化物)形式存在，它比还原(硫醇)形式有更小的极性。Arg侧链的长脂肪族部分构成了其结构和功能作用的关键特征，通过非极性置换而不是其它碱性残基置换可最好地保留这一特性。而且，会认识到含有芳族基团的侧链(Trp、Tyr和Phe)可参与离子的-芳族的或“阳离子-π”相互作用。在这种情况下，一个酸性或不带电的极性基团置换一个这样的侧链可能是结构和功能保守的。诸如Pro、Gly和Cys(二硫化物形式)的残基对主链构象有直接影响，其置换常引起结构变形。
保守的置换包括下述基于侧链相似性的特定置换，以下列出的示例性置换和优选的置换。根据氨基酸侧链特性的相似性可将其分类(在A.L. Lehninger，in Biochemistry(生物化学)，second ed.，pp.73-75，Worth Publishers，New York(1975)) (1)非极性Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M) (2)不带电的极性Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q) (3)酸性Asp(D)、Glu(E) (4)碱性Lys(K)、Arg(R)、His(H) 作为选择，基于共同的侧链特性可将天然存在的残基分成如下几组 (1)疏水的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2)中性亲水的Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3)酸性的Asp、Glu； (4)碱性的His、Lys、Arg； (5)影响主链定向的残基Gly、Pro； (6)芳族的Trp、Tyr、Phe。
表1 非保守的置换需要把一个这些类型中的成员换成另一种类型。还将这些置换的残基引入保守的置换位点，或更优选地，引入其余(非保守的)位点。
本发明范围内的术语“氨基酸”具有最广泛的意义，包括天然存在的Lα-氨基酸或残基。本文采用通用的一个和三个字母缩写代表天然存在的氨基酸(Lehninger，A.L.，Biochemistry(生物化学)，2d ed.，pp.71-92，(1975)Worth Publishers，New York)。该术语包括D-氨基酸和诸如氨基酸类似物的化学修饰的氨基酸，和通常不被整合进蛋白质的诸如正亮氨酸的天然存在的氨基酸，以及具有本领域公知的氨基酸特性的化学合成的化合物。例如，氨基酸定义包括苯丙氨酸或脯氨酸类似物或模拟物，它与天然Phe或Pro对肽化合物具有相同的构象约束。这些类似物或模拟物在本文称作氨基酸的“功能等同物”。Roberts andVellaccio(The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology，)(肽分析、合成、生物学)Eds.Gross and Meiehofer，Vol.5 p 341，Academic Press，Inc，N.Y.1983(在此引入作为参考)列出了氨基酸的其它例子。
由本文描述的标准固相合成技术合成的肽，例如，但不限于由基因编码的氨基酸，用于涉及氨基酸的置换。通常碰到的非遗传密码编码的氨基酸包括，例如，描述在第WO 90/01940号国际申请中的氨基酸，以及例如2-氨基己二酸(Aad)置换Glu和Asp；2-氨基庚二酸(Apm)对Glu和Asp；2-氨基丁酸(Abu)置换Met、Leu和其它脂肪族氨基酸；2-氨基庚酸(Ahe)置换Met、Leu和其它脂肪族氨基酸；2-氨基异丁酸(Aib)置换Gly；环己基丙氨酸(Cha)置换Val和Leu和Ile；高精氨酸(Har)置换Arg和Lys；2，3-双氨基丙酸(Dpr)置换Lys、Arg和His；N-乙基甘氨酸(EtGly)置换Gly、Pro和Ala；N-乙基谷胺酰氨(EtAsn)置换Asn和Gln；羟基赖氨酸(Hyl)置换Lys；别羟赖氨酸(AHyl)置换Lys；3-(和4)羟基脯氨酸(3Hyp，4Hyp)置换Pro、Ser和Thr；别异亮氨酸(AIIe)置换Ile、Leu和Val；-脒基苯丙氨酸置换Ala；N-甲基甘氨酸(MeGly，肌氨酸)置换Gly、Pro和Ala；N-甲基异亮氨酸(MeIle)置换Ile；正缬氨酸(Nva)置换Met和其它脂肪族氨基酸；正亮氨酸(Nle)置换Met和其它脂肪族氨基酸；鸟氨酸(Orn或Or)置换Lys、Arg和His；瓜氨酸(Cit)和甲硫氨酸亚砜(MSO)置换Thr、Asn和Gln；-甲基苯丙氨酸(MePhe)、三甲基苯丙氨酸、卤代(F、Cl、Br和I)苯丙氨酸、三氟苯丙氨酸置换Phe。
可采用本领域公知的方法产生这些变化，如寡核苷酸介导的(定点)突变、丙氨酸扫描和PCR突变。在克隆的DNA中进行定点突变[Carteret al.，Nucl.Acids Res.，134331(1986)；Zoller et aL，Nucl.Acids Res.，106487(1987)]、盒式突变[Wells et al.，Gene，34315(1985)]、限制性选择突变[Wells et al.，Philos.Trans.R.Soc.London SerA，317415(1986)]或其它公知的技术可产生变体DNA。
还可采用扫描氨基酸分析法沿着连续序列鉴定一个或多个氨基酸。优选的扫描氨基酸为相对小的、中性的氨基酸。这些氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。在这些组中丙氨酸是优选的扫描氨基酸，因为它除去了β-碳原子之外的侧链且很少可能改变变体的主链构象[Cunningham and Wells，Science，2441081-1085(1989)]。丙氨酸通常是优选的还因为它是最常见的氨基酸。而且，经常在隐藏的和暴露的位置发现丙氨酸[Creighton，The Proteins(蛋白质)，(W.H.Freeman & Co.，N.Y)；Chothia，J.Mol.Biol，1501(1976)]。如果丙氨酸置换不产生足够量的变体，那么可采用isoteric氨基酸。
术语“检测”旨在包括测定有或没有分子或定性或定量测定分子的量。因此该术语指采用本发明中的原料、组合物和方法进行定性和定量的测定。通常，用于检测的具体技术对本发明的实施不是关键的。
例如，本发明的“检测”包括例如采用本领域公知的方法检测分子是否存在、表达所述多肽的细胞数、结合到靶的分子的水平或量或结合到分子的靶的水平或量的变化；分子的生物学功能/活性(例如结合配体或受体的活性)、胞内信号转导(如NF-kB活化作用)、肿瘤细胞增殖、B细胞增殖或存活等)的变化。在一些实施方案中，“检测”包括检测分子的野生型水平(例如mRNA或多肽水平)。检测可包括与对照相比时定量在10％和90％之间的任何值、或在30％和60％之间的任何值、或超过100％的任何值的变化(增加或减少)。检测包括在2倍至10倍之间的任何值的变化，包括或多于例如100倍。因此，提及BR3分子可指其mRNA或蛋白质等。
本文用到的“BR3分子”指与如下大体相同的分子BR3多肽、编码BR3多肽的核酸分子、以及该多肽或核酸分子的异构体、片段、类似物或变体。例如，BR3分子包括来源于哺乳动物的BR3多肽的异构体、片段、类似物或变体，其中，BR3分子具有结合BAFF的能力。
“BAFF分子”用在本文时指与如下大体相同的分子BAFF多肽、编码BAFF多肽的核酸分子、以及该多肽或核酸分子的异构体、片段、类似物或变体。例如，BAFF分子包括来源于哺乳动物的BAFF多肽的异构体、片段、类似物或变体，其中，BAFF分子具有结合BR3的能力。
如本文用到的，待治疗的个体为哺乳动物(例如，人、非人灵长类动物、大鼠、小鼠、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫等)。该个体可以是临床患者、临床试验的志愿者、试验动物等。个体可能被怀疑患有癌症或免疫疾病或具有癌症或免疫疾病的风险，可能被诊断为癌症或免疫疾病，或可能为确定不是癌症的对照个体。很多癌症和免疫疾病的诊断方法以及癌症或免疫诊断的临床描述在本领域是公知的。根据一个优选的实施方案，根据本发明待治疗的个体为人。
“治疗”或“减轻”指措施，其中对象待阻止或减小(减轻)目标病理状况或病症或减轻一些病症的症状。需要治疗的个体包括那些已有疾病的个体和那些倾向于有疾病的个体或那些需预防疾病的个体。如果接受本发明治疗量的多肽或抗体后，患者表现出如下一种或多种的可观察到的和/或可测量的减少或不存在，那么个体或哺乳动物的癌症被成功“治疗”癌细胞数量减少或不存在癌细胞、肿瘤大小的减少、对癌细胞渗入周边器官包括癌症扩散到软组织和骨骼的抑制(即，某种程度上减慢，优选停止)、肿瘤转移的抑制(即，某种程度上减慢，优选停止)、某种程度上肿瘤生长的抑制、和/或某种程度上减轻与特定肿瘤相关的一种或多种症状、减少的发病率和死亡率以及生活方面质量的改善。就本发明的多肽可阻止生长和/或杀死存在的癌细胞来说，它可能是抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。患者也可感觉到这些迹象或症状的减少。
术语“治疗有效量”指足以“减轻”或“治疗”个体疾病或病症的本发明多肽的量。对于癌症，治疗有效量的药物可减少癌细胞数、减少肿瘤大小、抑制(即，某种程度上减慢，优选停止)癌细胞渗入周边器官、抑制(即，某种程度上减慢，优选停止)肿瘤转移、某种程度上抑制肿瘤生长、和/或某种程度上减轻与癌症相关的一种或多种症状。就该药可阻止生长和/或杀死存在的癌细胞来说，它可能是抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。
“慢性的”给药指以与急性方式相反的连续方式给药，以致于在一段时间内维持初始的治疗效果(活性)。“间歇的”治疗不是连续的进行而没有中断，而是在性质上是周期性的。
“载体”用在本文时包括药物可接受的载体、赋形剂、或稳定剂，它们在采用的剂量和浓度时对接触的细胞或哺乳动物是无毒的。药物可接受的载体常是含水的pH缓冲液。药物可接受的载体的实例包括诸如磷酸、柠檬酸和其他有机酸的缓冲液、包括抗坏血酸在内的抗氧化剂；低分子量(小于约10个残基)的多肽；诸如血清白蛋白、白明胶或免疫球蛋白的蛋白质；诸如聚乙烯吡咯烷酮的亲水聚合物；诸如甘氨酸、谷胺酰氨、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸的氨基酸；单糖、二糖、和包括葡萄糖、甘露糖或糊精在内的其它碳水化合物；诸如EDTA的螯合剂；诸如甘露醇或山梨醇的糖醇；诸如钠的成盐平衡离子；和/或诸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM的非离子表面活性剂。
如本文所用到的，术语“免疫粘附因子”指抗体样分子，其将异种蛋白(“粘附素(adhesion)”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定结构域的效应功能结合在一起。结构上，免疫粘附因子包括将具有不同于抗原识别和抗体结合位点的期望的结合特性的氨基酸序列(即，“异种的”)与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。免疫粘附因子的粘附素部分通常是至少包含受体或配体结合位点的连续的氨基酸序列。可从诸如IgG-1、IgG-2、IgG-3、或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM的任何免疫球蛋白中获得免疫粘附因子的免疫球蛋白恒定结构域序列。例如，根据本发明有用的免疫粘附因子可以是包含多肽的BAFF结合部分或多肽的BR3结合部分的多肽(例如，融合到Fc区的去除了跨膜或胞质序列的BAFF受体的一部分、TACI受体胞外区-Fc或BCMA胞外区-Fc或BR3胞外区-Fc)。在一个实施方案中，本发明的多肽序列被融合到免疫球蛋白序列的恒定结构域。
“免疫缺陷疾病”是其中免疫应答减弱的疾病或疾病状态(例如X连锁的重症联合免疫缺陷(SCID)、常染色体连锁SCID、腺苷脱氨酶缺乏症(ADA缺乏症)、X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)、布鲁顿氏病、先天性无丙种球蛋白血症、婴儿X连锁无丙种球蛋白血症、获得性无丙种球蛋白血症、成年发病的无丙种球蛋白血症、迟发性无丙种球蛋白血症、异常丙种球蛋白血症、低丙种球蛋白血症、婴儿期暂时性低丙种球蛋白血症、非特异低丙种球蛋白血症、无丙种球蛋白血症、常见可变型免疫缺陷(CVID)(获得性)、维-奥综合征(WAS)、伴高IgM的X连锁免疫缺陷、伴高IgM的非X连锁免疫缺陷、选择性IgA缺乏症、IgG亚类缺乏症(伴有或不伴有IgA缺乏)、伴有正常或高免疫球蛋白的抗体缺乏症、伴有胸腺瘤的免疫缺陷、免疫球蛋白重链缺失、κ链缺乏、B细胞淋巴细胞增生性疾病(BLPD)、选择性IgM免疫缺陷、隐性无丙种球蛋白血症(瑞士型)、网状组织发育不全、新生儿中性粒细胞减少症、重症先天性白细胞减少、胸腺淋巴组织发育不全-发育不全或伴有免疫缺陷的发育不全、共济失调-毛细血管扩张症毛细血管扩张症(小脑性共济失调、眼与皮肤的毛细血管扩张症和免疫缺陷)、短肢侏儒症、X连锁淋巴细胞增生性综合征(XLP)、尼兹诺夫综合征-合并免疫球蛋白的免疫缺陷、嘌呤核苷酸磷酸化酶缺乏症(PNP)、II型MHC缺乏症(裸淋巴细胞综合征)和重症联合免疫缺陷病)、或者与免疫缺陷相关的疾病状态、Janus相关激酶3(JAK3)缺乏症、迪乔治综合征(单一性T细胞缺乏症)和相关综合征例如唐氏综合征、慢性皮肤粘膜念珠菌病、高IgE综合征、慢性肉芽肿病、部分白化病和WHIM综合征(疣、低丙种球蛋白血症、感染和骨髓粒细胞无效增生[白细胞在增生性髓中驻留])。
本文中“自身免疫疾病”是由个体自身组织产生且抗个体自身组织或其共分离或表现的疾病或障碍或其造成的疾病状态。自身免疫疾病或障碍的例子包括但不限于关节炎(例如急性关节炎的类风湿性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、慢性炎性关节炎、变性关节炎、感染性关节炎、莱姆关节炎、增生性关节炎、银屑病关节炎、椎骨关节炎、幼年发病的类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性进行性关节炎、变形性关节炎、原发性慢性多关节炎、反应性关节炎和强直性脊椎炎)；炎性过度增生性皮肤疾病，银屑病，例如斑块状银屑病、滴状银屑病、脓疱性银屑病和甲银屑病，皮炎，包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、变应性皮炎、变应性接触性皮炎、疱疹样皮炎和特应性皮炎；X连锁高IgM综合征；荨麻疹，例如慢性变应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹，包括慢性自身免疫性荨麻疹；多发性肌炎/皮肌炎；幼年皮肌炎；中毒性表皮坏死松解症；硬皮病(包括全身性硬皮病)；硬化，例如全身性硬化、多发性硬化(MS)，例如spino-optical MS、原发性进展性MS(PPMS)和复发-缓解型MS(RRMS)，进展性全身性硬化、动脉粥样硬化、颈动脉粥样硬化，多发性硬化和共济失调的硬化；炎性肠病(IBD)(例如克隆病，自身免疫介导的胃肠疾病，结肠炎，例如溃疡性结肠炎、溃疡性结肠炎、显微镜性结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎和肠壁全层结肠炎(transmural colitis)和自身免疫炎性肠疾病)；坏疽性脓皮病，结节性红斑；原发性硬化性胆管炎；巩膜炎)；呼吸窘迫综合征，包括成年或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)；脑膜炎；全部或部分葡萄膜的炎症；虹膜炎；脉络膜炎；自身免疫性血液系统疾病；类风湿性脊椎炎；突发性耳聋；IgE-介导的疾病，例如变态反应以及变应性和特应性鼻炎；脑炎，例如Rasmussen′s脑炎和边缘性和/或脑干脑炎；葡萄膜炎，例如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫葡萄膜炎；伴有或不伴有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)，例如慢性或急性肾小球肾炎例如原发性GN、免疫介导性GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜性-或膜增生性GN(MPGN)，包括I型和II型和急进性GN；变应性疾病状态、变应性反应；湿疹，包括变应性或特应性湿疹；哮喘，例如支气管哮喘哮喘、支气管哮喘和自身免疫性哮喘；涉及T细胞渗入的疾病状态和慢性炎性反应、慢性肺部炎性疾病；自身免疫性心肌炎；白血球粘着缺乏症；系统性红斑狼疮(SLE)或系统性红斑狼疮(lupus erythematodes)，例如皮肤型SLE、亚急性皮肤型红斑狼疮、新生儿期狼疮综合征(NLE)、播散性红斑狼疮；狼疮(包括肾炎、大脑炎、儿科的、非肾脏的、肾外的、盘状的、脱发)；幼年发病的(I型)糖尿病，包括儿科胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)，成年发病的糖尿病(II型糖尿病)，自身免疫糖尿，特发性尿崩症，与通过细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫应答；结核；结节病；肉芽肿病，包括淋巴瘤样肉芽肿病、韦格纳肉芽肿病；粒细胞缺乏症；血管炎，包括脉管炎，包括大血管脉管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安)动脉炎)、中血管脉管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎)、显微镜性多动脉炎、CNS脉管炎、坏死性、皮肤的或超敏性脉管炎、系统性坏死性脉管炎、和ANCA-相关脉管炎，例如Churg-Strauss脉管炎或综合征(CSS))、颞动脉炎；再生障碍性贫血、自身免疫性障碍性贫血、Coombs试验阳性贫血、戴-布贫血、溶血性贫血或免疫溶血性贫血，包括自身免疫性溶血性贫血(AJHA)、恶性贫血(anemia perniciosa)、艾迪生病、纯红细胞贫血或发育不全(PRCA)、第八因子缺乏症、血友病A、自身免疫性中性白细胞减少症、各类血细胞减少症、白细胞减少症、涉及白细胞血球渗出的疾病、CNS炎性疾病；多器官损伤综合征，例如由败血病、外伤或出血继发的那些；抗原-抗体复合体介导的疾病、抗肾小球基底膜病、抗磷脂抗体综合征、过敏性神经炎、Bechet′s或贝赫切特病、Castleman′s综合征、古德帕斯丘综合征、Reynaud′s综合征、舍格伦综合征、斯-约综合征、类天疱疮，例如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮，天疱疮(包括寻常性天疱疮、落叶性天疱疮、天疱疮粘膜类天疱疮和红斑性天疱疮)，自身免疫性多内分泌腺疾病、赖特尔病或综合征、免疫复合体型肾炎、抗体介导的肾炎；视神经脊髓炎；多神经病；慢性神经病，例如IgM多神经病或IgM介导的神经病；血小板减少(例如心肌梗死患者中发展的)，包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和自身免疫或免疫介导的血小板减少，例如特发性血小板减少性紫癜(ITP)，包括慢性或急性ITP；睾丸和卵巢的自身免疫性疾病，包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎；原发性甲状腺功能减退症，甲状腺功能减退症，自身免疫性内分泌疾病，包括甲状腺炎，例如自身免疫性甲状腺炎，桥本病，慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎，自身免疫性甲状腺疾病，特发性甲状腺功能减退症，Grave′s病；多腺体综合征，例如自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌病综合征)，副癌综合征，包括神经病学副癌综合征，例如兰-伊肌无力综合征或伊-兰综合征、僵人综合征；脑脊髓炎，例如变应性脑脊髓炎或过敏脑脊髓炎和实验性变应性脑脊髓炎(EAE)；重症肌无力，例如胸腺瘤相关的重症肌无力、小脑变性、神经性肌强直、眼阵挛或眼阵挛-肌阵挛综合征(OMS)、和感觉神经病变、多灶性运动神经病、希恩综合征；自身免疫性肝炎、慢性肝炎、狼疮样肝炎、巨细胞肝炎、慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎；淋巴细胞间质性肺炎、闭塞性毛细支气管炎(非移植)vs NSP、吉-巴综合征、Berger′s病(IgA肾病)、特发性IgA肾病、线状IgA皮病、原发性胆汁性肝硬化、肺硬化、自身免疫性肠病综合征、Celiac病、Coeliac病、乳糜泻(麸质性肠病)、难治性口炎性腹泻、特发性口炎性腹泻、冷球蛋白血症、肌萎缩侧索硬化症(ALS；路-盖里格氏病)、冠状动脉疾病；自身免疫耳病，例如自身免疫内耳病(AIED)、自身免疫性耳聋、斜视眼阵挛-肌阵挛综合征(OMS)；多软骨炎，例如难治性或复发性多软骨炎；肺泡蛋白沉积症；淀粉样变性；巩膜炎；非癌性淋巴细胞增多症、原发性淋巴细胞增多症、其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多症(例如，良性单克隆γ球蛋白病和意义未明单克隆γ球蛋白病，MGUS)；周围神经病；副癌综合征；离子通道病，例如癫痫、偏头痛、心律失常、肌肉疾病、聋、瞎、周期性麻痹和CNS的离子通道病；孤独症；炎性肌病；局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)；内分泌腺眼病，葡萄膜视网膜炎，脉络膜视网膜炎，自身免疫肝脏学病，纤维肌痛，多发性内分泌衰竭，施密特综合征，性肾上腺炎，胃萎缩，早老性痴呆；脱髓鞘性疾病，例如自身免疫脱髓鞘性疾病，糖尿病肾病，心肌梗死后综合征，斑秃，CREST综合征(钙质沉着、雷诺氏现象、食管运动障碍、指(趾)硬化和毛细血管扩张)，雄性和雌性自身免疫不育，混合性结缔组织病，Chagas′病，风湿热，习惯性流产，农民肺，多形红斑，心脏切开后综合征，库欣综合征，养鸟者肺，变应性肉芽肿性血管炎，良性淋巴细胞性血管炎，奥尔波特综合征；肺泡炎，例如过敏性肺泡炎和纤维性肺泡炎；间质性肺病，输血反应，麻风，疟疾，利什曼病，kypanosomiasis，血吸虫病，蛔虫病，曲霉病，Sampter’s综合征，卡普兰综合征，登革热，心内膜炎，心肌心内膜纤维化，弥散性间质性肺纤维化，间质性肺纤维化，特发性肺纤维化，囊性纤维化，眼内炎，持久性隆起性红斑，胎儿幼红细胞增多病，嗜酸性筋膜炎，舒尔曼综合征，费尔蒂综合征，丝虫病，睫状体炎，例如慢性睫状体炎，异色性睫状体炎，虹膜睫状体炎，或Fuch’s睫状体炎，过敏性紫癜，人免疫缺陷病毒(HIV)感染，埃可病毒感染，心肌病，阿耳茨海默病，微小病毒感染，风疹病毒感染，接种后综合征，先天性风疹感染，EB病毒感染，流行性腮腺炎，埃文斯综合征，自身免疫性生殖腺衰竭，西德纳姆舞蹈病，链球菌感染后肾小球肾炎，血栓闭塞性脉管炎，甲状腺毒症，脊髓痨，脉络膜炎，巨细胞多肌痛，内分泌眼病，慢性过敏性肺，干燥性结角膜炎，流行性角结膜炎，特发性肾病综合征，微小病变性肾病，良性家族性和缺血性-再灌注损伤，视网膜自身免疫，关节炎，支气管炎，慢性阻塞性气道疾病，矽肺，口疮，口疮性口炎，动脉硬化疾病，无精子生成，自身免疫性溶血，伯克病，冷球蛋白血症，迪皮特朗挛缩，endophthalmia phacoanaphylactica，过敏性肠炎，麻风性结节性红斑，特发性面瘫，慢性疲劳综合征，风湿病病态，Hamman-Rich′s病，感音神经性聋，haemoglobinuria paroxysmatica，性腺功能减退症，局部回肠炎，白血球减少症，传染性单核细胞增多症，横断性脊髓炎，原发性特发性粘液性水肿，肾病，交感性眼炎，肉芽肿性睾丸炎，胰腺炎，急性多脊神经根炎，坏疽性脓皮病，奎尔万甲状腺炎，获得性脾萎缩，由于抗精子抗体导致的不育，非-恶性胸腺瘤，白癫风，SCID和EB病毒相关疾病，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，寄生虫病，例如利什曼病，中毒性休克综合征，食物中毒，涉及T细胞渗入的疾病状态，白血球粘着缺乏症，与通过细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫应答，涉及白细胞血球渗出的疾病，多器官损伤综合征，抗原-抗体复合体介导的疾病，抗肾小球基底膜病，变应性神经炎，自身免疫多内分泌病，卵巢炎，原发性粘液性水肿，自身免疫萎缩性胃炎，交感性眼炎，风湿性疾病，混合性结缔组织病，肾病综合征，胰岛炎，多内分泌衰竭，周围神经病，自身免疫性多腺体综合征I型，成年发病的特发性甲状旁腺功能减退症(AOIH)，全秃，扩张型心肌病，获得性大疱性表皮松解症(EBA)，色素沉着病，心肌炎，肾病综合征，原发性硬化性胆管炎，化脓性或非化脓性鼻窦炎，急性或慢性鼻窦炎，筛窦炎，额窦炎，上额窦炎或蝶窦炎；嗜酸粒细胞相关疾病，例如嗜酸粒细胞增多，嗜酸粒细胞增多性肺浸润，嗜酸粒细胞增多-肌痛综合征，勒夫勒综合征，慢性嗜酸粒细胞肺炎，热带肺嗜酸粒细胞增多症，曲霉菌支气管肺炎，肺曲菌球病或含有嗜酸粒细胞的肉芽肿；变态反应，血清阴性脊柱关节炎，多种内分泌腺的自身免疫病，硬化性胆管炎，巩膜，巩膜外层，慢性皮肤黏膜念珠菌病，布鲁顿综合征，婴儿期暂时性低丙种球蛋白血症，维-奥综合征，共济失调性毛细血管扩张症，与胶原疾病相关的自身免疫病，风湿病，神经科疾病，缺血性再灌注障碍，血压反应降低，血管功能不良，血管扩张，组织损伤，心血管缺血，痛觉过敏，脑缺血和伴有血管形成的疾病，变应性过敏性疾病，血管球性肾炎(glomerulonephritide)，再灌注损伤，心肌或其它组织的再灌注损伤，伴有急性炎性成分的皮肤病，急性化脓性脑膜炎或其它中枢神经系统炎性疾病，眼和眶的炎性疾病，粒细胞输血相关综合征，细胞因子诱导的毒性，急性严重炎症，慢性难治性炎症，肾盂炎，肺硬化，糖尿病性视网膜病，糖尿病性大动脉疾病，动脉内膜增生，胃溃疡，心瓣炎和子宫内膜异位。
用在本文中，“B细胞去除”指与治疗前的B细胞水平相比，在药物或抗体治疗后动物或人的B细胞水平降低。可使用公知试验来测量B细胞水平，例如在实验实施例中描述的那些。B细胞清除可以是完全的或部分的。在一实施方案中，除去至少25％的表达BR3的B细胞。不被任一机理所限制，B细胞清除的可能机理包括ADCC、CDC、凋亡、钙流出调节或前述的两个或多个机理的组合。
本文中“B细胞表面标志物”或“B细胞表面抗原”是表达在B细胞的表面的抗原。
“B细胞去除剂”指减少外周B细胞至少25％的试剂。在另一实施方案中，外周B细胞的去除为至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一优选实施方案中，B细胞去除剂特异结合白血细胞而非其它细胞类型。其它实施方案中，B细胞去除剂特异结合B细胞而非其它细胞类型。在一实施方案中，B细胞去除剂是抗体。在一优选实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。其它实施方案中，所述抗体是与化疗剂或细胞毒性剂偶联的抗体。B细胞清除剂的特定例子包括但不限于前述的抗CD20抗体。
B细胞瘤包括何杰金氏病，包括淋巴细胞为主型何杰金氏病(LPHD)；非何杰金氏淋巴瘤(NHL)；滤泡中心细胞(FCC)淋巴瘤；急性淋巴细胞白血病(ALL)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；毛细胞白血病和BR3-阳性瘤。非何杰金氏淋巴瘤包括低度恶性/滤泡何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中度恶性/滤泡NHL、中度恶性弥散性NHL、高度恶性免疫母细胞NHL，、高度恶性淋巴母细胞NHL、高度恶性小无裂细胞NHL、巨瘤症NHL、类质浆细胞淋巴细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤和原发性巨球蛋白血症。还试图对这些癌症的复发进行治疗。LPHD是尽管经过放疗和化疗治疗依然倾向于经常复发的何杰金氏病类型，并且可以被BR3阳性恶性细胞所表征。CLL是白血病的四种主要类型之一。被称为淋巴细胞的成熟B细胞的癌症，CLL表现为细胞在血液、骨髓和淋巴组织中的进行性积蓄。慢性淋巴瘤是缓慢生长的、可治愈的疾病，其中患者在好转和复发的多个周期后平均存活6至10年。
如本文中所用，术语“非何杰金氏淋巴瘤”或“NHL”指除何杰金氏淋巴瘤外的淋巴系统癌症。通常可以通过Reed-Sternberg细胞在何杰金氏淋巴瘤中存在和在非何杰金氏淋巴瘤中缺失来区分何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤。被本文中所用术语包括的非何杰金氏淋巴瘤的例子包括可以被本领域技术人员(例如，肿瘤学家或病理学家)根据本领域已知的分类方案鉴别的任何例子，所述分类方案例如在Color Atlas of Clinical HematologY，Third Edition(临床血液学的彩色图集，第三版)；A.Victor Hoffbrand和John E.Pettit(eds.)(HarcourtPublishers Limited 2000)中描述的修定的欧洲-美国淋巴瘤(REAL)方案(特别参见图11.57、11.58和/或11.59)。更加具体的例子包括但不限于复发性或难治性NHL、一线低度恶性NHL、III/IV期NHL、耐化疗NHL、前体B急性淋巴细胞白血病和/或淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病和/或幼淋巴细胞白血病和/或小淋巴细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、免疫细胞瘤和/或淋巴浆细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、结外边缘区-MALT淋巴瘤、结内边缘区淋巴瘤、毛细胞白血病、浆细胞瘤和/或浆细胞骨髓瘤、低度恶性/滤泡淋巴瘤、中度恶性/滤泡NHL、套细胞淋巴瘤、滤泡中心型淋巴瘤(滤泡的)、中度恶弥散性NHL、弥散性大B细胞淋巴瘤、侵袭性NHL(包括侵袭性一线NHL和侵袭性复发性NHL)、自体干细胞移植后复发性或难治性NHL、原发性纵隔的大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、高度恶性免疫母细胞NHL、高度恶性原始淋巴细胞NHL、高度恶性小无裂细胞NHL、bulky disease NHL巨瘤症NHL、伯基特淋巴瘤、前体(外周)T细胞急性淋巴细胞白血病和/或淋巴瘤、成体T细胞淋巴瘤和/或白血病、T细胞慢性淋巴细胞白血病和/或幼淋巴细胞白血病、大颗粒淋巴细胞白血病、蕈样肉芽肿和/或赛泽里综合征、结外自然杀伤细胞/T细胞(鼻型)淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾型T细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、皮肤(皮)淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤、肠道T细胞淋巴瘤、外周T细胞(非特指型)淋巴瘤和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤。
术语“癌症”和“癌症的”指或描述哺乳动物的生理状态，其通常被不受调节的细胞生长所表征。癌症的离子包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这些癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜的癌症、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝脏肿瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)和各种类型的头颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低度恶性/滤泡非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中度恶性/滤泡NHL、中度恶性弥散性NHL、高度恶性免疫母细胞NHL、高度恶性原始淋巴细胞NHL、高度恶性小无裂细胞NHL、bulky disease NHL；套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、和原发性巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、毛细胞白血病、慢性原始粒细胞白血病、多发性骨髓瘤和移植后淋巴增生性疾病(PTLD)。依照一优选实施方案，所述癌症包括在其表面表达BR3多肽的肿瘤(BR3-阳性)。依照另一实施方案，所述表达BR3的癌症是CLL癌症。
在特定实施方案中，本发明的抗BR3抗体和多肽被用于治疗选自下列的任何一种或多种疾病非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、淋巴细胞为主型何杰金氏病(LPHD)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡淋巴瘤，它们为非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的类型，类风湿性关节炎和幼年风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)包括狼疮性肾炎、Wegener′s病、炎性肠疾病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少、多发性硬化、银屑病、IgA肾病、IgM多神经病、重症肌无力、脉管炎、糖尿病、Reynaud’s综合征、Sjorgen’s综合征、血管球性肾炎和多发性骨髓瘤。
本文中所用术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞功能和/或造成细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、Bi213、P32，以及Lu的放射性同位素)、化疗剂和毒素，例如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体。根据一实施方案，所述细胞毒性剂能够被内化。根据另一实施方案，细胞毒性剂的活性部分为1100kD或更小。根据一实施方案，化疗剂选自甲氨蝶呤、盐酸阿霉素、长春碱类(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、左旋溶肉瘤素、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其它插入试剂、酶及其片段，例如核溶解酶、抗生素和毒素，例如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，例如单甲基auristatin(MMAE)，包括其片段和/或变体，以及下文公开的多种抗肿瘤或抗癌剂或生长抑制剂。下文描述其它细胞毒性剂。
“化疗剂”是在治疗癌症中有用的化合物。化疗剂的例子包括烷基化剂，例如硫替派和CYTOXAN_环磷酰胺；烷基磺酸酯，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如卡波醌、meturedopa和uredopa；氮丙啶和methylamelamine类，包括六甲蜜胺、三亚胺嗪、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和trimethylolomelamine；己酸配质(acetogenin)(特别是布拉他辛和bullatacinone)；喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻环肽类(cryptophycin)(特别是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀；苯并二毗咯类抗生素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；硝脲，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫斯汀、尼莫斯汀和雷莫斯汀；抗生素，例如烯二炔抗生素类(例如刺孢霉素，特别是刺孢霉素γ1I和刺孢霉素ω1I(参见，例如Agnew，Chem Intl.Ed.Engl.，33183-186(1994))；蒽环类抗生素，包括蒽环类抗生素A；二膦酸盐，例如clodronate氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团和相关的色蛋白enediyne烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素、放线菌素、authramycin、重氮丝氨酸、争光霉素、线菌素C、carabicin、洋红霉素、嗜癌酶素/chromomycinis、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN_阿霉素(包括吗啉代阿霉素、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉并-阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素例如丝裂霉素C、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他汀、佐柔比星；抗代谢物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，例如卡普睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酪；以及肾上腺素，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充物，例如frolinic acid；醋葡醛内酯；醛磷酰胺苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；defofamine；秋水仙胺；地 醌；elfornithine；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；lentinan磨茹多糖；氯尼达明；美登素类化合物(maytansinoids)，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；mopidanmol；nitraerine；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基肼；甲基苄肼；PSK_多糖复合体(JHS NaturalProducts，Eugene，OR)；雷佐生；力索新；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素(特别是T-2毒素、verracurin A、露湿漆斑霉素A和anguidine)；乌拉坦(urethane)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；硫替派；紫杉醇，例如TAXOL_太平洋紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ.)，ABRAXANETM太平洋紫杉醇的不含聚氧乙烯蓖麻油白蛋白工程化纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)，和TAXOTERE_多烯紫杉醇(Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；chloranbucil；GEMZAR_吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；NAVELBINE_长春瑞滨；能灭瘤；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄醛衍生物，例如视黄酸；卡培他滨；以及任何上述物质的药物可接受盐、酸或衍生物。
本定义还包括起调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，例如抗雌激素剂和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(包括NOLVADEX_他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟泰米芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮、以及FARETON托瑞米芬；抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，它可调节肾上腺中雌激素的产生，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、MEGASE_醋酸甲地孕酮、AROMASIN_依西美坦、formestanie、法倔唑、RIVISOR_伏氯唑、FEMARA_来曲唑、以及ARIMIDEX_阿那曲唑；以及抗雄激素类，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林、以及戈舍瑞林；以及曲沙他滨(1，3-二氧戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制与异常细胞增殖密切相关的信号转导途径中的基因(例如PKC-α、Ralf和H-Ras)的表达的反义寡核苷酸；核酶，例如VEGF表达抑制剂(如ANGIOZYME_核酶)和HER2表达抑制剂；诸如基因治疗性疫苗的疫苗，例如ALLOVECTIN_疫苗、LEUVECTIN_疫苗、以及VAXID_疫苗；PROLEUKIN_rIL-2；LURTOTECAN_拓扑异构酶1抑制剂；ABARELIX_rmRH；以及上述任何物质的药用盐、酸或衍生物。
本文所使用的“生长抑制剂”指抑制细胞在体外或体内生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是一种显著减少S期细胞百分率的药剂。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期前进的药剂(在除S期外的位置)，例如诱导GI阻滞和M期阻滞的药剂。标准的M期阻断剂包括长春碱类(长春新碱和长春碱)、TAXOL_紫杉醇、以及诸如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷、以及博来霉素等拓扑II抑制剂。这些阻滞GI的药剂还蔓延到S期阻滞，例如，DNA烷基化剂，如他莫昔芬、泼尼松、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、以及阿糖胞苷。其它资料可在The Molecular Basis of Cancer(癌症的分子基础)，Mendelsohn & Israel，eds.，第一章，题为“Cell cycleregulation，oncogenes，and antieioplastic drugs(细胞周期调节、癌基因、以及antieioplastic药物)”Murakaini等人(W B SaundersPhiladelphia，1995)，特别是p.13中找到。
“诱导细胞死亡”的抗体是一种使存活细胞变成不存活细胞的抗体。所述细胞通常为表达可与抗体结合的抗原的细胞，特别是该细胞过量表达所述抗原。优选地，该细胞为癌细胞，例如乳腺、卵巢、胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、甲状腺、胰脏或膀胱细胞。在体外，细胞可以是SKBR3、BT474、Calu3、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SKOV3细胞。可在缺少补体和免疫效应细胞的情况下对体外细胞死亡进行测定，以辨别是由抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)还是由补体依赖细胞毒性(CDC)所引起的细胞死亡。因此，可使用热灭活血清(例如对缺少补体的情况)和在缺少免疫效应细胞的情况下对细胞死亡进行分析。为了确定抗体是否能够诱导细胞死亡，与未处理细胞相比，可以通过摄取碘化丙啶(PI)、锥虫蓝(参见Moore等人，Cytotechnology，171-11(1995))或7AAD对膜完整性的丧失进行分析评估。
“诱导细胞凋亡”的抗体是诱导程序性细胞死亡的抗体，该程序性细胞死亡可通过结合膜联蛋白V(annexin V)、DNA断裂、细胞皱缩、内质网膨胀、细胞片段化、和/或膜囊形成(称为凋落小体)来测定。所述细胞是表达可与抗体结合的抗原的细胞，并且该细胞可以是一种过量表达所述抗原的细胞。细胞可以是肿瘤细胞，例如乳腺、卵巢、胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、甲状腺、胰脏或膀胱细胞。在体外，细胞可以是SKBR3、BT474、Calu3、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SKOV3细胞。可使用不同的方法评估与细胞凋亡相关的细胞事件。例如，通过膜联蛋白结合测定磷脂酰丝氨酸(PS)易位；如通过本文实施例中所公开的梯型DNA可评估DNA断裂；以及通过任何亚二倍体细胞的增加评估伴随DNA断裂产生的核/染色质浓缩。在膜联蛋白结合分析中，使用表达可与诱导细胞凋亡的抗体相结合的抗原的细胞。优选地，与未处理的细胞相比，该抗体是一种可使诱导膜联蛋白结合提高约2至50倍，优选地提高约5至50倍，以及更优选地提高约10至50倍的抗体。
诱导细胞凋亡的抗体实例包括抗-DR5抗体3F1 1.39.7(ATCCHB-12456)；3H3.14.5(ATCC HB-12534)；3D5.1.10(ATCC HB-12536)；以及3H3.14.5(ATCC HB-12534)，包括其人源化和/或高亲和性变异体；人抗-DR5受体抗体16E2和20E6，包括其高亲和性变异体(WO 98/51793，本文特将其引入作为参考)；抗-DR4抗体4E7.24.3(ATCCHB-12454)；4H6.17.8(ATCC HB-12455)；1H5.25.9(ATCC HB-12695)；4G7.18.8(ATCC PTA-99)；以及5GI1.17.1(ATCC HB-12694)，包括其人源化和/或高亲和性变异体。
可运用例如在Harlow和Lane，Antibody，A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)，eds.(New YorkCold Spring Harbor Laboratory，1998)中所描述的常规交叉封闭测定法，筛选结合与目的抗体结合的抗原上的表位的抗体。
“偶联物”指任何杂交分子，包括融合蛋白和同时含有氨基酸或蛋白部分和非蛋白部分的分子(例如毒素-抗体偶联物、或聚乙二醇化抗体偶联物)。通过本领域已知的许多种技术可合成或设计偶联物，例如重组DNA技术、固相合成、液相合成、有机化学合成技术或这些技术的组合。合成方法的选择将取决于待产生的具体分子。例如，通过重组技术和液相技术的组合可合成实际上不全部为“蛋白质”的杂交分子。
根据一个实施方案，偶联物是与如美国专利5,739,277中所描述的补救受体结合表位(特别是抗体片段)以共价键连接的抗体或目的多肽。例如，编码补救受体结合表位的核酸分子可与编码本发明多肽序列的核酸同框(in frame)连接，以使设计的核酸分子表达的融合蛋白包括补救受体结合表位和本发明的多肽序列。本文所使用的术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4)的Fc区的表位，其可用于增加IgG分子的体内血清半衰期(例如，Ghetie，V等人，(2000)Ann.Rev.Immunol.18739-766，表1)。
在另一个实施方案中，通过(特别是抗体片断)与血清白蛋白或结合FcRn受体或血清白蛋白结合肽的部分血清白蛋白的连接，或与非蛋白质聚合物(例如聚乙二醇部分)的连接，可形成偶联物。例如，在WO 01/45746中公开了这种多肽序列。在一个优选的实施方案中，待附着的血清白蛋白肽包含DICLPRWGCLW氨基酸序列。在另一个实施方案中，通过这些方法可增加如本发明Fab的半衰期。对于血清白蛋白结合肽序列，还参见Dennis，M.S.等人，(2002)JBC 277(38)35035-35043。
本文所使用的词语“标记物”指可直接或间接与抗体偶联的可检测化合物或组分。该标记可以是自身可检测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶标记的情况下，其可催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化。
A.本发明的组合物与方法 本发明提供结合人BR3以及任选地也结合其它灵长类动物BR3的抗体。根据一实施方案，H链具有非人类抗人BR3抗体(供体抗体)的至少一个、两个或全部H链CDR，以及作为受体抗体的人共有抗体(consensus antibody)的基本上全部框架残基。供体抗体能够来自多种非人物种，包括小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、兔、马、灵长类动物，但是通常是鼠类抗体。关于“基本上全部”是指人源化抗体中受体FR区域可以包括原始不存在于人共有FR序列中的一个或多个氨基酸置换。这些FR变化可以包括在受体或供体抗体中未被发现的残基。
在一实施方案中，供体抗体是鼠类9.1抗体、包括SEQ ID NO19和SEQ ID NO20中显示的每一VH和VL链的CDR和FR序列在内的V区域。在一实施方案中，人Fab框架的残基对应于或来源于人Vκ亚群I和VH亚群III的共有序列。根据一实施方案，本发明的人源化BR3抗体在H链中具有至少一个鼠类供体抗体的CDR。在一实施方案中，与人BR3结合的人源化BR3抗体包含供体抗体H链的重链CDR。
在全长抗体中，本发明的人源化BR3结合抗体包含与人免疫球蛋白C链连接的V结构域，例如SEQ ID NO132。在优选实施方案中，H链C区域来自人IgG，例如IgG1或IgG3。根据一实施方案，L链C结构域来自人κ链。根据另一实施方案，全长BR3结合抗体的Fc序列是SEQ ID NO134，其中X选自N、A、Y、F和H。
BR3结合抗体将至少结合人BR3。根据一实施方案，BR3结合抗体将结合其它灵长类动物的BR3，例如包括短尾猴、恒河猴和猩猩在内的猴类的BR3。根据另一实施方案，BR3结合抗体或多肽结合啮齿动物的BR3蛋白和人BR3蛋白。在另一实施方案中，BR3多肽结合小鼠BR3多肽序列和人BR3多肽序列。
根据一实施方案，拮抗性BR3结合抗体的生物活性是下列活性的任意一种、其任意组合或其全部(1)以500nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低的表观Kd值与人BR3胞外域序列结合；(2)以500nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低的表观Kd值与人BR3胞外域序列结合以及与小鼠BR3胞外域序列结合；(3)具有人BR3上的功能性表位，包括残基F25、V33和A34，其中单克隆抗体；(4)抑制人BAFF和人BR3结合；(5)在人效应细胞存在时具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或在人效应细胞存在时具有增强的ADCC；(6)结合人Fc新生受体(FcRn)，其亲和力高于具有野生型或天然序列IgG Fc的多肽或母体多肽；(9)体外或体内杀死或去除B细胞，当与基线水平或不使用抗体治疗的合适的阴性对照相比时，优选体外或体内杀死或去除至少20％的B细胞；(10)抑制B细胞体外或体内增殖以及(11)抑制B细胞体外或体内存活。根据本发明的多肽或抗体的一实施方案，功能性表位还包含残基R30。根据本发明的另一实施方案，所述功能性表位还包含残基L28和V29。
在一实施方案中，与使用不结合B细胞表面抗原的对照抗体的处理相比，或者与治疗前的基线相比，与mIgG2A的Fc区域融合的本发明抗体的可变结构域能够去除小鼠下列任一细胞群、细胞群的任意组合或全部细胞群中至少20％的B细胞(1)血液中的B细胞；(2)淋巴结中的B细胞；(3)脾脏中的卵泡B细胞以及(4)脾脏中的边缘区B细胞。在另一实施方案中，B细胞去除是25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。在一优选实施方案中，在使用抗体处理15天后测量所述去除。在另一优选实施方案中，如本文实施例18或19所述，进行所述去除测定。在另一优选实施方案中，通过治疗15天后小鼠的外周B细胞群测量所述去除。
根据另一实施方案，本发明的激动型BR3结合抗体的生物活性是选自下列活性的任意一种、其任意组合或其全部(1)以500nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低的表观Kd值与人BR3胞外域序列结合；(2)具有人BR3上的功能性表位，包括残基F25、V33和A34，其中该单克隆抗体不是9.1抗体也不是2.1抗体；(3)刺激B细胞体外增殖或存活；(4)抑制人BAFF和人BR3结合；(5)刺激B细胞体内增殖或存活；(6)结合人Fc新生受体(FcRn)，其亲和力高于具有野生型或天然序列IgG Fc的多肽或母体多肽。
B细胞去除的期望水平将取决于疾病。对于BR3阳性癌症的治疗，可以期望将B细胞去除最大化，所述B细胞是本发明的抗BR3抗体和多肽的靶。因此，对于BR3阳性B细胞瘤的治疗，期望B细胞的去除足以至少预防疾病的进展，本领域医师能够例如通过监测肿瘤的生长(大小)、癌细胞类型的增殖、转移、特定癌症的其它体征和症状评价所述疾病。根据一优选实施方案，B细胞去除足以阻止疾病的进展至少2个月，更优选3个月，甚至更优选3个月，更优选5个月，甚至更优选6个月或更长。在甚至更优选实施方案中，B细胞清除足以延长好转时间至少6个月，更优选9个月，更优选1年，更优选2年，更优选3年，甚至更优选5年或更长。在最有选实施方案中，B细胞去除足以治愈该疾病。在优选实施方案中，癌症患者中B细胞去除至少是治疗前基线水平的约75％，并且更优选80％、85％、90％、95％、99％、甚至是100％。
对于自身免疫性疾病的治疗，能够希望根据个体患者的疾病和/或疾病状态的严重程度，通过调节BR3结合抗体或多肽来调节B细胞的程度。因此，B细胞去除能够但不必须完全。可以期望在最初治疗中而不是随后的治疗中完成总B细胞去除，可以调整剂量以达到仅部分去除。在一实施方案中，B细胞去除是至少20％，即与治疗前基线水平相比，80％或更少的BR3阳性B细胞仍然存在。在其它实施方案中，B细胞去除是25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更高。根据一优选实施方案，B细胞去除足以中断疾病的进展，更优选减缓治疗中特定疾病的体征和症状，甚至更优选治愈所述疾病。
本发明还提供双特异性BR3结合抗体，其中抗体的一个臂具有本发明BR3结合抗体的人源化H和L链，并且另一臂具有针对另一抗原的V区域结合特异性。在具体实施方案中，第二抗原选自CD3、CD64、CD32A、CD16、NKG2D或其它NK活化配体。
不涉及维持抗BR3抗体适当构象的任何半胱氨酸残基还可以被置换，通常是被丝氨酸置换，以改善分子的氧化稳定性并避免异常交联。相反地，可以向抗体加入半胱氨酸键以改善其稳定性(尤其是当抗体是抗体片段时，例如Fv片段)。
尤其优选类型的置换变体涉及置换母体抗体(例如人源化的或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，为了进一步开发而选择的所得变体具有与产生其的母体抗体相关的改善的生物学性质。产生这样的置换变体的传统方法涉及噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，突变若干高变区位点(例如6-7个位点)以在每一位点产生全部的可能氨基酸置换。由此产生的抗体变体以单价形式由丝状噬菌体颗粒展示，所述抗体变体与包裹在每一颗粒中的M13基因III产物融合。然后如本文所述筛选噬菌体展示变体的生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴别用于修饰的候选高变区，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴别显著促进抗原结合的高变区残基。作为选择或补充，分析抗原-抗体复合体的晶体结构来鉴别抗体和人BR3之间的接触点是有利的。这样的接触残基和临近残基是根据本文所述技术进行置换的候选物。一旦产生了这样的变体，那么如本文所述筛选一组变体，并且可以选择在一个或多个相关测定中具有优良性质的抗体以进行进一步开发。
抗体的另一类型的氨基酸变体改变抗体的原始糖基化形式。通过改变这意味着删除抗体中存在的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加抗体中不存在的一个或多个碳水化合物部分。
抗体的糖基化通常是N连接的或O连接的。N连接的指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链相连。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是碳水化合物部分与天冬酰胺的酶催化连接的识别序列，其中X是除了脯氨酸以外的任意氨基酸。因此，存在于多肽中的这些三肽序列的任意一种形成潜在糖基化位点。O连接的糖基化指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟氨基酸相连，最常见的羟氨基酸是丝氨酸或苏氨酸，虽然也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
向抗体加入糖基化位点通常是通过改变氨基酸序列从而包含一个或多个上述的三肽序列(来实现的对于N连接的糖基化位点)。还可以通过向原始抗体序列中加入或置换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基进行所述改变(对于O连接的糖基化位点)。
通过本领域已知的多种方法制备编码抗-BR3抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于，从天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)或通过寡核苷酸介导的(或定点的)诱变、PCR诱变以及较早制备的变体或抗BR3抗体的非变体形式的盒式诱变来制备。
可能希望出于效应作用而修饰本发明的抗体，以便例如加强抗原依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和/或抗体的补体依赖细胞毒性(CDC)。这可以通过在抗体的Fc区域引入一个或多个氨基酸置换来实现。作为选择或补充，可以在Fc区域引入半胱氨酸残基，从而在该区域中形成链间二硫键。由此产生的同型二聚抗体具有改善的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。参见Caron et al，J.Exp Med.1761191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.1482918-2922(1992)。还可以使用如Wolff et al.Cancer Research 532560-2565(1993)所述的异双功能交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同型二聚抗体。或者，能够工程化抗体，其具有双Fc区域并且可以借此具有增强的补体介导的溶解和ADCC能力。参见Stevenson et al.Anti-Cancer Drug Design 3219-230(1989)。
为了增强抗体的血清半衰期，例如如美国专利第5,739,277号所述可以向抗体中并入补救受体结合表位(尤其是抗体片段)。如本文所用，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区域的表位，其负责增加IgG分子的体内血清半衰期。
其它抗体修饰 本文考虑了抗体的其它修饰。例如，可以将抗体与多种非蛋白质的聚合物相连，所述聚合物例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化乙烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。还可以将抗体包埋在制备的微囊中，例如通过在胶体药物输送系统中(例如脂质体、白蛋白微球、微乳状液、毫微型颗粒和毫微型胶囊)或粗乳状液中凝聚技术或通过界面聚合法(例如分别使用羟甲基纤维素或明胶微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊)。Remington’s Pharmaceutical Sciences，16th edition，Oslo，A.，Ed.，(1980)公开了这样的技术。
筛选具有期望特性的抗体 如实验实施例所述可以选择具有某些生物学性质的抗体。例如，能够在ELISA测定中通过与BR3结合，更优选地与在细胞表面表达的BR3结合(例如BJAB细胞系)来选择与BR3结合的抗体。例如参见 实施例5。
能够例如使用内源性表达BR3的细胞或使用BR3基因转染后表达BR3的细胞，通过实施例或本领域已知的方法来评价本发明的抗BR3抗体的生长抑制作用。例如，在一优选实施方案中，表达BR3的原代B细胞能够被用于增殖和存活测定(例如实施例7)。在另一实施方案中，可以使用不同浓度的本发明的抗BR3单克隆抗体来处理肿瘤细胞系和BR3转染的细胞若干天(例如2-7天)并使用结晶紫或MTT染色或通过某些其它的比色测定来进行分析。测量增殖的另一方法可以通过对比在存在或不存在本发明的抗BR3抗体下被处理细胞对3H-胸腺嘧啶核苷的摄入。抗体处理后，收集细胞并在闪烁计数器中定量测定并入DNA中放射性强度的量。合适的阳性对照包括使用已知抑制细胞系生长的生长抑制抗体来处理所选的细胞系。
为了选择诱导细胞死亡的抗体，可与对照相比来评价例如通过碘化丙锭(PI)、锥虫蓝或7AAD的吸收表明的膜完整新丧失。能够在不存在补体和免疫效应细胞下进行PI吸收测定。单独使用培养基或使用含有例如约10μg/ml合适单克隆抗体的培养基孵育表达BR3的肿瘤细胞。将细胞孵育3天。每一处理后，洗涤细胞并分装到35mm带有滤网帽的12×75试管中(每试管1ml，每处理组3个试管)以便除去细胞块。然后向试管中加入PI(10μg/ml)。可以使用FACSCANTM流式细胞测定器和FACSCONVERTTM CellQuest软件(Becton Dickinson)分析样品。可以选择诱导统计学上显著水平的细胞死亡的那些抗体作为诱导细胞死亡的抗体，所述细胞死亡是由PI吸收确定的。
为了筛选BR3上与结合感兴趣抗体的表位结合的抗体，可进行诸如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，EdHarlow and David Lane(1988)中所述的常规交叉封闭测定。该测定能够被用于确定测试抗体是否与本发明的抗BR3抗体结合相同的位点或表位。作为选择或补充，能够通过本领域已知的方法进行表位作图。例如，能够例如通过丙氨酸筛选诱变抗体序列，以便鉴别接触残基。最初突变抗体与多克隆抗体一起测试结合，以便确保适当的折叠。在不同的方法中，与BR3不同区域对应的肽能够被用于使用测试抗体或使用测试抗体和具有特征性或已知表位的抗体的竞争测定。
特定抗BR-3抗体的例子 本发明的抗体特别包括包含表2(下表)中公开的任一抗体可变重链序列的抗体，以及尚未被杂种细胞产生的它们的BR3结合片段。本发明的抗体特别包括包含可变重链序列的抗体，所述可变重链序列包含SEQ ID NO4-13、15-18、22、24、26-73、75-76、78、80-85、87-96、98、100、102、104、106-107、109-110、112、114、116、118、120、122、124、126和127中的任意一个，以及它们的BR3结合片段。依照其它实施方案，本发明的抗体包含表2中公开的任一抗体的可变重链和可变轻链区，以及它们的BR3结合片段。依照一实施方案，所述抗体还包含含有SEQ ID NO134的序列的Fc区，其中X是选自N、A、W、Y、F和H的氨基酸。依照另一实施方案，所述抗体包含SEQID NO76或SEQ ID NO131的序列，其中X是选自N、A、W、Y、F和H的氨基酸。
表2抗体序列的例子 本发明的抗体包括具有H3序列的BR3-结合抗体以及这些抗体的BR3结合片段，所述H3序列与SEQ ID NO4-13、15-18、22、24、26-73、75-76、78、80-85、87-96、98、100、102、104、106-107、109-110、112、114、116、118、120、122、124、126和127中任一序列的H3序列有至少约70％的氨基酸序列一致性，或者至少约71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列一致性。
本发明的抗体包括具有H1、H2和H3序列的BR3结合抗体，所述H1、H2和H3序列与附图中描述的任一抗体序列的下划线部分或者与序列表中描述的高变区CDR有至少约70％的一致性，或者至少约71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列一致性。
本发明的抗体包括具有L1、L2和L3序列的BR3结合抗体，所述L1、L2和L3序列与附图中描述的任一抗体序列的下划线部分或者与序列表中描述的高变区的CDR有至少约70％的一致性，或者至少约71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列一致性。
本发明的抗体包括具有VH结构域的BR3结合抗体，所述VH结构域与表2中任一抗体的VH结构域有至少约70％的同源性，或者至少约71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列一致性。
本发明的抗体包括包含表2抗体序列的重链CDR3序列的任何尚未被杂种细胞产生的BR3结合抗体。本发明的抗体包括包含重链CDR3序列或包含H3序列的任何BR3结合抗体，所述重链CDR3序列是SEQ ID NO7-13、15-18、36、38-73、78、82-85、87-96、98、100、102、104、106-107、109-110、112、114、116、118、120、122、124、126和127中任意一个的重链CDR3序列，所述H3序列源自SEQID NO7-13、15-18、36、38-73、78、82-85、87-96、98、100、102、104、106-107、109-110、112、114、116、118、120、122、124、126和127中任意一个的H3序列。在另一实施方案中，本发明的抗体包括包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的任何BR3结合抗体或者源自包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的抗体，所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3是选自SEQ ID NO7-13、15-18、36、38-73、78、82-85、87-96、98、100、102、104、106-107、109-110、112、114、116、118、120、122、124、126和127中任意一个序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。本发明的抗体包括包含表2抗体的重链H1、H2和H3序列的任何尚未被杂种细胞产生的BR3结合抗体。
本发明的抗体包括包含由Hu9.1-RF-H-IgG核酸序列编码的多肽序列的抗体和抗BR3结合抗体，其中Hu9.1-RF-H-IgG核酸序列于2004年11月17日以保藏号PTA-6315被保藏到ATCC，所述抗-BR3结合抗体包含与Hu9.1-RF-H-IgG多肽序列的任一可变区序列有至少约70％一致性，或者至少约71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列一致性的氨基酸序列。本发明的抗体包括包含由Hu9.1-RF-L-IgG核酸序列编码的多肽序列的抗体和抗BR3结合抗体，其中Hu9.1-RF-L-IgG核酸序列于2004年11月17日以保藏号PTA-6316被保藏到ATCC，所述抗BR3结合抗体包含与Hu9.1-RF-L-IgG多肽序列的可变区序列有至少约70％同一性，或者至少约71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
本发明的抗体包括包含由Hu2.1-46.DANA-H-IgG核酸序列编码的多肽序列的抗体和抗BR3结合抗体，其中Hu2.1-46.DANA-H-IgG核酸序列于2004年11月17日以保藏号PTA-6313被保藏到ATCC，所述抗BR3结合抗体包含与Hu2.1-46.DANA-H-IgG多肽序列的可变区序列有至少约70％一致性，或者至少约71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列一致性的氨基酸序列。本发明的序列包括包含由Hu2.1-46.DANA-L-IgG核酸序列编码的多肽序列的抗体和抗BR3结合抗体，Hu2.1-46.DANA-L-IgG核酸序列于2004年11月17日以保藏号PTA-6314被保藏到ATCC，所述抗BR3结合抗体包含与Hu2.1-46.DANA-L-IgG多肽序列的可变区序列有至少约70％一致性，或者至少约71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
本发明的抗体包括包含由HuV3-46s-H-IgG核酸序列编码的多肽序列的抗体和抗BR3结合抗体，其中HuV3-46s-H-IgG核酸序列于2004年11月17日以保藏号PTA-6317被保藏到ATCC，所述抗BR3结合抗体包含与HuV3-46s-H-IgG多肽序列的可变区序列有至少约70％一致性，或者至少约71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列一致性的氨基酸序列。本发明的序列包括包含由HuV3-46s-L-IgG核酸序列编码的多肽序列的抗体和抗BR3结合抗体，HuV3-46s-L-IgG核酸序列于2004年11月17日以保藏号PTA-6318被保藏到ATCC，所述抗BR3结合抗体包含与HuV3-46s-L-IgG多肽序列的可变区序列有至少约70％一致性，或者至少约71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
本发明的抗体包括Hu9.1-RF-IgG抗体，其包含ATCC保藏号为PTA-6315的重链序列和ATCC保藏号为PTA-6316的轻链序列。本发明的抗体包括Hu2.1-46.DANA-IgG抗体，其包含ATCC保藏号为PTA-6313的重链序列和ATCC保藏号为PTA-6314的轻链序列。本发明的抗体包括HuV3-46s-IgG抗体，其包含ATCC保藏号为PTA-6317的重链序列和ATCC保藏号为PTA-6318的轻链序列。
根据一优选实施方案，本发明的抗体特异结合天然人BR3多肽的序列。根据另一实施方案，本发明的抗体与称为9.1-RF Ig的抗体相比，在pH6.0时与FcRn受体有增强的结合。根据另一实施方案，本发明的抗体与称为9.1-RF Ig的抗体相比，在人效应细胞存在下，具有增强的ADCC功能。根据另一实施方案，本发明的抗体与称为9.1-RF Ig的抗体相比，在人效应细胞存在下，具有减弱的ADCC功能。
应当理解，本发明的所有抗体包括缺失信号序列的抗体和缺失Fc区的K447残基的抗体。
载体、宿主细胞和重组方法 本发明还提供编码BR3结合抗体或BR3结合多肽的分离核酸、包含该核酸的载体和宿主细胞、以及用于生产所述抗体的重组技术。
为了生产BR3结合抗体和多肽，分离其编码核酸并且插入到可复制载体中用于进一步克隆(DNA复制)或表达。使用常规方法(例如，通过使用能够特异结合编码所述抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离编码单克隆抗体或多肽的DNA并测序。可以使用许多载体。载体组分通常包括但不限于下列中的一个或多个信号序列、复制起点、一个或多个标志物基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
(i)信号序列组分 不仅可以直接重组生产本发明的抗体或多肽，本发明的抗体或多肽还可以与异源多肽一起作为融合多肽生产，所述异源多肽优选信号序列或在所述成熟蛋白或多肽的N-末端具有特异切割位点的其它多肽。所选的异源信号序列优选被宿主细胞识别并加工(例如，被信号肽酶切割)。对于不识别和加工天然BR3结合抗体信号序列的原核宿主细胞，该信号序列被例如选自下列的原核信号序列代替碱性磷酸酶、青霉素酶、1pp或热稳定肠毒素II前导序列。对于酵母分泌，该天然信号序列可以被例如下列所代替酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括酿酒酵母(Saccharomyces)和克鲁维酵母(Kluyveromyces)α因子前导序列)、或酸性磷酸酶前导序列、白色念珠菌(C.albicans)葡萄糖淀粉酶前导序列或WO 90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达中，可获得哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。
将用于所述前导区的DNA与编码BR3结合抗体的DNA同框连接。
(ii)复制起点 表达载体和克隆载体均含有使得该载体能够在一种或多种所选宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，此序列是使得载体能够独立于宿主染色体DNA而复制的序列，并且包括复制起点或自主复制序列。公知多种细菌、酵母和病毒的这样的序列。质粒pBR322的复制起点适合大多数革兰氏阳性菌，2μ质粒起点适合酵母，并且多种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)适用于哺乳动物细胞的克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分(通常使用SV40起点只是因为其含有早期启动子)。
(iii)选择基因组分 表达载体和克隆载体可以含有选择基因，也称为选择标志物。典型的选择基因编码蛋白，该蛋白(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如，对氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的抗性，(b)补足营养缺陷体的不足，或(c)提供复合培养基不提供的关键营养，例如，为杆菌(Bacilli)编码D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个例子使用药物来抑制宿主细胞的生长。被异源基因成功转化的那些细胞产生赋予药物抗性的蛋白且因此在选择下存活。这些显性选择的例子使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
适于哺乳动物细胞的选择标志物的另一个例子是那些使得能够鉴别竞争性吸收BR3结合抗体核酸的细胞，所述BR3结合抗体例如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和金属硫蛋白-II，优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等等。
例如，通过在含有甲氨蝶呤(Mtx)的培养基中培养所有转化体来首先鉴定被DHFR选择基因转化的细胞，甲氨蝶呤为DHFR的竞争性拮抗剂。当使用野生型DHFR时，适当的宿主细胞是缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如，ATCC CRL-9096)。
或者，可以通过细胞在含有用于选择标志物的选择试剂的培养基中的生长来选择被编码BR3结合抗体、野生型DHFR蛋白和另一选择标志物的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(尤其是含有内源DHFR的野生型宿主)，该另一选择标志物例如氨基糖苷3’-磷酸转移酶(APH)，所述选择试剂例如氨基糖苷类抗生素，例如卡那霉素或G418。参见美国专利第4,965,199号。
适合用在酵母中的选择基因是存在于酵母质粒YRp7上的trp1基因(Stinchcomb et al.，Nature，28239(1979))。trp1基因提供对缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株进行选择的选择标志物，所述菌株例如ATCC号44076或PEP4-1。Jones，Genetics，8512(1977)。然后酵母宿主细胞基因组中存在的trp1病灶为通过在不含色氨酸下生长来检测转化提供了有效环境。类似地，Leu2缺失酵母株(ATCC 20,622或38,626)被带有Leu2基因的已知质粒补足。
此外，衍生自1.6μm环状质粒pKD1的载体可被用于转化克鲁维酵母(Kluyveromyces)。或者，报道了用K.lactis大量生产重组小牛凝乳酶的表达系统。Van den Berg，Bio/Technology，8135(1990)。还公开了用于通过克鲁维酵母(Kluyveromyces)的工业株来分泌成熟重组人血清白蛋白的稳定的多拷贝表达载体。Fleer et al.，Bio/Technology，9968-975(1991)。
(iv)启动子组分 表达载体和克隆载体通常含有被宿主生物体识别且与编码BR3结合抗体的核酸可操作地连接的启动子。适合用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子系统和杂种启动子，例如tac启动子。然而，其它的已知细菌启动子是合适的。用于细菌系统的启动子还含有与编码BR3结合抗体的DNA可操作地连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
已知真核生物的启动子序列。事实上所有的真核基因都具有富含AT的区域，其位于转录起始位点上游的约25至30个碱基处。在许多基因的转录起始点上游的70至80个碱基处找到的另一个序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因地3’末端是AATAAA序列，其可能是向编码序列的3’末端加入多聚A尾部的信号。所有这些序列都适于插入到真核表达载体中。
适合用于酵母宿主的启动子序列包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，所述糖酵解酶例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸歧化酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。
其它酵母启动子，其为具有由生长条件控制转录的额外优势的可诱导启动子，是乙醇脱氢酶2、异细胞色素C(isocytochrome C)、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解性酶类、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。EP 73,657中进一步描述了适合用于在酵母中表达的载体和启动子。酵母增强子与酵母启动子一起使用也是有利的。
可以控制哺乳动物细胞中抗体从载体的转录，例如，通过从病毒的基因组、或者从异源哺乳动物启动子、或者从热休克蛋白启动子获得的启动子，前提条件为这些启动子与宿主细胞系统兼容，所述病毒例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒、猿猴病毒40(SV40)，所述异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子。
SV40病毒的早期和晚期启动子可方便地作为SV40限制片段得到，还片段还含有SV40病毒复制起点。人巨细胞病毒的中早期启动子作为HindIII E限制片段方便地得到。美国专利第4,419,446号描述了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利第4,601,978号描述了对此系统的改进。还参见Reyes et al.，Nature 297598-601(1982)关于在小鼠细胞中在单纯性疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA。或者，劳斯肉瘤病毒的长末端重复序列可以被用作启动子。
(v)增强子元件组分 经常通过向载体中插入增强子序列来提高高等真核生物对编码本发明抗体的DNA的转录。目前已知许多来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的增强子。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括位于复制起点晚期一侧(bp100-270)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点晚期一侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。还参见Yaniv，Nature29717-18(1982)关于活化真核启动子的增强元件。增强子可以被剪接到载体中抗体编码序列的5’或3’位置，但是优选位于启动子的5’位点。
(vi)转录终止组分 用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还含有终止转录和稳定mRNA所需要的序列。这样的序列通常由真核或病毒DNA或cDNA的5’，以及偶尔还有3’非翻译区来提供。这些序列含有被转录为编码抗体的mRNA的非翻译部分中的多腺苷化片段的核苷酸区段。一个有用的转录终止成分是牛生长激素多腺苷化区域。参见WO 94/11026以及其中公开的表达载体。
(vii)宿主细胞的选择和转化 用于克隆或表达本发明载体中的DNA的适合宿主细胞是上述的原核生物、酵母或高等真核生物细胞。适合此目的的原核生物包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，举例来说，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)例如埃希杆菌属(Escherichia)，例如E.coli，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文菌属(Erwinia)，克雷白杆菌属(Klebsiella)，变性杆菌属(Proteus)，沙门菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)，沙雷菌属(Serratia)，例如粘质沙雷菌(Serratia marcescans)和志贺菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌(Bacilli)例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日出版的DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌属(Pseudomonas)，例如铜绿色假单胞菌(P.aeruginosa)，以及链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的E.coli克隆宿主是E.coli 294(ATCC31,446)，尽管诸如E.coli B、E.coli X1776(ATCC 31,537)和E.coliW3110(ATCC 27,325)的其它菌株也是合适的。这些例子是说明性的而非限制。
可以在细菌中生产全长抗体、抗体片段和抗体融合蛋白，特别是当不需要糖基化和Fc效应功能时，例如当治疗性抗体与细胞毒性剂(例如毒素)偶联时，免疫结合物自身显示破坏肿瘤细胞的效果。全长抗体在循环中具有更长的半衰期。在E.coli中生产更快且成本更低。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，例如参见美国专利第5,648,237号(Carter等人)、美国专利第5,789,199号(JoIy等人)和美国专利第5,840,523号(Simmons等人)，其描述了翻译起始区(TIR)和用于最优化表达和分泌的信号序列，通过引用将这些专利并入此处。表达后，抗体在可溶部分中被从E.coli细胞糊状物中分离且可以被纯化，例如通过取决于同种型的蛋白A或蛋白G柱。最终纯化可以按照与纯化在例如CHO细胞中表达的抗体的方法类似地进行。
除原核细胞外，真核微生物例如丝状真菌或酵母是编码BR3结合抗体的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或普通的面包酵母是低等真核宿主微生物中最常使用的。然而，许多其它属、种和菌株是通常可获得的且在本发明中是有用的，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、K.wickeramii(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母菌(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、K.thermotolerans和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；yarrowia(EP402,226)；甲醇酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；念珠菌属(Candida)；Trichoderma reesia(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，例如西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；以及丝状真菌，例如链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉(Aspergillus)宿主，例如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
适合表达糖基化BR3结合抗体的宿主细胞来自多细胞生物。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴别了例如来自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)的许多杆状病毒株和变体和相应的允许昆虫宿主细胞。可从公开途径获得多种用于转染的病毒株，例如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica NPV)的L-1变体和家蚕NPV(Bombyx mori NPV)的Bm-5株，并且这些病毒可以被用作根据本发明的病毒，特别是用于草地贪夜蛾细胞的转染。
棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物也可被用作宿主。
然而，最感兴趣的是脊椎动物细胞，并且脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已经是常规操作了。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是被SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾系(293或为在悬浮培养中生长经过亚克隆的293细胞，Graham et al，J.Gen Virol.3659(1977))；小仓鼠(baby hamster)肾细胞(BHK，ATCCCCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.ScL USA 774216(1980))；小鼠Sertoli cells(TM4，Mather，Biol.Reprod.23243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)，小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather etal，Annals N.Y.Acad.ScL 38344-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞和人肝细胞瘤系(Hep G2)。
用上述用于抗体生产的表达或克隆载体转化宿主细胞，并且在经修饰以适合诱导启动子、选择转化体或扩增编码希望序列的基因的常规营养培养基中培养。
(viii)培养宿主细胞 可以在多种培养基中培养用于生产本发明抗体的宿主细胞。可商购的培养基例如Ham′s F10(Sigma)、Minimal Essential Medium((MEM)，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium((DMEM)，Sigma)适合于培养宿主细胞。此外，Ham et al.，Meth.Enz.5844(1979)，Barnes et al.，Anal Biochem.102255(1980)，美国专利第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第4,560,655号或第5,122,469号，WO 90/03430，WO 87/00195或美国专利Re.30,985中描述的任何培养基均可以作为宿主细胞的培养基。可以根据需要向任何这些培养基中补充激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效的能量来源。还可以以本领域技术人员已知的合适浓度包括任何其它需要的补充物。培养条件，例如温度、pH等等，是之前就用于所选用于表达的宿主细胞的那些，并且对于本领域技术人员是明显的。
(ix)抗体纯化 当使用重组技术时，抗体可以在细胞内、在壁膜间隙中产生或者直接分泌到培养基中。如果抗体在细胞内产生，作为第一步，除去或者是宿主细胞或者是溶胞片断的颗粒碎片，例如通过离心或超滤。Carter et al.，Bio/Technology 10163-167(1992)描述了分离分泌到E.coli的壁膜间隙中的抗体的过程。简而言之，在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下解冻细胞糊状物约30分钟。可以通过离心除去细胞碎片。当抗体被分泌到培养基中时，通常首先使用可商购的蛋白浓缩滤膜来浓缩该表达系统的上清液，所述滤膜例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元。可以在前述任何步骤中包括进蛋白酶抑制剂例如PMSF来抑制蛋白水解，且还可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。
可以纯化从细胞制备的抗体组合物，例如使用羟磷灰石色谱、疏水作用色谱法、凝胶电泳、透析和亲和色谱，且亲和色谱为通常优选的纯化步骤之一。蛋白A作为亲和配体的稳定性依赖于物种和抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的同种型。可以使用蛋白A来纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark et al.，J.Immunol.Meth.621-13(1983))。推荐蛋白G用于所有小鼠同种型以及用于人γ3(Guss etal.，EMBO J.515671575(1986))。亲和配体所附着的基质最经常为琼脂糖，但其它基质也可使用。机械稳定的基质，例如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯，使得能够实现比琼脂糖更快的流速和更短的处理时间。当抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)对于纯化是有用的。根据要回收的抗体，还提供蛋白纯化的其它技术，例如离子交换柱分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱法、肝素SEPHAROSETM色谱法、阴离子或阳离子交换树脂(例如聚天冬氨酸柱)色谱法、层析聚焦法、SDS-PAGE和硫酸氨沉淀。
在任何初步纯化步骤后，可以使包含感兴趣的抗体和污染物的混合物经历低pH疏水作用色谱，使用pH为约2.5-4.5的洗脱液，优选在低盐浓度下进行(例如，约0-0.25M盐)。
抗体偶联物 抗体可以被偶联到细胞毒性试剂，例如毒素或放射性同位素。在某些实施方案种，该毒素为刺孢霉素(calicheamicin)，类美登醇(maytansinoid)、多拉司他汀(dolastatin)、auristatin E及其类似物或衍生物为优选的。
优选的药物/毒素包括DNA损伤剂、微管聚合或解聚的抑制剂以及抗代谢物。优选细胞毒素剂的种类例如包括诸如二氢叶酸还原酶抑制剂和胸苷酸合成酶抑制剂的酶抑制剂、DNA嵌入剂、DNA切割剂、拓扑异构酶抑制剂、蒽环族药物、长春花药物、丝裂霉素类、博来霉素类、细胞毒性核苷类、蝶啶族药物、diynene类、鬼臼毒素、以及分化诱导剂。这些种类中尤其有用的成员例如包括氨甲喋呤，甲基叶酸，二氯氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶，6-巯基嘌呤，阿糖胞苷，美法仑，洛诺生(leurosine)，洛诺西丁(leurosideine)，放线菌素，柔红霉素，多柔比星，N-(5，5-二乙酰氧基戊基)多柔比星，吗啉代多柔比星，1-(2-二氯乙基(choroehthyl))-1，2-二甲磺酰肼，N8-乙酰基亚精胺，氨基蝶呤甲基叶酸，埃斯波霉素(esperamicin)，丝裂霉素C，丝裂霉素A，放线菌素，博来霉素，洋红霉素，氨基蝶呤，他利霉素，鬼臼毒素和诸如依托泊苷或依托泊苷磷酸脂的鬼臼毒素衍生物，长春碱，长春新碱，长春地辛，紫杉醇，泰索帝，视黄酸，丁酸，N8-乙酰基亚精胺，喜树碱，刺孢霉素，草苔虫素类(bryostatins)，吡嗪双甾体类(cephalostatins)，安丝菌素(ansamitocin)，布拉地新(actosin)，诸如DM-1、美登素、美登醇、N-脱甲基-4，5-脱环氧美登醇、C-19-脱氯美登醇、C-20-羟基美登醇、C-20-脱甲氧基美登醇、C-9-SH美登醇、C-14-烷氧基甲基美登醇、C-14-羟基或乙酰氧基甲基美登醇、C-15-羟基/乙酰氧基美登醇、C-15-甲氧基美登醇、C-18-N-脱甲基美登醇以及4，5-脱氧美登醇的类美登醇，诸如auristatin E、M、PHE和PE的auristatin类；诸如dolostatin A、dolostatinB、dolostatin C、dolostatin D、dolostatin E(20-epi和11-epi)、dolostatinG、dolostatin H、dolostatin I、dolostatin 1、dolostatin 2、dolostatin 3、dolostatin 4、dolostatin 5、dolostatin 6、dolostatin 7、dolostatin 8、dolostatin 9、dolostatin 10、deo-dolostatin 10、dolostatin 11、dolostatin12、dolostatin 13、dolostatin 14、dolostatin 15、dolostatin 16、dolostatin17、以及dolostatin 18的dolostatin类；诸如吡嗪双甾体1、吡嗪双甾体2、吡嗪双甾体3、吡嗪双甾体4、吡嗪双甾体5、吡嗪双甾体6、吡嗪双甾体7、25’-epi-吡嗪双甾体7、20-epi-吡嗪双甾体7、吡嗪双甾体8、吡嗪双甾体9、吡嗪双甾体10、吡嗪双甾体11、吡嗪双甾体12、吡嗪双甾体13、吡嗪双甾体14、吡嗪双甾体15、吡嗪双甾体16、吡嗪双甾体17、吡嗪双甾体18、以及吡嗪双甾体19的吡嗪双甾体类。
类美登醇为有丝分裂抑制剂，其通过乙酯微管素聚合起作用。美登醇起初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)中分离(美国专利号3,896,111)。随后，发现某些微生物也产生类美登醇，如美登醇和C-3美登醇脂(美国专利号4,151,042)。合成的美登醇及其衍生物和类似物例如公开于第4,137,230号、第4,248,870号、第4,256,746号、第4,260,608号、第4,265,814号、第4,294,757号、第4,307,016号、第4,308,268号、第4,308,269第号、第4,309,428号、第4,313,946号、第4,315,929号、第4,317,821号、第4,322,348号、第4,331,598号、第4,361,650号、第4,364,866号、第4,424,219号、第4,450,254号、第4,450,254号、第4,362,663号以及第4,371,533号美国专利，通过引用将它们的公开内容明确并入本文。
美登素和类美登醇已被偶联到特异结合肿瘤细胞抗原的抗体。含有类美登醇的免疫偶联物和它们的治疗用途例如已被公开于第5,208,020号、第5,416,064号美国专利以及欧洲专利EP 0425 235 B1中，通过引用将它们的公开内容明确并入本文。Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 938618-8623(1996)描述了包含命名为DM1的类美登醇的免疫偶联物，其中该DM1连接到抗人结肠直肠癌的单克隆抗体C242。该偶联物被发现对培养的结肠癌细胞有很强毒性，并在体内肿瘤生长测定中显示了抗肿瘤活性。Chari et al.Cancer Research 52127-131(1992)描述了这样的免疫偶联物，其中类美登醇通过二硫化物连接物偶联到结合人结肠癌细胞系上的抗原的鼠抗体A7，或偶联到结合HER-2/neu癌基因的另一鼠抗体TA.1。
现有技术中已知有很多连接基团用于制备抗体-类美登醇偶联物，例如包括公开于第5,208,020号美国专利或欧洲专利0 425 235 B1以及Chari et al.Cancer Research 52127-131(1992)中的那些。所述连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸敏感基团、光敏基团、肽酶敏感基团或酯酶敏感基团，如公开于上述专利中的那些，二硫化物和硫醚基团是优选的。
抗体和类美登醇的偶联物可以通过采用多种双功能蛋白偶合剂来制备，所述双功能蛋白偶联剂例如为N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯、硫醇亚胺(iminothiolane，IT)、亚胺酯(imidoester)类的双功能衍生物(例如二甲基adipimidate HCL)、活性酯类(例如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛类(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮基衍生物(例如双-(对重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯类(例如甲苯2，6-二异氰酸酯)、以及双活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。尤其优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson et al.，Biochem.J.173723-737[1978])和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)来提供二硫键。
所述连接物可以在不同位置连接到类美登醇分子，这取决于连接的类型。例如，可以通过采用常规偶联技术与羟基基团反应形成酯键。该反应可以发生在具有羟基基团的C-3位、以羟甲基修饰的C-14位、以羟基基团修饰的C-15位、以及具有羟基基团的C-20位。在优选的实施方案中，该键在美登醇或美登醇类似物的C-3位形成。
刺孢霉素 另一令人感兴趣的免疫偶联物包含偶联到一个或多个刺孢霉素分子的BR3结合抗体。刺孢霉素族抗生素能够在亚皮摩尔浓度下产生双链DNA断裂。关于制备刺孢霉素族的偶联物，参见第5,712,374号、第5,714,586号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号、第5,877,296号美国专利(都属于American Cyanamid Company)。可以使用的刺孢霉素结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG和θ1I(Hinman et al.CancerResearch 533336-3342(1993)，Lode et al.Cancer Research 582925-2928(1998)以及上述American Cyanamid的美国专利)。抗体可偶联的另一抗肿瘤药物为抗叶酸素(antifolate)的QFA。刺孢霉素和QFA都具有分子内作用位点，并且不易跨过质膜。因此，通过抗体介导的内化来进行这些试剂的细胞摄取显著地增强它们的细胞毒性效应。
放射性同位素 对于肿瘤的选择性破坏，抗体可以包含高放射性原子。有多种放射性同位素可用于产生放射偶联的抗BR3抗体。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212以及Lu的放射性同位素。当所述偶联物用于诊断，它可以包括用于闪烁法研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，例如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
放射或其它标记物可以通过已知方式掺入偶联物。例如，肽可以被生物合成或被人工合成，其中采用包括例如氟-19替换氢的合适的氨基酸前体来进行化学氨基酸合成。诸如tc99m或I123、Re186、Re188以及In111的标记物可通过肽中的半胱氨酸残基连接。钇-90可通过赖氨酸残基连接。IODOGEN方法(Fraker et al.(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.8049-57)可用于掺入碘-123。“Monoclonal Antibodies inImmunoscintigraphy”(Chatal，CRC Press 1989)详细描述了其它方法。
抗体和细胞毒素剂的偶联物可以通过采用多种双功能蛋白偶合剂来制备，所述双功能蛋白偶联剂例如为N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯、硫醇亚胺(IT)、亚胺酯类的双功能衍生物(例如二甲基adipimidate HCl)、活性酯类(例如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛类(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮基衍生物(例如双-(对重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯类(例如甲苯2，6-二异氰酸酯)、以及双活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可按Vitetta et al.Science 2381098(1987)中的描述来制备。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于偶联放射性核素到抗体的示例性螯合剂。参见WO 94/11026。连接物可以是“可切割的连接物”，有助于在细胞中释放细胞毒性药物。例如，可以使用酸敏感的连接物、肽敏感的连接物、光敏感的连接物、二甲基连接物或含有二硫化物的连接物(Chari et al.Cancer Research 52127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
BR3结合抗体的治疗用途 本发明的BR3结合抗体可用于治疗众多恶性和非恶性疾病，包括自身免疫性疾病和相关疾病状态，以及包括B细胞淋巴瘤和白血病的BR3阳性癌。骨髓中的干细胞(B细胞的祖细胞)缺乏BR3抗原，使得健康B细胞能够在治疗后再生并在几个月内返回到正常水平。
自身免疫性疾病或自身免疫性相关疾病状态包括关节炎(类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣性关节炎)、牛皮癣、包括特应性皮炎在内的皮炎；慢性自身免疫性荨麻疹、多发性肌炎/皮肌炎、中毒性表皮坏死松解症、全身性硬皮病和硬化、与炎性肠病(IBD)(克罗恩病、溃疡性结肠炎)有关的反应、呼吸窘迫综合征、成年呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑膜炎、变应性鼻炎、脑炎、眼色素层炎、结肠炎、肾小球性肾炎、变应性疾病状态、湿疹、哮喘、涉及T细胞滤过和慢性炎性应答的疾病状态、动脉粥样硬化、自身免疫性心肌炎、白细胞粘附缺陷、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮(包括肾炎、非肾脏的、盘状的、脱发)、青少年型糖尿病、多发性硬化、变应性脑脊髓炎、与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应有关的免疫反应、结核、肉样瘤病、包括韦格纳肉芽肿病在内的肉芽肿病、粒细胞缺乏症、血管炎(包括ANCA)、再生障碍性贫血、Coombs试验阳性贫血、戴-布贫血、包括自身免疫性溶血性贫血(AJHA)在内的免疫性溶血性贫血、恶性贫血、单纯红细胞再生障碍(PRCA)、因子VIII缺陷、血友病A、自身免疫性中性白细胞减少症、各类血细胞减少症、白细胞减少症、涉及白细胞血球渗出的疾病、CNS炎性疾病、多器官损伤综合征、重症肌无力、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜病、抗磷脂抗体综合征、过敏性神经炎、Bechet病、Castleman综合征、古德帕斯丘综合征、Lambert-Eaton肌无力综合征、雷诺氏综合征、舍格伦综合征、斯-约综合征、实体器官移植排斥(包括对高群体反应性抗体滴度的预处理、IgA在组织中沉积，等等)、移植物抗宿主病(GVHD)、大疱性类天疱疮、天疱疮(所有的，包括寻常性天疱疮、落叶性天疱疮)、自身免疫性多内分泌腺疾病、赖特尔病、硬汉综合征、巨细胞动脉炎、免疫复合物肾炎、IgA肾病、IgM多发性神经病或IgM介导的肾炎、特发性血小板减少性紫癫(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎的睾丸和卵巢自身免疫性疾病、原发性甲状腺功能减退症、包括自身免疫性甲状腺炎的自身免疫性内分泌疾病、慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)、亚急性甲状腺炎、特发性甲状腺功能减退症、阿狄森病、Grave’s病、自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌病综合征)、也称为胰岛素依赖型糖尿病的I型糖尿病以及希恩综合征；自身免疫性肝炎、淋巴样间质性肺炎(HIV)、梗阻性细支气管炎(非移植的)vs NSIP、格-巴二氏综合征、大脉管血管炎(包括风湿性多肌病和巨细胞(Takayasu’s)动脉炎)、中脉管血管炎(包括川畸病和结节性多动脉炎)、强直性脊柱炎、Berger’s病(IgA肾病)、急进性肾小球性肾炎、原发性胆汁性肝硬化、口炎性腹泻(麸质肠病)、冷球蛋白血症、ALS、冠状动脉疾病。
BR3阳性癌症为那些包括在细胞表面表达BR3的细胞的异常增殖的癌症。BR3阳性B细胞瘤包括BR3阳性何杰金氏病，包括淋巴细胞为主的何杰金氏病(LPHD)；非何杰金氏淋巴瘤(NHL)；滤泡中心细胞(FCC)淋巴瘤；急性淋巴细胞白血病(ALL)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；毛细胞白血病。非何杰金氏淋巴瘤包括低度恶性/滤泡何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、中度恶性/滤泡NHL、中度恶性弥散性NHL、高度恶性免疫母细胞NHL、高度恶性淋巴母细胞NHL、高度恶性小无裂细胞NHL、巨瘤症NHL、类质浆细胞淋巴细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤和原发性巨球蛋白血症。还涉及了对这些癌症的复发的治疗。LPHD是尽管经过放疗和化疗治疗但依然倾向于经常复发的何杰金氏病类型，并且可以被BR3阳性恶性细胞所表征。CLL是白血病的四种主要类型之一。被称为淋巴细胞的成熟B细胞的癌症，CLL表现为细胞在血液、骨髓和淋巴组织中的进行性积蓄。
在具体的实施方案中，所述BR3结合抗体及其功能性片段用于治疗非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、淋巴细胞为主的何杰金氏病(LPHD)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、慢性淋巴细胞白血病、风湿性关节炎和青少年型风湿性关节炎、包括狼疮性肾炎的系统性红斑狼疮(SLE)、韦格纳病、炎性肠病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化症、牛皮癣、IgA肾炎、IgM多发性神经病、重症肌无力、血管炎、糖尿病、雷诺氏综合征、舍格伦综合征以及血管球性肾炎。
BR3结合抗体或其功能性片段可用作例如复发的或难治愈的低度或滤泡的、BR3阳性B细胞NHL的单一药剂治疗，或可在多药物方案中与其它药物一起给予患者。
缓慢进展淋巴瘤是缓慢生长的不可治愈疾病，其中普通患者在多个好转和复发期后存活6至10年。在一个实施方案中，人源化的BR3结合抗体或其功能性片段用于治疗缓慢进展NHL。
用于评估肿瘤治疗的有效性或是否成功的参数对于该适合疾病领域的熟练医师来说是已知的。通常，熟练医师会关注特定疾病体征和症状的减弱。参数可包括疾病进展的中值时间，好转、疾病稳定的时间。
以下的参考文献描述了淋巴瘤和CLL、它们的诊断、治疗以及检测治疗有效性的标准医学程序。
以下的参考文献描述了淋巴瘤和CLL、它们的诊断、治疗以及测量治疗有效性的标准医学程序。Canellos GP，Lister，TA，Sklar JLTheLymphomas(淋巴瘤).W.B.Saunders Company，Philadelphia，1998；vanBesien K和Cabanillas，FClinical Manifestations，Staging andTreatment of Non-Hodgkin’s Lymphoma (非何杰金氏淋巴瘤的临床表现、分期和治疗)，Chap.70，pp 1293-1338，inHematology，BasicPrinciples and Practice，3rd ed.Hoffman et al.(编者).ChurchillLivingstone，Philadelphia，2000；以及Rai，K和Patel，DChronicLymphocytic Leukemia(慢性淋巴性白血病)，Chap.72，pp 1350-1362，inHematology，Basic Principles and Practice，3rd ed.Hoffman et al.(等人).Churchill Livingstone，Philadelphia，2000。
用于评估自身免疫疾病或自身免疫相关疾病的治疗的有效性或是否成功的参数对于该适当疾病领域的熟练医师来说是已知的。通常，熟练医师会关注特定疾病体征和症状的减弱。以下的描述是示例性的。
在一个实施方案中，本发明的抗体可用于治疗类风湿性关节炎(RA)。RA以多个关节炎症、软骨丧失和骨质侵蚀为特征，其导致关节破坏并最终减弱关节功能。此外，由于RA为系统性疾病，它可对其它组织有影响，例如肺、眼、和骨髓。少于50％的患者在患有RA长于10年后仍能继续工作或逐渐功能正常。
抗体可用作患有早期RA的患者(即没有用氨甲喋呤(MTX)治疗的)的一线疗法，并作为单一疗法，或与例如MTX或环磷酰胺联合。或者，所述抗体可作为二线疗法用在对DMARD和/或MTX治疗不显疗效的患者的治疗中，并作为单一疗法或与例如MTX联合。人源化BR3结合抗体可用于在RA中防止和控制关节损伤、延迟结构性损伤、减小与炎症有关的疼痛，通常在中度至严重RA中减弱体征和症状。该RA患者可在用其它治疗RA的药物治疗之前、之后或同时(参见以下的联合治疗)用人源化的BR3抗体治疗。在一个实施方案中，之前用缓解疾病的抗风湿性药物治疗无效和/或对单独的氨甲喋呤无充分反应的患者以本发明的人源化BR3结合抗体治疗。在这种治疗的一个实施方案中，患者在17日治疗方案中接受单独人源化BR3结合抗体(第1和第15天静脉输注1g)；BR3结合抗体加环磷酰胺(第3和第17天静脉输注750mg)；或BR3结合抗体加氨甲喋呤。
评价RA治疗有效性的一种方法基于美国风湿病学学院(AmericanCollege of Rheumatology，ACR)标准，其测量触痛和肿胀关节的改善百分比以及其它事项。与无抗体治疗(例如治疗前的基线水平)或以安慰剂治疗相比，RA患者可评分为例如ACR 20(改善20％)。评价抗体治疗有效性的其它方式包括用于评价诸如骨质侵蚀和关节腔变窄的结构性损伤的X射线评分，例如Sharp X射线评分。也可基于健康评定问卷[HAQ]评分对患者在防止残疾或在残疾改善方面作出评价。ACR 20标准可以包括在触痛(疼痛)关节数和肿胀关节数上的20％改善加上在5项以下测量中的至少3项中的20％改善 1.通过直观类比尺度(VAS)的患者疼痛评价， 2.疾病活跃性的患者整体评价(VAS)， 3.疾病活跃性的医师整体评价(VAS)， 4.通过健康评定问卷的患者自评残疾，以及 5.急性期反应物，CRP或ESR。
类似地定义ACR 50和70。优选地，所述患者被给予有效量的本发明BR3结合抗体以实现至少ACR 20，优选至少ACR 30，更优选至少ACR 50，甚至更优选至少ACR 70，最有选ACR 75和更高。
牛皮癣性关节炎具有独特和不同的放射学特征。对于牛皮癣性关节炎，关节侵蚀和关节腔变窄也可通过Sharp评分来评价。本发明的人源化BR3结合抗体可用于防止关节损伤以及减弱该病症的体征和症状。
本发明的另一方面是通过给予患有SLE的患者治疗有效量本发明BR3结合抗体来治疗狼疮(Lupus)或SLE的方法。SLEDAI提供了疾病活跃性的数值定量。SLEDAI为24个与疾病活跃性有关的临床和实验室参数的加权指数，数值范围在0-103。参见Bryan Gescuk & John Davis，“Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus(系统性红斑狼疮的新治疗剂)”in Current Opinion in Rheumatology 2002，14515-521。针对双链DNA的抗体被认为会引起肾炎症和其它狼疮表现。可监视接受抗体治疗的患者的肾炎症的进程，肾炎症被定义为血清肌酸酐、尿蛋白或尿血的显著的、可重现的增加。或者，或另外，可监测患者抗核抗体和抗双链DNA抗体的水平。对SLE的治疗包括大剂量的皮质激素和/或环磷酰胺(HDCC)。
脊椎关节病是一组关节疾病，包括强直性脊柱炎、牛皮癣性关节炎和克罗恩病(Crohn’s disease)。可通过确认的患者和医师的整体评价测量手段来确定治疗的成功。
多种药物处理可用于治疗牛皮癣；治疗的不同直接与疾病严重性有关。患有较轻型的牛皮癣通常采用局部治疗来控制疾病，例如采用局部类固醇、蒽啉、卡泊三烯(calcipotriene)、氯倍他索和他佐罗汀，而患有中度和重度牛皮癣的患者更可能采用全身性(氨甲喋呤、视黄酸类、环磷酰胺、PUVA和UVB)疗法。焦油也被使用。这些疗法具有合并的安全顾虑、耗时的治疗方案或不便的治疗过程。此外，一些疗法需要昂贵的设备和诊所中的专用空间。全身性药物处理可产生严重的副作用，包括高血压、高脂血症、骨髓抑制、肝病、肾脏病和胃肠不适。另外，光疗的使用可增加皮肤癌的发病率。除了与使用局部疗法相关的不变和不适之外，光疗和全身性治疗还要求使患者循环接受和停止治疗，并且由于它们的副作用还监测终身接触量(lifetimeexposure)。
对牛皮癣的治疗通过监测疾病临床体征和症状的变化来进行，这包括与基线状况相比的医师的整体评价(PGA)变化以及牛皮癣面积和严重性指数(PASI)评分、牛皮癣症状评价(PSA)。患者可在治疗期间定期进行测量，该测量基于用于表明在特定时间点感受的搔痒程度的直观类比标度。
患者可能在他们首次输注治疗抗体时经历输液反应或输液相关症状。这些症状的严重性不同，通常在医学干预下会逆转。这些症状包括但不限于流感样发热、寒战/僵直、恶心、荨麻疹、头疼、支气管痉挛、血管性水肿。本发明的疾病治疗方法最小化输液反应是所期望的。因此，本发明的另一方面是通过给予BR3结合抗体的疾病治疗方法，其中所述抗体具有减小的或无补体依赖的细胞毒性。
剂量 取决于待治疗的适应症和本领域医师熟知的与给药有关的因素，本发明的抗体将以有效治疗该适应症并使毒性和副作用最小化的剂量给药。为了治疗癌症、自身免疫疾病或免疫缺陷疾病，该治疗有效剂量可为50mg/剂至2.5g/m2。在一个实施方案中，该给药剂量为约250mg/m2至约400mg/m2或500 mg/m2。在一个实施方案中，该剂量为约250-375mg/m2。在另一实施方案中，该剂量范围为275-375mg/m2。
在一个治疗本文描述的BR3阳性B细胞瘤(例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、滤泡性淋巴瘤(FL)或多发性骨髓瘤)的实施方案中，所述抗体以50mg/剂至2.5g/m2给药。对于治疗患有诸如非何杰金氏淋巴瘤的B细胞淋巴瘤的患者的治疗，在特定的实施方案中，本发明的抗BR3抗体和人源化抗BR3抗体将以10mg/kg或375mg/m2的剂量给予人类患者。对于治疗NHL，一种给药方案为在治疗的第一周以10mg/kg的剂量给予一剂抗体组合物，间歇两周，然后给予同样量的第二剂。通常，NHL患者可一年接受这种治疗一次，但是一旦有淋巴瘤复发，可重复这种治疗。在另一给药方案中，所治疗的患有低度NHL的患者接受4周的抗BR3抗体(375mg/m2每周)，在第5周后是3个附加疗程的所述抗体加上标准的CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松)或CVP(环磷酰胺、长春新碱、泼尼松)化疗，其每三周进行一次，循环三次。
对于治疗风湿性关节炎，在一个实施方案中，抗BR3抗体的剂量范围为125mg/m2(等于约200mg/剂)至600mg/m2，以两剂给药，例如在第一天给予200mg的第一剂，随后在第15天给予200mg的第二剂。在不同的实施方案中，所述剂量选自250mg/剂、275mg/剂、300mg/剂、325mg/剂、350mg/剂、375mg/剂、400mg/剂、425mg/剂、450mg/剂、475mg/剂、500mg/剂、525mg/剂、550mg/剂、575mg/剂以及600mg/剂。
在疾病治疗中，本发明额BR3结合抗体可长期地或间歇地给予患者，这由熟悉该疾病的医师来决定。
通过静脉内输注或皮下给药的患者可能经历一些不良反应，例如发热、寒战、灼热感、无力和头痛。为了减轻或最小化这些不良反应，患者可以接受起始的调整剂量的抗体，随后为治疗剂量。该调整剂量低于治疗剂量以使患者耐受更高剂量。
本发明的BR3结合抗体(1)缺乏ADCC功能或与包含野生型人IgGFc的抗体相比具有减小的ADCC功能；(2)缺乏部分地或全部抑制BAFF结合到BR3的能力或(3)缺乏ADCC功能或与包含野生型人IgGFc的抗体相比具有减小的ADCC功能，并且缺乏部分地或全部抑制BAFF结合到BR3的能力，这样的BR3结合抗体是有用的，例如用在对抑制BAFF和BR3结合以及具有ADCC功能的抗BR3抗体疗法具有或预计具有显著不良反应的患者的补充疗法、替代疗法或维持疗法中。例如，考虑患者可首先用抑制BAFF和BR3结合以及具有ADCC功能的抗BR3抗体治疗，然后以如下抗BR3抗体治疗即其(1)缺乏ADCC功能或与包含野生型人IgG Fc的抗体相比具有减小的ADCC功能；(2)缺乏部分地或全部抑制BAFF结合到BR3的能力或(3)缺乏ADCC功能或与包含野生型人IgG Fc的抗体相比具有减小的ADCC功能，并且缺乏部分地或全部抑制BAFF结合到BR3的能力。
给药途径 所述BR3结合抗体按照已知方法给予人类患者，例如静脉内给药，例如作为快速注射(bolus)或通过在一段时间内的连续输注，通过皮下、肌内、腹膜内、脑脊髓内、关节内、滑膜内、鞘内或吸入途径，通常通过静脉内或皮下给药。
在一个实施方案中，所述抗BR3抗体与作为输注载体的0.9％氯化钠溶液一起通过静脉内输注给药。在另一实施方案中，所述抗BR3抗体以预装注射器给药。
联合治疗 本发明的BR3结合抗体或多肽可与第二治疗剂联合使用来治疗疾病。应理解术语第二治疗剂并不排除以其它另外的疗法治疗该个体。提及第二治疗剂旨在将该治疗剂与也在使用的特异的BR3结合抗体或多肽区别开。在一个实施方案中，以BR3结合抗体或多肽治疗自身免疫疾病或癌症的患者可用生物应答调节剂(BRM)同时、顺序(之前或之后)或交替治疗，以刺激或恢复免疫系统功能以在多药物方案中对抗疾病和/或感染。BRM可包括单克隆抗体，例如靶向TNF-α或IL-1的抗体(例如Enbrel_、Remicade_、以及Humira_)、干扰素、白介素(例如IL-2、IL-12)和各种类型的集落刺激因子(CSF、GM-CSF、G-CSF)。例如，BRM可能干扰炎症活性，最终减小关节损伤。
在一个实施方案中，所述第二治疗剂为IAP抑制剂。
在另一实施方案中，以BR3结合抗体或多肽治疗自身免疫疾病或癌症的患者可用B细胞去除剂同时、顺序(之前或之后)或交替治疗。
在一个实施方案中，以BR3结合抗体或多肽治疗自身免疫疾病或癌症的患者可用BAFF拮抗剂同时、顺序(之前或之后)或交替治疗。
在另一实施方案中，对于上述的癌症和肿瘤，所述患者可在多药物方案中用本发明的BR3结合抗体联合一种或多种诸如化疗剂的治疗剂进行治疗。所述BR3结合抗体可与所述化疗剂同时、顺序(之前或之后)或交替给药，或在对其它疗法无反应后给药。对淋巴瘤治疗的标准化疗可以包括环磷酰胺、阿糖胞苷、美法仑、以及米托蒽醌加美法仑。CHOP是治疗非何杰金氏淋巴瘤的最常用化疗方案。以下为用在CHOP方案中的药物环磷酰胺(商品名称cytoxan，neosar)；阿霉素(多柔比星/羟基多柔比星)；长春新碱(Oncovin)；以及泼尼松龙(有时称为Deltasone或Orasone)。在具体的实施方案中，所述BR3结合抗体与化疗剂多柔比星、环磷酰胺、长春新碱和泼尼松龙中的一种或多种联合向有需要的患者给药。在具体的实施方案中，患有淋巴瘤的患者用本发明的抗BR3抗体与CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙)疗法联合治疗。在另一实施方案中，患者癌症或肿瘤可用本发明的BR3结合抗体联合CVP(环磷酰胺、长春新碱和泼尼松龙)化疗进行治疗。在具体的实施方案中，患有BR3阳性NHL的患者用人源化抗BR3抗体与CVP联合治疗。在治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)的具体实施方案中，所述BR3结合抗体与使用一种或多种核苷类似物化学疗法联合给药，或与使用环磷酰胺的化学疗法联合给药，所述核苷类似物例如为氟达拉滨、克拉屈滨(2-氯脱氧腺苷，2-CdA[Leustatin])、喷司他丁(Nipent)。
在治疗上述自身免疫疾病或自身免疫相关疾病状态中，例如在多药物方案中，所述患者可用本发明的BR3结合抗体与第二化疗剂联合治疗，该化疗剂例如为免疫抑制剂。BR3结合抗体可与免疫抑制剂同时、顺序或交替给药，或在对其它治疗无反应时给药。所述免疫抑制剂可以等于或少于现有技术中指出的剂量给药。优选的辅助免疫抑制剂取决于很多因素，包括所治疗的病症的类型以及患者的病史。
这里所用的用于辅助治疗的“免疫抑制剂”指用作抑制或掩盖患者的免疫系统的物质。这些试剂包括抑制细胞因子产生、下调或抑制自身抗原的表达、或掩盖MHC抗原的物质。这些试剂的实例包括类固醇，如糖皮质激素，如泼尼松、甲基泼尼松和地塞米松；2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(参见美国专利4,665,077)、硫唑嘌呤(或环磷酰胺，如果对硫唑嘌呤有副反应)；溴隐定；戊二醛(其掩盖MHC抗原，如美国专利4,120,649所述)；针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体； 环孢素A；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂，包括抗干扰素γ、β、或α的抗体；抗肿瘤坏死因子-α抗体；抗肿瘤坏死因子-β抗体；抗白介素-2抗体和抗IL-2受体抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；pan(泛)-T抗体、优选抗-CD3或抗--CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合结构域的可溶肽(WO 90/08187，1990年7月26日公开)；链激酶；TGF-β；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷怕霉素(rapamycin)；T细胞受体(美国专利5,114,721)；T细胞受体片段(Offner et al.，Science 251430-432(1991)；WO 90/11294；以及WO 91/01133)；以及T细胞受体抗体(EP340,109)，如T10B9。
对于治疗类风湿性关节炎，所述患者可用本发明的BR3抗体与以下药物的一种或多种联合治疗DMARDS(缓解疾病的抗风湿性药物(例如氨甲喋呤)、NSAI或NSAID(非类固醇抗炎药物)、HUMIRA_(阿达木单抗；Abbott Laboratories)、ARAVA_(来氟米特)、REMICADE_(英夫利昔单抗；Centocor Inc.，ofMalvern，Pa)；ENBREL_(依那西普；Immunex，WA)；COX-2抑制剂。通常用于RA的DMARDs为羟基cloroquine、柳氮磺吡啶、氨甲喋呤、来氟米特、依那西普、英夫利昔单抗、硫唑嘌呤、D-青霉胺、金制剂(口服)、金制剂(肌内)、米诺环素、环孢素、葡萄球菌蛋白A免疫吸附。阿达木单抗是结合TNF的人单克隆抗体。英夫利昔单抗是结合TNF的嵌合单克隆抗体。依那西普是“免疫粘合素”融合蛋白，由人75kD(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的细胞外配体结合部分连接到人IgG1的Fc部分构成。对于RA的常规治疗，参见例如“Guidelines for the management of rheumatoidarthritis”Arthritis & Rheumatism 46(2)328-346(2002年2月)。在具体的实施方案中，该RA患者用本发明的BR3抗体与氨甲喋呤(MTX)联合治疗。示例性的MTX剂量为约7.5-25mg/kg/wk。MTX可口服和皮下给药。
对于治疗强直性脊柱炎、牛皮癣性关节炎和克罗恩病，患者可用本发明的BR3结合抗体与例如Remicade_(英夫利昔单抗；来自Centocor Inc.，of Malvern，Pa.)、ENBREL_(依那西普；Immunex，WA)联合治疗。
治疗SLE包括高剂量的皮质激素和/或环磷酰胺(HDCC)。
对于治疗牛皮癣，患者可给予BR3结合抗体并结合局部治疗，例如局部类固醇、蒽啉、卡泊三烯、氯倍他索以及他佐罗汀，或者结合氨甲喋呤、类视黄醇、环孢素、PUVA和UVB疗法。在一个实施方案中，所述牛皮癣患者用BR3抗体与环孢素顺序或同时治疗。
药物制剂 通过将具有所需纯度的抗体与任选的药物可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980))混合，来制备用于储存的本发明所用BR3结合抗体的治疗制剂，形式为冻干制剂或水溶液。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用剂量和浓度下对接受者无毒性，并包括诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸的缓冲剂；包括抗坏血酸和蛋氨酸在内的抗氧化剂；防腐剂(例如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；烷基对羟基苯甲酸酯类，如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10残基)多肽；蛋白，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如olyvinylpyrrolidone；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖以及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的抗衡离子，如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
示例性的抗BR3抗体制剂描述在WO 98/56418中，将其通过参考明确并入本文。另一种制剂为液体多剂量制剂，包含40mg/mL的抗BR3抗体、25mM醋酸盐、150mM海藻糖、0.9％苄醇、0.02％聚山梨醇酯20，pH5.0，其在2-8℃贮存具有最少两年的保存期。另一感兴趣的抗BR3制剂包含在9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL二水合柠檬酸钠、0.7mg/mL聚山梨醇酯80以及无菌注射用水中的10mg/mL抗体，pH6.5。另一含水药物制剂包含约pH4.8至约pH5.5(优选pH5.5)的10-30mM的醋酸钠、0.01-0.1％v/v的量的作为表面活性剂的聚山梨醇酯、约2-10％w/v的量的海藻糖以及作为防腐剂的苄醇(U.S.6,171,586)。适于皮下给药的冻干制剂描述在WO 97/04801中。这类冻干制剂可以与合适的稀释剂重新配制成高蛋白浓度，并且重新配制的制剂可以皮下给予待治疗的哺乳动物。
一种用于人源化抗BR3抗体的制剂为在10mM组氨酸、6％蔗糖、0.02％聚山梨醇酯20中的12-14mg/mL抗体，pH5.8。
在具体的实施方案中，抗BR3抗体，尤其是9.1RF、9.1RF(N434突变体)或V3-46s以20mg/mL抗体配制在10mM组氨酸硫酸盐、60mg/ml蔗糖、0.2mg/ml聚山梨醇酯20，以及无菌注射用水中，pH5.8。
如应治疗的适应症所需，这里的制剂还可以含有多于一种活性化合物，优选具有互补活性且相互间无不良影响的那些。例如，可能希望进一步提供细胞毒素剂、化疗剂、细胞因子或免疫抑制剂(例如，作用于T细胞的试剂，如环孢素，或结合T细胞的抗体，如结合LFA-1的抗体)。这类其它试剂的有效量取决于存在于制剂中的抗体量、疾病或病症或治疗的类型、以及以上讨论的其它因素。它们通常以与这里描述的剂量和给药途径相同的方式使用，或者以之前采用的剂量的约1至99％使用。
也可以将活性成分纳入例如通过凝聚技术或通过界面聚合技术制备的微囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微囊和聚甲基丙烯酸甲酯微囊)中、胶体给药系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳状液(macroemulsion)中。这些技术公开在Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)中。
可以制备缓释制剂。合适的缓释制剂的例子包括含有所述拮抗剂的固体疏水聚合物的半通透基质，这些基质为有形物，例如膜或微囊。缓释基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和乙基L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟乙酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(可注射的微球，由乳酸-羟乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成)、以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内给药的制剂必需是无菌的。这可容易地通过滤过无菌过滤膜来完成。
制品和试剂盒 本发明的另一实施方案为含有可用于治疗自身免疫疾病和相关疾病状态以及BR3阳性癌(如非何杰金氏淋巴瘤)的物质的制品。本发明的又一实施方案为含有可用于治疗免疫缺陷疾病的物质的制品。所述制品包括容器和置于容器上或伴随容器的标签或药品说明书。适合的容器例如包括瓶、小瓶、注射器等。这些容器可以从多种材料形成，例如玻璃或塑料。所述容器容纳有有效治疗所述疾病状态的组合物，并且可能具有无菌入口(例如该容器可能为静脉注射溶液袋，或具有皮下注射针可刺入的塞子的小瓶)。所述组合物中的至少一种活性剂为发明的BR3结合抗体。所述标签或药品说明书指明所述组合物可用于治疗特定疾病状态。所述标签或药品说明书进一步包括关于向患者给予抗体组合物的说明。还涉及包含本文描述的联合疗法的制品和试剂盒。
药品说明书指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，含有关于适应症、用法、给药、禁忌症和/或关于使用这种治疗产品的告诫事项。在一个实施方案中，所述药品说明书表明所述组合物可用于治疗非何杰金氏淋巴瘤。
此外，所述制品可以进一步包括包括第二容器，其中包含药物可接受的缓冲剂，如灭菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。其可进一步包括其它从商业和使用者立场来看所需的其它物质，包括其它的缓冲剂、稀释剂、滤器、针和注射器。
还提供了可用于多个目的的试剂盒，例如用于B细胞杀伤测定、作为阳性对照用于凋亡测定、用于从细胞纯化或免疫沉淀BR3。对于分离和纯化BR3，所述试剂盒可含有偶合到小珠(例如琼脂糖小珠)的抗BR3抗体。可提供含有用于在体外例如在ELISA或Western印迹中检测和定量BR3的抗体的试剂盒。如同所述制品，该试剂盒包含容器和置于容器上或伴随容器的标签或说明书。该容器容纳有包含至少一种本发明的抗BR3抗体的组合物。可以包括另外的容器，其含有例如稀释剂和缓冲剂、对照抗体。所述标签或说明书可以提供对所述组合物的描述以及对体外预期或诊断用于的说明。
单克隆抗体 抗BR3抗体可为单克隆抗体。单克隆抗体可通过例如使用杂交瘤方法制备，如Kohler and Milstein，Nature，256495(1975)中所描述的，或可通过重组DNA方法(美国专利4,816,567)制备，或可通过在以下实施例部分描述的方法产生。在杂交瘤方法中，小鼠、仓鼠或其它适合的宿主动物通常被免疫剂免疫，以刺激产生或能够产生特异结合该免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可以在体外被免疫。
所述免疫剂通常包括BR3多肽或其融合蛋白。通常，需要人类细胞时，使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，需要非人哺乳动物来源时，使用脾细胞或淋巴结细胞。随后采用适合的融合剂，如聚乙二醇，使淋巴细胞与永生化的细胞株融合以形成杂交瘤。Goding，MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practice(单克隆抗体原理与实践)(New YorkAcademic Press，1986)，pp.59-103。永生化的细胞株通常为转化的哺乳动物细胞，尤其是啮齿动物、牛、和人类的骨髓瘤细胞。通常采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞株。杂交瘤细胞可在适合的培养基中培养，该培养基含有一种或多种抑制未融合的永生化细胞生长或存活的物质。例如，如果母体细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基典型地包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(“HAT培养基”)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞的生长。
优选的永生化细胞株能有效融合、支持所选择的抗体表达细胞稳定的高水平表达抗体，并且对诸如HAT培养基的培养基敏感。更优选的永生化细胞株为鼠骨髓瘤细胞株，其例如可从Salk Institute CellDistribution Center(索尔克研究所细胞分配中心)，San Diego，California和American Type Culture Collection(美国典型培养物收藏所)，Manassas，Virginia得到。人骨髓瘤和小鼠-人杂种骨髓瘤细胞株也被描述用于产生人单克隆抗体。Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications(单克隆抗体生产技术和应用)(Marcel Dekker，Inc.NewYork，1987)pp.51-63。
然后，可对杂交瘤细胞在其中培养的培养基测定是否存在针对BR3多肽的单克隆抗体。优选地，杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定(如放射免疫测定，RIA，或酶联免疫吸附测定)来确定。这类技术和测定在本领域是已知的。单克隆抗体的结合亲和性例如可通过Munson和Pollard的Scatchard分析法(Anal.Biochem.，107220(1980))确定。
在鉴定所需的杂交瘤细胞后，这些克隆可通过有限稀释程序进行亚克隆，并通过标准方法培养。Goding，如上。出于这种目的的适合培养基例如包括Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基)和RPMI-1640培养基。或者，所述杂交瘤细胞可在哺乳动物体内作为腹水生长。
由所述亚克隆分泌的单克隆抗体可通过常规的免疫球蛋白纯化操作从培养基或腹水中分离或纯化，这些免疫球蛋白纯化操作例如为蛋白A琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
所述单克隆抗体也可通过重组DNA方法制备，例如描述在第4,816,567号美国专利中的那些方法。编码本发明的单克隆抗体的DNA可容易地通过常规操作被分离和测序(例如，通过能够特异结合编码鼠抗体的重和轻链的寡核苷酸探针)。本发明的杂交瘤细胞用作这种DNA的优选来源。一旦分离出来，该DNA可被置于表达载体中，该表达载体随后转染进不产生其它免疫球蛋白的诸如猿COS细胞、中国仓鼠(CHO)细胞或骨髓瘤细胞的宿主细胞，以实现在重组宿主细胞中合成单克隆抗体，。所述DNA可被修饰，例如将编码人重链和轻链恒定区的序列代替同源的鼠序列(美国专利4,816,567；Morrison et al.，如上)，或将非免疫球蛋白多肽的全部或部分序列共价连接到所述免疫球蛋白的编码序列。这种非免疫球蛋白可替换本发明抗体的恒定区，或可替换本发明抗体的一个抗原结合位点的可变区以产生嵌合二价抗体。
所述抗体可为单价抗体。制备单价抗体的方法在本领域是已知的。例如，一种方法涉及重组表达免疫球蛋白轻链和修饰的重链。该重链通常在Fc区的任意位点被截短以便防止重链交联。或者，有关的半胱氨酸残基被其它氨基酸残基替代或被删除以便防止交联。
体外方法可适于制备单价抗体。采用本领域已知的技术可实现消化抗体以产生其片段，尤其是Fab片段。
人和人源化抗体 所述抗BR3抗体可进一步包括人源化抗体或人抗体。人源化形式的非人(例如鼠)抗体为嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2、或抗体的其它抗原结合亚序列)，它们通常含有衍生自非人免疫球蛋白的最小限度序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者CDR的残基被来自诸如小鼠、大鼠或兔的非人物种CDR的具有所需的特异性、亲和性和容量的残基(供者抗体)所替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基所替代。人源化抗体还可包含既不存在于接受者抗体也不存在于引入的CDR或框架序列中的残基。通常，所述人源化抗体包含至少一个、通常两个可变区的几乎全部，其中全部或几乎全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，并且全部或几乎全部FR区为人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体还优选包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区。Jones et al.，Nature，321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature.332323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992)。
一些人源化非人抗体的方法在现有技术中和以下实施例中有描述。通常，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入的”残基，其通常取自“输入的”可变区。根据一个实施方案，人源化可基本上按照Winter及其合作者的方法(Jones et al.，Nature，321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science，2391534-1536(1988))进行，用啮齿动物CDR或CDR序列替代人抗体的对应序列。因此，这种“人源化的”抗体中大大少于完整人可变区的部分被对应的来自非人种类的序列所替代(美国专利4,816,567)。实际上，人源化的抗体通常为人抗体，其中一些CDR残基以及可能还有一些FR残基被来自啮齿动物抗体中相似位点的残基所替代。
作为人源化的替代，可生成人抗体。例如，现在可能产生转基因动物(例如小鼠)，它们在免疫后可在不产生内源免疫球蛋白情况下产生人抗体的所有组成部分。例如，已有报道，在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致完全抑制内源抗体产生。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移进这种种系突变小鼠会导致在抗原激发后产生人抗体。参见，例如Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551(1993)；Jakobovits et al.，Nature，362255-258(1993)；Bruggemann et al.，Year in Immune，733(1993)；美国专利5,545,806，5,569,825，5,591,669(均为GenPharm所有)；5,545,807以及WO97/17852。或者，可通过将人免疫球蛋白基因座位引入内源免疫球蛋白基因被部分地或全部失活的转基因动物(如小鼠)中来制备人抗体。在激发后，在所有方面都观察到近似于在人体中看到的人抗体产生，包括基因重排、装配和抗体所有成分。这种方法例如描述在美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；661,016以及下列科学出版物中Marks et al.，Bio/Technology，10779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature，368856-859(1994)；Morrison，Nature，368812-813(1994)；Fishwild et al.，Nature Biotechnology，14845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology，14826(1996)；Lonberg andHuszar，Intern.Rev.Immunol.，1365-93(1995)。
或者，噬菌体展示技术(McCafferty et al.，Nature 348552-553[1990])可用于在体外从未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)区基因所有组成部分(repertoire)生产人抗体和抗体片段。按照这项技术的一个实施方案，将抗体V区序列框内(in-frame)克隆进丝状噬菌体(如M13或fd)的大或小外壳蛋白基因，并作为功能性抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面。噬菌体展示可以多种形式进行，例如在以下实施例部分所描述的，或在例如Johnson，Kevin S.and Chiswell，David J.，CurrentOpinion in Structural Biology3564-571(1993)中所综述的形式。几个来源的V基因片段可用于噬菌体展示。Clackson et al.，Nature，352624-628(1991)从免疫小鼠的脾来源的V基因小随机组合库分离了大量不同的抗噁唑酮抗体。基本上按照Marks et al.，J.MoI.Biol.222581-597(1991)或Griffith et al.，EMBO J.12725-734(1993)的描述的技术，可构建来自未免疫人供体的V基因所有组成部分，并可分离针对大量不同阵列抗原(包括自身抗原)的抗体。还参见美国专利5,565,332和5,573,905。
如上所述，人抗体也可通过在体外活化B细胞来产生(参见美国专利5,567,610和5,229,275)。人抗体也可采用本领域已知的多种技术来产生，其中包括噬菌体展示库。Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.，222581(1991)。Cole et al.and Boemer et al.的技术也可用于制备人单克隆抗体。Cole et al.Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)和Boemer et al.，J.Immunol.，147(1)86-95(1991)。
多特异性抗BR3抗体 多特异性抗体为单克隆的、优选为人的或人源化的抗体，其具有对两种或多种不同抗原具有结合特异性(例如双特异性抗体具有对至少两种抗原的结合特异性)。例如，一种结合特异性可针对BR3多肽，另一种可针对任何其它抗原。根据一个优选的实施方案，该其它抗原为细胞表面蛋白或受体亚基。例如细胞表面蛋白可以是自然杀伤(NK)细胞受体。因此，根据一个实施方案，本发明的双特异性抗体可结合BR3并结合NK细胞，以及任选地活化NK细胞。
对制备双特异性抗体的方法的实例已有描述。通常，重组产生双特异性抗体基于两免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两重链具有不同的特异性。Milstein and Cuello，Nature，305537-539(1983)。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机配对，这些杂交瘤(细胞杂交瘤)产生10种不同抗体分子的可能的混合物，其中只有1种具有正确的双特异性结构。对正确分子的纯化一般通过亲和层析步骤完成。类似的操作描述在1993年5月13日公开的WO 93/08829以及Traunecker et al.，EMBO J.，103655-3659(1991)中。
具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区可被融合到免疫球蛋白恒定区序列。优选与免疫球蛋白重链恒定区融合，该重链恒定区至少包含铰链区、CH2区和CH3区。优选使含有轻链结合所需的位点的第一重链恒定区(CH1)存在于至少一种融合蛋白中。将编码免疫球蛋白重链融合蛋白的DNA，如果需要，还有编码免疫球蛋白轻链融合蛋白的DNA，插入独立的表达载体中，并共转染进适合的宿主有机体。对于进一步的产生双功能抗体的细节，参见例如Suresh et al.，Methods in Enzymology，121210(1986)。
制备和直接从重组细胞培养物分离双特异性抗体片段的多种技术都已有描述。例如，已采用亮氨酸拉链产生双特异性抗体。Kostelny etal.，J.Immunol.，148(5)1547-1553(1992)。通过基因融合将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽连接到两不同抗体的Fab’部分。抗体同型二聚体在铰链区被还原，以形成单体，然后再氧化形成抗体异型二聚体。这种方法也可用于产生抗体同型二聚体。Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)描述的“diabody(双特异抗体)”技术提供了另一种制备双特异性抗体片段的机制。所述片段包含通过接头连接到VL的VH，该接头过短而使得相同链上的两结构域之间不能配对。因此，一个片段的VH和VL结构域被迫与另一片段的互补VL和VH结构域配对，由此形成两抗原结合位点。也报道了另一使用单链Fv(sFv)二体制备双特异性抗体片段的策略。参见Gruber et al.，J.Immunol.，1525368(1994)。
也涉及高于二价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt et al.J.Immunol.14760(1991)。
杂偶联抗体 杂偶联抗体由两共价连接的抗体组成。例如，这些抗体已被提出用于将免疫系统细胞靶向有害细胞(美国专利4,676,980)并且用于治疗HIV感染。WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089。考虑所述抗体可在体外通过合成蛋白质化学中已知的方法制备，其中包括那些涉及交联剂的方法。举例而言，可采用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键构建免疫毒素。用于这种目的的适合的试剂的例子包括亚氨基硫醇盐和甲基-4-mercaptobutyrimidate以及例如描述在美国专利4,676,980中的那些。
效应功能工程化 需要在效应功能方面对本发明的抗体进行修饰，以便增强例如抗体在治疗癌症中的有效性。例如，可将半胱氨酸残基引入Fc区，由此使得在该区域形成链内二硫键。由此产生的同源二聚体抗体具有改进的内化能力和/或增强的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。参见Caron et al.，J.Exp.Med.，1761191-1195(1992)和Shopes，J.Immunol.，1482918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同源二聚体抗体也可采用杂双功能交联剂来制备，如Wolff et al.，Cancer Research，532560-2565(1993)中所述。或者，抗体可被工程化，以具有双Fc区域，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson et al.，Anti-Cancer Drug Design，3219-230(1989)。
可在Fc区域序列中产生突变或改变以改善FcR结合(例如FcgammaR，FcRn)。根据一个实施方案，本发明的抗体具有至少一种改变的效应功能，其选自ADCC、CDC和与天然IgG或母体抗体相比改进的FcRn结合。几个有益的特异性突变的例子例如描述在Shields，RL et al.(2001)JBC 276(6)6591-6604；Presta，L.G，(2002)BiochemicalSociety Transactions 30(4)487-490；以及WO公开号WO 00/42072。
根据一个实施方案，Fc受体突变为在以下至少一个位置处的置换，所述位置选自位于Fc区的238，239，246，248，249，252，254，255，256，258，265，267，268，269，270，272，276，278，280，283，285，286，289，290，292，293，294，295，296，298，301，303，305，307，309，312，315，320，322，324，326，327，329，330，331，332，333，334，335，337，338，340，360，373，376，378，382，388，389，398，414，416，419，430，434，435，437，438或439，其中Fc区中的残基编号遵循EU编号系统。根据一个具体实施方案，所述置换为选自N434A、N434F、N4343Y和N434H的434残基置换。根据另一实施方案，所述置换为D265A/N297A突变。根据另一实施方案，所述置换为S298A/E333A/K334A或S298A/K326A/E333A/K334A。根据另一实施方案，所述置换为K322A。
天然序列人IgG Fc区序列的例子，humIgG1(非A和A同种异型)(分别为SEQ ID NOs133和135)、humIgG2(SEQ ID NO136)、humIgG3(SEQ ID NO137)以及humIgG4(SEQ ID NO138)之前已有描述。天然序列鼠IgG Fc区序列的例子，murIgG1(SEQ ID NO139)、murIgG2A(SEQ ID NO140)、murIgG2B(SEQ ID NO141)以及murIgG3(SEQ ID NO142)之前已有描述。
免疫偶联物 本发明还涉及免疫偶联物，其包含偶联到细胞毒素剂的抗体，所述细胞毒素剂例如为化疗剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶联物)。
可用于产生这类免疫偶联物的化疗剂在上文已有描述。可用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲菌素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、Phytolacaamericana蛋白(PAPI、PAPII、以及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、泻果素、巴豆毒素、sapaonaria officinalis抑制剂、白树毒素、米托洁林(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素以及镰刀菌毒素(tricothecene)。多种放射性核素可用于产生放射偶联的抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y以及186Re。
可用多种双功能蛋白偶合剂来制备抗体和细胞毒素剂的偶联物，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、硫醇亚胺(IT)、亚胺酯类的双功能衍生物(例如二甲基adipimidate HCl)、活性酯类(例如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛类(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮基衍生物(例如双-(对重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯类(例如甲苯2，6-二异氰酸酯)、以及双活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可按Vitetta et al.Science，2381098(1987)中的描述来制备。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于偶联放射性核素到抗体的示例性螯合剂。参见WO 94/11026。
在另一实施方案中，所述抗体可被偶联到“受体”(例如链亲和素)用于肿瘤预靶向，其中抗体-受体偶联物被给予患者，然后使用清除剂从循环中除去未结合的偶联物，接着给予偶联到细胞毒素剂(例如放射性核素)的“配体”(例如抗生物素蛋白)。
免疫脂质体 本文公开的抗体也可配制为免疫脂质体。含有抗体的脂质体可通过本领域已知的方法制备，这些方法例如描述在Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823688(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774030(1980)；以及美国4,485,045和4,544,545。在美国专利5,013,556中公开了具有延长的循环时间的脂质体。
尤其有用的脂质体可通过反相蒸发方法产生，其脂质组合物包含磷脂酰胆碱、胆固醇、以及PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)。从具有定义孔径的滤器中滤出脂质体以产生具有期望直径的脂质体。可依Martin et al.，J.Biol.Chem.，257286-288(1982)中描述的方法通过二硫化物互换反应将本发明抗体的Fab’片段偶联至脂质体。该脂质体中任选地含有化疗剂(例如多柔比星)。参见，Gabizon et al.，J.NationalCancer Inst.，81(19)1484(1989)。
抗体和多肽的药物组合物 能够以以下的药物组合物的形式给予本文鉴定的特异性结合BR3多肽的抗体、以及使用上文中公开的筛选实验鉴定的其它分子来治疗上述的多种病症。
Lipfectins(脂转染剂)或脂质体能够被用于将多肽和抗体或本发明的组合物输送至细胞。当使用抗体片段时，优选与靶蛋白结合区域特异性结合的最小抑制片段。例如，根据抗体的可变区序列，能够设计保持结合靶蛋白序列能力的肽分子。能够化学合成和/或通过重组DNA技术产生这样的肽。例如参见Marasco et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，907889-7893(1993)。
本文所述的制剂还能够包含待治疗的具体适应症所需的多于一种的活性化合物，优选地，所述活性化合物具有补充活性，该补充活性不具有相互间的不良反应。或者或此外，组合物能够包含加强其功能的剂，例如细胞毒性剂、化疗剂或生长抑制剂。这样的分子适于以有效达到期望目的的量出现在组合中。
还能够将活性成分纳入在制备的微囊中，例如通过在胶体药物输送系统中(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米型胶囊)或粗乳状液中分别使用羟甲基纤维素或明胶微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊的凝聚技术或通过界面聚合法。上述的Remington’sPharmaceutical Sciences公开了这样的技术。
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这易于通过使用无菌过滤膜进行过滤来完成。
能够制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质是有形物，例如膜或微囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和L-谷氨酸-γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羟乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)的可降解的乳酸-羟乙酸共聚物以及聚-D-(-)-3-羟丁酸。虽然诸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-羟乙酸的聚合物能够持续超过100天释放分子，但是某些水凝胶持续更短的时间释放蛋白质。当被包被的抗体在体内长时间停留时，在37℃下暴露于水分中的结果是它们能够变性或凝聚，这导致生物活性的丧失和免疫原性可能的改变。根据所涉及的机理能够设计合理的策略用于稳定化。例如，如果发现聚集机理是通过硫-二硫化物交换形成分子间S-S键，那么能够通过修饰巯基残基、冻干酸性溶液、控制水分含量、使用合适的添加剂以及开发特殊的聚合物基质组合物来实现稳定化。
诊断用途与成像 与BR3特异性结合的标记抗体及其衍生物和类似物能够被用于诊断目的以检测、诊断或监测与本发明的多肽的表达、异常表达和/或活性相关的疾病和/或病症。根据一优选实施方案，在涉及向个体中注射抗BR3抗体的诊断分析或成像分析中使用的抗BR3抗体是不阻断BAFF和BR3之间相互作用或仅部分阻断BAFF和BR3之间相互作用的抗体。本发明提供检测BR3多肽异常表达，其包括(a)使用一种或多种本发明的抗体测定个体细胞或体液中BR3多肽的表达以及(b)将基因表达水平与标准基因表达水平对照，借此与标准表达水平相对照，测定的基因表达水平的增高或降低表示异常表达。
本发明提供使用本发明的抗BR3抗体或多肽用于诊断待治疗病症的诊断分析，其包括(a)使用本发明的抗体测定个体细胞或体液中BR3多肽的表达，(b)将BAFF基因表达水平与标准基因表达水平对照，借此与标准表达水平相对照，测定的基因表达水平的增高或降低以及体液或病症组织中BR3多肽的存在表示欲用抗BR3抗体或多肽治疗的病症。关于癌症，个体活组织中BR3的存在或BR3转录相对较高的量可以表明疾病发生的素因，或者可以在出现实际临床症状之前提供鉴定疾病的手段。这种更加确定的诊断允许保健专家早期利用预防措施或积极疗法，从而预防癌症的发生或进一步的进展。
使用本领域技术人员公知的传统免疫组织学方法，本发明的抗体能够被用于分析生物样品中的蛋白质水平(例如参见Jalkanen，et al.，J.Cell.Biol.101976-985(1985)；Jalkanen，et al.，J.Cell.Biol.1053087-3096(1987))。其它用于检测蛋白质基因表达的基于抗体的方法包括免疫分析，例如酶联免疫吸附分析(ELISA)和放射免疫分析(RIA)。本领域已知合适的抗体分析标记物，其包括酶标记物，例如葡糖氧化酶；放射性同位素，例如碘(131I、125I、123I、121I)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，铟(115mIn、113mIn、112In、111In)和锝(99Tc、99mTc)，铊(201Ti)，镓(68Ga，67Ga)，钯(103Pd)，钼(99Mo)，氙(133Xe)，氟(18F)，153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru；鲁米诺以及荧光标记物，例如荧光素和若丹明，以及生物素。
本领域已知的技术可以用于标记本发明的抗体。这样的技术包括但不限于使用双工能的偶联剂(例如参见美国专利第5,756,065、5,714,631、5,696,239、5,652,361、5,505,931、5,489,425、5,435,990、5,428,139、5,342,604、5,274,119、4,994,560和5,808,003号，以参考的方式引入每一专利的全部内容)。
动物，优选哺乳动物并且最有选人类中BR3分子表达或异常表达相关的疾病或病症的诊断能够包括测定哺乳动物BR3分子的步骤。在一实施方案中，诊断包括(a)向哺乳动物分别给予(例如肠胃外、皮下或腹膜内)有效剂量的标记的抗BR3抗体或多肽，所述标记的抗BR3抗体或多肽与BR3分子特异性结合；(b)给药后等待一段时间间隔，使得标记分子优先在个体表达BR3分子的位点处聚集(并且对于未结合的标记分子，被清除至背景水平)；(c)确定背景水平；以及(d)测定个体中的标记分子，从而高于背景水平的标记分子的测定表明个体患有与BR3表达或异常表达相关的特定疾病或病症。能够通过多种方法确定背景水平，包括将被测定的标记分子的量与先前确定的特定体系的标准值相对比。根据具体实施方案，本发明的抗体被用于定量或定性B细胞系的细胞或单核细胞系的细胞浓度。
根据一具体实施方案，通过评价细胞表面上存在的BR3水平或细胞分泌的BR3水平(例如通过使用抗BR3抗体或抗BAFF抗体；FACS分析等)，在诊断或预后分析中确定BR3多肽表达或过表达。或者或此外，可以测量细胞中编码BR3多肽的核酸或mRNA的水平，例如通过荧光原位杂交，其使用对应于编码BR3的核酸或其互补序列的基于核酸的探针；(FISH；参见1998年10月公开的WO 98/45479)，Southern印迹，Northern印迹或多聚酶链式反应(PCR)技术，例如实时定量PCR(RT-PCR)。还能够通过测量诸如血清的生物液体中脱落的抗原，例如使用基于抗体的分析(例如参见1990年6月12日授权的美国专利第4,933,294号；1991年4月18日公开的WO 91/05264；1995年3月28日授权的美国专利第5,401,638号以及Sias et al.，J.Immunol.Methods 13273-80(1990))研究BR3分子或BAFF分子过表达。除了上述测定以外，本领域技术人员可以获得多种体内分析。例如，能够将哺乳动物机体中的细胞暴露于抗体，该抗体被可检测的标记任选地标记，所述可检测的标记例如放射性同位素，并且能够评价抗体与哺乳动物细胞的结合，例如通过外部扫描放射性强度或通过分析取自之前暴露于抗体的哺乳动物的活组织。
分析 本发明的激动性抗BR3抗体被用于直接刺激BR3的生物学途径但是并不刺激TACI或BCMA受体的途径(即“BR3特异性的”)。这样的激动性抗体能够被用于鉴别BR3特异性信号途径的下游标志物。因此，鉴别BR3途径的下游标志物的分析能够包括向在其表面上表达BR3的细胞给予激动性BR3结合、BR3特异性抗体或多肽，以及测定细胞的基因表达(例如微阵列或ELISA测定)或细胞的蛋白质活性变化的步骤。根据本发明的另一实施方案，激动性抗体能够被用于筛选BR3途径特异性抑制剂。所述筛选方法能够例如包括向在其表面上表达BR3的细胞给予激动性BR3结合、BR3特异性抗体或多肽，向所述细胞给予候选化合物以及确定所述候选化合物是否抑制了细胞的增殖或细胞的存活或上述二者的步骤。
因此以参考的方式引入本文引用的所有出版物(包括专利和专利申请)的全部内容，包括2004年12月31日提交的美国临时专利申请第60/640,323号。
下列DNA序列根据布达佩斯条约的条款保藏于位于10801University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，USA的美国典型培养物保藏中心，保藏内容具体如下 拉料保藏号 保藏日期 Hu9.1-RF-H-IgG PTA-63152004年11月17日 Hu9.1-RF-L-IgG PTA-63162004年11月17日 Hu2.1-46.DANA-H-IgG PTA-63132004年11月17日 Hu2.1-46.DANA-L-IgG PTA-63142004年11月17日 HuV3-46s-H-IgG PTA-63172004年11月17日 HuV3-46s-L-IgG PTA-63182004年11月17日 鼠类B细胞12B 12.1 PTA-66242005年3月3日 鼠类B细胞3.1 PTA-66222005年3月3日 根据《(国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约》(布达佩斯条约)进行了本文的保藏。这确保从保藏日起30年保存保藏物的活培养物。根据布达佩斯条约的条款以及Genentech，Inc.与ATCC的协议，从ATCC可以得到所述保藏物，所述协议保证根据授权的相关美国专利或者根据任何对公众公开的美国或国外专利申请，公众永久地并且不受限制地得到保藏物培养物的后代，并且保证根据35 U.S.C.122并依据局长细则(包括特别参考886 OG 638的37 C.F.R.1.14)授权美国专利商标局局长所确定的人员可以得到所述后代。
本申请的受让人已经同意，如果当合适的条件下进行培养时，保藏材料的培养物死亡或丢失或损毁，那么应该通知使用相同的材料立即进行替换。保藏材料的可获得性不应被理解为允许违背政府根据其专利法所授予的权利而实施本发明。
除非另有说明，根据制造商的说明使用实施例中提及的商业上可以得到的试剂。下列实施例和整个说明书中由ATCC编号鉴别的细胞来源是位于Manassas，VA的美国典型培养物保藏中心。除非另有说明，本发明使用重组DNA技术的标准步骤，例如上文所述的以及下列教科书中所述的上文引用的Sambrook et al；Ausubel et al，CurrentProtocols in Molecular Biology(现代分子生物手册)(Green PublishingAssociates and Wiley Interscience，N.Y.，1989)；Innis et al，PCRProtocolsA Guide to Methods and Applications(PCR实验方案方法与应用的指南)(Academic Press，Inc.N.Y.，1990)；Harlow et al，AntibodiesA Laboratory Manual(抗体实验室手册)(Cold Spring Harbor PressCold Spring Harbor，1988)；Gait，Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸的合成)(IRL PressOxford，1984)；Freshney，Animal Cell Culture(动物细胞培养物)，1987；Coligan et al.，Current Protocols in Immunology(免疫学的通用实验方案)，1991。
在本说明书和权利要求中，应该将词语“包含(comprise)”或其变化，例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”理解为其意味着包括所述整体或整体组，但是不排除任何其它整体或整体组。
上述书面描述被认为足以使本领域技术人员实施本发明。仅仅是为了说明的目的提供下列实施例，并且并不意味着以任何方式限制本发明的范围。事实上，除了那些本文显示的和描述的以外，通过上述描述本发明的各种变化对本领域技术人员是明显的并且落入所附权利要求的范围之内。
实施例 实施例1-材料 从利用聚集的人BR3-Fc免疫的小鼠中产生结合BR3的鼠单克隆抗体。这些抗体包括从杂交瘤产生的称为11G9，8G4，7B2，1E9，12B12，1E9，1A11，8E4，10E2和12B12的那些抗体。称为2.1和9.1的产生鼠单克隆抗体的杂交瘤为已知的(International Patent Application PCT/US01/28006(WO 02/24909))并保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号分别为ATCC NO.3689和ATCC NO.3688(10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，USA)。B9C11抗体为仓鼠抗小鼠BR3抗体，其对鼠BR3特异但不结合人BR3，以及来自杂交瘤3.1的抗体，均从Biogen Idee，Inc.公司获得。
在Pioneer肽合成仪(PE Biosystems)上采用标准Fmoc化学合成作为C-末端氨基化合物的小BR3(miniBR3)肽(TPCVPAECFDLLVRHCVACGLLR(SEQ ID NO150)。通过5％三异丙基硅烷的TFA溶液室温处理1.5-4小时从树脂中切除肽。通过旋转蒸发去除TFA后，加入乙醚来沉淀肽，随后，用反相HPLC(乙腈/H2O/0.1％TFA)纯化。通过电喷雾质谱来证实肽的身份。冻干后，用HPLC纯化氧化的肽。利用NH4OH将含有还原的小BR3的HPLC组分的pH调节至约9；随后通过加入少量过量的K3Fe(CN)6以在半胱氨酸24和35间形成二硫化合物，并用HPLC来纯化氧化的肽。通过用少量过量的I2对HPLC洗出液处理约4h去除Acm基团(有另一二硫化合物伴随形成)。分析HPLC来监测氧化的进程，并用HPLC来再次纯化终产物。当在树脂上时，小BR3在氨末端被生物素化，随后如上所述来准确地去除和纯化得到未修饰的肽。
通过将其序列亚克隆至pET32a表达载体(Novagen)，在细菌中产生人BR3胞外区(hBR3-ECD)和小鼠BR3胞外区(mBR3-ECD)构建体，产生与随后是肠激酶蛋白酶位点的N-末端硫氧还原蛋白(TRX)-His-标签的融合。使E.coli(大肠杆菌)BL21(DE3)细胞(Novagen)生长在30℃并用IPTG诱导蛋白表达。通过Ni-NTA(Qiagen)柱子来纯化TRX-BR3，用咪唑梯度来洗脱，并用肠激酶(Novagen)来切除。在S-Sepharose柱上纯化BR3，在PBS，pH7.8，含有3mM氧化和1mM还原的谷胱甘肽中重折叠过夜，用PBS透析，在MonoS柱子上再纯化，浓缩，并透析入PBS中。所用的人BR3胞外序列为 MRRGPRSLRGRDAPAPTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLRTPRPKPAGASSPAPRTALQPQE(SEQ ID NO151)。小鼠胞外序列为 MGARRLRVRSQRSRDSSVPTQCNQTECFDPLVRNCVSCELFHTPDTGHTSSLEPGTALQPQEGS(SEQ DD NO152)。
如以往所述(Pelletier，M.，et al.，(2003)J.Biol.Chem.278，33127-33133)在中华仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中产生人和小鼠BR3-Fc蛋白。小鼠BR3-Fc序列mBR3-Fc)最初描述在Yan et al.，(2001)CurrentBiology 11，1547-1552中。小鼠BR3-Fc序列为MSALLILALVGAAVASTGARRLRVRSQRSRDSSVPTQCNQTECFDPLVRNCVSCELFHTPDTGHTSSLEPGTALQPQEGQVTGDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO153)。变体人BR3-Fc融合体(vBR3-Fc)通常与Fc融合蛋白有关，包括天然产生的人BR3序列的ECD序列的变体序列，该变体同样结合BAFF并且具有低于天然人BR3序列的聚集的倾向。
可根据已有描述(Gordon，N.C，et al.，(2003)Biochemistry 42，5977-5983)表达和纯化本文所用的人BAFF。将编码BAFF残基82-285的DNA片段克隆至pET15b(Novagen)表达载体，产生与随后是凝血酶切位点的N-末端His-标签的融合。在37℃，在含50mg/L羧苄青霉素的LB培养基中将E.coli BL21(DE3)(Novagen)培养物生长为中对数期，随后在用1.0mM IPTG诱导前冷却至16℃。12小时进一步生长后利用离心来收集细胞并储存在-80℃。将该细胞沉淀重悬在50mM Tris，pH8.0，和500mM NaCl中并在冰上超声破碎。离心后，将上清液加载到Ni-NTA琼脂糖柱子上(Qiagen)。用50mM Tris，pH8.0，500mM NaCl，和20mM咪唑洗涤该柱子，随后用步进梯度在含有250mM咪唑的相同的缓冲液中洗提。合并含BAFF的馏分，加入凝血酶，在4℃用20mM Tris，pH8.0，和5mM CaCl2透析样品过夜。在monoQ(Pharmacia)柱子最终在S-200体积排阻柱上在20mM Tris，150mM NaCl和5mM MgCl2中进一步纯化蛋白。
在一些实验中，使用杂种BAFF分子。该杂种BAFF分子包括重组融合至小鼠BAFF残基128-309的N-末端的人BAFF残基82-134。该重组蛋白在细菌中表达并如上所述进行纯化。添加人的序列有助于mBAFF蛋白的表达。在另外一些实验中，表达在CHO细胞中的人BAFF用于B细胞增殖测定。
实施例2-竞争ELISA测定 采用竞争ELISA测定来检测抗-BR3抗体对人BR3胞外区和小BR3的相对亲和性。在一些实验中，生物素化的BR3-ECD对吸附在微滴定板(Nunc MaxiSorp)小孔上的抗体的结合被未标记的BR3-ECD或小BR3竞争。在室温下与10倍摩尔过量的硫代-NHS-生物素(Pierce)反应2小时来生物素化BR3-ECD。在室温下、在包被缓冲液(50mM碳酸钠，pH9.6)中以5μg/mL包被抗体2小时，随后用PBS/0.05％Tween-20/2.5％(重量/体积)的脱脂奶粉来封闭1小时。确定用链亲和素-HRP测定后在492nm产生约1.0的吸光度所需的生物素-BR3-ECD的含量。对于单克隆抗体Mab3.1和12B12，所需生物素-BR3-ECD的浓度为5nM，对于8G4和11G9，其为2nM，对于2.1和9.1，该生物素-BR3-ECD的浓度为200pM。制备含有这些生物素-BR3-ECD浓度的溶液和不同浓度的未标记的BR3-ECD或小-BR3并加入到由抗体包被的微滴定板的各孔中。摇动孵育2小时后，倒出溶液，用PBS/.05％Tween-20冲洗小孔6次。加入链亲和素-HRP(0.5μg/mL)，摇动孵育30分钟，随后清空小孔并如上洗涤。通过加入含PBS、0.01％过氧化氢和0.8mg/mL邻苯二胺的溶液测定结合的HRP。生色20分钟，并随后通过添加等体积的1 M磷酸终止反应。在平板阅读仪(Thermo LabSy stems)上检测492nm的吸光度。通过采用四参数等式(1)来确定生物素-BR3-ECD结合抑制的IC50来分析作为竞争剂浓度的函数的吸光度 (1)((m1-m4)/(1+(m0/m3)＾m2))+m4 其中m1为无竞争剂时的吸光度，m4为无穷大的抑制剂浓度时的吸光度，m0为竞争剂浓度，以及m3为IC50值。
表3. 2.1、9.1、8.G4和11G9结合的26残基小BR3具有与全长BR3胞外区类似的亲和性(表3)。如以下所示，这些抗体也阻断BR3对BAFF的结合。不结合小BR3的3.1和12B12抗体，同样也不阻断BAFF-BR3间的相互作用。
实施例3-人源化抗体 (a)材料与方法 根据Kabat(Kabat et al.，Sequences of proteins of immunologicalinterest，5th Ed.，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))指定以下所提及的残基数目。使用单字母氨基酸缩写。利用IUB密码表示DNA兼并密码(N＝AICIGIT，D＝A/G/T，V＝AJCIG，B＝C/G/T，H＝A/C/T，K＝G/T，M＝A/C，R＝A/G，S＝G/C，W＝A/T，Y＝C/T)。
将高变区直接嫁接在接受者人共有框架上- 将来自鼠2.1、11G9和9.1的VL和VH区与人共有κI(huKI)和人亚组III共有VH(huEI)区比对。为产生CDR嫁接物，采用huKI和接受者VH框架，其在3个位点不同于人亚组III共有VH区R71A、N73T和L78A(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 894285(1992))。参见图1-3中的粗体字母。将来自鼠2.1(mu2.1)、11G9(mul 1G9)和9.1(mu9.1)抗体的高变区工程化入接受者人共有框架以产生直接CDR-嫁接物(2.1嫁接物，11G9嫁接物和9.1嫁接物)(图1-3)。在VL区，以下区域被嫁接到人共有接受者位置24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)(Kabat编号系统)。在VH区，嫁接位置26-35(H1)、49-65(H2)和94-102(H3)(Kabat编号系统)(图1-3)。MacCallum等人(MacCallum et al.J. Mol.Biol.262732-745(1996))已经分析了抗体和抗原复合体晶体结构并发现重链的位置93和94为部分接触区，因此当人源化抗体时，在CDR-H3的定义中包括这些位置似乎是有理由的。编码嫁接的CDR-人框架序列的核酸序列被包含在噬菌粒中。该噬菌体为单价Fab-g3展示载体并包括在phoA启动子控制下的2个开放阅读框。第一个开放阅读框由融合至接受者轻链的VL和CH1区的stII信号序列组成，第二个由融合至接受者重链的VH和CH1区的stII信号序列组成，随后是小噬菌体外壳蛋白P3。
对于每一高变区利用单独的寡核苷酸通过Kunkel突变来产生直接嫁接物变体。通过DNA测序来评价正确的克隆。
高变区的软随机化-对于每一嫁接的抗体，利用软随机化策略向每一高变区引入序列变异，该策略能够维持向鼠高变区的偏好。这可通过首次由Gallop et al.，J.Med.Chem.371233-1251(1994)描述的中毒寡核苷酸合成策略来实现。对于欲突变的高变区中的给出位置，利用70-10-10-10的核苷酸混合物来使编码野生型氨基酸的密码中毒，可产生在每一位置的平均50％的突变率。
软随机化寡核苷酸在鼠高变区序列后设置并包括由直接高变区嫁接物定义的相同区域。利用密码RGC，将位于VH区中的H2(位置49)起始的氨基酸限定为序列变异A，G，S或T。
噬菌体文库的产生-为每一高变区设计的随机化寡核苷酸池在6次20μl的反应中分别磷酸化，该反应含660ng的寡核苷酸，50mM Tris pH7.5，10mM MgCl2，1mM ATP，20mM DTT和5U多聚核苷酸酶，在37℃进行1小时。随后将该6个磷酸化寡核苷酸池与20μg的50mM Tris pH7.5，10mM MgCl2中的Kunkel模板混合，其终体积为500μl，寡核苷酸对模板的比值为3。在90℃、4分钟，50℃、5分钟将该混合物退火，随后在冰上冷却。通过QIAQUICK PCR纯化试剂盒(Qiagen kit 28106)去除过量的非未退火的寡核苷酸，其中利用改良的方案来防止退火的DNA的过度变性。向500μl的退火混合物中，加入150μl的PB，将该混合物分入2个硅胶柱子中。用750μl的PE洗涤每一柱子并用超旋转来干燥柱子后，利用110μl的10mM Tris，1mM EDTA，pH8洗脱每一个柱子。随后加入1μl 100mM ATP，10μl 25mM dNTPs(每一种dATP，dCTP，dGTP和dTTP为25mM)，15μl100mM DTT，25μl 10X TM缓冲液(0.5M Tris pH7.5，0.1M MgCl2)，2400 UT4连接酶和30UT7聚合酶在室温进行3小时来填满退火和清洁的模板(220μl)。
在Tris-醋酸-EDTA/琼脂糖凝胶(Sidhu et al.，Methods in Enzymology328333-363(2000))上分析填满的产物。通常可见三个条带底端条带为正确的填满并被连接的产物，中间条带为填满但未被连接的的条带，顶端的条带为取代链。顶端的条带是T7聚合酶的固有的副作用产生的并很难避免(Lechner et al.，J.Biol.Chem.25811174-11184(1983))；但是，此条带转化效率低于顶端条带的30倍，并通常对文库没有贡献。中间的条带是由于缺乏用于最终连接反应的5’磷酸而产生的；此条带有效地转化，遗憾的是主要产生野生型序列。
随后清洗该填满的产物并提供电穿孔引入SS320细胞，根据Sidhu etal.，Methods in Enzymology 30 328333-363(2000)所述在有M13/KO7辅助噬菌体存在下增殖。文库大小为1-2×109独立克隆。测序起始文库中的随机克隆来评价文库的质量。
噬菌体的筛选-人BR3ecd或变体BR3-Fc融合体(vBR3-Fc)用作噬菌体筛选的靶标(Kayagaki et al.Immunity 17515-524(2002)and Pelletier etal.J.Biol.Chem.27833127-33133(2003))。将PBS中的10μg/ml BR3ecd或vBR3-Fc包被在MaxiSorp微滴定板上(Nunc)。对于第一轮筛选，采用8个小孔的靶标；单个小孔的靶标用于后续的筛选。利用酪蛋白封闭剂(Casein Blocker，Pierce)来封闭小孔1小时。从培养上清液中收集噬菌体并悬浮在含1％BSA和0.05％Tween 20(PBSBT)的PBS中。对小孔结合2小时后，通过过量的含0.05％Tween 20(PBST)的PBS洗涤来去除未结合的噬菌体。通过将小孔与50mM HCl，0.5M KCl孵育30分钟洗脱结合的噬菌体。利用Top 10细胞和M13/KO7辅助噬菌体扩增噬菌体并在37℃、在2YT，50μg/ml carbenacillin中增长过夜。比较从包被的小孔中洗脱的噬菌体滴度与从靶标未包被的小孔中恢复的噬菌体滴度来评价富集作用。
还利用溶液分选方法(solution sorting method)(Lee，C.V.，et al.(2004)J.Mol.Biol 340(5)1073-93)将噬菌体文库分选。利用硫代-NHS-LC-生物素(Pierce)(b-vBR3-Fc)将vBR3-Fc生物素化。在4℃用10μg/ml PBS中中性链亲和素(neutravidin)包被微滴定小孔过夜，并随后利用酪蛋白封闭剂(Pierce)封闭1小时。利用标准板分选方法通过固化的vBR3-Fc来进行第一轮淘洗(panning)。对于第二轮筛选，将200μl悬浮在含0.05％Tween20(PBST)和1％BSA的PBS中的噬菌体与100nM b-vBR3-Fc混合2小时。将结合了b-vBR3-Fc的噬菌体捕获到中性链亲和素包被的小孔5分钟，并用PBST洗除未包被的噬菌体。利用100mM HCl洗脱噬菌体30分钟，中和，并在含有KO7辅助噬菌体(New England Biolabs)的XL1蓝细胞(blue cell，Strategene)中增殖。类似地进行后续轮次的筛选，除了以下不同在第3轮中，b-vBR3-Fc终浓度为20nM，在第4和5轮中，b-vBR3-Fc终浓度为1nM。在第5轮中建立噬菌体结合1h后，在中性链亲和素上捕获之前，将1μM未生物素化的vBR3-Fc加入到该混合物中孵育64h。
噬菌体ELISA-用10μg/ml PBS中的人vBR3-Fc包被MaxiSorp微滴定板过夜随后用酪蛋白封闭剂(Pierce)封闭。将来自培养上清液中的噬菌体与在含1％BSA PBST中系列稀释的vBR3-Fc在组织培养微滴定板中孵育1h，之后，将80μl的混合物转移至靶包被的小孔中15分钟，以捕获未结合的噬菌体。用PBST洗涤该板并加入HRP结合的抗-M13(Amersham Pharmacia Biotech)(在含1％BSA的PBST为1∶5000)40分钟。用PBST洗涤该板通过加入四甲基联苯胺底物来生色(Kirkegaard andPerry Laboratories，Gaithersburg，MD)。将405nm的吸光度作为溶液中的靶标的浓度函数来作图，来确定IC50。这用作展示在噬菌体表面上的Fab克隆的亲和性评估。
Fab产生与亲和性测定 为表达用于亲和性检测的Fab蛋白，将中止密码引入到噬菌体载体中的重链与g3之间。将克隆转化入E.coli 34B8细胞，并在30℃在AP5培养基中生长(Presta et al.Cancer Res.574593-4599(1997))。通过离心收集细胞，悬浮在10mM Tris，1mM EDTA pH8并用微流体仪(microfluidizer)破裂细胞。利用蛋白G亲和层析来纯化Fab。利用BIAcoreTM-2000通过表面等离子体共振进行亲和性测定。将vBR3-Fc或hBR3ecd在10mM醋酸pH4.5(分别为220或100反应单位(RU))固化在CM5传感器芯片上，并且注入Fab在PBST中的系列2倍稀释液(6.25至100nM)。用2分钟结合(association)和20分钟解离(dissociation)来分析每一样品。每次注射后利用10mM Glycine pH1.5再生该芯片。通过从空白流细胞减去RU来校正结合反应。将kon和koff的同时拟合的1∶1 Languir模型用于动力学分析。
(b)结果与讨论 2.1、11G9和9.1的人源化-用于人源化的人接受者框架是基于用于Herceptin_抗体的框架并由共有人κIVL区和人亚组III共有的VH区组成。该变体VH区具有3来自人共有R71A、N73T和L78A的三个改变。每一鼠2.1、11G9和9.1的VL和VH区均与人κI和亚组III区比对；鉴定每一互补决定区(CDR)并嫁接入人接受者框架以产生CDR嫁接物，其可在噬菌体上以Fab展示。当检测噬菌体展示2.1、11G9或9.1 CDR嫁接物对固化vBR3-Fc的结合时，观察到低的结合亲和性。
对每一抗体产生CDR修复文库，其中每一CDR嫁接物的CDR区被软随机化。每一CDR嫁接物文库针对固化的vBR3-Fc淘洗进行四轮的筛选。仅观察到对应9.1的CDR嫁接物的富集。挑选克隆用于DNA测序分析并显示靶定在CDR-L2和CDR-H1(图4)的序列变化。利用vBR3-Fc噬菌体ELISA来筛选克隆，并且所选克隆利用表达的Fab蛋白通过Biacore进一步分析。相对于嵌合9.1 Fab，两个克隆9.1-70和9.1-73显示改进的对vBR3-Fc的结合(图10)。
因为利用CDR修复，没有将结合募集在2.1-嫁接物和11G9-嫁接物上，我们观察了鼠和接受者框架的不同。有趣的是，在位置71和78，2.1和11G9以及9.1比我们最初使用的接受者框架更类似人共有亚组III序列(图5)。这促使我们来利用2个新框架“RL”和“RF”探讨CDR修复。这些框架不同于受者框架，因为存在于共有序列中的R71被恢复，并且位置78被改变为共有亮氨酸(RL)或通过引入苯丙氨酸(RF)在该位置被修饰成类似鼠的框架。这些框架的改变导致2.1和11G9噬菌体结合vBR3-Fc的适度改善。嫁接到RL或RF框架的9.1 CDR(9.1-RL或9.1-RF)的结合显著改善(图6)。
如上述，利用软随机化策略，同时在用于每一抗体/框架嫁接物(2.1-RL，2.1-RF，351 1G9-RL，11G9-RF，9.1-RL和9.1-RF)的6个CDR的每一个，产生的CDR修复文库。对于这些筛选，采用溶液分选方法来增强基于亲和性的噬菌体筛选方法效率。通过操纵生物素化靶标的浓度，减少噬菌体捕获时间，来降低背景，并且未生物素化靶标的加入可去除具有更快解离率的克隆，优先选择高亲和性的克隆(Lee，C.V.，et al.J.MoI.Biol.(2004)340(5)1073-93)。根据以上在方法中的描述，利用b-vBR3-Fc独立分选12个文库。
5轮筛选后，分析来自每一文库的单独克隆的DNA序列。利用vBR3-Fc噬菌体ELISA筛选克隆，并进一步通过BIAcore表面等离子体共振(SPR)利用表达的Fab蛋白来分析所选择的克隆。几个克隆被鉴定为具有相当或超过嵌合抗体的单体亲和性的BR3结合亲和性。对于9.1-RL和9.1-RF文库，序列改变再次集中在CDR-H1，表明此CDR的重新设计对抗原结合的恢复是重要的(图8)。特别是，突变M34I常包括在不同的克隆中。在CDR-H1中其它的常见改变包括A31G和T28P，尽管无数的CDR-H1中的其它取代表现为较好的耐受。这些结果清楚地表明，存在有能够修复嫁接到人框架上的9.1亲和性的多序列改变，以及可以通过框架改变(例如9.1-RF)或CDR修复(例如9.1-70和9.1-73)来人源化此抗体，产生超过原始的鼠抗体的亲和性的亲和性。
对于11G9文库，当采用11G9-RF作为模板用于CDR修复文库时才观察到富集，其中在CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3观察到序列改变(图8)。但是2个最高的亲和性克隆的每一个具有与CDR-H3类似的改变；两个克隆均包括D96N、G97D和W100L的改变。这些克隆的亲和性超过单体鼠11G9的亲和性＞10倍。
在2.1-RL和2.1-RF文库中均观察到富集(图7)。有趣的是，在两个文库中均观察到类似的序列改变、靶向CDR-H3。事实上，在这两种情况下，CDR-H3的改变在文库(94-97NSNF和95-97TLP)间是相同的。由于文库的设计而产生的潜在的序列多样性是令人惊奇的。在两种文库中观察到的序列的共同类别包括T94N和H96N，与位置95和97(例如，94-97NSNF、94-97NLNY和94-97NANY)的其它改变结合。这些变体倾向于具有对vBR3-Fc或hBR3ecd的最高亲和性。事实上，克隆2.1-30(94-97NLNY)的亲和性超过单体鼠2.1的亲和性。
人源化改变的小结 从6种鼠9.1 CDR(定义为位置24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、26-35(H1)、49-65(H2)和94-102(KB))嫁接入人共有κIVL和亚组IIIVH区，鉴定了此抗体的人源化的2个途径。除了新CDR-H1序列和CDR-L2中2个改变的选择之外，第一个采用在Herceptin_抗体(R71A，N73T andL78A)存在的3个框架改变。这产生了高于嵌合9.1 Fab的亲和性近2倍的人源化变体(9.1-70)。第二个途径采用在框架中添加2个改变(N73T和L78F)而对CDR(9.1-RF)没有改变，再次产生高于嵌合9.1 Fab的亲和性近2倍的亲和性。
从6种鼠11G9 CDR(定义为位置24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、26-35(H1)、49-65(H2)和94-102(KB))嫁接入人共有κIVL和亚组III VH区开始，在框架中添加2个改变(N73T和L78F)及在CDR-H3中3个改变(D96N，G97D和W100L)产生相对于嵌合11G9 Fab亲和性，具有＞10倍改善的亲和性的全人11G9抗体(11G9-46)。
从6种鼠2.1 CDR(定义为位置24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、26-35(H1)、49-65(H2)和94-102(H3))嫁接入人共有κIVL和亚组III VH区开始，在框架中添加单个改变(N73T)及在CDR-H3中4个改变(T94N，P95L，H96N和T97Y)，相对于嵌合2.1Fab亲和性，产生具有改善亲和性的全人2.1抗体(2.1-30)。
利用所选择的克隆的Biacore结合分析结果如图10所示。
实施例4-衍生自天然噬菌体文库的抗BR3抗体 最初从噬菌体展示合成抗体文库中挑选其它的结合BR3的抗体，在在重链的互补决定区(CDR)内的溶剂暴露位置引入合成的多样性，在单个人框架构建该文库。
(a)用于文库构建的噬菌粒载体 设计噬菌粒pV0350-2b和pV0350-4分别用于在M13噬菌体颗粒表面单价和双价地展示Fab模板。
该Fab模板基于h4D5抗体，该抗体为人源化抗体，其特异识别称为Her-2(erbB2)的癌相关抗原。通过多聚酶链式反应利用humAb4D5变种8(“humAb4D5-8”)来获得h4D5序列(Carter et al.，(1992)PNAS894285-4289)。该h4D5核酸序列编码来自对Her-2特异的小鼠单克隆抗体的修饰的CDR区，该抗体位于人共有的序列Fab框架。具体地，该序列包含VH和CH1结构域(HC区)上游的κ轻链(LC区)。产生抗-Her-2抗体的方法以及可变区序列的鉴定由美国专利第5,821,337号和第6,054,297提供。
所述载体pV0350-2b通过修饰前述的噬菌粒(pHGHam-gIII)，该噬菌体在phoA启动子控制下已经被用于人生长激素(hGH)的的噬菌体展示。在phGHam-gIII中编码融合至M13小包被蛋白的C末端结构域P3(cP3)的stII分泌信号序列和hGH的开放阅读框被含有两个开放阅读框的DNA片段取代。第一阅读框编码cP3的h4D5轻链(变种8)，第二阅读框编码h4D5重链的可变区(VH)和第一恒定区(CH1)，这些区域均融合至cP3；N-末端stII信号序列指导每一蛋白的分泌。删除在重链片段和cP3间的琥珀型终止密码子，因已经证实此修饰能够增加展示在噬菌体上的Fab的水平。将表位标签加入到h4D5轻链C末端(gD标签)。二价展示载体(pV0350-4)与pV0350-2b相同，除了编码如上述的在重链CH1结构域和cP3之间的GCN4亮氨酸拉链的DNA片段的插入之外。在3个位置进一步修饰两种噬菌体中的轻链基因来编码在天然抗体序列的Kabat数据库中最常见的氨基酸；具体是，Arg66被改变为Gly，Asn30和His91被改变为Ser。发现这些改变可增加Fab表达以及在噬菌体上的展示。利用Kunkel et al.(Kunkel，J.D.，et al.，(1987)Methods Enzymol 154367-82)方法进行定点突变。
(b)文库的构建 利用已知的定向寡核苷酸的突变和pV0350-2b或pV0350-4的“终止模板”变体(Lee，C.V.，et al.，(2004)J.Immunol.Methods 284119-132；Lee，C.V.，et al.，(2004)JMB 3401073-1093)产生噬菌体展示文库。将终止密码子(TAA)植入到所有的三个重链CDR。通过简并寡核苷酸的混合物在突变反应中修补它们，该寡核苷酸在编码CDR-H1、-H2和-H3的序列上退火，并用特制的简并密码子来取代所选择用于随机化位置的密码子。将突变反应物电穿孔至E.coli SS320细胞，并且在30℃下在添加KO7辅助噬菌体、50g/ml的carbenicillin和50g/ml的卡那霉素的2YT肉汤中将培养物生长过夜。根据已知方法(Sidhu，S.S.et al.，(2000)，Methods Enzymol.328333-363)来从培养基中收集噬菌体并用PEG/NaCl沉淀。每一电穿孔反应使用约1011的E.coli细胞和约10μg的DNA并产生1×109-5×109的转化体。
利用适于模拟CDR-H1和CDR-H2的天然多样性的简并寡核苷酸来建立不同的文库(Lee，CV，et al.，(2004)，JMB，supra，Table 1)具有Fab.zip模板的文库3(Lib-3)。参见上述引用的Lee，CV，et al.，(2004)描述的Lib-3。CDR-H1和CDR-H2的2至4个寡核苷酸组合来增加天然多样性的覆盖性。Lib-3分别采用寡核苷酸HIa和HIb(比值2∶1)及CDR-H1和CDR-H2的H2a-c(比值1∶2∶0.1)(参见上述引用的Lee，CV.et al.(2004)，JMB的表1对寡核苷酸的描述)。
对于CDR-H3的位置95-100，Lib-3由具有延伸的CDR-H3长度的一组文库组成，该延伸的CDR-H3长度含有NNS密码子(或NNK密码子)或修饰版本的NNS密码子(XYZ密码子)，该版本在三联密码子的每一位置含有不相等的核苷酸比例。NNS密码子涵盖32密码子并编码所有20个氨基酸。X含有38％G，、9％A、26％T和17％C；Y含有31％G、34％A、17％T和18％C；以及Z含有24％G和76％C。在上述引用的Lee，CV.et al.，(2004)表5中描述了Lib-3的CDR-H3设计。除了一起进行电穿孔的7个和8个残基长度之外，单独进行突变反应并将每一长度的CDR-H3进行电穿孔。
通过检测48个随机挑选的克隆对抗gD抗体的结合来检验每一文库中全部Fab的噬菌体展示水平。对于Lib-3，对于不同的CDR-H3长度观察到了相似的展示水平，除了整合最长的CDR-H3(15-19残基)具有降低的Fab展示克隆百分比(15-30％)外。这反映出在使用较长的合成寡核苷酸时会降低突变效率。
噬菌体分选 在板上针对BR3(mBR3-ECD)的小鼠胞外区、融合到IgG1(mBR3-Fc)的Fc区的小鼠BR3胞外区、人BR3胞外区(hBR3-ECD)和融合到IgG1(vBR3-Fc)的Fc区人BR3胞外区，分选F(ab)′2(随机化的CDR-H1/H2/H3)合成噬菌体抗体文库。采用在包被缓冲液中(0.05M碳酸钠缓冲液，pH9.6)的100μl/孔的靶抗原(mBR3-ECD，mBR3-Fc，hBR3-ECD和vBR3-Fc)(5μg/ml)将96孔Nunc Maxisorp板在4℃包被过夜或在室温包被2小时。用65μl 1％封闭蛋白30分钟和40μl 1％Tween20另一30分钟封闭该板(封闭蛋白(1st第一轮-牛血清白蛋白(BSA)，2nd轮-卵清蛋白，3rd轮-奶，4th轮-BSA)。随后，用含0.1％Tween 20的1％BSA将噬菌体文库稀释3-5O.D/ml(1 O.D.＝1.13×1013噬菌体/ml)。通常，噬菌体的加入为第1轮3-5 O.D./ml，第2轮3O.D./ml，第3轮0.5-1 O.D/ml以及第4轮加入0.1-0.5 O.D/ml。在室温孵育该稀释的噬菌体30分钟。连续用PBS和0.05％Tween 20洗涤小孔至少5次。将封闭的噬菌体文库100μl/孔加入至8个靶抗原包被孔及2个未包被的孔1小时。连续用PBS和0.05％Tween 20洗涤该板至少10次。在室温用100μl/孔的100mM HCl洗脱噬菌体20分钟。将洗脱的噬菌体(来自包被的孔)和背景噬菌体(来自未包被的孔)收集在单独的管中。通过向两个管中加入1/10体积的1M Tris pH11.0来中和洗脱的收集物。向洗脱噬菌体的管中加入BSA至终浓度0.1％。在62℃加热该洗脱的噬菌体20分钟。为滴定该噬菌体，用10μl洗脱的噬菌体或背景噬菌体在37℃感染90μl的对数期XL-I(OD 600nm约0.1-0.3)30分钟。随后，用90μl 2YT以10倍增加系列稀释感染的细胞。将每个羧苄青霉素板用10μl等份的感染细胞铺板。
为增殖噬菌体，在37℃采用大约400μl的洗脱噬菌体感染约4ml指数期的XL-1汤(OD 600nm约0.1-0.3)30-45分钟。在37℃将辅助噬菌体，KO7，和羧苄青霉素加入至感染中至终浓度1×1010pfu/ml KO7和50μg/ml羧苄青霉素，1小时。在37℃将培养物过夜(或至少17小时)生长在含50μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的终体积为20-25ml的2YT中。第二天，将培养物在30℃生长另外2小时来增加噬菌体产量。
通过以8000rpm离心沉降细胞10分钟来纯化噬菌体。收集上清液。以上清液体积的1/5加入20％PEG/2.5M NaCl，混合并放置在冰上5分种。12000rpm离心噬菌体15分钟形成沉淀。收集上清液并在5000rpm再次离心5分钟。将沉淀重悬在1ml PBS中并在12000rpm离心15分钟来清除碎片。从PEG/NaCl添加起始的步骤在重悬的沉淀中重复。在270nm读取重悬的噬菌体沉淀的OD值。提高重复如上所述的噬菌体分选步骤来完成第二、第三和第四轮噬菌体分选。
ELISA筛选分析 通过ELISA分析来筛选来自第三和第四轮克隆的特异性和亲和性。阳性克隆(结合克隆，binder)为具有高于背景结合至靶抗原(mBR3-ECD和hBR3-ECD)而不对诸如牛血清白蛋白的封闭蛋白结合的克隆。
首先，用20μl每孔的(1μg/ml包被缓冲液)mBR3-ECD，hBR3-ECD和抗gD将384孔微滴定板的小孔在4℃包被过夜和在室温包被2小时。
在另一96孔板中，来自第三和第四轮的克隆，在37℃在含有50μg/ml羧苄青霉素和辅助噬菌体KO7的150μl 2YT培养基中生长过夜。在2500rpm离心该板20分钟。在包被孔的板中，将50μl的上清液加入至120μl的ELISA缓冲液(含0.5％BSA和0.05％Tween20的PBS)。将30μl的混合物加入至384孔包被板的每一四分部分，并在室温孵育1小时。通过室温加入75μl/孔的含0.5％BSA和0.05％Tween20的PBS中的辣根过氧化氢酶(HRP)-结合的抗M13抗体30分钟(Sidhu et al.，如上引用)来对结合定量。利用PBS-0.05％Tween20洗涤至少5次。随后，将100μl/孔的1∶1比例的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)过氧化氢酶底物和过氧化氢酶溶液B(H2O2)((Kirkegaard-Perry Laboratories(Gaithersburg，MD))加入到小孔中并在室温孵育5分钟。通过向每个小孔添加100μl 1M的磷酸(H3PO4)并在室温孵育5分钟来终止反应。利用标准的ELISA平板阅读仪来在450nm测定每孔中黄颜色的OD值。选择对mBR3-ECD和hBR3-ECD的结合高于对BSA的结合3倍的克隆(图11)。
测序所选择的结合克隆。发现15个独特的克隆(1个克隆来自对mBR3-ECD的分选，6个克隆来自对mBR3-Fc的分选，8个克隆来自对hBR3-ECD的分选，没有克隆来自对hBR3-Fc的分选)(图12)。
溶液结合竞争ELISA 为测定所选择的F(ab)′2噬菌体的结合亲和性，进行竞争ELISA。首先，增殖并纯化噬菌体。37℃用克隆感染30分钟的10μl的XL-1细菌铺板在羧苄青霉素板上。挑选克隆并在37℃生长在2ml(2YT and50μg/ml羧苄青霉素)3-4小时。将辅助噬菌体KO7以终浓度1010pfu/ml加入到培养物中，并在37℃再培养1小时。20ml的培养基(将含50μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的2YT)加入到培养物中，在37℃生长过夜。根据以上所述纯化噬菌体。
其次，确定优化以用于以下竞争ELISA分析的纯化的噬菌体的浓度(即，在包被板上的大约90％的最大结合能力)。用2μg/ml包被缓冲液中的mBR3-ECD或mBR3-Fc对96孔Nunc Maxisorp板在4℃包被过夜或在室温包被2小时。通过添加65μl 1％BSA，30分钟，随后是40μl 1％Tween20另一30分钟，来封闭该小孔。接下来，利用PBS-0.05％Tween20洗涤小孔5次。在ELISA缓冲液中(PBS-0.5％BSA和0.05％Tween20)将F(ab)′2噬菌体稀释至0.1O.D./ml，并随后添加到小孔中室温15分钟。随后利用PBS-0.05％Tween20洗涤小孔至少3次。每孔加入75μl的HRP-偶联的抗-M13抗体(Amersham，用ELISA缓冲液做1/5000稀释)并在室温孵育30分钟。再次用PBS-0.05％Tween20洗涤小孔至少5次。接下来，将100μl/孔的1∶1比例的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)过氧化氢酶底物和过氧化氢酶溶液B(H2O2)((Kirkegaard-Perry Laboratories(Gaithersburg，MD))加入到小孔中，并在室温孵育5分钟。利用标准的ELISA平板阅读仪来在450nm测定每孔中颜色的光密度值。将噬菌体的稀释度相对于O.D.读取值作图。
第三，实施进行ELISA。用2μg/ml的mBR3-ECD或mBR3-Fc对96孔Nunc Maxisorp板在4°包被过夜或在室温包被2小时。通过添加65μl 1％BSA，30分钟，随后是40μl 1％Tween20另一30分钟，来封闭该小孔。利用PBS-0.05％Tween20洗涤小孔5次。根据上述的结合分析，将50μl的能够产生约90％的对包被的结合的稀释的噬菌体与50μl的ELISA缓冲液中的不同浓度的mBR3-ECD或mBR3-Fc或hBR3-ECD或hBR3-Fc(0.1至1000nM)在小孔中室温孵育2小时。通过转移75μl的该小孔混合物至用mBR3-ECD或mBR3-Fc预包被的第二96孔板并在室温孵育15分钟来分析未结合的噬菌体。用PBS-0.05％Tween20洗涤第二板的小孔至少3次。每孔加入75μl的HRP-结合的抗M13抗体(Amersham，用ELISA缓冲液做1/5000稀释)并在室温孵育30分钟。再次用PBS-0.05％Tween20洗涤小孔至少5次。接下来，将100μl/孔的1∶1比例的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)过氧化氢酶底物和过氧化氢酶溶液B(H2O2)((Kirkegaard-Perry Laboratories(Gaithersburg，MD))加入到小孔中，并在室温孵育5分钟。通过向每个小孔添加100μl 1M的磷酸(H3PO4)并在室温孵育5分钟来终止反应。利用标准的ELISA平板阅读仪来在450nm测定每孔中颜色的光密度值。将竞争剂mBR3-ECD或mBR3-Fc或hBR3-ECD或hBR3-Fc相对于O.D.读取值作图。IC50，抑制50％的F(ab)′2-噬菌体的mBR3-ECD或mBR3-Fc或hBR3-ECD或hBR3-Fc的浓度，代表所述的亲和性(图13)。V3克隆对小鼠和人BR3的结合均具有高亲和性。
mBAFF阻断ELISA 为了发现这些独特的克隆具有与配体(BAFF)相似的结合表位，如下进行mBAFF阻断ELISA用2μg/ml包被缓冲液中的mBR3-Fc对96孔Nunc Maxisorp板在4°包被过夜或在室温包被2小时。通过添加65μl1％BSA，30分钟，随后是40μl 1％Tween20另一30分钟，来封闭该小孔。接下来，利用PBS-0.05％Tween20洗涤小孔5次。将在ELISA缓冲液中的不同浓度的mBAFF-Flag蛋白在小孔中室温孵育30分钟。随后，向每孔加入具有独特序列的F(ab)′2噬菌体，10分钟，在没有mBAFF-Flag蛋白存在下该加入的噬菌体浓度通常能够产生90％结合能力。利用PBS-0.05％Tween20洗涤小孔5次。
通过加入含0.5％BSA和0.05％Tween20的PBS中75μl/孔的辣根过氧化物酶(HRP)-偶联的抗M13抗体，在室温30分钟(Sidhu et al.，如上引用)定量结合。利用PBS-0.05％Tween20洗涤小孔至少5次。接下来，将100μl/孔的1∶1比例的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)过氧化氢酶底物和过氧化氢酶溶液B(H2O2)((Kirkegaard-Perry Laboratories(Gaithersburg，MD))加入到小孔中，并在室温孵育5分钟。通过向每个小孔添加100μl 1M的磷酸(H3PO4)并在室温孵育5分钟来终止反应。利用标准的ELISA平板阅读仪来在450nm测定每孔中溶液的OD值。结果如图13和图14所示。
还进行了另一单价形式的BAFF阻断ELISA。通过利用mBR3-ECD包被的板，使ELISA缓冲液中的不同浓度的杂种BAFF蛋白在小孔中室温孵育30分钟。随后，向每孔加入具有独特序列的F(ab)′2噬菌体，10分钟，在没有杂种BAFF蛋白存在下该加入的噬菌体浓度通常能够产生90％结合能力。以下步骤如上所述。结果如图13所示。
图14显示了克隆3(V3)较容易地阻断BAFF-BR3结合。图15中描述了V3的可变区序列。
改变V3骨架的F(ab)′2形式为Fab形式 因为V3具有最好的BAFF的阻断活性，并具有对mBR3和hBR3的跨物种结合活性，V3是进一步的亲和性改善的抗体候选物。为了证实单价亲和性的进一步的亲和性改善，利用F220寡序列(5′-TCT TGT GACAAA ACT CAC AGT GGC GGT GGC TCT GGT-3′)(SEQ ID NO154)通过Kunkel突变去除亮氨酸拉链。此外，为了证实随机形式的CDR-L3掺入，将终止密码子(TAA)掺入到在CDR-L3中预多样化的位置。F9寡序列(5′-TAT TAC TGT CAG CAA CAT TAA TAA AGG CCT TAA CCTCCC ACG TTC GGA-3′)(SEQ ID NO155)被用在CDR-L3区添加终止密码子。
用于亲和性改善的V3骨架上的构建体文库 将硬和软的随机设计用来亲和性改善。硬随机表示限定的位置被随机化为全部的20个氨基酸。软随机表示在某些位置随机化保留50％的亲代氨基酸和50％的19个其它的氨基酸或终止密码子。通过Kunkel突变已经构建了基于V3骨架的4个文库。
V0902-1CDR-L1(F111+F202＝1∶1)/L2(F201+F203＝1∶1)/L3(F133a∶133b∶133c∶133d＝1∶1∶1∶1) V0902-2CDR-L3软(F232)/H1软(F226)/L2(F201+F203＝1∶1) V0902-3CDR-H3软(F228+F229+F230+F231＝1∶1∶0.5∶0.5)/L3软(F232) V0902-4CDR-L3软(F232)/H1软(F226)/H2软(F227) 寡序列 L1 F111(5′-ACC TGC CGT GCC AGT CAG RDT RKT RVW ANW THTGTA GCC TGG TAT CAA CAG AAA C-3′)(SEQ ID NO156) F202(5′-ACC TGC CGT GCC AGT CAG RDT RKT RVW ANW THTCTG GCC TGG TAT CAA CAG AAA C-3′)(SEQ ID NO157) L2 F201(5′-CCG AAG CCT CTG ATT TAC KBG GCA TCC AVC CTCTAC TCT GGA GTC CCT-3′)(SEQ ID NO158) F203(5′-CCG AAG CTT CTG ATT TAC KBG GCA TCC AVC CTCGMA TCT GGA GTC CCT TCT CGC-3′)(SEQ ID NO159) L3 F133a(5′-GCA ACT TAT TAC TGT CAG CAA TMT DMC RVT NHTCCT YKG ACG TTC GGA CAG GGT ACC-3′)(SEQ ID NO160) F133b(5′-GCA ACT TAT TAC TGT CAG CAA TMT DMC RVT NHTCCT TWT ACG TTC GGA CAG GGT ACC-3′)(SEQ ID NO161) F133c(5′-GCA ACT TAT TAC TGT CAG CAA SRT DMC RVT NHTCCT YKG ACG TTC GGA CAG GGT ACC-3′)(SEQ ID NO162) F133d(5′-GCA ACT TAT TAC TGT CAG CAA SRT DMC RVT NHTCCT TWT ACG TTC GGA CAG GGT ACC-3′)(SEQ ID NO163) 软随机寡序列符号5(70％A，10％G，10％C，10％T) 6(70％G，10％A，10％C，10％T) 7(70％C，10％A，10％G，10％T) 8(70％T，10％A，10％G，10％C) L3软F232(5′-GCA ACT TAT TAC TGT CAG CAA 567 857 577 577CCG 776 ACG TTC GGA CAG GGT ACC-3′)(SEQ ID NO164) H1软F226(5′-TGT GCA GCT TCT GGC TTC WCC NTT 567 567 557567 587 757 TGG GTG CGT CAG GCC-3′)(SEQ ID NO165) H2软F227(5′-AAG GGC CTG GAA TGG GTT GST 866 ATC 577 776567 658 668 557 577 658 TAT GCC GAT AGC GTC AAG-3′)(SEQ ID NO166) H3软 F228(5′-GCC GTC TAT TAT TGT GCT CGT 768 686 TGC 857 567567 686 768 668 TGC 676 668 676 ATG GAC TAC TGG GGT CAA G-3′)(SEQ ID NO167) F229(5′-GCC GTC TAT TAT TGT GCT CGT 768 686 867 857 567567 686 768 668 867 676 668 676 ATG GAC TAC TGG GGT CAA G-3′)(SEQ ID NO168) F230(5′-GCC GTC TAT TAT TGT GCT 768 768 686 TGC 857 567567686 768 GGC TGC GCG GGG GCA ATG-3′)(SEQ ID NO169) F23 1(5′-GCT CGT CGG GTC TGC TAC 567 567 686768 668 TGC676 668 676 ATG GAC TAC TGG GGT CAA G-3′)(SEQ ID NO170) 噬菌体的表达 利用上述的突变DNA通过电穿孔转化E.coli菌株SS320/KO7(KO7感染的)。在30℃将转化的细菌细胞生长在含50μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的2YT培养基中20小时。根据已知方法(Sidhu et al.，Methods Enzymol.(2000)，328333-363)来收集噬菌体。简而言之，首先利用聚乙二醇从过夜的培养基中沉淀噬菌体并重悬在PBS来纯化噬菌体。
利用分光光度计通过其在268nm的读数(1OD＝1.13×1013/ml)来定量噬菌体。
相对于V3产生亲和性改善的噬菌体分选策略 对于亲和性改善筛选，将噬菌体文库进行第一轮的板分选并随后进三轮的溶液分选。在第一轮板分选中，分别针对mBR3-ECD和hBR3-ECD包被的板(NUNC Maxisorp板)进行4个文库的分选。加入的噬菌体大约为3O.D/ml(在1％BSA和0.1％Tween20中)。以下步骤如上噬菌体分选部分所述。将针对mBR3-ECD或hBR3-ECD的来自文库V0902-2，V0902-3和V902-4的洗脱的噬菌体合并进行增殖。
第一轮板分选后，进行三轮的溶液分选来增加筛选的严紧性。
A)mBR3-ECD和hBR3-ECD的生物素化 在生物素化之前，将靶蛋白放入不含胺的缓冲液中，理想地在高于7.0的pH并在＞0.5mg/ml的浓度下。首先，通过使用Amicon Mltra 5K管将含有mBR3-ECD和hBR3-ECD的缓冲液交换入PBS中。其次，制备NHS-生物素反应剂在PBS中的新鲜储存液(100X)。将大约3∶1摩尔比例的MHS-生物素反应剂和靶蛋白在室温孵育30分钟至1h。随后，在室温下加入0.1M Tris pH7.530分钟，以淬灭未反应的NHS。
B)用PBS中的100μl/孔的中性链亲和素(5μg/ml)对96孔NuncMaxisorp板在4℃包被过夜和在室温包被2小时。利用65μl Superblock(Pierce)封闭该板30分钟，并用40μl 1％Tween20封闭另外30分钟。
C)将从第一轮板分选中增殖的1O.D./ml噬菌体与100nM的生物素化的mBR3-ECD或hBR3-ECD在150-200μl含Superblock 0.5％和0.1％Tween20的缓冲液中在室温下一起孵育至少1小时。利用Superblock0.5％对该混合物做5-10X的进一步稀释，并以100μl/孔施加到中性链亲和素包被的小孔中室温5分钟，同时通过柔和的摇动使得生物素化的靶标能够结合噬菌体。利用PBS-0.05％Tween20洗涤小孔8次。为了确定背景结合，将含有具有未生物素化的靶标的噬菌体的对照孔捕获在中性链亲和素包被的板上。对于另一对照(中性链亲和素结合的对照)，将生物素化靶标与噬菌体混合并孵育在未用中性链亲和素包被的小孔中。0.1NHCl洗脱结合的噬菌体20分钟，用1/10体积的1M Tris pH11中和，并滴定和增殖用于下一轮。接下来，利用降低浓度至5nM和1nM的生物素化mBR3-ECD或BR3-ECD来实施另两轮的溶液分选，以增加严紧性。而且，将噬菌体的加入减少至0.5O.D/ml和0.1O.D/ml来降低背景噬菌体结合。
高通量亲和性筛选ELISA(单点竞争) 从第三和第四轮筛选中挑选克隆并在37℃过夜生长在96孔板(Falcon)中的含50μg/ml羧苄青霉素和1e10/ml KO7的2YT培养基中。从相同的板中，挑选XL-1感染的V3噬菌体克隆作为对照。
利用100μl/孔包被缓冲液中的mBR3-ECD(2μg/ml)对96-孔 NuncMaxisorp板在在4°包被过夜或在室温包被2小时。通过65μl 1％BSA，30分钟，随后是40μl 1％Tween20另一30分钟，来封闭该板。
将噬菌体上清液在100μl总体积的ELISA缓冲液(含0.5％BSA，0.05％Tween20的PBS)中作1∶10稀释，该缓冲液含或不含100nMmBR3-ECD或hBR3-ECD，并在F板(NUNC)中室温(RT)孵育至少1小时。将75μl的混合物，含有和不含mBR3-ECD或者含有hBR3-ECD平行地转移至mBR3-ECD包被的板中。将该板轻柔摇动10-15分钟使得将未结合的噬菌体捕获至mBR3-ECD包被的板上。通过添加ELISA缓冲液中的辣根过氧化物酶(HRP)-结合的抗M13抗体(1∶5000)并在室温孵育30分钟来定量该结合。用PBS-0.05％Tween20洗涤该板至少5次。接下来，将100μl/孔的1∶1比例的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)过氧化氢酶底物和过氧化氢酶溶液B(H2O2)((Kirkegaard-Perry Laboratories(Gaithersburg，MD))加入到小孔中，并在室温孵育5分钟。通过向每个小孔添加100μl1M的磷酸(H3PO4)并在室温孵育5分钟来终止反应。利用标准的ELISA平板阅读仪来在450nm测定每孔中黄色的OD值。通过以下等式来计算OD的降低值(％)。
OD450nm降低值(％)＝(含竞争剂孔的OD450nm)/(不含竞争剂孔的OD450nm)*100 与V3噬菌体(100％)小孔的OD450nm降低值(％)比较，挑选对mBR3-ECD和hBR3-ECD的OD450nn降低值(％)均低于50％的克隆。仅从针对mBR3-ECD分选的V0902-2，3，4混合文库中挑选出14种克隆。无论从针对mBR3-ECD分选的V0902-1 LC硬随机文库，还是从针对hBR3-ECD分选的两种文库中，均无命中。对这14种克隆进行测序。最终，存在4种独特序列(V3-1、V3-11、V3-12和V3-13)。所有4个独特克隆具有与V3克隆相同的CDR-L1和CDR-H2，其与4D5文库模板相同。V3-1、V3-11和V3-12来自文库V0902-3，而V3-13来自文库V0902-2。
图16A显示L2、L3、H1和H3区域的部分序列。
新克隆的功能特征 对V3-衍生的克隆进行BAFF阻断ELISA，来检测与V3克隆比较的BAFF阻断活性。所有的4个克隆显示对杂合的BAFF的完全阻断活性。这表明，所有4个克隆对BR3具有与BAFF相似的结合表位。
此外，实施竞争ELISA来测定这些噬菌体克隆对mBR3-ECD、hBR3-ECD和小-BR3的亲和性。小BR3为26个残基肽段，其对BAFF具有完全的亲和性。阻断ELISA和噬菌体竞争ELISA的结果总结如图16B。
用于细菌细胞中表达的Fab构建体 通过去除病毒cP3序列，用含有5′-GCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATG-3′(SEQ ID NO171)的终止序列取代它们，并去除编码gD标签的序列(分别为pwO276-V3，pwO276-V3-1，pwO276-V3-11和pw0276-V3-12)，来修饰V3、V3-1、V3-11、V3-12和V3-13噬菌体。将所有构建体转化入E coli 34B8细胞。挑选单个克隆，并生长在含25μg/ml羧苄青霉素完全的CRAP培养基中，30℃，至少22小时。通过蛋白G高陷阱柱子(high trap column，AmershamPharmacia)来纯化所表达的蛋白。
利用在BIAcoreTM-2000上的Biacore检测表面等离子体共振分析来测定抗BR3Fab的亲和性。在CM5芯片上的固化的mBR3-ECD和hBR3-ECD约150反应单位(RU)。从3nM至500nM增加浓度的Fab样品以20μl/分钟注射，并通过从空白流细胞减去RU来校正对mBR3-ECD或hBR3-ECD的结合反应。对于动力学分析，利用kon和koff同时拟合的1∶1 Languir模型。将表观kD值报告在表4中。
表4. 利用V3-1构建文库以进一步改善亲和性 利用软和较软的随机化来进行进一步的亲和性改善。软随机化表示在某些位置，50％保留亲代氨基酸，而另50％为另外19种氨基酸或终止密码子。较软随机化表示在某些位置保留75％为亲代氨基酸，而另25％为其它的19种氨基酸和终止密码子。通过Kunkel突变基于V3-1骨架构建4个文库。
V1008-1L3(F279+F280+F293＝1∶1∶0.2)/H3(F285+F286＝1∶1) V1008-2L3(F279)/H3(F283+F284＝1∶1) V1008-3H1(F281)/H2(F282)/L3(F279) V1008-4L3(F280+F293＝1∶4)/H3(F283+F284+F266+F267＝1∶1∶1∶1) 寡序列 I3软 F279(5′-ACT TAT TAC TGT CAG CAA 568 767 587 577 CCG 777ACG TTC GGA CAG GGT-3′)(SEQ ID NO172) F280(5′-ACT TAT TAC TGT CAG CAA 568 767 587 577 568 CCG777 ACG TTC GGA CAG GGT-3′)(SEQ ID NO173) F293(5′-ACT TAT TAC TGT CAG CAA 878 NNK NNK NNK 878CCG CCC ACG TTC GGA CAG GGT-3′)(SEQ ID NO174) H1软 F281(5′-GCA GCT TCT GGC TTC WCC ATT 568 568 568 878 ATACAC TGG GTG CGT C-3′)(SEQ ID NO175) H2软 F282(5′-CTG GAA TGG GTT GCT TGG RTT 578 CCT 878 657 GGT878 ACT 657 TAT GCC GAT AGC GTC AAG-3′)(SEQ ID NO176) H3软 F283(5′-GTC TAT TAT TGT GCT CGT 766 687 TGC 857 557 767788 668 688 TGC GCT GGT GGG ATG-3′)(SEQ ID NO177) F284(5′-GTC TAT TAT TGT GCT CGT 766 687 TGC 857 557 767CTT GGT GTT TGC 678 668 668 ATG GAC TAC TGG GGT CAA-3′)(SEQ ID NO178) F285(5′-GTC TAT TAT TGT GCT CGT 766 687 RST 857 557 767788 668 688 RST GST GST GSG ATG GAC TAC TGG GGT-3′)(SEQ IDNO179) F286(5′-TAT TAT TGT GCT CGT CGG 687 RST 857 557 767 788668 688 RST 678 668 668 ATG GAC TAC TGG GGT C-3′)(SEQ ID NO180) H3较软 F266(5′-GTC TAT TAT TGT GCT CGT 766 687 TGC 857 557767788 668 688 TGC GCT GGT GGG ATG-3′)(SEQ ID NO181) F267(5′-GTC TAT TAT TGT GCT CGT 766 687 TGC 857 557 767CTT GGT GTT TGC 678 688 668 ATG GAC TAC TGG GGT CAA-3′)(SEQ ID NO182) 较软随机化的寡序列符号5(85％A，5％G，5％C，5％T) 6(85％G，5％A，5％C，5％T) 7(85％C，5％A，5％G，5％T) 8(85％T，5％A，5％G，5％C) 产生相对于V3-1的亲和性改善的噬菌体分选策略 通过降低生物素化mBR3-ECD和hBR3-ECD的浓度在4种文库(V1008-1、V1008-2、V1008-3和V1008-4)中进行4轮的溶液分选。噬菌体加入量第一轮为3O.D/ml，后三轮为1、0.5、0.1。对于文库V 1008-1，在第一轮使用100nM的生物素化的靶标。随后在后三轮使用10nM，10nM和2nM的生物素化靶标。对于其它的三个文库(V1008-2，V1008-3和V1008-4)，第一轮使用20nM的生物素化的靶标。随后在后三轮中使用1nM，1nM和0.5nM的生物素化靶标。分选方法如上所述。为了增加严紧性，在第四轮，将生物素化的靶标与噬菌体文库在37℃孵育3小时。接下来，加入1000倍过量的未生物素化的靶标，并在该生物素化的材料被捕获在中性链亲和素板之前将该混合物在室温孵育30分钟竞争掉高解离率(off-rate)结合物。
高通量亲和性筛选ELISA(单点竞争) 如上所述实施该方法。将10nM mBR3-ECD和hBR3-ECD用于单点竞争。
与V3-1噬菌体孔(80％)的OD450nm降低(％)比较，挑选对mBR3-ECD和hBR3-ECD的OD450nn降低值(％)均低于50％的克隆。挑选、测序并分析12种克隆(图17)。结果总结在图17中。
克隆41和克隆46为最佳的两种V3-1亲和性改善变体。因克隆41具有更多的天冬酰胺残基(N)，选择克隆46用于进一步的表征。在克隆46的CDR-H1区存在潜在的糖基化位点(N-S-S/T)。为去除该潜在的糖基化位点，在位点31制备3种单一CDR-H1突变体(N31A、N31S和N31Q)来检测mBR3-ECD与hBR3-ECD结合活性。实施竞争ELISA来测定它们对mBR3-ECD和hBR3-ECD的亲和性。结果显示如下。在这三种突变体中，N31S的亲和性最接近于V3-46亲代克隆(表5)。
表5. 该V3-46的N31S突变体被重命名为V3-46s。根据以上所述方法来制备V3-46s的Fab。利用在BIAcoreTM-2000上的Biacore检测通过表面等离子体共振分析来测定V3-46s Fab的亲和性。结果总结在以下表中(表6和表7)。与V3-1Fab比较，V3-46s Fab对mBR3-ECD的结合率(on-rate)得到改进。相对于V3-1，V3-46s Fab对hBR3-ECD的结合率和解离率得到显著改善。
mBR3-ECD 表6. hBR3-ECD 表7. 在V3-46s骨架上构建同源鸟枪文库以进一步改善亲和性。
对于进一步的亲和性改善，利用V3-46s噬菌粒作为模板来制备同源鸟枪文库。在所有3种轻链CDR中通过引入TAA密码子来构建终止模板。设计突变的寡核苷酸来使用二名(binominal)密码子，其在需要的位点仅编码野生型和类似的氨基酸(JMB 2002320[415-418])。通过Kunkel突变方法，修复终止密码子并将突变引入所需要的位点(Kunkel et al1987)。
通过将如下所述的所有6种同源鸟枪寡序列混合来制备文库1109-3。对于CDR-H1、H2和H3，除原同源鸟枪寡序列外，我们还囊括了突变每一其它位置的寡序列(a和b)来保证对BR3的最初结合活性没有被破坏。
V1 109-3 L1∶L2∶L3∶H1∶H2∶H3＝1∶1∶1∶0.5∶1∶1.5 L1(F349)/L2(F350)/L3(F351)/H1(F352+F352a+F352b＝1∶1∶1)/H2(F355+F35 5a+F355b＝1∶1∶1)/H3(F356+F356a+F356b＝1∶1∶1) 寡序列 <CDR-L1> F349(5′-ACC TGC CGT GCC AGT SAA GAM RTT KCC ASC KCT GTA GCC TGG TAT CAA CAG AAA C-3′)(SEQ ID NO181) <CDR-L2> F350(5′-CCG AAG CTT CTG ATT TWC KCC GCA TCC TWC CTC TWC TCT GGA GTC CCT TCT CGC-3′)(SEQ ID NO182) <CDR-L3> F351(5′-GCA ACT TAT TAC TGT CAG CAS KCC SAA RTT KCC CCGS SCA ACG TTC GGA CAG GGT ACC-3′)(SEQ ID NO183) CAS密码子编码Gln和His。
<CDR-H1> F352(5′-GCA GCT TCT GGC TTC ACC ATT KCC KCC KCC KCC ATA CAC TGG GTG CGT CAG-3′)(SEQ ID NO1 84) F352a (5′-GCA GCT TCT GGC TTC ACC ATT AGT KCC AGC KCC ATA CAC TGG GTG CGT CAG-3′)(SEQ E)NO185) F352b(5′-GCA GCT TCT GGC TTC ACC ATT KCC AGC KCC TCT ATA CAC TGG GTG CGT CAG-3′)(SEQ ID NO186) <CDR-H2> F355(5′-AAG GGC CTG GAATGG GTT GCA TKG RTT MTC SCA KCC RTT GST TWC ASC GAM TAT GCC GAT AGC GTC AAG GGC- 3′)(SEQ ID NO187) F355a (5′-AAG GGC CTG GAA TGG GTT GCT TGG RTT CTT SCA TCT RTT GGT TWC ACT GAM TAT GCC GAT AGC GTC AAG GGC- 3′)(SEQ ID NO188) F355b (5′-AAG GGC CTG GAA TGG GTT GCT TKG GTT MTC CCT KCC GTG GST TTT ASC GAC TAT GCC GAT AGC GTC AAG GGC-3′) (SEQ ID NO189) <CDR-H3> F356 (5′-ACT GCC GTC TAT TAT TGT GCA ARA ARA RTT TGC TWC RAC ARA MTC GST RTT TGC KCT GST GST ATG GAC TAC TGG GGT CAA-3′)(SEQDDNO190) F356a(5′-ACT GCC GTCTAT TAT TGT GCT CGT ARA GTC TGC TWC AAC ARACTTGSTGTT TGC KCT GGTGST ATG GAC TAC TGG GGT CAA-3′)(SEQIDNO191) F356b(5′-ACT GCC GTC TAT TAT TGT GCT ARA CGG RTT TGC TAC RACCGC MTCGGT RTTTGC GCTGST GGT ATG GAC TAC TGG GGT CAA-3′)(SEQ ID NO192) 参见Vajdos，et al.，(2002)J.MoI.Biol.320415-418的表1，用于说明编码wt残基和其同源残基的密码子用法。
用于V3-46s亲和性筛选的噬菌体分选 通过降低生物素化mBR3-ECD和hBR3-ECD的浓度在V1109-3中进行3轮溶液分选。噬菌体加入量第一轮为2O.D/ml，在后两轮为0.5、0.1O.D/ml。在第一轮使用1nM的生物素化的靶标。随后在后两轮使用0.2和0.1nM的生物素化靶标。分选方法如上所述。为了增加严紧性，在第三轮，将生物素化的靶标与噬菌体文库在37℃孵育3小时。接下来，加入1000倍过量的未生物素化的靶标，并在该生物素化的材料被捕获在中性链亲和素板之前将该混合物在室温孵育30分钟竞争掉高解离率结合物。
高通量亲和性筛选ELISA(单点竞争) 如上所述，利用1nM mBR3-ECD和hBR3-ECD进行单点竞争。将检测孔的OD450nm降低值(％)与V3-46s噬菌体(95％)的比较。挑选在mBR3-ECD和hBR3-ECD存在下OD450nn降低值(％)均低于50％的克隆。挑选、测序并分析14个克隆。
图18显示，与WT V3-46s比较，噬菌体亲和性IC50选则V3-46s克隆用于mBR3-ECD或hBR3-ECD。所有14种克隆，对于mBR3-ECD和hBR3-ECD，均是好于V3-46s(WT)的结合物。除V3-46s-12之外，大多数克隆具有与WT V3-46s相同的CDR-HC序列，而该V3-46s-12在其CDR-H1不同于WT。参见图18和SEQ ID NO193。如图18所示，所有这些克隆在CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3均具有改变。与亲代V3-46s克隆比较，大多数亲和性改善变体为2至5倍的亲和性改善。V3-46s-42对mBR3-ECD和hBR3-ECD的结合改善为6至8倍，增加至pM范围。
为了证实亲和性改善克隆的蛋白亲和性，通过以上所述方法来制备V3-46s-9和V3-46s-42Fab。利用在BIAcoreTM-3000上的表面等离子共振分析来确定这些Fabs的亲和性。结果总结在以下表中。与V3-46s Fab比较，V3-46s-42Fab对mBR3-ECD和hBR3-ECD的结合率得到改善。其Kds与噬菌体IC50值具有良好的一致性。参见如下。
实施例5-BJAB细胞结合分析 将BJAB细胞，人伯基特淋巴瘤细胞株，在RPMI培养基中培养，该培养基补充有10％FBS、青霉素(100U/ml，Gibco-Invitrogen，Carlsbad，CA)、链霉素(100μg/ml，Gibco)和L-谷氨酰胺(10mM)。通过流式细胞术进行的受体表达分析表明，BJAB细胞表达高水平的BR3和不可测水平的BCMA和TACI。为进行结合分析，用冷的分析缓冲液(含1％胎牛血清(FBS)的磷酸盐缓冲液(PBS)，pH7.4)洗涤细胞。将细胞密度调至1.25×106/ml，并将200μl细胞悬浮液等分置入96孔圆底聚丙烯培养板(NUNC，Neptune，NJ；250,000细胞/孔)的孔中。将含有细胞的培养板在4℃和1200rpm条件下离心5分钟，小心地将上清液从细胞沉淀上吸除。V3-1m(或mV3-1)和V3-1h分别指与小鼠IgG2a或人IgG1的恒定区融合的V3-1抗体的可变区。术语嵌合11G9、嵌合2.1或嵌合9.1分别指11G9、2.1或9.1的可变区与人IgG1的恒定区的融合。对这些实验，使用全长抗体(IgG)。
按照如下进行直接结合分析和竞争结合分析。对直接结合分析，将IgG抗体样本在冷的分析缓冲液中系列稀释至浓度为300-0.02nM。将样本(100μl)加入所述细胞沉淀中，将培养板在冰上孵育45分钟。然后向每孔中再加入100μl分析缓冲液，并将培养板在4℃和1200rpm条件下离心5分钟。小心地吸除上清液后，再用200μl分析缓冲液清洗细胞两次。适当地，加入在冷的分析缓冲液中以1/10,000稀释的抗-小鼠IgG Fc-HRP或山羊抗-人IgG Fc-HRP(100μl/孔，JacksonImmunoResearch，West Grove，PA)，并将培养板在冰上孵育45分钟。用200μl冷的分析缓冲液清洗两次后，加入四甲基联苯胺(TMB，Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)，并让其显色10分钟。加入100微升1M H3PO4来终止反应。然后在微量培养板阅读器上在450nm并使用620mn参照来对所述培养板进行读数。在该直接结合分析中，将标明浓度的mAbs加入BJAB细胞中，并检测结合的mAb。
在竞争结合分析中，抗-BR3 mAbs与生物素化的BAFF竞争性地结合细胞表面的BR3。如前所述(Podriguez，C.F.，et al.，(1998)J.Immunol.Methods 21945-55)，用NHS-X-生物素(Research Organics，Cleveland，OH)对在Genentech表达且纯化的人BAFF进行生物素化。将抗-BR3抗体系列稀释并与等体积的生物素-BAFF合并，以得到最终浓度333-0.15nM mAb和10ng/ml生物素-BAFF。将稀释的样本加入上述的96孔培养板中的沉淀的BJAB细胞中。在冰上孵育45分钟后，用200μl冷的分析缓冲液清洗细胞两次，并加入在分析缓冲液中以1/5,000稀释的链亲和素-HRP(AMDEX，Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)(100μl/孔)。将培养板在冰上孵育最后45分钟。用冷的分析缓冲液清洗两次后，用TMB使其产色，用H3PO4终止反应，并如上所述对培养板进行读数。
图19显示了抗体结合BJAB细胞上的BR3。图20显示虽然V3-1m能竞争性地替代BAFF对表达在BJAB细胞上的人BR3的结合(插图A)，以及直接结合BJABs(插图B)，B9C11显示出在任一分析方式中都没有能力结合人BR3(分别为插图A和B)。相比之下，V3-1m和B9C11均能完全阻断BAFF对表达在BHK细胞上的鼠类BR3的结合(插图C)，并且能直接结合到所述细胞(插图D)。对用V3-1m(小鼠IgG)和B9C11(仓鼠IgG)进行的直接结合分析，需要不同的检测抗体。
基于BJAB结合分析的结果，所述抗体可以分为阻断型或非阻断型。在该竞争性分析中，四种mAbs(11G9，2.1，9.1和V3-1)完全地阻断了生物素-BAFF的结合，而三种其它(IE9，7B2和8G4)导致部分抑制(图19和20，表8)。发现MAbs 1A11，8E4，10E2，12B 12和3.1为非阻断型(图19)。在这些非阻断型抗体中，1A11和8E4在直接结合分析中对BJAB的结合相对较差，而与其它mAbs相比10E12和12B12的结合给出了更高的最大信号。小鼠IgG1、IgG2a和IgG2b同种型对照未显示出可检测的对BJAB的结合，HRP-结合的抗-小鼠IgG Fc检测抗体显示出对这些同种型同等地结合。在BJAB和BHK结合分析中均对MAbs V3-1m和B9C11进行评价(图20)。虽然这些阻断型抗体均与鼠类BR3结合，仅V3-1m结合人BR3。V3-1h的结果与V3-1m观测的结果类似。
实施例6-抗原表位定位ELISA 通过酶联免疫吸附分析(ELISA)进行抗原表位定位研究，其中未标记的mAbs的稀释曲线与生物素化的2.1，9.1，11G9或1E9竞争性地结合vhBR3-Fc(图2)。完全阻断mAbs的结果(11G9，2.1和9.1)表明抗原表位对11G9结合在空间上位于对mAbs2.1及9.1的抗原表位之间，表明2.1和9.1均有效地替代了生物素化的11G9的结合，但是对彼此间的替代仅显示出最低的能力。在竞争性BJAB结合分析中，三种mAbs(1E9，7B2和8G4)表现为部分阻断剂。在该抗原表位定位的ELISA中，如果它们仅部分抑制11G9，2.1和9.1的结合，这些mAbs显示出结合至中心BAFF阻断位点的周围。最终，如果它仅可被部分阻断剂1E9替代，非阻断mAb，12B12显示出结合至距离阻断抗体区域更远的位置。
同时也进行定位研究来评价V3-1m、B9C11和P1B8对小鼠BR3的结合。结果证明，两种阻断mAb(V3-1m和B9C11)能交叉竞争地结合小鼠BR3，而非阻断mAb P1B8显示出结合独立的抗原表位(图22)。
下表是竞争性BJAB细胞结合分析结果的总结(表8)。搜集了几个月内进行的分析的结果。根据标明的实验数“n”计算平均IC50。
表8 n/a＝未检测到抑制或不能计算IC50 +/-＝抗体部分抑制的生物素化的BAFF结合 下表是直接BJAB细胞结合分析结果的总结(表9)。搜集了几个月内进行的分析的结果。虽然多数抗体显示出显著的剂量依赖的信号，三种mAb显示出仅产生部分结合，而与其它相比两种mAb重复地显现出更高的最大信号。根据标明的实验数“n”计算平均EC50。
表9 n/a未检测到结合或不能计算EC50 +/-＝部分结合 人源化的抗-BR3抗体(IgG)也阻断BAFF对BJAB细胞上的BR3的结合，并结合BJAB细胞上的BR3。参见如下表10。
表10 *“h”表示人源化的；“ch”表示嵌合体。
实施例7-抗BR3抗体对B细胞增殖的拮抗作用和激动作用 (a)2.1、9.1和11G9抑制人B细胞增殖 利用CD19 MACS珠(Miltenyi Biotec)通过阳性选择从外周血单个核细胞中分离B细胞。对增殖分析，B细胞在平底96孔板中配置为2×105细胞/孔细胞，配置三份。将细胞与抗-IgM(10mg/ml)(JacksonImmunoresearch)，mBAFF(5μg/ml)及表明的抗BR3抗体培养5天，或与蛋白培养5天。所用抗体为嵌合在hIgG1背景中并从组织培养物中纯化的嵌合抗体。然后在培养的最后6小时，将细胞用1mCi/孔的氚标记的脱氧胸腺嘧啶苷进行冲击，收集到过滤器上并计数。结果如图23所示。
(b)V3-1抑制鼠B细胞增殖 用来自Miltenyi的B细胞分离试剂盒，根据生产商的指导，从2-4个月龄的C57BL/6小鼠或抗-HEL BCR转基因小鼠制备脾脏B细胞。我们始终获得纯度超过95％的B细胞。将B细胞在含有10％热灭活的FCS，青霉素/链霉素，2mM L-谷氨酰胺和5×10-2μMβ-巯基乙醇的RPMI-1640培养基中培养。
在存在或不存在各种浓度的抗-BR3 mAb的条件下，将纯化的B细胞(105 B细胞最终体积200μl)用抗-小鼠IgM Ab 5μg/ml(IgG，F(ab’)2片段)(Jackson ImmunoResearch Laboratories)或卵溶菌酶(Hen EggLysozyme(Sigma))，以及用或不用BAFF(2ng/ml或10ng/ml)，进行培养。通过48小时刺激过程中最后8小时的3H-脱氧胸腺嘧啶苷(1μCi/孔)摄取来检测增殖。在某些实验中，将抗-BR3 mAb及BR3-Fc融合蛋白用PCR仪预沸腾5分钟以使其失活(对照)。
图24显示，象BR3-Fc一样，在抗-IgM介导的原代鼠类B细胞增殖过程中，B9C11和V3-1m均能抑制BAFF共同刺激活性。在存在或不存在各种剂量的抗-IgM抗体的条件下，B9C11和V3-1m均不显示任何对B细胞增殖的直接作用(数据未示出)。还观察到V3-1m和B9C11(非煮沸过的V3-1m或B9C11)对来自抗-HEL BCR转基因小鼠的B细胞的增殖的抑制(数据未示出)。两种抗体均非激动性的，因为它们本身没有触发正常鼠类B细胞增殖。
(b)其它抗体 利用CD19 MACS磁珠，根据制造商的方案(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)，通过阳性选择从外周血单个核细胞中分离人B细胞。细胞或者分离后直接使用，或者在液氮中冷冻留待后续使用；在该分析中新鲜细胞和冷冻细胞效果相当。将B细胞以1×105细胞/孔在带有清洁的平底孔的黑色96-孔板(PE Biosystems，Foster City，CA)中进行培养。
为评价抗-BR3抗体的拮抗作用，将细胞用可溶重组BAFF(10ng/ml)和F(ab’)2山羊抗-人IgM(Fc特异性)抗体(4μg/ml)(JacksonImmunoResearch，West Grove，PA)，在存在或不存在浓度在100nM至1.3pM(15μg/ml-1ng/ml)范围的各种浓度的抗-BR3抗体的条件下，进行孵育。在第6天通过向每一分析孔中加入Celltriter Glo(Promega，Madison，WI，根据制造商的指导重组)来评估B细胞增殖。在室温孵育10分钟后，在光度计中对培养板进行读数。
通过在仅有抗-IgM抗体(4μg/ml)存在或者在抗-IgM加“交联”的F(ab’)2山羊抗-人IgG Fc抗体(Pierce，Rockford，IL，30μg/ml)存在，且不存在BAFF的条件下通过孵育抗-BR3抗体(100nM至1.3pM)来评估抗-BR3抗体激动性刺激B细胞增殖的潜力。如上所述，在第6天用Celltiter Glo来对增殖进行评估。
图25显示9.1-RF阻断BAFF-依赖的B细胞增殖，但不会激动。
图26显示在抗-IgM存在下2.1-46刺激B细胞增殖，表明其作为激动剂发挥作用。
实施例8-使用BIACORE进行亲和性检测 材料和方法 通过用Pharmacia BIAcore_3000(BIAcore AB，Uppsala，Sweden)在室温进行表面等离子体共振来检测实时生物特异性相互作用(Karlsson，R.，et al.(1994)Methods697-108；Morton，T.A.和Myszka，D.G.(1998)Methods in Enzymology 295268-294)。通过伯胺基团将人BR3 ECD或vBR3-Fc固化至传感器芯片(CM5)。通过以5μl/分钟的速度注射20μl的0.025M N-羟基琥珀酰亚胺与0.1M N-乙基-N’(二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的混合物，来使羧甲基化的传感器芯片表面基质活化。以5μl/分钟的速度注射5-10μl的溶于10mM醋酸钠中的5μg/ml的BR3 ECD或vBR3-Fc溶液，pH4.5。偶联后，通过注射20μl的1M乙醇胺，pH8.5，来封闭芯片上未被占据的位点。流动缓冲液(runningbuffer)为含0.05％聚山梨酯20的PBS。对于动力学检测，以30μl/分钟的流量向流动细胞中注入抗-BR3抗体在流动缓冲液中的两倍系列稀释液(6.2-100nM或12.5-200nM)，并使结合的抗-BR3抗体解离20分钟。通过注入20-30μl 10mM甘氨酸·HCl(pH1.5)来使结合表面再生。使用流动细胞一作为参照细胞，该细胞经活化但不具有固化的BR3 ECD或BR3-Fc。没有明显的抗-BR3抗体对流动细胞一的非特异性结合。使用1∶1的结合模型采用全局拟合法(global fitting)进行数据分析。同时拟合结合和解离速度常数(BIAevaluation software)。对选定的测试抗体，无论样本是以浓度递增还是浓度递减的顺序操作，都得到类似的结果。
通过BIAcore检测抗-BR3抗体对BR3 ECD或BR3-Fc的结合动力学。将BR3 ECD或vBR3-Fc固化到传感器芯片上，并将抗体的系列稀释液注入到流动细胞上(表11和12)。或者，将抗-BR3抗体固化到传感器芯片上，并将BR3 ECD的系列稀释液注入到流动细胞上(表13)。采用高流率来使物质输送作用最小。将人源化的Fab和人源化的IgG抗体的结果并列比较。使用溶液中的IgG获得的表观结合亲和性高于使用溶液中的Fab获得的结果，这可能归因于亲合力作用(avidityeffects)因为IgG是二价的。来自9.1、2.1、11G9以及V3-1抗体系列的抗-BR3抗体的表观动力学参数如表11-13所示。
A.BR3 ECD在芯片上 表11 BR3-Fc在芯片上 表12 B.抗体在芯片上(ECD在溶液中) 表13 实施例9-功能性抗原表位定位 使用以下实验来功能性地定位BR3上的对抗-BR3抗体结合至关重要的抗原表位。
用于小BR3鸟枪筛选(miniBR3 Shotgun Scanning)的文库构建。通过前述噬菌粒pW1205a的连续突变构建了显示M13噬菌体上的抗原表位标签的小BR3的文库(Weiss，G.A.，et al.，(2000)Proc Natl Acad SciUSA 978950-4；Gordon，N.et al.，(2003)Biochemistry 425977-83)。该噬菌粒编码融合至人生长激素的N-末端，其后为M13基因-8的主要外壳蛋白的肽抗原表位标签(MADPNRFRGKDLGG)。pW1205a用作Kunkel诱变的模板(Kunkel，J.D.，et al.，(1987)Methods Enzymol154367-82)以产生用于小BR3鸟枪文库构建的适当模板。在待突变区，用编码包含TAA终止密码子的小BR3的部分序列的DNA片段对编码人生长激素的pW1205a片段进行寡核苷酸替代。产生两个新的模板，模板1(编码残基34-42)和模板2(编码残基17-25)，如前所述将每一模板用于构建小BR3文库(Sidhu，H.et al.，Metods Enzymol 328333-63)。将每一“部分小BR3”模板用作利用突变的寡核苷酸的Kunkel突变的模板，该突变的寡核苷酸设计用来以小BR3的互补区域替代模板的终止密码子，同时在所需位点引入突变。在突变位点，野生型位点被相应的鸟枪丙氨酸密码子(Weiss，如上所引用)替代。这两个文库中每一个都允许在小BR3的11个残基处突变，但在文库之间没有相同的突变位置。文库1编码位置17，18，20-23，25，27，28，30和33处的鸟枪密码子，而文库2编码位置26，29，31，34和36-42处的鸟枪密码子。每一文库都包含2×109个成员，使得可以充分代表理论多样性(＞104倍过量)。
文库的分选和分析。将来自上述两个文库中每一文库的噬菌体进行相对于固化在96-孔Nunc Maxisorp免疫培养板上的中和抗体9.1，2.1，8G4，11G9(功能筛选(functional selection))和V3-1或抗-标签抗体(3C82F4，Genentech，Inc.)(展示筛选(display selection))的几轮次的结合筛选。将展示筛选包括在内，以标准化对于文库成员之间的表达差异的抗-BR3抗体结合筛选。将从每一靶标上洗脱的噬菌体在E.coliXL1-蓝中繁殖；将扩增的噬菌体用于相对前一轮中的相同靶标的筛选。两轮筛选后，将来自每一文库和筛选的48个独立克隆生长在96孔板形式中含有羧苄青霉素和KO7辅助噬菌体的400L 2YT培养基中。将这些培养物的上清直接用于噬菌体ELISA，以测定能结合抗体靶标的噬菌体-展示的小BR3变体，对它们进行相对选择以确认结合。
通常根据如下进行噬菌体ELISA。在室温下，将Maxisorp免疫培养板(96孔)用捕获靶蛋白(抗-BR3抗体)包被两小时(100μl，在50mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)中为5μg/ml)。然后将培养板用磷酸盐缓冲液(PBS)中的0.2％BSA封闭1小时，用PBS，0.05％Tween 20清洗8次。将噬菌粒系列稀释入BSA封闭缓冲液中，并将100μl转移至包被后的小孔中。1小时后，用PBS，0.05％Tween 20清洗培养板8次，与100μl位于BSA封闭缓冲液中的1∶3000辣根过氧化物酶/抗-M13抗体偶联物孵育30分钟，然后用PBS，0.05％Tween 20清洗8次及PBS清洗两次。培养板用二盐酸邻苯二胺/H2O2溶液(100μl)显色，用2.5M H2SO4(50μl)终止，并在492nm检测吸光度。
发现所有测试的克隆在其各自的ELISA中均显阳性，然后如前所述进行测序(Weiss，如上引用)。翻译并比对具有可接受质量的序列。
预先检测BAFF结合及展示筛选的数据(Gordon，如上引用)。类似地计算抗-BR3结合和展示筛选的数据。通常，在两轮对抗-BR3抗体或抗-标签抗体结合的选择后，将在已测序克隆中发现的野生型残基(wt)和每一丙氨酸突变(mut)的数量制表。将野生型残基的数量除以突变体的数量以确定每一位置的每一突变的wt/mut比例(未示出)。
如前所述计算F-值(Weiss，如上引用；Gordon，如上引用)。通常，计算标准化的频率比(F)以定量化每一BR3突变对BAFF或抗BR3-抗体结合的作用，同时计算展示效率即F＝[wt/突变体(BAFF或抗-BR3抗体筛选)]除以[wt/突变体(展示筛选)]。有害的突变具有＞1的比值，而有益的突变具有＜1的比值；粗体表示＞10倍的作用。显示出高于10倍作用(即F＞10或F＜0.1)的突变视为特别显著。
表14.F值 数据显示11G9、9.1和2.1利用人和小鼠BR3之间的序列变体区域(表14)。V3-1的功能性抗原表位模拟在人与小鼠BR3之间高度保守的BAFF的功能性抗原表位。该数据的示意图如图27所示。图27中画圈的残基表示小-BR3序列外的潜在的O-连接的糖基化作用。11G9，2.1，9.1和V3-1抗体不需要BR3糖基化来结合。9.1抗体的功能性抗原表位包括L38和R39。2.1的功能性抗原表位包括G36。V3-1的功能性抗原表位包括L28和L29。11G9的功能性抗原表位包括P21和A22。在该分析中，A34、F25和V33残基的丙氨酸筛选突变也破坏9.1、2.1、11G9和V3-1对BR3的结合，这些残基对保持BR3在噬菌体中的结构完整性可能是至关重要的。
实施例10-CLL表达 将来自慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者的外周血细胞用抗B细胞标志物(CD19、CD27、CD20、CD5和BR3)抗体染色(图28)。用V3-1染色BR3。虽然该特定患者在其B细胞上没有CD20表达(CD19+左底部)，但BR3以显著的水平表达(参看直方图的峰-盘B)。对来自12位其它CLL患者的12个样本进行了评价。12个样品中有12个表达BR3。这些数据显示抗-BR3抗体将对这一指征有治疗价值。
实施例11-抗体依赖的细胞毒性 基本如所述(Shields et al，J.Biol.Chem.2766591-6604(2001))使用乳酸脱氢酶(LDH)读出装置，分析抗-BR3嵌合单克隆抗体介导BJAB细胞(表达CD20的Burkitt’s淋巴瘤B细胞株)的天然杀伤细胞(NK细胞)溶解的能力(ADCC活性)。使用RosetteSep_人NK细胞富集鸡尾酒剂(StemCeLl Technologies，Vancouver，B.C.)，根据制造商的方案，从来自正常人供体的100mL肝素化血液制备NK细胞。将血液用等体积的硫酸盐缓冲液稀释，在15mL FicoL1-PaqueTM(AmershamBioscience，Uppsala，Sweden)上分层，并在1450rpm离心20分钟。将层间界面处的白细胞分配至4个干净的50-mL管中，这些管中充满含有15％胎牛血清的RPMI培养基。将管在1450rpm离心20分钟并弃去上清液。将NK细胞在分析培养基(F12/DMEM 50∶50不含甘氨酸，1mM HEPES缓冲液pH7.2，青霉素/链霉素(100单位/mL；Gibco)，谷氨酰胺，和1％热灭活的胎牛血清)中稀释至2×106细胞/mL。
将抗体在分析培养基中的系列稀释液(0.05mL)加入96孔圆底组织培养板中。将BJAB细胞在分析缓冲液中稀释至浓度4×105/mL。将BJAB细胞(0.05mL每孔)与96孔板中的稀释的抗体混合，并在室温孵育30分钟以使得抗体结合至BR3(调理作用)。
通过向每孔中加入0.05mL NK细胞来启动ADCC反应。在对照孔中，加入2％的Triton X-100。然后将培养板在37℃孵育4小时。使用细胞毒性(LDH)检测试剂盒(Kit#1644793，Roche Diagnostics，Indianapolis，Indiana)，按照制造商的指导，检测释放的LDH水平。向每孔中加入0.1mL的LDH显色剂，随后混合10秒。然后将培养板用铝箔覆盖，并在室温和黑暗条件下孵育15分钟。然后读取490nm处的光密度，并通过除以对照孔中测量的总LDH来计算溶解(lysis)％。将溶解作为抗体浓度的函数来作图，并使用4-参数曲线拟合(KaleidaGraph)来去定EC50浓度。
所有人源化的抗-BR3抗体在引导NK细胞介导的BJAB细胞(人Brukitt’s淋巴瘤)溶解中具有高度活性，其相对效力浓度低于1nM(图29)。用Ramos(人Burkitt’s淋巴瘤)和WIL2s细胞(人B-细胞淋巴瘤)替代BJAB细胞来进行类似的分析。图29A和图29B分别显示了借助抗-BR3抗体的Ramos和WIL2s细胞的ADCC杀伤。使用抗-Her2抗体(4D5)作为阴性对照。通常，对BR3具有高亲和性的抗体在抗体依赖的细胞杀伤分析中效力更高。
实施例12-利用BR3-Fc或抗-BR3抗体的B细胞去除 将抗-BR3抗体去除B细胞的能力与BR3-Fc相对比。六周大的BALB/c小鼠在第0天时用500μg对照(小鼠IgG2a)、小鼠BR3-Fc或抗-BR3(V3-1)抗体进行腹膜内处理。在第1、3、7和15天将每组的小鼠处死。图30显示了处理第7天的血液、淋巴结和脾脏中的B细胞的流式细胞术分析。与BR3-Fc和对照处理的动物相比，在V3-1处理的小鼠中血液、淋巴结和脾脏显示出更少的B细胞(CD21+CD23+和CD21高CD23低)。与对照Fc处理的动物相比，BR3-Fc处理先前显示为明显减少B细胞的数量。圆圈边上的粗体数字表示该特定区域(圆圈)中所含的淋巴细胞的百分比。
在类似条件下的另一实验中，与BR3-Fc和对照处理的动物相比，在V3-1处理的小鼠中血液、淋巴结和脾脏的FACS分析通常显示出更少的B细胞(CD21+CD23+和CD21高CD23低)(图31)。与对照动物相比，特别是在后期的时间点，BR3-Fc处理显著减少B细胞的数量。
图31显示了第1、3、7和1 5天时1ml血液中所含的B细胞的绝对数量；淋巴结中的B细胞％，以及脾脏中的滤泡(FO-CD21+CD23+)或边缘区(MZ-CD21高CD23低)的绝对数量。数据表示为平均值+/-标准误的形式(n＝4)。
在类似条件下的另一实验中，脾脏中的浆母细胞(顶行-IgM+Syn+)以及生发中心细胞(中间行-B220+CD38低)的FACS分析显示出抗-BR3抗体(V3-1)可以去除某些浆母细胞和生发中心细胞(图32)。与对照动物相比，BR3-Fc显著减少浆母细胞的数量。插图A中记载的数字代表在该特定区域中所含的淋巴细胞的百分比。在图上的直方图中数据表示为平均值+/-标准误的形式(n＝4)。
数据显示，与BR3-Fc处理相比，用抗-BR3处理后观察到更大程度的B细胞去除，该融合蛋白BR3-Fc阻断BAFF对BR3的结合但不具有ADCC功能。
实施例13-最大程度减少B细胞的Fc-依赖的细胞杀伤和BAFF阻断 用单剂量10mg/kg的抗-BR3抗体(mV3-1)，带有D265A/N297A突变的mV3-1，非-BAFF阻断抗-BR3抗体PIH11或BR3-Fc来处理BALB/c小鼠。在处理后第6天通过流式细胞术来分析来自脾脏或外周血的B细胞。处理后外周血B细胞(B220+)和脾脏滤泡B细胞(CD21+CD23+)的绝对数量分别在图33A和图33B中显示。数据表示为平均值+/-标准误的形式(n＝4)。D265A/N297A Fc突变去除了FcγRIII的体外结合。该结果表明虽然两种非阻断抗体，具有缺失Fcγ受体结合的抗-BR3抗体和BR3-Fc，均可减少B细胞群，同时具有Fc-依赖的细胞杀伤活性和BAFF-阻断活性的抗-BR3抗体是强力得多的B细胞减少/去除剂。这归因于将两种活性即抗体依赖的细胞毒性(ADCC)和B细胞存活阻断合并在一个分子中。
实施例14-狼疮小鼠模型 在狼疮小鼠模型中测试抗-BR3抗体。为进行这些研究，在第0天和第7天用200μg的mIgG2a(抗-gp120)(对照)或mBR3-Fc或mV3-1(抗-BR3抗体)处理(ip)约8月龄的NZB/W狼疮-倾向(prone)阳性小鼠。通过流式细胞术来分析血液、淋巴结和脾脏(滤泡-FO和边缘区-MZ)中的B细胞。数据表达为独立的小鼠数据点(n＝4)。类似BR3Fc，抗-BR3抗体能减少这种小鼠自免疫株中的B细胞(数据未示出)。
在长期研究中，对显示大约100mg/dl蛋白尿的7月大的NZBxWF1小鼠(狼疮肾炎小鼠模型)用300μg mV3-1，mBR3-Fc或对照mIgG2a抗体(抗gp120)每周两次处理约6个月时间。每一处理组含25只小鼠。每月评估所有小鼠在疾病随时间的进展的改善(图34A)。随时间的进展检测为存活小鼠或具有低于300mg/dl蛋白尿水平的小鼠的百分比。此外，在处理后约6个月，将存活小鼠处死，并在FACS分析中分析。抗-BR3抗体处理小鼠中的外周B细胞(定义为B220+)的中位数低于BR3-Fc处理小鼠和对照小鼠(图34B)。抗-BR3抗体处理小鼠和BR3-Fc处理小鼠中的总脾脏B细胞(B220+)的中位数低于对照小鼠(图34C)。抗-BR3抗体和BR3-Fc处理小鼠中的活化的脾脏B细胞(B220+CD69+)的中位数低于对照小鼠(数据未示出)。抗-BR3抗体(p＜0.00001)和BR3-Fc(p＜0.02)处理小鼠中的脾脏浆细胞/浆母细胞(CD138+)的中位数也低于对照小鼠(数据未示出)。BR3-Fc(p＜0.02)和抗-BR3抗体(p＜0.00001)处理小鼠中的脾脏生发中心B细胞(B220+CD38低)的中位数明显低于对照小鼠(数据未示出)。
实施例15-SCID模型 在重症联合免疫缺陷(SCID)模型中测试抗-BR3抗体的B细胞去除活性。在第0天，将在B细胞和CD4 T(＞90％)细胞中磁性富集的4千万人外周血单个核细胞(PBMCs)，，脾内转移至亚致死量照射(350拉德)的6周大的scid米色小鼠中。在第0天，用500μg抗-BR3抗体(具有人IgG2a恒定区2.1或V3-1)，人IgG2a同种型对照或小鼠BR3-Fc处理小鼠。在第4天将小鼠处死，并通过流式细胞术对其脾脏进行人B细胞分析。通过抗-BR3处理能显著减少活化的/生发中心(GC)B细胞(顶部)和浆母细胞(底部)，而通过BR3-Fc仅显著减少活化的/GC细胞(图35A-D)。描述了10只独立小鼠/组，并对每组平均。
在其它实验中，将人PBMC中的CD8 T细胞，CD16/CD56 NK细胞和CD14单核细胞磁性去除，并脾内注射入经辐射的scid-米色小鼠(40×106/小鼠)。同一天，用300μg/小鼠人抗-人BR3(9.1RF)或同种型对照(人IgG1)处理小鼠。七天后，将小鼠处死，用流式细胞术对其脾脏中的人B细胞活化进行评估。在用抗BR3处理的组中活化的及生发中心B细胞(CD19高CD38+)显著减少(图35E)。
在另一试验中，用标准方法从来自正常人供体(Blood Centers ofthe Pacific，San Francisco，CA)的Leukopack分离人PBMC。将PBMC重悬在40×106/30μl PBS中，并在脾内注射过程中始终保持在冰上。使用铯137源以350拉德对受体小鼠进行亚致死量辐射。辐射4小时后，所有小鼠接受30μl PBS中的40×106人PBMC的脾内注射(i.s.)。在麻醉下，对手术位点刮毛并用聚维酮碘和70％酒精处理。在紧靠肋缘下方的左胁开1cm的皮肤切口，随后开腹壁和腹膜切口。小心地暴露脾脏，并注射30μl细胞悬浮液。分别用5-OVicryl和手术钉封闭肌肉层和皮肤中的切口。在第0天，在细胞转移前4小时，用单次300μg剂量的溶于200μl盐水的Ab溶液的静脉内注射液对所有小鼠进行处理。辐射后的7天中，向饮水中加入多粘菌素B 110mg/升和新霉素1.1g/升。
实验组 组1赋形剂(n＝9)。
组2抗-BR3(9.1RF)(n＝9)。
组3抗-BR3(9.1RF N434A)(n＝9)。
在第4天对所有的小鼠实施安乐死。通过流式细胞术分析对其脾脏内的B淋巴细胞亚群进行定量。在第4天收集血清样本(100μl)，以确认在时间终点的Ab血清浓度。
在转移入scid/米色小鼠后，人PBMC衍生的B细胞迅速扩展并活化。细胞转移后第4天之前，脾脏中的主要B细胞种群显示出活化的B细胞CD19高/CD38int表型(抗-CD19和抗-CD38抗体)。安慰剂处理组中的活化B细胞平均百分率为10.1％，而在9.1RF处理组中的活化B细胞平均百分率为0.46％。在转移后的第4天，当将9.1RF和9.1RFN434A抗体的减少B细胞前体以及通过BAFF阻断抑制活化B细胞扩展的活性进行对比，均显示统计学显著的抑制作用(使用Dunnett’s检验，与安慰剂对照组比较，9.1RF和9.1RF N434A的p值均＜0.0001)。
参见如下。
结果 平均和标准差 抗-BR3Ab(9.1RF和9.1RF N343A)均对人-scid体内模型中的B细胞存活显示出明显的降低和抑制作用。由于该模型体内测试ADCC和BAFF存活阻断，两种Ab均具有足够的性能和潜能来治疗具有B细胞成分和B细胞恶性肿瘤的人自身免疫性疾病。
实施例16-FcRn结合 改变9.1RF IgG抗体(SEQ ID NOs74和75)的残基N434(根据EU编号体系)，以增强对人FcRn受体的结合。在CHO细胞中产生IgG抗体。
使用BIAcore-3000系统(BIAcore Inc.)测定9.1RF及其突变体的结合亲和性。使用pH4的10mM醋酸钠，根据制造商的指导，通过氨基偶联剂将人和短尾猴FcRn固定到CM5芯片上。在25℃进行偶联。所得最终密度是700-1000RU。
通过在25℃注射9.1RF或其突变体在pH 6的流动缓冲液(PBS pH6，0.05％Tween-20)中的三倍系列稀释液2分钟，流率为20μl/分钟，来进行动力学检测。所用的抗体最大浓度为1μM。检测解离速率10分钟。通过注射20μl的10mM Tris pH9，150mM NaCl注射液来再生表面，结合活性损失最小。结果如下表15所示的ka、kc和KDa值。
通过在25℃注射9.1RF或其突变体在流动缓冲液中的三倍系列稀释液6分钟，流率为2μl/分钟，来进行平衡结合实验。解离持续2分钟。所用的抗体最大浓度为1μM。平衡结合实验的流动缓冲液为PBSpH6，0.05％Tween-20或者PBS pH7.4，0.0％Tween-20。通过注射20μl的10mM Tris pH9，150mM NaCl注射液来再生表面。使用BIAevaluation v3.2软件来评估Sensorgram。结果显示在图36中，并如下表15所示的KD值(KDb)。
综上所述，结果显示与9.1RF相比，9.1RF的N434A和N434W突变体在pH6.0和pH7.4时对人FcRn和短尾猴FeRn具有更大的亲和性。并且，与N434A突变体相比，N434W突变体在pH6.0和pH7.4时对人FcRn和短尾猴FcRn具有更大的亲和性。该数据表明，与具有9.1RF的Fc序列的抗体相比，每一突变体都具有提高的对人和短尾猴FcRn受体的亲和性以及更长的体内半衰期。
表15 实施例17-Fcγ受体结合 如前所述(Shields，R.L.，et al.，(2001)JBC 2766591-6604)制备缺少其跨膜及细胞内结构域、且在其C末端包含His-标签的谷胱甘肽S转移酶(GST)序列的人FcγR(以下也称为hFcgR)。
在4℃，将MaxiSorp 96孔微孔板(Nunc，Roskilde，Denmark)用2μg/ml抗-GST(克隆8E2.1.1，Genentech)包被，100μl/孔在50mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)中。用含0.05％聚山梨酯的PBS，pH7.4(清洗缓冲液)清洗培养板，并用150μl/孔的含0.5％BSA的PBS(pH7.4)封闭。在室温孵育1小时后，用清洗缓冲液清洗培养板。将人Fcγ受体以在含0.5％BSA，0.05％聚山梨酯20的pH7.4的PBS(分析缓冲液)的形式以0.25μg/ml，100μl/孔加入培养板中。孵育1小时后，用清洗缓冲液清洗培养板。对低亲和性的Fcγ受体IIa，IIb，III(F158)和高亲和性III(V158)，将抗体与山羊F(ab’)2抗-κ(Cappel，ICN pharmaceuticals，Inc.，Aurora，Ohio)或抗-γ(BioSource，CamariLlo，CA)抗体以1∶2(w/w)的比例孵育1小时，以形成抗体复合物。将11个在分析缓冲液中的复合的IgG抗体(1.17-5000ng/ml在三倍系列稀释液中)的两倍系列稀释液加入培养板中。对高亲和性FcγRI，将11个在分析缓冲液中的未复合的IgG抗体(0.017-1000ng/ml在三倍系列稀释液中)的两倍系列稀释液加入培养板中。孵育两小时后，用清洗缓冲液清洗培养板。通过以100μl/孔加入分析缓冲液中的过氧化物酶标记的山羊F(ab’)2抗-人IgG F(ab’)2(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)来检测结合的IgG。孵育1小时后，用清洗缓冲液清洗培养板，并以100μl/孔加入底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)(Kirkegaard & Perry Laboratories)。通过以100μl/孔加入1M磷酸来终止反应。在multiskan Ascent分析仪(ThermoLabsystems，Helsinki，Finland)上读取450nm处的吸光度。
计算标准曲线中点的吸光度(mid-OD vs.ng/ml)。用四参数非线性回归曲线拟合程序(KaleidaGraph，Synergy software，Reading，PA)从滴定曲线确定该mid-OD的对应的标准浓度和样本浓度。通过用标准mid-OD浓度除以样本的mid-OD浓度来计算相对活性。先前显示为结合Fcγ受体的Herceptin_Ab在此用作阳性对照。
对所有的FcγR，所报导的结合值为每一9.1-RF变体相对于9.1RF的结合，假定(A450nm(变体)/A450nm(9/1RF))对FcγRII和FcγRIIIA为0.33或1μg/ml，对FcγRI为2μg/ml。大于1的值表明相对于9.1RF，变体的结合得到提高，而低于1的比例表明相比9.1RF结合降低。hFcγRIII(F158)和hFcγRIII(V158)分别指对人IgG具有更低亲和性和更高亲和性的hFcγRIII同种型。
表16和图37显示，测试的9.1抗-BR3抗体类似地结合FcγR并应当促进ADCC。
表16 实施例18-用抗-CD20和抗-BR3抗体去除B细胞 用200μg mIgG2a(对照)、或m2H7(鼠抗-人CD20抗体)或mV3-1对6周龄的人CD20转基因阳性小鼠进行处理。抗体处理后，1小时、1天、8天及15天时分析血液中的B细胞。通过流式细胞术分析来自血液、淋巴结的B细胞。数据表示为平均值+/-标准误(n＝4)。
虽然在早期时间点(1小时)和1天时，与抗BR3抗体相比抗-CD20抗体去除更多的细胞，在第8天和第15天时，抗BR3抗体产生的去除超过抗-CD20抗体产生的去除。图38显示了血液及淋巴结中的处理后B细胞水平分析。
实施例19-滤泡及边缘区B细胞的去除 用200μg mIgG2a(对照)、或m2H7(小鼠抗-人CD20)或mV3-1对6周龄的人CD20转基因阳性小鼠进行处理。mAb处理后，1天、8天及15天时分析血液中的B细胞。通过流式细胞术分析来自脾脏的B细胞。将上述三种处理的脾脏内滤泡(FO-CD21+CD23+)或边缘区(MZ-CD21高CD23低)的绝对数字进行对比。数据表示为平均值+/-标准误(n＝4)。
虽然在1天时，与抗BR3抗体相比抗-CD20抗体去除更多的细胞，在第8天和第15天时，抗BR3抗体在滤泡及边缘区B细胞中产生的去除均超过抗-CD20抗体产生的去除(图39)。
实施例20-在短尾猴中的半衰期 将对FcRn具有不同结合亲和性的三种人源化单克隆抗-BR3抗体(9.1RF，9.1RF N434A和9.1RF N434W)在短尾猴中的药物代谢动力学进行对比。将4-5年龄体重2-4kg的17只公短尾猴和17只母短尾猴按重量随机分入三个组中。组1、2和3的动物分别接受单iv剂量的20mg/kg野生型、N434A突变体、或N434W突变体。该研究的设计如下。
Conc.＝浓度 a基于最新的体重计算总剂量体积(mL)。对剂量体积进行插值至非常接近0.1mL。
在以下时间点，从每一动物的外周静脉收集约1.0mL用于药代动力学分析的血液 ·给药前 ·在研究日1，给药后30分钟和6小时 ·在研究日2、3、4、5、8、11、15、18、22、29、36、43、50、57、64、71、78、85、92、99、106、113、120、127和134各一次 在以下时间点，从每一动物的外周静脉收集约1.0mL用于抗-治疗抗体分析的血液 ·给药前 ·在研究日15、29、43、57、71、85、99、113、127和134各一次 将用于药代动力学(PK)和抗-治疗抗体(ATA)分析的血液样本收集入血清分离管中，并在室温凝结约30-80分钟。通过离心(室温2000×g，15分钟)得到血清(约0.5mL)。将血清样本转移至预先标记的1.5mL埃彭道夫管(eppendorf)中，并在设定为保持在-60℃至-80℃的冰箱中保存，直至在干冰上打包直至分析。
通过使用ELISA分析测定每一血清样本中每种抗体的浓度。血清中的定量分析下限(L1QQ)为0.05μg/mL。低于该界限的值记为低于可报告值(LTR)。使用桥接ECLA分析测定每一样本中的抗-治疗抗体。
在数据分析中，使用与方案偏差最小的标称剂量和样本收集时间。雄性和雌性短尾猴中的血清9.1RF、9.1RFN434A和9.1RFN434W浓度的平均值和SD值使用Excel(2000版，Microsoft Corporation，Redmond，WA)计算，并用SigmaPlot(9.0版；Systat Software，Inc.，Point Richmond，CA)绘图。从所有数据分析中排除低于可报告值的血清浓度。当n≤2时不计算SD值。结果显示为三张重要的图。
使用Gauss-Newton(Levenberg和Hartley)二室模型，以1 over y hat加权方式(WinNolin3.2版；Pharsight Corporation；Mountain View，CA)来估算每一动物的PK参数。组1的10只短尾猴中有8只(野生型；9.1RF)和组3的10只短尾猴中有5只(9.1RFN434W)在第57日前出现ATA。通常，特定时刻检测到ATA与血清浓度在该期间或之后急剧下跌相关，这导致更短的终半衰期及降低的药物暴露。为了理解ATA响应对PK作用的强度，用两种方法计算每一组的平均PK参数。在方法1中，用来自每组的全部10只短尾猴的数据计算PK参数(平均值±标准差)。在方法2中，仅使用未在第57日前出现抗-治疗抗体的短尾猴(组1为n＝2，组2为n＝10，组3为n＝5)的数据来计算PK参数。对组1和3，与方法2相比，方法1产生较低的终半衰期(t1/2，β)和暴露(AUC)估算值。然而，使用这两种方法的总体结论是类似的。因此，本文报导的平均PK参数是采用方法1计算的(例如包括来自所有短尾猴的数据)。
结果 在单次iv快速注射(bolus)给药20mg/kg的9.1RF(野生型抗体)、9.1RFN434A(N434变体)和9.1RFN434W(N434W变体)后，血清浓度显示出两相分配，快速初始分布相其后是缓慢消失相(图1)。对每组估算的PK参数显示在表2中，并包括来自每组的所有10只短尾猴的数据。9.1RF(野生型抗体)的终半衰期(平均值±SD)是6.15±2.01天，并在10只短尾猴中的变化范围是4.24-11.0天。在两只57日时未出现ATA的短尾猴中的9.1RF平均终半衰期(t1/2，β)是8.95天。对9.1RFN434A(N434A变体)，平均终半衰期是14.1±1.55天，比9.1RF高1.6-2.3倍(p＜0.05)。对9.1RFN434W(N434W变体)，10只短尾猴中的平均值±SD的终半衰期是9.55±2.49天。该数值明显高于10只短尾猴中9.1RF(野生型抗体)的总平均t1/2，β(p＜0.05)，但类似于在两只未出现可检测的ATA的短尾猴中的9.1RF的平均t1/2，β值(8.95天)。上述观测到的9.1RF(野生型抗体)和9.1RFN434W(N434W变体)之间的t1/2，β差别可能是由这两组中的ATA响应混淆了。
浓度-时间曲线下的面积推导出9.1RF(野生型抗体)的极限值(AUC)为2440±398天*μg/mL，且对10只短尾猴的范围为1740-3140天*μg/mL。两只57日时未出现ATA的短尾猴中的9.1RF的平均AUC为2850天*μg/mL。对9.1RFN434A(N434A变体)，平均AUC为4450±685天*μg/mL，比9.1RF(野生型抗体)高1.6-1.8倍(p＜0.05)。在9.1RF(野生型抗体)和9.1RFN434W的AUC之间没有差异。
总之，在对短尾猴单iv剂量给药20mg/kg后，测试了9.1RF、9.1RFN434A和9.1RF434W的药代动力学。对9.1RF在56日前10只短尾猴中有8只出现了抗-治疗抗体(ATA)，而对9.1RFN434W在56日前10只短尾猴中有5只出现了ATA。对9.1RFN434A在56日前没有短尾猴出现ATA。相比9.1RF(野生型抗体)，9.1RFN434A显示出增加的终半衰期和增加的AUC(p＜0.05)。相比9.1RF，9.1RFN434W显示出轻微增加的终半衰期；但观测到的这种差别可能是由对9.1RF和9.1RFN434W的抗-治疗抗体响应混淆的。
*在WT&9.1RFN434W组中8/10和5/10短尾猴中的抗-药物抗体的存在可能会混淆WT&9.1RFN434W的PK参数(例如降低AUC和降低t1/2，β) **与WT不同，p＜0.05 实施例21-短尾猴中的B细胞消耗 抗-BR3(9.1RF称为WT)及FcRn变体N434A(称为9.1RFN434A)。在以下研究设计中用WT或9.1RFN434A对51只短尾猴给药。
在所有组中通过FACS监测外周B细胞(总的及B细胞亚群)随时间的去除，并表示为各动物基线的百分比。每一动物的基线值是给药前三个采样时间点的平均值。在每一尸检时间点通过FACS分析来分析组织B细胞亚群。对B细胞去除的组织分析包括脾脏、下颌淋巴结和肠系膜淋巴结(图40A和图40B)。
给药后，在所有给药组的血液中观测到明显的B细胞去除。在给药量20mg/kg×4剂的WT和9.1RFN434A组中，在第29日(尸检时间点)组织B细胞被清除。在WT 2mg/kg组中，组织内的B细胞去除较不显著。图41A-C显示了治疗后的B细胞亚群。
实施例22-具有增强ADCC活性的抗BR3抗体 设计了抗-BR3抗体9.1RF的Fc部分的氨基酸替代子，以增强该分子对B细胞瘤株的ADCC活性。通过定位的突变，该抗体的Fc区域突变为S298A/K326A/E333A/K334A或S298A/E333A/K334A (EU编号系统)。化学合成了氨基酸替代子特异的寡核苷酸，并根据Kunketet al.的方案(Methods in Enzymology(1987)154，367-382)用于编码9.1RF的质粒的寡核苷酸-定向的突变。通过基于二脱氧核苷酸的测序来确认变体的序列。使用Qiagen，Inc.描述的gigaprep方案，从E.coliXL-1 Blue(Stratagene，Inc.)的1L培养物(含50μg/mL carbenecillin的2YT基质)中纯化质粒DNA，该菌株用相关质粒转化，并在200rpm的振荡条件下在37℃生长。通过使用瞬时转染CHO细胞的纯化的质粒DNA，表达蛋白。通过在Protein A-Sepharose上进行色谱分离随后在SP-Sepharose上进行阳离子交换色谱，从1L培养物上清液中纯化出抗体。通过SDS-PAGE和氨基末端测序确认了纯化蛋白的身份。通过分析凝胶过滤色谱，所有纯化的抗体产生同一的峰，从静态光散射数据计算的摩尔质量为150,000±5000，且具有低于3％的聚集体含量。通过MALDI-TOF的N-连接的低聚糖分析显示了典型的重组抗体的碳水化合物组合物。
使用基于ELISA的分析评估变体抗体对Fcγ受体的结合。人Fcγ受体I，IIa，IIb，IIIa(F158)，IIIa(V158)和小鼠Fcγ受体I，II和III的细胞外区在CHO细胞中表达为His-标签的GST融合蛋白，并根据Shieldset al.(J.Biol.Chem.2766591-6604(2001))中所述进行纯化。对于ELISA分析，在包被有抗-GST抗体的微滴定板的小孔上俘获融合蛋白。加入变体抗体的稀释液，并使其结合，随后清洗所述小孔以去除未结合的抗体。对较弱的结合抗体，在将样本加入所述孔之前，将样本与抗-huκ-链抗体的Fab’s片段复合。用山羊抗-huFab’s抗体的HRP-偶联的Fab’s片段检测结合的抗体。通过使用4-参数方程评估结合曲线以计算EC50值，得到饱和时信号的50％的抗体浓度。在这些分析中，使用Herceptin_作为对照抗体，从EC50值的比例(EC50赫赛汀/EC50样本)计算结合的增强倍数。
这些数据显示所有抗-BR3抗体对人FcγRIIIa的F158和V158异型均具有增强的亲和性。所有变体在对人FcγRI的亲和性上的变化不明显。
基本如所述(Shields et al，J.Biol.Chem.2766591-6604(2001))使用乳酸脱氢酶(LDH)读出装置，分析抗-BR3抗体介导天然杀伤细胞(NK细胞)溶解BJAB细胞(表达BR3和CD20的Burkitt’s淋巴瘤B细胞系)的的能力(ADCC活性)。在该分析中，以5∶1的效应子靶标比例使用分离自对CD16的F/V158异型杂合的供体的NK细胞。使用RosetteSep_人NK细胞富集鸡尾酒剂(StemCell Technologies，Vancouver，B.C.)，根据制造商的方案，从100mL肝素化血液制备NK细胞。将血液用等体积的磷酸盐缓冲盐水稀释，在15mL Ficoll-PaqueTM(Amersham Bioscience，Uppsala，Sweden)上分层，并在1450rpm离心20分钟。将层间界面处的白细胞分配至4个干净的50-mL管中，这些管中充满含有15％胎牛血清的RPMI培养基。将所述管在1450RPM离心20分钟并弃去上清液。将NK细胞在分析培养基(F12/DMEM50∶50不含甘氨酸，1mM HEPES缓冲液pH7.2，青霉素/链霉素(100单位/mL；Gibco)，谷氨酰胺，和1％热灭活的胎牛血清)中稀释至2×106细胞/mL。
将抗体在分析培养基中的系列稀释液(0.05mL)加入96孔圆底组织培养板中。将BJAB细胞在分析缓冲液中稀释至浓度4×105/mL。将BJAB细胞(0.05mL每孔)与96孔板中的稀释的抗体混合，并在室温孵育30分钟以使得抗体结合至BR3(调理作用)。
通过向每孔中加入0.05mL NK细胞来初始化ADCC反应。在对照孔中，加入2％的Triton X-100。然后将培养板在37℃孵育4小时。使用细胞毒性(LDH)检测试剂盒(Kit#1644793，Roche Diagnostics，Indianapolis，Indiana)，按照制造商的指导，检测释放的LDH水平。向每孔中加入0.1mL的LDH显色剂，随后混合10秒。然后将培养板用铝箔覆盖，并在室温和黑暗条件下孵育15分钟。然后读取490nm处的光密度，并通过除以对照孔中测量的总LDH来计算溶解％。将溶解作为抗体浓度的函数来作图，并使用4-参数曲线拟合(KaleidaGraph)来确定EC50浓度。
所有抗-BR3变体在ADCC分析中均具有活性，得到低于1nM的EC50值(杀伤％vs抗体浓度)。Fc替代子通过减小EC50及增大最大杀伤％导致相对9.1的效力上升(数据未示出)。在该分析中，相对9.1wt，S298A/K326A/E333A/K334A突变体具有3倍高的ADCC活性(相对EC50值)。在该分析中，相对9.1wt，S298A/EE333A/K334A突变体具有2.8倍高的ADCC活性(相对EC50值)。
序列表
<110>基因技术公司
拜奥根IDEC马萨诸塞公司
柯里斯蒂娜·M·安布鲁瓦兹
梅塞德兹·巴拉日
劳拉·德福尔热
马克·S·丹尼斯
热尔梅娜·富
斯蒂芬·D·赫斯特
LEE，Chingwei V
亨利·B·洛曼
弗莱维厄斯·马丁
杰拉尔德·R·纳卡穆拉
达亚·塞莎赛义迪
梅丽莎·斯塔罗瓦斯尼克
杰弗里·S·汤普森
<120>结合BR3的多肽及其用途
<130>P2142R1
<140>
<141>
<150>60/640,323
<151>2004-12-31
<160>236
<170>PatentTn version 3.3
<210>1
<211>106
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>1
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15 10 15
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Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
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Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asp Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
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<210>2
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<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>2
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工列的描述合成多肽
<400>3
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<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>4
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<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>5
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<223>人工序列的描述合成多肽
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>7
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Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>8
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Val Thr Val Ser Ser
115
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<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly
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35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Asn Leu Asn Tyr Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>10
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Asn Ala Asn Tyr Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>11
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Thr Ser His Asn Thr Gly Glu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>12
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Thr Thr Leu Pro Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>13
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Asn Ser Asn Phe Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>14
<211>237
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>14
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val
35 40 45
Asp Asp Tyr Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asp Leu Glu Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
100 105 110
Gln Thr Ser Lys Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
115 120 125
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
130 135 140
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
145 150 155 160
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
165 170 175
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
180 185 190
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
195 200 205
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
210 215 220
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210>15
<211>441
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>15
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly Tyr Trp Asn Trp Val
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr
35 40 45
Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
65 70 75 80
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Asn Ser Asn Phe Tyr
85 90 95
Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
130 135 140
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
145 150 155 160
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
180 185 190
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
195 200 205
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210>16
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Thr Asn His Leu Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>17
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Pro His Asn Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>18
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Pro His Asn Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>19
<211>108
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>19
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
8590 95
Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
100 105
<210>20
<211>123
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>20
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ile Ser Gly Phe Thr Val Thr Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Phe Tyr Leu Gln Me1 Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly
115 120
<210>21
<211>114
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210>22
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Thr Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>23
<211>114
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Gln His Leu Asp Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210>24
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Pro Me1 Ala Gly Phe
20 25 30
Tyr Thr Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>25
<211>114
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro LVs Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Asp Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210>26
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Ser Pro Arg Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>27
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Trp Pro Val Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu lyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>28
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
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Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>29
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Pro Ala Val Ala Pro His
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>30
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Tyr Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
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Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>31
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Gly Gly Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
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Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>32
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Glu Ser Ala Tyr
20 25 30
Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
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Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>33
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>33
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Tyr
20 25 30
Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>34
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人序列的描述合成多肽
<400>34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ala Thr Gly Ile Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val lyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>35
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Thr Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Trp Thr Glu His Gly His
20 25 30
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65 70 75 80
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Thr Ala Tyr
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Arg Arg Gly Tyr
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<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Gly Gly Ser Phe
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<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Val Thr Gly Ser
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Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212>PRT
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<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Thr Thr Ala Arg
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Leu Val Thr Val Ser Ser
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Thr Ala Ser
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Val Thr Ala Ser
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Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212>PRT
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<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>45
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Leu Arg Gly Ser
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Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Leu Val Thr Val Ser Ser
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<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Ala Val Thr Gly Ser
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Tyr Ile Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<223>人工序列的描述合成多肽
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Arg Ala Val Thr Gly Tyr
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Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
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Leu Val Thr Val Ser Ser
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Ala Thr Gly His
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Tyr Ile Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
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Leu Val Thr Val Ser Ser
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<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Val Asp Lys Leu Thr Gly Ser
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Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Leu Val Thr Val Ser Ser
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<223>人工序列的描述合成多肽
<400>50
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Leu Gly Pro Gly Arg
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Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<223>人工序列的描述合成多肽
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Gln Ala Thr Gly Ser
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<212>PRT
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<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ser Met Thr Gly Val
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Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211>118
<212>PRT
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<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ser Leu Thr Gly Tyr
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Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ala Gly Tyr
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<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Asn Gly Arg
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<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>56
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<211>118
<212>PRT
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<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>57
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<211>118
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<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>58
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<400>59
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<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>60
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Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<211>118
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<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<210>62
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>62
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115
<210>63
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>63
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Asp Thr Gly His
20 25 30
Tyr Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>64
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Ser Leu Asn Gly Tyr
20 25 30
Tyr Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>65
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>65
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Asp Tyr Gly Asn
20 25 30
Tyr Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>66
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Gly Thr Gly Ser
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp ryr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>67
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>67
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Leu Thr Gly Ser
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>68
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工的序列的描述合成多肽
<400>68
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ile Gly Ser
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>69
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>69
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ala His
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>70
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>70
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Tyr Thr Glu Asn Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>71
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>71
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Glu Gly Gly Phe
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>72
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>72
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Glu Asp Ser Tyr
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>73
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>73
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Gly Gly Thr Phe
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Tle Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>74
<211>220
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>74
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Asn ASn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210>75
<211>447
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>75
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Thr Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val phe Leu phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210>76
<211>447
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<220>
<221>M0D_RES
<222>(435)..(435)
<223>Ala，Trp，His，Tyr of Phe
<400>76
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Thr Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Xaa His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210>77
<211>108
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>77
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr
100 105
<210>78
<211>123
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>78
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Leu Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gly Leu Asp Gly Leu Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120
<210>79
<211>114
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>79
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210>80
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>80
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gly Leu Asp Gly Leu Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>81
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>81
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gly Leu Asp Gly Leu Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>82
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Asn Phe Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Leu Asn Asp Leu Phe Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>83
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>83
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gly Leu Asn Asp Leu Tyr Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>84
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>84
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asn Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gly Leu Asp Gly Leu Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>85
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>85
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asn Ile Gly Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gly Leu Asp Gly Leu Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>86
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>86
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>87
<211>232
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>87
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Thr Pro Ser Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Ser Ser Val Arg Gly Cys Ala Gly Ala Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
225 230
<210>88
<211>119
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>88
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Gly Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Tyr Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Phe Val Met Ser Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>89
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>89
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Gly Ser
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Lys Pro Ala Gly Pro Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>90
<211>119
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>90
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Gly Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Thr Pro Ala Asn Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Phe Pro Phe His Tyr Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>91
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>91
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Ser Ser
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Thr Pro Ala Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Phe His Trp Tyr Arg Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115120
<210>92
<211>116
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>92
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Gly Ser
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Lys Pro Ala Gly Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210>93
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>93
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Thr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Gly Ile Ser Pro Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Lys Val Val Ser Ser His Val Thr Asn Lys Tyr Val Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>94
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>94
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Gly Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Thr Pro Ser Asn Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ser Arg Arg Pro Trp Leu Trp Gly Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>95
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(33)
<223>未确定的氨基酸
<220>
<221>MOD_RES
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<223>未确定的氨基酸
<220>
<221>MOD_RES
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<223>未确定的氨基酸
<220>
<221>MOD_RES
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<223>未确定的氨基酸
<400>95
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Pro Xaa Xaa Gly Asn Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>96
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(33)
<223>未确定的氨基酸
<220>
<221>MOD_RES
<222>(50)..(50)
<223>未确定的氨基酸
<220>
<221>MOD_RES
<222>(54)..(55)
<223>未确定的氨基酸
<220>
<221>MOD_RES
<222>(104)..(105)
<223>未确定的氨基酸
<400>96
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Xaa Ile Ser Pro Xaa Xaa Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Ary Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Cys Ala Pro Xaa Xaa Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>97
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>97
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Ile Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210>98
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>98
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Thr Pro Ser Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>99
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>99
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser 6ly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Ser Thr Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210>100
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成多肽
<400>100
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Thr Pro Ser Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Asn Leu Gly Val Cys Ala Gly Ala Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>101
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>101
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210>102
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>102
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Thr Pro Ser Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asp Arg Ala Arg Val Cys Ala Gly Ala Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>103
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>103
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ala Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210>104
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>104
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Arg Arg
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Thr Pro Ser Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Ser Ser Val Arg Gly Cys Ala Gly Ala Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>105
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>105
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Ile Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210>106
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>106
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Val Thr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>107
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>107
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Thr Pro Gly His Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>108
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>108
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Asn Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210>109
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<23>人工序列的描述合成多肽
<400>109
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe ser Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Thr Pro Thr His Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>110
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>110
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Ala Arg Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Leu Pro Ser Ala Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>111
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>111
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Leu Ile Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210>112
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>112
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Arg Ser Ile
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Thr Pro Phe Asn Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>工序列的描述合成多肽
<400>113
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Met Ser Pro Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>114
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Thr Pro Ser Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn His Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>115
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Thr Thr Pro Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>116
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Ser Asn His
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Val Thr Pro Ser Tyr Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>117
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Leu Met Thr Pro Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
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<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>118
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Val Thr Pro Gly Val Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>119
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>119
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Ile Ser Pro Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210>120
<211>L25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>120
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Ser Arg Arg
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Thr Pro Leu Tyr Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>121
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>121
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gly Ile Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210>122
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>122
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Arg Asn Asn
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Val Leu Pro Ser Asn Gly Val Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>123
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>123
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Ile Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210>124
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>124
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asn Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
3S 40 45
Ala Trp Val Leu Pro ser val Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp ser Val
50 5560
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met ASn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>125
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 510 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ala Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
6S 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>126
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>126
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Gln Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>127
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>127
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 5560
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Va1 Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>128
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>128
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Ile Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>129
<211>232
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>129
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
225 230
<210>130
<211>454
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>130
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
325 330 335
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu lyr Ser
405 410 415
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450
<210>131
<211>454
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(442)..(442)
<223>Ala，Trp，His，Tyr or Phe
<400>131
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Tle Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
325 330 335
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Xaa His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450
<210>132
<211>330
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>132
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210>133
<211>218
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>133
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
115 120 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
180 185 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210>134
<211>217
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(204)..(204)
<223> Ala，Trp， His，Tyr or Phe
<400>134
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
115 120 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
180 185 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu Xaa Asn His Tyr Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215
<210>135
<211>218
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>135
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
115 120 125
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
180 185 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210215
<210>136
<211>217
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>136
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210>137
<211>218
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>137
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
115 120 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
180 185 190
Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210>138
<211>218
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>138
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
115 120 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp GlX Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
180 185 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215
<210>139
<211>215
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>139
Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
1 5 10 15
Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
20 25 30
Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp
35 40 45
Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe
50 55 60
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp
65 70 75 80
Cys Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe
85 90 95
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
100 105 110
Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys
115 120125
Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp
130 135 140
Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys
145 150 155 160
Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser
165 170175
Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr
180 185 190
Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser
195 200 205
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
210 215
<210>140
<211>218
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>140
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
35 40 45
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
50 55 60
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
85 90 95
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
100 105 110
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
115 120 125
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
130 135 140
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
165 170 175
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
210 215
<210>141
<211>218
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>141
Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
1 5 10 15
Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
35 40 45
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
50 55 60
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser His Leu Pro Ile Gln
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
85 90 95
Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
100 105 110
Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln
115 120 125
Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn
130 135 140
Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
165 170 175
Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp
180 185 190
Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu
195 200 205
Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
210 215
<210>142
<211>217
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>142
Pro Pro Gly Asn Ile Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Ala Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val His Val Ser Trp
35 40 45
Phe Val Asp Asn Lys Glu Val His Thr Ala Trp Thr Gln Pro Arg Glu
50 55 60
Ala Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Met Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
100 105 110
Arg Ala Gln Thr Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Arg Glu Gln
115 120 125
Met Ser Lys Lys Lys Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Thr Asn Phe Phe
130 135 140
ser Glu Ala Ile Ser Val Glu Trp Glu Arg Asn Gly Glu Leu Glu Gln
145 150 155 160
Asp Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Ile Leu Asp Ser Asp Gly Thr Tyr Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Thr Asp Ser Trp Leu Gln Gly Glu
180 185 190
Ile Phe Thr Cys Ser Val Val His Glu Ala Leu His Asn His His Thr
195 200 205
Gln Lys Asn Leu Ser Arg Ser Pro Gly
210 215
<210>143
<211>285
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>143
Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu
1 5 10 15
Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro
20 25 30
Arg Lys Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu
35 40 45
Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val
50 55 60
Ser Phe Tyr Gln Val Ala Ala Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg
65 70 75 80
Ala Glu Leu Gln Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly
85 90 95
Ala Pro Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu
100 105 110
Lys Ile Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn
115 120 125
Ser Arg Asn Lys Arg Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln
130 135 140
Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys
145 150 155 160
Gly Ser Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser
165 170 175
Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr
180 185 190
Phe Phe Ile Tyr Gly Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met
195 200 205
Gly His Leu Ile Gln Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu
210 215 220
Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu
225 230 235 240
Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly
245 250 255
Asp Glu Leu Gln Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu
260 265 270
Asp Gly Asp Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu
275 280 285
<210>144
<211>309
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>144
Met Asp Glu Ser Ala Lys Thr Leu Pro Pro Pro Cys Leu Cys Phe Cys
1 5 10 15
Ser Glu Lys Gly Glu Asp Met Lys Val Gly Tyr Asp Pro Ile Thr Pro
20 25 30
Gln Lys Glu Glu Gly Ala Trp Phe Gly Ile Cys Arg Asp Gly Arg Leu
35 40 45
Leu Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Ser Ser Phe Thr Ala
50 55 60
Met Ser Leu Tyr Gln Leu Ala Ala Leu Gln Ala Asp Leu Met Asn Leu
65 70 75 80
Arg Met Glu Leu Gln Ser Tyr Arg Gly Ser Ala Thr Pro Ala Ala Ala
85 90 95
Gly Ala Pro Glu Leu Thr Ala Gly Val Lys Leu Leu Thr Pro Ala Ala
100 105 110
Pro Arg Pro His Asn Ser Ser Arg Gly His Arg Asn Arg Arg Ala Phe
115 120 125
Gln Gly Pro Glu Glu Thr Glu Gln Asp Val Asp Leu Ser Ala Pro Pro
130 135 140
Ala Pro Cys Leu Pro Gly Cys Arg His Ser Gln His Asp Asp Asn Gly
145 150 155 160
Met Asn Leu Arg Asn Ile Ile Gln Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp
165 170 175
Ser Asp Thr Pro Thr Ile Arg Lys Gly Thr Tyr Thr Phe Val Pro Trp
180 185 190
Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Asn Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys
195 200 205
Ile Val Val Arg Gln Thr Gly Tyr Phe Phe Ile Tyr Ser Gln Val Leu
210 215 220
Tyr Thr Asp Pro Ile Phe Ala Met Gly His Val Ile Gln Arg Lys Lys
225 230 235 240
Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys
245 250 255
Ile Gln Asn Met Pro Lys Thr Leu Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala
260 265 270
Gly Ile Ala Arg Leu Glu Glu Gly Asp Glu Ile Gln Leu Ala Ile Pro
275 280 285
Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Arg Asn Gly Asp Asp Thr Phe Phe Gly
290 295 300
Ala Leu Lys Leu Leu
305
<210>145
<211>184
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>145
Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro
1 510 15
Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys
20 25 30
Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala
35 40 45
Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly
50 55 60
Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro Gly Leu Leu Phe Gly
65 70 75 80
Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Val Leu Val
85 90 95
Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gln Arg Arg Leu Arg Gly Ala Ser
100 105 110
Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys Asp Ala Pro Glu Pro Leu Asp
115 120 125
Lys Val Ile Ile Leu Ser Pro Gly Ile Ser Asp Ala Thr Ala Pro Ala
130 135 140
Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His Ser
145 150 155 160
Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr Thr
165 170 175
Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gln Gln
180
<210>146
<211>185
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>146
Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys
20 25 30
Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala
35 40 45
Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val
50 55 60
Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro Gly Leu Leu Phe
65 70 75 80
Gly Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Val Leu
85 90 95
Val Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gln Arg Arg Leu Ar1 Gly Ala
100 105 110
Ser Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys Asp Ala Pro Glu Pro Leu
115 120 125
Asp Lys Val Ile Ile Leu Ser Pro Gly Ile Sar Asp Ala Thr Ala Pro
130 135 140
Ala Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His
145 150 155 160
Ser Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr
165 170 175
Thr Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gln Gln
180 185
<210>147
<211>175
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>147
Met Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gln Arg Ser Arg Asp Ser
1 5 10 15
Ser Val Pro Thr Gln Cys Asn Gln Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val
20 25 30
Arg Asn Cys Val Ser Cys Glu Leu Phe His Thr Pro Asp Thr Gly His
35 40 45
Thr Ser Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Gly Ser
50 55 60
Ala Leu Arg Pro Asp Val Ala Leu Leu Val Gly Ala Pro Ala Leu Leu
65 70 75 80
Gly Leu Ile Leu Ala Leu Thr Leu Val Gly Leu Val Ser Leu Val Ser
85 90 95
Trp Arg Trp Arg Gln Gln Leu Arg Thr Ala Ser Pro Asp Thr Ser Glu
100 105 110
Gly Val Gln Gln Glu Ser Leu Glu Asn Val Phe Val Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Thr Pro His Ala Ser Ala Pro Thr Trp Pro Pro Leu Lys Glu Asp Ala
130 135 140
Asp Ser Ala Leu Pro Arg His Ser Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu
145 150 155 160
Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr Thr Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gln
165 170 175
<210>148
<211>175
<212>PRT
<213>Rattus norvegicus
<400>148
Met Gly Val Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Arg Arg Ser Arg Asp Ser
1 5 10 15
Pro Val Ser Thr Gln Cys Asn Gln Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val
20 25 30
Arg Asn Cys Val Ser Cys Glu Leu Phe Tyr Thr Pro Glu Thr Arg His
35 40 45
Ala Ser Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Gly Ser
50 55 60
Gly Leu Arg Pro Asp Val Ala Leu Leu Phe Gly Ala Pro Ala Leu Leu
65 70 75 80
Gly Leu Val Leu Ala Leu Thr Leu Val Gly Leu Val Ser Leu Val Gly
85 90 95
Trp Arg Trp Arg Gln Gln Arg Arg Thr Ala Ser Leu Asp Thr Ser Glu
100 105 110
Gly Val Gln Gln Glu Ser Leu Glu Asn Val Phe Val Pro Pro Ser Glu
115 120 125
Thr Leu His Ala Ser Ala Pro Asn Trp Pro Pro Phe Lys Glu Asp Ala
130 135 140
Asp ASn Ile Leu Ser Cys His Ser Ile Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu
145 150 155160
Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr Thr Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gln
165 170 175
<210>149
<211>183
<212>PRT
<213>Macaca mulatta
<400>149
Met Lys Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro
1 510 15
Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys
20 25 30
Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Ala Pro
35 40 45
Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val
50 55 60
Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Ser Leu Pro Gly Leu Leu Phe
65 70 75 80
Gly Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Val Leu
85 90 95
Val Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gln Arg Arg Leu Arg Gly Ala
100 105 110
Ser Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys Asp Lys Asp Glu Pro Leu
115 120 125
Asp Lys Val Ile Ile Leu Ser Pro Gly Ile Ser Asp Ala Ala Ala Pro
130 135 140
Ala Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His
145 150 155 160
Ser Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr
165 170 175
Thr Lys Thr Ala Gly Pro Glu
180
<210>150
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>150
Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys
1 5 10 15
Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg
20
<210>151
<211>61
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>151
Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys
20 25 30
Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala
35 40 45
Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu
50 55 60
<210>152
<211>64
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>152
Met Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gln Arg Ser Arg Asp Ser
1 5 10 15
Ser Val Pro Thr Gln Cys Asn Gln Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val
20 25 30
Arg Asn Cys Val Ser Cys Glu Leu Phe His Thr Pro Asp Thr Gly His
35 40 45
Thr Ser Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Gly Ser
50 55 60
<210>153
<211>314
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>153
Met Ser Ala Leu Leu Ile Leu Ala Leu Val Gly Ala Ala Val Ala Ser
1 5 10 15
Thr Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gln Arg Ser Arg Asp Ser
20 25 30
Ser Val Pro Thr Gln Cys Asn Gln Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val
35 40 45
Arg Asn Cys Val Ser Cys Glu Leu Phe His Thr Pro Asp Thr Gly His
50 55 60
Thr Ser Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Gly Gln
65 70 75 80
Val Thr Gly Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro
85 90 95
Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
100 105 110
Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys
115 120 125
Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp
130 135 140
Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu
145 150 155 160
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met
165 170 175
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser
180 185 190
Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
195 200 205
Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln
210 215 220
Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe
225 230 235 240
Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu
245 250 255
Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr phe
260 265 270
Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn
275 280 285
Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
290 295 300
Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
305 310
<210>154
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>154
tcttgtgaca aaactcacag tggcggtggc tctggt 36
<210>155
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>155
tattactgtc agcaacatta ataaaggcct taacctccca cgttcgga 48
<210>156
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(29)..(29)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<400>156
acctgccgtg ccagtcagrd trktrvwanw thtgtagcct ggtatcaaca gaaac 55
<210>157
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(29)..(29)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<400>157
acctgccgtg ccagtcagrd trktrvwanw thtctggcct ggtatcaaca gaaac 55
<210>158
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>158
ccgaagcctc tgatttackb ggcatccavc ctctactctg gagtccct 48
<210>159
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>159
ccgaagcttc tgatttackb ggcatccavc ctcgmatctg gagtcccttc tcgc 54
<210>160
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(31)..(31)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<400>160
gcaacttatt actgtcagca atmtdmcrvt nhtcctykga cgttcggaca gggtacc57
<210>161
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(31)..(31)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<400>161
gcaacttatt actgtcagca atmtdmcrvt nhtccttwta cgttcggaca gggtacc57
<210>162
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(31)..(31)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<400>162
gcaacttatt actgtcagca asrtdmcrvt nhtcctykga cgttcggaca gggtacc57
<210>163
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(31)..(31)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<400>163
gcaacttatt actgtcagca asrtdmcrvt nhtccttwta cgttcggaca gggtacc57
<210>164
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(22)..(33)
<223>a，t，c or g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(37)..(39)
<223>a，t，c or g
<400>164
gcaacttatt actgtcagca annnnnnnnn nnnccgnnna cgttcggaca gggtacc 57
<210>165
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修饰的碱基
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<223>a，t，c or g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(25)..(42)
<223>a，t，c or g
<400>165
tgtgcagctt ctggcttcwc cnttnnnnnn nnnnnnnnnn nntgggtgcg tcaggcc57
<210>166
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(22)..(24)
<223>a，t，c or g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(28)..(51)
<223>a，t，c or g
<400>166
aagggcctgg aatgggttgs tnnnatcnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ntatgccgat 60
agcgtcaag 69
<210>167
<211>79
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(22)..(27)
<223>a，t，c or g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(31)..(48)
<223>a，t，c or g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(52)..(60)
<223>a，t，c or g
<400>167
gccgtctatt attgtgctcg tnnnnnntgc nnnnnnnnnn nnnnnnnntg cnnnnnnnnn 60
atggactact ggggtcaag 79
<210>168
<211>79
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(22)..(60)
<223>a，t，c or g
<400>168
gccgtctatt attgtgctcg tnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
atggactact ggggtcaag 79
<210>169
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(19)..(27)
<223>a，t，c or g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(31)..(45)
<223>a，t，c or g
<400>169
gccgtctatt attgtgctnn nnnnnnntgc nnnnnnnnnn nnnnnggctg cgcgggggca 60
atg 63
<210>170
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(19)..(33)
<223>a，t，c or g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(37)..(45)
<223>a，t，c or g
<400>170
gctcgtcggg tctgctacnn nnnnnnnnnn nnntgcnnnn nnnnnatgga ctactggggt 60
caa 63
<210>171
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>171
gctcggttgc cgccgggcgt tttttatg 28
<210>172
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(19)..(30)
<223>a，t，c or g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(34)..(36)
<223>a，t，c or g
<400>172
acttattact gtcagcaann nnnnnnnnnn ccgnnnacgt tcggacaggg t 51
<210>173
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(19)..(33)
<223>a，t，c or g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(37)..(39)
<223>a，t，c or g
<400>173
acttattact gtcagcaann nnnnnnnnnn nnnccgnnna cgttcggaca gggt 54
<210>174
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(19)..(20)
<223>a，t，c or g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(22)..(23)
<223>a，t，c or g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(25)..(26)
<223>a，t，c or g
<400>174
acttattact gtcagcaann knnknnkccg cccacgttcg gacagggt 48
<210>175
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(22)..(33)
<223>a，t，c or g
<400>175
gcagcttctg gcttcwccat tnnnnnnnnn nnnatacact gggtgcgtc 49
<210>176
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(22)..(24)
<223>a，t，c or g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(28)..(33)
<223>a，t，c or g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(37)..(39)
<223>a，t，c or g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(43)..(45)
<223>a，t，c or g
<400>176
ctggaatggg ttgcttggrt tnnncctnnn nnnggtnnna ctnnntatgc cgatagcgtc 60
aag 63
<210>177
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(19)..(24)
<223>a，tt，c or g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(28)..(45)
<223>a，tt，c or g
<400>177
gtctattattt gtgctcgtnn nnnntgcnnn nnnnnnnnnn nnnnntgcgc tggtgggatg 60
<210>178
<211>75
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(19)..(24)
<223>a，t，c or g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(28)..(36)
<223>a，t，c or g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(49)..(57)
<223>a，t，c or g
<400>178
gtctattatt gtgctcgtnn nnnntgcnnn nnnnnncttg gtgtttgcnn nnnnnnnatg 60
gactactggg gtcaa 75
<210>179
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(19)..(24)
<223>a，t，c or g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(28)..(45)
<223>a，t，c or g
<400>179
gtctattatt gtgctcgtnn nnnnrstnnn nnnnnnnnnn nnnnnrstgs tgstgsgatg 60
gactactggg gt 72
<210>180
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<22修饰的碱基
<222>(19)..(21)
<223>a，t，c or g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(25)..(42)
<223>a，t，c or g
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(46)..(54)
<223>a，t，c or g
<400>180
tattattgtg ctcgtcggnn nrstnnnnnn nnnnnnnnnn nnrstnnnnn nnnnatggac 60
tactggggtc70
<210>181
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>181
acctgccgtg ccagtsaaga mrttkccasc kctgtagcct ggtatcaaca gaaac 55
<210>182
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>182
ccgaagcttc tgatttwckc cgcatcctwc ctctwctctg gagtcccttc tcgc 54
<210>183
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>183
gcaacttatt actgtcagca skccsaartt kccccgscaa cgttcggaca gggtacc57
<210>184
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>184
gcagcttctg gcttcaccat tkcckcckcc kccatacact gggtgcgtca g 51
<210>185
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>185
gcagcttctg gcttcaccat tagtkccagc kccatacact gggtgcgtca g 51
<210>186
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>186
gcagcttctg gcttcaccat tkccagckcc tctatacact gggtgcgtca g 51
<210>187
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>187
aagggcctgg aatgggttgc atkgrttmtc scakccrttg sttwcascga mtatgccgat 60
agcgtcaagg gc 72
<210>188
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>188
aagggcctgg aatgggttgc ttggrttctt scatctrttg gttwcactga mtatgccgat 60
agcgtcaagg gc 72
<210>189
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>189
aagggcctgg aatgggttgc ttkggttmtc cctkccgtgg sttttascga ctatgccgat 60
agcgtcaagg gc 72
<210>190
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>190
actgccgtct attattgtgc aaraarartt tgctwcraca ramtcgstrt ttgckctgst 60
gstatggact actggggtca a 81
<210>191
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>191
actgccgtct attattgtgc tcgtaragtc tgctwcaaca racttgstgt ttgckctggt 60
gstatggact actggggtca a 81
<210>192
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>192
actgccgtct attattgtgc taracggrtt tgctacracc gcmtcggtrt ttgcgctgst 60
ggtatggact actggggtca a 81
<210>193
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>193
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ala Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>194
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>194
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ala Thr Ser
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Ile Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>195
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>195
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ser Ala Ser Phe Leu Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Glu Val Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>196
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>196
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Ile Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>197
<21L>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>197
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Tyr Leu Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Val Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>198
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>198
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Ile Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>199
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>199
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Glu Ile Ala Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Tyr Leu Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Val Ala Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>200
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>200
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Glu Ile Ala Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Glu Val Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>201
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>201
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ala Thr Ser
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Tyr Leu Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Val Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>202
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>202
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Glu Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Glu Val Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>203
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>203
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ser Ala Ser Phe Leu Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Val Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>204
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>204
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ala Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Ile Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>205
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>205
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Glu Ile Ala Thr Ser
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Val Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>206
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>206
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Ile Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>207
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>207
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Tyr Leu Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Gln Val Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>208
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>208
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
1 5
<210>209
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>209
Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala
1 5
<210>210
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>210
Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe
1 5
<210>211
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>211
Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu
1 5
<210>212
<211>8
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>212
Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr
1 5
<210>213
<211>20
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>213
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
1 5 10 15
Ser Val Lys Gly
20
<210>214
<211>10
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>214
Gly Phe Thr Val Thr Ala Tyr Tyr Met Ser
1 5 10
<210>215
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(3)
<223>Gln or Ser
<220>
<221>MOD_RES
<222>(4)
<223>His，Ile or Thr
<220>
<221>MOD_RES
<222>(5)
<223>Leu or Arg
<220>
<221>MOD_RES
<222>(6)
<223>Asp or Glu
<400>215
Trp Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Ser
1 5
<210>216
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>Gly，Asp，Ser，Ala，Val， Glu or Thr
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)
<223> Leu，Ser，Trp，Pro，Phe，Ala，Val，Ile，Arg，
Tyr or Asp
<220>
<221>MOD_RES
<222>(3)
<223>Pro，Thr，Ala，Asn，Ser，Ile，Lys，Leu或
Gln
<220>
<221>MOD_RES
<222>(4)
<223>Met，Arg，Val，Tyr，Gly，Glu，Ala，Thr，Leu
Trp or Asp
<220>
<221>MOD_RES
<222>(5)
<223>Ala，Ser，Thr，Gly，Ile，Arg，Pro，Asn，Asp
Tyr or His
<220>
<221>MOD_RES
<222>(6)
<223>Gly，Ala，Ser，Pro or Thr
<220>
<221>MOD_RES
<222>(7)
<223>Phe，His，Tyr，Arg，Ser，Val or Asn
<220>
<221>MOD_RES
<222>(9)
<223>Thr，Ile，Met，Phe，Trp or Val
<220>
<221>MOD_RES
<222>(10)
<223>Thr，Gly，Ser or Ala
<400>216
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa
1 5 10
<210>217
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>Thr，Asn or Arg
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)
<223>Thr，Ser，Leu，Asn or Pro
<220>
<221>MOD_RES
<222>(3)
<223>Leu，Asn or His
<220>
<221>MOD_RES
<222>(4)
<223>Pro，Phe，Tyr，Leu or Asn
<220>
<221>MOD_RES
<222>(5)
<223>Asp or Tyr
<400>217
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210>218
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>Asn，Thr or Arg
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)
<223>Ala，Ser，Thr，Leu，Asn or Pro
<220>
<221>MOD_RES
<222>(3)
<223>Asn，His or Leu
<220>
<221>MOD_RES
<222>(4)
<223> Pro，Tyr，Phe，Asn，Thr or Leu
<220>
<221>MOD_RES
<222>(5)
<223>Tyr，Thr or Asp
<220>
<221>MOD_RES
<222>(7)
<223>Ala or Glu
<400>218
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Met Asp Tyr
1 5 10
<210>219
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>219
Asn Ser Asn Phe Tyr Gly Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210>220
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(6)
<223>Arg or His
<400>220
Arg Val Cys Tyr Asn Xaa Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210>221
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>221
Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210>222
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>222
Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn Ser Ile His
1 5 10
<210>223
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>223
Ala Trp Ile Thr Pro Ser Asp Gly Asn Thr Asp
1 5 10
<210>224
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>224
Gly Phe Thr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His
1 5 10
<210>225
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>225
Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp
1 5 10
<210>226
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(4)
<223>Gln or Glu
<220>
<221>MOD_RES
<222>(5)
<223>Asp or Glu
<220>
<221>MOD_RES
<222>(6)
<223>Ile or Glu
<220>
<221>MOD_RES
<222>(7)
<223>Ser or Ala
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)
<223>Ser or Thr
<220>
<221>MOD_RES
<222>(9)
<223>Ala or Ser
<400>226
Arg Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Ala
1 5 10
<210>227
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>Tyr or Phe
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)
<223>Ser，Ala or Gly
<220>
<221>MOD_RES
<222>(5)
<223>Asn，Phe or Tyr
<220>
<221>MOD_RES
<222>(7)
<223>Phe or Tyr
<400>227
Xaa Xaa Ala Ser Xaa Leu Xaa Ser
1 5
<210>228
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)
<223>Gln or His
<220>
<221>MOD_RES
<222>(4)
<223>Gly，Leu，Arg，His，Tyr，Gln or Glu
<220>
<221>MOD_RES
<222>(5)
<223>Asn，Thr，Met，Ser，Ala，Ile or Val
<220>
<221>MOD_RES
<222>(6)
<223>Thr or Ser
<400>228
Gln Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Pro Pro Thr
1 5
<210>229
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>229
Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ser Thr Ala Val Ala
1期 5 10
<210>230
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>230
Tyr Ala Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210>231
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>231
Gln Gln Ser Gln Ile Ser Pro Pro Thr
1 5
<210>232
<211>17
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>232
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Asn Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210>233
<211>7
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>233
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210>234
<211>9
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>234
Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210>235
<211>10
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>235
Thr Pro His Thr Tyr Gly Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210>236
<211>17
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>236
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Asn Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
权利要求
1.抗体或多肽，其结合人BR3胞外区序列且在人效应细胞存在下具有抗体依赖的细胞毒性(ADCC)或者与包含人野生型IgG Fc的抗体相比，在人效应细胞存在下，其具有增加的ADCC。
2.抗体或多肽，其结合人BR3胞外区序列且与包含人野生型IgG Fc的抗体相比，在人效应细胞存在下，其具有降低的抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。
3.抗体或多肽，其结合人BR3胞外区并在体内杀伤或去除B细胞。
4.如权利要求3所述的抗体或多肽，其中与基线水平或未用所述抗体或多肽处理的阴性对照相比，所述抗体或多肽体内杀伤或去除至少20％的B细胞。
5.如权利要求4所述的抗体或多肽，其中与基线水平或未用所述抗体或多肽处理的阴性对照相比，所述抗体或多肽体内杀伤或去除血液中至少25％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多的B细胞。
6.如权利要求4或5所述的抗体或多肽，其中所述抗体能够去除至少一种灵长类动物B细胞，所述灵长类动物B细胞选自人、短尾猴和恒河猴B细胞。
7.抗体或多肽，其结合人BR3胞外区序列且与具有野生型或天然序列IgG Fc的抗体相比，其在体内具有增加的半衰期。
8.如权利要求3所述的抗体或多肽，其中所述抗体或多肽与血清白蛋白、血清白蛋白结合多肽或非蛋白聚合物偶联。
9.如权利要求1-7中任一权利要求所述的抗体或多肽，其中所述抗体或多肽包含与野生型IgG Fc区相比较改变的Fc区。
10.如权利要求7所述的抗体或多肽，其中所述抗体或多肽包含改变的Fc区，其与包含野生型IgG Fc区的抗体相比，在pH 6.0时对人Fc新生受体(FcRn)具有更高的亲和性。
11.人源化抗体或人抗体，其具有在人BR3上的包含残基L38和R39的功能性表位。
12.人源化抗体或人抗体，其具有在人BR3上的包含残基G36的功能性表位。
13.抗体，其具有在人BR3上的包含残基L28和V29的功能性表位。
14.抗体，其具有在人BR3上的包含残基P21和A22的功能性表位。
15.人源化抗体或人抗体，其具有在人BR3上的包含残基F25、V33、A34并还任选地包含残基R30的功能性表位。
16.抗体或多肽，其以如下的表观Kd值结合人BR3胞外区序列并结合小鼠BR3胞外区序列500nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低。
17.如权利要求1-14中任一权利要求所述的抗体或多肽，其在25℃下在BIAcore分析中作为Fab以如下表观Kd值结合人BR3胞外区序列100μM或更低、1μM或更低、500nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低。
18.抗体或多肽，其来源于表2中的任一种抗体并在25℃下在BIAcore分析中作为Fab以如下表观Kd值结合人BR3胞外区序列100μM或更低、1μM或更低、500nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低。
19.人源化抗体或人抗体，其结合人胞外BR3序列并具有H1、H2和H3区，所述H1、H2和H3区分别与表2中的任一种抗体的H1、H2和H3区具有至少70％同源性。
20.人源化抗体或人抗体，其结合人BR3胞外区序列并具有L1、L2和L3区，所述L1、L2和L3区分别与表2中的任一种抗体的L1、L2和L3区具有至少70％同源性。
21.人抗体或人源化抗体，其结合人BR3胞外区序列并与表2中的任一种抗体的VH结构域具有至少70％同源性。
22.结合人BR3胞外区序列的人抗体或人源化抗体，所述抗体包含任一SEQ ID NOs.4-13，15，16-18，20，22，24，26，28-73，75-76，78，80-85，87-96，98，100，102，104，106，107，109-110，112，116，118，120，122，124-127和129-131中的H3序列。
23.如权利要求22所述的抗体，其还包含来自表2中公开的任一种抗体的H1、H2和H3序列。
24.如权利要求23所述的抗体，还包含来自表2中公开的任一种抗体的L1、L2和L3序列。
25.抗-BR3抗体，其包含(1)含有QVRRALDY(SEQ ID NO212)的H3高变区(HVR3)；和(2)含有RDTSKNTF(SEQ ID NO210)的重链框架3区(HC-FR3)。
26.如权利要求25所述的抗-BR3抗体，其还包含在H1高变区(HVR1)中的残基GFTVTAYYMS(SEQ ID NO214)和在H2高变区(HVR2)中的残基GFIRDKANGYTTEYNPSVKG(SEQ ID NO213)。
27.如权利要求25所述的抗-BR3抗体，其还包含HVR1和HVR2，所述HVR1含有任一SEQ ID NOS6-9，16-18，35-36，75-76和81-85的抗体序列的编号为26-35(Kabat编号)的残基，以及所述HVR2含有任一SEQ ID NOs6-9，16-18，35-36，75-76和81-85的抗体序列的编号为49-65(Kabat编号)的残基。
28.抗-BR3抗体，其包含(1)含有QVRRALDY(SEQ ID NO212)的H3高变区(HVR3)；和(2)含有RDTSKNTL(SEQ ID NO211)的重链框架3区(HC-FR3)。
29.如权利要求28所述的抗-BR3抗体，其还包含SEQ ID NOs5、11-13和37-73中任一抗体序列的编号为26-35和49-65(Kabat编号)的残基。
30.抗-BR3抗体，其包含(1)含有QVRRALDY(SEQ ID NO212)的H3高变区(HVR3)；和(2)含有W-A-X3-X4-X5.X6-S(SEQ ID NO215)的L1高变区(LVR1)，其中X3为Q或S，X4为H或I，X5为L或R以及X6为D或E。
31.抗-BR3抗体，其包含(1)含有QVRRALDY(SEQ ID NO212)的H3高变区(HVR3)；和(2)含有X1-X2-P-X4-X5-G-X7-Y-X9-S(SEQID NO216)的H1高变区(HVR1)，其中X1为G或D，X2为L或S，X4为M、R或V，X5为A或S，X7为F、H或Y以及X9为T或I。
32.抗-BR3抗体，其包含(1)含有QVRRALDY(SEQ ID NO212)的H3高变区(HVR3)；(2)含有SEQ ID NO215的序列的LVR1，和(3)含有SEQ ID NO216的序列的HVR1。
33.抗-BR3抗体，其包含(1)含有序列X1-X2-X3-X4-X5-G-A-M-D-Y(SEQ ID NO217)的HVR3，其中X1为T、N或R，X2为T、S、L、N或P，X3为L或N，X4为P、F、L、Y或N以及X5为D或Y和(2)含有RDTSKNTF(SEQ ID NO210)的重链框架3区(HC-FR3)。
34.如权利要求33所述的抗-BR3抗体，其中所述HVR3包含任一SEQ ID NOs6-9和16-18的抗体的编号为94-102(Kabat编号)的残基。
35.抗-BR3抗体，包含(1)含有序列 X1-X2-X3-X4-X5-G-X7-M-D-Y(SEQ ID NO218)的HVR3，其中X1为T或N，X2为A、T或S，X3为N、H或L，X4为P、F、Y或N，X5为T或Y以及X7为A或E，和(2)含有RDTSKNTL(SEQ ID NO211)的重链框架3区(HC-FR3)。
36.如权利要求35所述的抗-BR3抗体，其中所述HVR3包含任一SEQ ID NOs5和10-13的抗体的编号为94-102(Kabat编号)的残基。
37.包含HVR3的BR3结合抗体，所述HVR3含有任一SEQ IDNOs7-13和16-18的抗体序列的编号为94-102(Kabat编号)的残基。
38.抗-BR3抗体，其包含(1)含有任一SEQ ID NOs81-83的抗体序列的残基94-102(Kabat编号)的HVR3和(2)含有RDTSKNTF(SEQID NO210)的重链框架3区(HC-FR3)。
39.包含HVR3的抗-BR3抗体，所述HVR3含有RVCYN-X6-LGVCAGGMDY(SEQ ID NO220)，其中X6为R或H。
40.如权利要求39所述的抗-BR3抗体，其还包含LVR1、LVR2和LVR3，所述LVR1、LVR2和LVR3分别含有任一SEQ ID NOs86，97，99，101，103，105，108，111，113，115，117，119，121，123和194-207的抗体序列的残基24-34、49-55和89-97(Kabat编号)。
41.包含H1、H2和H3的抗-BR3抗体，所述H1、H2和H3分别含有任一SEQ ID NOs7-13，16-18，24，26-73，75-76，78，80-85，87-96，98，100，102，104，106，107，109-110，112，114，116，118，120，122，124-127，129和193的抗体序列的编号为26-35、49-65和94-102(Kabat编号)的残基。
42.人源化抗-BR3抗体，其包含含有残基QVRRALDY(SEQ IDNO212)的H3；含有残基GFTVTAYYMS(SEQ ID NO214)的H1，含有残基GFIRDKANGYTTEYNPSVKG(SEQ ID NO213)的H2。
43.抗-BR3抗体，其包含含有残基RVCYNRLGVCAGGMDY(SEQ ID NO221)的H3；含有残基SGFTISSNSIH(SEQ ID NO222)的H1和含有残基AWITPSDGNTD(SEQ ID NO223)的H2。
44.抗-BR3抗体，其包含含有残基RVCYNRLGVCAGGMDY(SEQ ID NO221)的H3；含有残基SGFTISSSSIH(SEQ ID NO224)的H1和含有残基AWVLPSVGFTD(SEQ ID NO223)的H2。
45.BR3结合抗体，其能够竞争性抑制由保藏为3.1(ATCC保藏号PTA-6622)或12B12.1(ATCC保藏号PTA-6624)的杂交瘤产生的抗体与人BR3的胞外区结合。
46.如权利要求45所述的抗-BR3抗体，其中所述抗体包含由保藏为3.1(ATCC保藏号PTA-6622)或12B12.1(ATCC保藏号PTA-6624)的所述杂交瘤产生的所述抗体的可变区序列。
47.如权利要求45所述的抗-BR3抗体，其中所述抗体包含由保藏为3.1(ATCC保藏号PTA-6622)或12B12.1(ATCC保藏号PTA-6624)的所述杂交瘤产生的所述抗体的高变区序列。
48.如权利要求45所述的抗-BR3抗体，其中所述抗体为由保藏为3.1(ATCC保藏号PTA-6622)或12B12.1(ATCC保藏号PTA-6624)的所述杂交瘤产生的所述抗体的人源化形式。
49.抗体，其包含任一SEQ ID NOs 13，15，16-18，22，24，26，28-73，75-76，78，80-85，87-96，98，100，102，104，106，107，109-110，112，116，118，120，122，124-127和129-131的VH序列。
50.抗体，其包含任一SEQ ID NOs.3，14，21，23，25，27，74，77，79，86，97，99，101，103，105，108，11，113，115，117，119，121，123和128的VL序列。
51.如权利要求19-27中任一权利要求所述的抗体，其中所述抗体在25℃下在BIAcore分析中作为Fab以如下表观Kd值结合人BR3胞外区序列500nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低。
52.如权利要求1-27中任一权利要求所述的抗体，其中所述抗体在25℃下在BIAcore分析中作为Fab以500nM-0.001pM之间的表观Kd值结合人BR3胞外区序列。
53.如权利要求1-52中任一权利要求所述的抗体或多肽，其中所述抗体或多肽包含人IgG的Fc区。
54.如权利要求1和3-52中任一权利要求所述的抗体或免疫粘附素，其中所述抗体或多肽包含人IgG1或人IgG3的Fc区。
55.如权利要求2-27中任一权利要求所述的抗体或多肽，其中所述抗体或多肽包含人IgG4的Fc区。
56.如权利要求1、3-21、25-44和49-52中任一权利要求所述的抗体或多肽，其中所述抗体或多肽抑制BAFF与细胞表面上的天然BR3多肽结合。
57.如权利要求1、3-21和25-52中任一权利要求所述的抗体或多肽，其中所述抗体或多肽抑制B细胞增殖和B细胞存活。
58.如权利要求1、7-21和25-52中任一权利要求所述的抗体或多肽，其中所述抗体或多肽在体内杀伤或去除B细胞。
59.如权利要求3-21和25-52中任一权利要求所述的抗体或多肽，其中所述抗体或多肽在人效应细胞存在下具有抗体依赖的细胞毒性(ADCC)或者与包含人野生型IgG1 Fc的抗-BR3抗体比较，在人效应细胞存在下，其具有增加的ADCC。
60.如权利要求3-21和25-52中任一权利要求所述的抗体或多肽，其中所述抗体或多肽与包含人野生型IgG1 Fc的抗-BR3抗体比较，在人效应细胞存在下，其具有降低的抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。
61.刺激B细胞增殖和B细胞存活的BR3结合抗体或多肽。
62.如权利要求61所述的BR3结合抗体或多肽，其中所述多肽不具有ADCC效应功能。
63.如权利要求61所述的BR3结合抗体或多肽，其中所述多肽包含人IgG的Fc区。
64.如权利要求63所述的BR3结合抗体或多肽，其中所述Fc区具有D265A和N297A突变(EU编号系统)。
65.如权利要求2所述的BR3结合抗体或多肽，其中所述Fc区具有D265A和N297A突变(EU编号系统)。
66.如权利要求1-65中任一权利要求所述的抗体或多肽，其中所述抗体或多肽包含Fc区，所述Fc区通过在如下位置的任一位置或其任意组合处替代氨基酸被改变，从而与野生型IgG Fc序列相比改变了所述抗体或多肽的ADCC、CDC和/或药物代谢动力学特性，所述位置选自所述Fc区的238，239，246，248，249，250，252，254，255，256，258，265，267，268，269，270，272，276，278，280，283，285，286，289，290，292，293，294，295，296，297，298，301，303，305，307，309，312，314，315，320，322，324，326，327，329，330，331，332，333，334，335，337，338，340，360，373，376，378，382，388，389，398，414，416，419，428，430，434，435，437，438和439，其中所述Fc区中的残基编号是根据EU编号系统。
67.如权利要求66所述的抗体或多肽，其中所述替代选自N434A、N434Y、N343F、N434H。
68.如权利要求66所述的抗体或多肽，其中所述Fc区为SEQ IDNO134，且其中X为选自A、W、H、Y和F的任意氨基酸。
69.如权利要求1和3-52中任一权利要求所述的抗体或多肽，其中抗体或免疫粘附素包含人IgG的Fc区，所述人IgG的Fc区包含如下替代的至少任意一种或其任意组合K246H、H268D、E283L、S324G、S239D和I332E。
70.如权利要求1和3-52中任一权利要求所述的抗体或多肽，其中抗体或免疫粘附素包含人IgG的Fc区，所述人IgG的Fc区包含如下替代的至少任意一种或其任意组合S298A、K326A、E333A和K334A。
71.与细胞毒剂或化学治疗剂偶联的前述权利要求中任一权利要求所述的抗体或多肽。
72.如权利要求71所述的抗体或多肽，其中所述细胞毒剂为放射性同位素或毒素。
73.如前述权利要求中任一权利要求所述的抗体或多肽，所述抗体是在CHO细胞中产生的。
74.如前述权利要求中任一权利要求所述的抗体或多肽，其中所述抗体是单克隆抗体。
75.如前述权利要求中任一权利要求所述的抗体或多肽，其中所述抗体是人源化抗体。
76.如前述权利要求中任一权利要求所述的抗体或多肽，其中所述抗体是人抗体。
77.如前述权利要求中任一权利要求所述的抗体或多肽，所述抗体选自Fab、Fab’、F(ab)’2、单链Fv(scFv)、Fv片段；双抗体和线性抗体。
78.如前述权利要求中任一权利要求所述的抗体或多肽，其中所述抗体是多特异性抗体。
79.编码前述权利要求中任一权利要求所述的抗体或多肽的分离的核酸分子。
80.编码前述权利要求中任一权利要求所述的抗体或多肽的表达载体。
81.含有权利要求79所述的核酸分子或表达载体的宿主细胞，所述表达载体含有所述核酸分子。
82.如权利要求81所述的宿主细胞，其产生前述权利要求中任一权利要求所述的抗体或多肽。
83.如权利要求82所述的宿主细胞，其为CHO细胞。
84.产生前述权利要求中任一权利要求所述的抗体或多肽的方法，包括培养权利要求81所述的细胞并从所述细胞培养中回收所述抗体或多肽。
85.包含前述权利要求中任一权利要求所述的BR3结合抗体或多肽以及载体的组合物。
86.如权利要求85所述的组合物，其还包含至少一种另外的治疗剂，所述治疗剂选自细胞毒剂、化学治疗剂、生物应答调节剂、免疫抑制剂和抗-CD20抗体。
87.制造的物品，其包含容器和其中所含的组合物，其中所述组合物包含前述权利要求中任一权利要求所述的抗体。
88.如权利要求87所述的制造的物品，其还包含表示所述组合物能够用于治疗疾病的包装说明书。
89.如权利要求88所述的制造的物品，其中所述疾病选自类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征、多发性硬化症、非何杰金氏淋巴瘤、ALL、CLL、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
90.治疗BR3阳性癌的方法，其包括将治疗有效剂量的本发明的BR3结合抗体或多肽给予患有所述癌症的患者。
91.如权利要求90所述的方法，其中所述BR3结合抗体或多肽为至少一种选自如下的BR3结合抗体或多肽权利要求1-1 8、22-52、66-78中任一权利要求所述的抗体和多肽，权利要求19-24中任一权利要求所述的任一拮抗性BR3结合抗体或表2中的拮抗性BR3结合抗体。
92.治疗B细胞瘤的方法，包括将治疗有效剂量的本发明的BR3结合抗体或多肽给予患有所述瘤的患者。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述BR3结合抗体或多肽为至少一种选自如下的BR3结合抗体或多肽权利要求1-18、25-52和66-78中任一权利要求所述的抗体和多肽，权利要求19-24中任一权利要求所述的任一拮抗性BR3结合抗体或表2中的拮抗性BR3结合抗体。
94.治疗自身免疫性疾病的方法，包括将治疗有效剂量的本发明的BR3结合抗体给予患有所述自身免疫性疾病的患者。
95.如权利要求68所述的方法，其中所述BR3结合抗体或多肽为至少一种选自如下的BR3结合抗体或多肽权利要求1-18、25-52和66-78中任一权利要求所述的抗体和多肽，权利要求19-24中任一权利要求所述的任一拮抗性BR3结合抗体或表2中的拮抗性BR3结合抗体。
96.治疗癌症的方法，包括将治疗有效剂量的本发明的BR3结合抗体给予患有所述癌症的患者。
97.如权利要求96所述的方法，其中所述BR3结合抗体或多肽为至少一种选自如下的BR3结合抗体或免疫粘附素权利要求1-18、25-52和66-78中任一权利要求所述的抗体和免疫粘附素，权利要求19-24中任一权利要求所述的任一拮抗性BR3结合抗体或表2中的拮抗性BR3结合抗体。
98.将B细胞从混合的细胞群中去除的方法，其包括将所述混合的细胞群与减少B细胞数目的有效量的前述权利要求中任一权利要求所述的BR3-结合抗体或多肽接触。
99.如权利要求72所述的方法，其中所述BR3结合抗体或多肽为至少一种选自如下的BR3结合抗体或多肽权利要求1-18、25-52和66-78中任一权利要求所述的抗体和多肽，权利要求19-24中任一权利要求所述的任一拮抗性BR3结合抗体或表2中的拮抗性BR3结合抗体。
100.从混合的细胞群中去除B细胞的方法，包括将所述混合的细胞群与减少B细胞数目的有效量的前述权利要求中任一权利要求所述的BR3-结合抗体或多肽接触，所述BR3结合抗体或多肽在人效应细胞存在下具有ADCC效应功能或具有增加的ADCC效应功能。
101.从混合的细胞群中去除B细胞的方法，包括将所述混合的细胞群与减少B细胞数目的有效量的前述权利要求中任一权利要求所述的BR3-结合抗体或多肽接触，所述BR3结合抗体或多肽在人效应细胞存在下具有ADCC效应功能或具有增加的效应功能并阻断BAFF与细胞表面上的BR3结合。
102.如权利要求90-97中任一权利要求所述的方法，其还包括将治疗有效剂量的抗-CD20抗体顺序地或同时地与所述BR3结合抗体或多肽进行给药的步骤。
103.如权利要求98-101中任一权利要求所述的方法，还包括将所述混合的细胞群与抗-CD20抗体顺序地或同时地与所述BR3结合抗体或多肽接触的步骤。
104.如权利要求90-97中任一权利要求所述的方法，其中所述BR3结合抗体或多肽具有改变的ADCC效应功能。
105.如权利要求101-102中任一权利要求所述的方法，其中所述BR3抗体阻断BAFF与细胞表面上的BR3结合。
106.如权利要求101和102所述的方法，其中所述CD20结合抗体为Rituxan_抗体。
107.如权利要求90-97中任一权利要求所述的治疗方法，还包括将治疗有效剂量的至少一种如下试剂顺序或同时给药BAFF拮抗剂、生物应答调节剂、B细胞去除剂、细胞毒剂、化学治疗剂和免疫抑制剂。
108.如权利要求98-101中任一权利要求所述的方法，还包括将治疗有效剂量的至少一种如下试剂顺序或同时给药BAFF拮抗剂、生物应答调节剂、B细胞去除剂、细胞毒剂、化学治疗剂和免疫抑制剂。
109.如权利要求107或108所述的方法，其中所述BAFF拮抗剂选自BR3-Fc、TACI-Fc、BCMA-Fc、抗-BAFF肽体(peptibody)、抗-BAFF抗体和抗-BR3抗体。
110.如权利要求90或92中任一权利要求所述的方法，其中所述癌症选自非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、淋巴细胞为主的何杰金氏病(LPHD)、滤泡性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、ALL、CLL和弥漫性大B细胞淋巴瘤。
111.如权利要求90-101中任一权利要求所述的方法，其中所述抗体来源于9.1抗体或V3-1抗体。
112.如权利要求90-101中任一权利要求所述的方法，其中所述抗体包含9.1RF的重链可变区(SEQ ID NO35)。
113.如权利要求90-101中任一权利要求所述的方法，其中所述抗体包含V3-46s RF的重链可变区(SEQ ID NO127)。
114.如权利要求92所述的方法，其中所述癌症为非何杰金氏淋巴瘤(NHL)以及所述化学治疗剂选自多柔比星、环磷酰胺、长春新碱和泼尼松龙。
115.如权利要求94所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、Wegener′s病、炎症性肠病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化症、银屑病、IgA肾病、IgM多发性神经病、重症肌无力、血管炎、糖尿病、雷诺氏综合征、干燥综合征和肾小球肾炎。
116.如权利要求115所述的方法，其中所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎。
117.如权利要求108所述的方法，其中所述免疫抑制剂为氨甲喋呤。
118.如权利要求90-115中任一权利要求所述的方法，其中所述抗体或多肽与细胞毒剂或化学治疗剂偶联。
119.如权利要求119所述的方法，其中所述细胞毒剂为放射性同位素或毒素。
120.如权利要求90-115中任一权利要求所述的方法，其中所述BR3结合抗体与具有野生型IgG Fc的抗体相比，对人FcRn具有增加的亲和性。
121.治疗免疫缺陷病的方法，包括将治疗有效剂量的激动性BR3结合抗体或多肽给予患有所述免疫缺陷病的患者。
122.如权利要求90-101和121中任一权利要求所述的方法，其中所述抗体或多肽来源于2.1抗体。
123.如权利要求121所述的方法，其中所述抗体包含2.1-46的重链可变区。
124.如权利要求121所述的方法，其中所述BR3结合抗体或多肽包含任一SEQ ID NOs 133和135-142的IgG Fc区。
125.如权利要求121所述的方法，其中所述BR3结合抗体或多肽包含具有至少一个在434处(EU编号系统)替代的人IgG1 Fc区，所述替代选自N434A、N434F、N4343Y和N434H。
126.如权利要求125所述的方法，其中所述人IgG1 Fc区为SEQID NO134，其中X为A、W、F、Y或H。
127.如权利要求121所述的方法，其中所述激动性BR3结合抗体或多肽与天然的人IgG野生型Fc相比，具有降低的ADCC活性。
128.如权利要求121所述的方法，其中所述抗体或多肽含有具有D265A/N297A替代(EU编号系统)的人IgG1 Fc序列。
129.如权利要求121所述的方法，其中所述激动性BR3结合抗体为Hu2.1-46或Hu2.1-46.DANA。
130.如权利要求90至129中任一权利要求所述的方法，其中所述BR3结合抗体为单克隆抗体
131.如权利要求90至129中任一权利要求所述的方法，其中所述BR3结合抗体为人源化抗体。
132.如权利要求90至129中任一权利要求所述的方法，其中所述BR3结合抗体为人抗体。
133.如权利要求90至129中任一权利要求所述的方法，其中所述BR3结合抗体选自Fab、Fab’、F(ab)’2、单链Fv(scFv)、Fv片段；双抗体和线性抗体。
134.如前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述抗体是多特异性抗体。
135.如权利要求90至129中任一权利要求所述的方法，其中所述BR3结合抗体还包含血清白蛋白结合肽。
136.分离BR3的方法，其包括将前述权利要求所述的抗体与BR3接触并回收所述抗体。
137.液体制剂，其包含在组氨酸缓冲液中的前述权利要求中任一权利要求所述的BR3抗体。
138.如权利要求137所述的液体制剂，其中所述缓冲液是组氨酸醋酸盐缓冲液。
139.筛选所述B细胞增殖抑制剂的方法，包括如下步骤
(a)用前述权利要求中任一权利要求所述的BR3激动性抗体刺激所述B细胞，
(b)将候选化合物给药；以及
(c)检测细胞增殖。
140.鉴定并监测BR3途径中的下游标志物的方法，包括如下步骤
(a)用前述权利要求中任一权利要求所述的BR3激动性抗体刺激所述B细胞，以及
(b)检测所述细胞中基因表达的变化。
141.诊断自身免疫性疾病或癌症的方法，其包括
(a)将来自测试个体的生物样品与本发明的BR3结合抗体或多肽接触；
(b)分析所述生物样品中的BR3多肽水平；以及
(c)将所述生物样品中的BR3多肽水平与BR3蛋白的标准水平比较；从而与BR3蛋白的标准水平相比，BR3蛋白的存在或BR3蛋白水平的增加预示着存在待用BR3结合疗法治疗的自身免疫性疾病或癌症。
142.检测BR3多肽的方法，包括如下步骤在测试样品或个体中结合本发明所述的抗-BR3抗体或多肽，并将结合的所述抗体或多肽与对照抗体或多肽进行比较。
143.如权利要求142所述的方法，其中将所述抗体或多肽用于选自如下的分析中FACS分析、免疫组织化学分析(IHC)和ELISA分析。
全文摘要
本发明涉及新的BR3结合抗体和多肽，包括拮抗和激动性多肽。本发明还涉及BR3结合抗体和多肽的用途，例如在治疗方法、筛选方法、诊断方法、测定和蛋白纯化方法中的用途。
文档编号C07K16/28GK101120021SQ200580044339
公开日2008年2月6日 申请日期2005年12月23日 优先权日2004年12月31日
发明者柯里斯蒂娜·M·安布鲁瓦兹, 梅塞德兹·巴拉日, 劳拉·德福尔热, 马克·S·丹尼斯, 热尔梅娜·富, 斯蒂芬·D·赫斯特, 重伟·V·李, 亨利·B·洛曼, 弗莱维厄斯·马丁, 杰拉尔德·R·纳卡穆拉, 达亚·塞莎赛义迪, 梅丽莎·斯塔罗瓦斯尼克, 杰弗里·S·汤普森 申请人:基因技术公司, 拜奥根Idec马萨诸塞公司