专利名称：：人骨形态发生蛋白9重组蛋白质核苷酸序列及生产方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种人骨形态发生蛋白9重组蛋白质核苷酸序列及生产方法和用途。
背景技术：
：骨骼是一种高度特异化组织，骨组织的成分包括胶原蛋白，蛋白多糖，非胶原蛋白，酯类。贯穿一生的骨组织的更新与修复由特定的细胞来完成。骨骼的生长通过成骨细胞完成，而骨骼的重塑通过破骨细胞和成骨细胞共同完成。在病理情况下，应用促进骨骼生长的因子可治疗骨折。这些因子可促进开放性骨折的愈合及改善人工关节的固定，修复先天性、创伤性颅骨缺损，应用于整容手术。此外，还可用于牙周或其他牙齿修复的治疗。目前对于骨折、颅骨和牙周缺损的治疗方法是进行骨移植或置入人工化合物。自体移植的成功率很高，但其缺点是会造成手术创伤和可应用的的移植骨数量有限。也可应用异体骨。但其具有潜在传播疾病的风险。也可应用陶瓷或金属制品，但它们只是骨附着物，新骨只在其附近或正常骨周围生长。因此，我们需要一种生理上可接受的生物制剂，它可在预知位点促进骨骼的形成。它可吸引、刺激成骨细胞或促进成骨细胞的前体细胞的分化。现在已发现了多种促进骨形成的生长因子，但获得纯化的骨生长因子的过程和技术仍不明朗，处于开始阶段。因此，将高度纯化的哺乳细胞的骨生长因子应用在骨科疾病的研究、诊断和治疗过程中，还需要生物化学和生理学方面的深入研究。
发明内容本发明的目的是提供一种人骨形态发生蛋白9重组蛋白质核苷酸序列及生产方法和用途。一种分离的DNA分子，它编码人骨形态发生蛋白9(BMP-9)核苷酸序列。一种蛋白质哺乳细胞及大肠杆菌表达人骨形态发生蛋白9重组蛋白质。一种载体将编码BMP-9核苷酸序列基因段重组于质粒载体，当该质粒载体在哺乳细胞和大肠杆菌扩增时，重组BMP-9得以表达。一种宿主细胞使重组BMP-9在其表达的哺乳细胞及大肠杆菌宿主细胞。一种人骨形态发生蛋白9重组蛋白质的生产方法，其特征在于方法的步骤如下人骨形态发生蛋白9重组蛋白质的生产方法的步骤如下在哺乳细胞1)利用RNA逆转录-多聚核苷酸链反应，合成人BMP-9的cDNA，RNA提取自人成骨细胞株U2-OS细胞，并逆转录成cDNA；2)将cDNA克隆至pcDNA3载体，这一BMP-9/pcDNA3表达质粒适合BMP-9蛋白在哺乳细胞的表达；3)利用DNA稳定转染的方法，将人BMP-9cDNA转染至中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；4)通过新霉素筛选和细胞克隆，获得稳定表达人BMP-9的单克隆细胞株，用Northern印渍的方法，测出人BMP-9在CHO细胞的表达；5)收集培养CHO/BMP-9细胞的条件培养液，将此培养液加入到成骨细胞中测定BMP-9活性。在大肠杆菌1)将人BMP-9成熟肽的cDNA克隆至pGEM-GST-KG载体，然后转导至DH5α大肠杆菌中；2)含有人BMP-9的大肠杆菌培养液蛋白经过凝胶电泳和离子交换层析方法纯化，然后经过透析及复性处理冷冻干燥后，制成纯化的，有活性的人BMP-9重组蛋白质。人骨形态发生蛋白9重组蛋白质用于制备刺激成骨细胞分化和新骨形成、促进骨折愈合，治疗骨折、骨缺损疾病的药物。本发明的优点是1.利用哺乳细胞和大肠杆菌首次成功表达人BMP-9重组蛋白质；2.人重组BMP-9蛋白质经复性处理后，具有完整性的生物活性；3.BMP-9重组蛋白质具有刺激成骨细胞分化和骨形成的功能；4.BMP-9重组蛋白质具有促进骨缺损和骨折修复的用途。图1是BMP-9cDNA核苷酸序列及BMP-9蛋白质氨基酸序列；图2是BMP-9刺激成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性示意图；图3是BMP-9刺激碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)和骨特异性转录调控因子Runx2mRNA的表达示意图；图4是BMP-9刺激成骨细胞骨小结的形成示意图；图5是BMP-9刺激小鼠颅骨表面新骨形成示意图；图6是BMP-9诱导小鼠异位骨形成示意图，左、中(a、b)图为X一光摄相，右(c)图为组织切片示意图；图7a是BMP-9诱导大鼠颅骨骨缺损的下X-光摄相示意图；图7b是BMP-9诱导大鼠颅骨缺损的组织切片示意图；图8是BMP-9促成骨痂形成和骨折修复示意图。具体实施例方式人骨形态发生蛋白-9(BMP-9)的cDNA序列和蛋白质氨基酸序列见图1。人BMP-9的cDNA含有1,942个核苷酸。5′端非编码序列有163个核苷酸，3′端非编码序列有489个核苷酸。人BMP-9含有429个氨基酸残基。通过SDS-PAGE法测得的人BMP-9蛋白质的分子量约28,000-32,000道尔顿(28-32kDa)，在SDS-PAGE还原状态中，该蛋白质的分子量约为14,000-22,000道尔顿(14-22kDa)。在本项发明中，我们首先利用RNA逆转录-多聚核苷酸链反应(RT-PCR)的技术，合成了人BMP-9的cDNA，RNA提取自人成骨细胞株U2-OS细胞，并逆转录成cDNA，然后将cDNA克隆至pcDNA3载体，这一BMP-9/pcDNA3表达质粒(Expressionplasmid)适合BMP-9蛋白在哺乳细胞的表达。利用DNA稳定转染(Stabletransfection)的方法，我们将人BMP-9cDNA转染至中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。通过新霉素筛选和细胞克隆，获得了稳定表达人BMP-9的单克隆细胞株。用Northern印渍(Northernblot)的方法，测出人BMP-9在CHO细胞的表达。然后我们收集了培养CHO/BMP-9细胞的条件培养液。将此培养液加入到原代大鼠成骨细胞中，我们发现该培养液可刺激大鼠成骨细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性，骨钙素(Osteocalcin，OC)和骨特异性转录调控因子Runx2基因的表达和促进体外骨小结(Bonenodule)的形成。这些结果证实BMP-9具有刺激成骨细胞分化作用。我们然后将人BMP-9成熟肽的cDNA克隆至pGEM-GST-KG载体，然后转导(transform)至DH5α大肠杆菌中。含有人BMP-9的大肠杆菌培养液蛋白经过凝胶电泳(Gelfiltration)和离子交换层析(IonExchange)方法纯化后，经过透析及复性处理冷冻干燥后，制成纯化的，有活性的人BMP-9重组蛋白质。经离体与在体实验测定后，证明此重组蛋白质具有成骨功能活性。BMP-9重组蛋白质的主要功能1)骨折修复。人BMP-9可用于促进各类临床骨折的愈合。对于难愈合性骨折(Non-unionfracture)，目前临床上尚无有有效的治疗方法，应用BMP-9，可有效地促进难愈合性骨折的愈合。重组BMP-9可注射于骨折部位或与I型胶原或聚丙烯等载体制成复合的生物材料敷于骨折部位，促进骨折的愈合。2)骨缺损的修复。由骨肿瘤手术后或创伤后造成的大块骨缺损(Segmentalbonedefect)，在临床上，目前只有用骨移植的方法进行治疗，且疗效往往不成功。用人BMP-9与其载体制成的复合物填充于骨缺损部位，可诱导成骨细胞的增殖与分化，保进新骨的形成。颅骨或颌面骨的缺损也可用人BMP-9治疗。3)用于脊柱融合。脊柱融合(Spinalfusion)是骨科常见手术，将BMP-9用于手术部位，可促进脊柱融合，加快手术后的愈合过程，大大缩短病人的住院时间和愈合时间。4)牙周骨修复和根管疗法。中年以上的病人，尤其妇女，伴随全身骨组织的丢失，牙周骨也有不同程度的缺损，严重时，可致牙齿脱落。人BMP-9可与载体制成复合物，种植于牙周骨组织内，促进新骨形成。此一治疗可用于种植牙(Toothimplant)手术前。5)用于伴有骨丢失的代谢性骨病。许多代谢性骨病伴有严重的骨丢失，其中最常见和最严重的是骨质疏松症(Osteoporosis)。骨质疏松症多发于绝经后妇女，其机体骨吸收大于骨形成而造成骨重塑(Boneremodeling)的负平衡。目前临床上常用的治疗骨质疏松病的药物为双磷酸盐类药物(Bisphosphonates)，该药物可有效地抑制骨吸收，防止骨组织的进一步丢失。目前临床上尚无有效药物促进骨形成，使骨质疏松症病人的丢失的骨重新建立。动物实验发现BMP-9可逆转卵巢去除后造成的骨丢失，具有良好的治疗骨质疏松症的前景。BMP-9还可用于其它原因造成的全身性骨丢失，如肿瘤转移造成的骨丢失。6)用于治疗软骨疾病。人BMP-9还有促进软骨细胞(Chondrocyte)的成熟和分化的功能。BMP-9可促进软骨细胞转化为肥大软骨细胞(Hypertrophicchondrocyte)，促进软骨细胞特异性基因，如X型胶原(TypeXcollagen)，MMP-9，骨桥蛋白(Osteopontin)等的表达。人BMP-9可用于治疗各类软骨发育不良综合症(Chondrodysplasia)。7)用于糖尿病的治疗。近年来的动物实验，还发现BMP-9可升高血液中胰岛素(Insulin)的水平和降低血糖水平，纠正动物实验性糖尿病。因此，人BMP-9重组蛋白质还具有治疗糖尿病的临床用途。实施例1、人骨形态发生蛋白-9的核苷酸和氨基酸序列。克隆和表达的人骨形态发生蛋白-9(BMP-9)cDNA的核苷酸序列和蛋白质的氨基酸序列(图1)。实施例2、用哺乳细胞表达人BMP-9。为在哺乳细胞表达人BMP-9蛋白，将编码的全长人BMP-9cDNA克隆至哺乳细胞表达载体pcDNA3中。转染方法为用lipofectamineplus试剂的方法。转染细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。由于pcDNA3质粒含有抗新霉素(Neomycin)的基因，在pcDNA3/BMP-9表达载体稳定转染至CHO细胞后，新霉素被加入到培养液中，表达BMP-9的细胞株具有抗新霉素的特性，其他细胞则被新霉素杀死。然后克隆此稳定转染的细胞。克隆细胞的方法为有限稀释(Limitingdilution)的方法。耐新霉素的细胞被稀释成1个细胞/200微升培养液并加入到96孔培养皿中(每孔200微升)。2-3周后，此单克隆细胞株长成细胞群。然后经蛋白酶(Trypsin)消化后，转至24孔板培养皿，后经6孔板培养皿及培养瓶(Flask)培养后，将该细胞株液氮保存。活性测定收集不含血清的或含低浓度血清(1％)的表达人BMP-9的细胞株的条件培养液，经对倍稀释后，与成骨细胞培养24小时，检测此条件培养液对成骨细胞(Osteoblast)碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase)的刺激活性。此细胞株为小鼠C2C12细胞，实验证明CHO细胞表达的人BMP-9具有刺激成骨细胞碱性磷酸酶的活性，其活性在3-12倍之间，并呈计量依赖(Dose-dependent)的方式。该条件培养液对成骨细胞特异性基因表达的刺激作用由瞬时PCR(Real-timePCR)的方法测定。该条件培养液与成骨细胞培养后，成骨细胞的I型胶原(TypeIcollagen)，骨桥蛋白(Osteopontin)RNA的表达均显著增加。将此条件培养液与成骨细胞培养10天后，用福尔马林固定，经vonKossa染色后，表明此条件培养液对成骨细胞骨小结(Bonenodule)的形成有刺激作用。这些实验结果表明，用CHO细胞表达的人BMP-9的重组蛋白质具有刺激成骨细胞分化的活性。实施例3、用大肠杆菌表达人BMP-9。用PCR的方法扩增人BMP-9成熟片断的cDNA。人BMP-9基因库存储号为AF188285，上游引物核苷酸序列为caccatgagcgccggggctggcag和下游引物核苷酸序列为ctacctgcacccacactctg。PCR试剂包括1微升上游引物(10nM)，1微升下游引物(10nM)，1微升cDNA模板和17微升PlatenumPCRSupermix。PCR条件为95℃/5分钟；95℃/30秒，56℃/30秒，72℃/40秒，35个循环(cycles)，72℃/2分钟。PCR产物(300-bp)经2％的琼脂胶分离后，由QiagenDNA纯化试剂盒纯化，然后由20微升TE缓冲液再溶解。克隆BMP-9PCR产物至表达载体为引入与表达载体一致的适当的酶切位点(Restrictionsite)我们先将BMP-9的PCR产物克隆至pGEMT-Easy载体(Promega)。DNA连结反应的条件如下10微升PCR产物，1微升PGERT-Easy载体，1.5微升T4DNA连结酶缓冲液，1微升T4DNA连结酶，加水至15微升。DNA连结反应为16℃，过夜。连结反应后，DNA经热休克的方法转导(Transform)至DH5α菌株。接种DH5α菌株的至接种板(Plate)含有IPTG和X-gal。经37℃过夜培养后，选出白色菌落(Colony)，并接种于2ml含氨苄青霉素(Ampicillin)的LB培养液中过夜培养。用QiagenDNA纯化试剂盒纯化BMP-9/pGEMT-Easy质粒(Plasmid)，纯化的质粒经EcoRI消化(37℃，1h)后，经2％的琼脂胶分离和纯化出300-bp的BMP-9DNA片断。此一DNA片断的5’和3’端含有EcoRI的酶切位点。pGEM-GST-KG载体为BMP-9的表达载体，此一载体经EcoRI消化后，做脱磷酸处理，处理过的载体经纯化后与纯化的BMP-9cDNA片断做连结反应(Ligation)，反应条件如前叙。连结反应的产物导入(Transform)DH5α菌株，选择单克隆菌落(Colony)并培养于含氨苄青霉素的LB培养液。DNA纯化后，BMP-9在pGEM-GST-KG载体中的方向(Orientation)和核苷酸序列由DNA测序鉴定。纯化BMP9-GST融合蛋白1)将表达BMP-9的DH5α菌株在5ml的LB培养液中过夜培养(37℃)，然后将此5ml的饱和菌液加入至50毫升LB培养液中在室温下培养至OD600值在0.6-0.7，然后加入IPTG(0.1mM)诱导BMP-9表达，IPTG诱导培养的条件为30℃，3小时。培养结束时的OD600值应为1.2-1.3。然后将培养细胞离心6,000xg，10分钟。2)将细胞在-80℃低温冰箱中冷冻1小时，然后化解细胞并加入酶蛋白抑制剂，超声裂解细胞4-6次，每次10秒，间隔45秒，加入TritonX-100试剂(终浓度为1％)，震荡20分钟，离心细胞裂解物(10,000xg，15分钟)后，将上清(Supernatant)转移至一干净试管中。3)加1毫升75％的GlutathioneSepharose匀浆洗净上清液。震荡2小时(4℃)，使蛋白与GlutathioneSepharose结合，通过离心(500xg，2分钟)去除未结合的蛋白，用冷PBS-T溶液洗树脂(Resin)2次和用冷PBS溶液洗树脂1次。4)用1毫升的洗脱缓冲液(Elutionbuffer)[(100mMTris，pH8.5-9.0；20mM还原的谷胱甘肽(Glutathione)]与树脂培养10分钟，离心树脂和收集上清液。用SDS-PAGE胶纯化的蛋白并用Coomassieblue染色方法检测BMP-9的蛋白的表达。用含有20％甘油(Glycerol)的PBS透析(Dialysis)和复性处理洗脱的蛋白，并将此蛋白粗提物冻存于-80℃低温冰箱。含有人BMP-9的大肠杆菌培养液蛋白经过凝胶电泳(Gelfiltration)和离子交换层析(IonExchange)方法纯化后，经冷冻干燥后，制成纯化的、有活性的人BMP-9重组蛋白质。实施例4、重组BMP-9刺激成骨细胞分化。将原代大鼠颅骨成骨细胞接种(Plate)于24孔培养皿中，细胞培养液为αMEM和10％小牛血清。当细胞达到70％融合时，在培养液中加入BMP-9，培养24小时后，用0.05％的TritonX-100试剂提取细胞溶解产物(Celllysate)，然后用Sigma碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性。BMP-9刺激成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性(图2)。将BMP-9与原代大鼠颅骨成骨细胞(Osteoblast)培养4和8天后，从细胞中提取RNA并用Northern印渍的方法检测成骨细胞标志基因mRNA表达的变化。BMP-9可促进成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)，骨钙素(Osteocalcin，OC)和骨特异性转录调控因子Runx2mRNA的表达(图3)。此外，将原代大鼠颅骨成骨细胞接种(Plate)于24孔培养皿中，细胞培养液为αMEM和10％小牛血清。待细胞融合(Confluence)后(此时定为零天)，细胞培养液换为αMEM/5％小牛血清/5mMβ-磷酸甘油(β-glycerophosphate)/100μg/ml维生素C(AscorbicAcid)及不同剂量的BMP-9(50和200ng/ml)。细胞培养于CO2温箱中，每两天换一次培养液，每天在显微镜下观察细胞变化和骨小结(Bonenodule)是否形成。细胞培养中止于10天。经福尔马林固定后，用vonKossa方法染色，然后用连接于显微镜的计算机和OsteoMeasure软件系统计算骨小结的形成量，BMP-9呈剂量依赖的方法促进骨小结的形成(图4)。实施例5、重组BMP-9刺激骨形成。BMP-9(500μgBMP-9/公斤体重)连续5天皮下注射于一月龄的ICRSwiss小鼠的颅骨表面。注射完成两周后，将动物处死，将颅骨取出，经福尔马林固定，用12％EDTA脱钙两周后，用石蜡(Paraffin)包埋，经组织切片，H&E染色后，观察颅骨表面的新骨形成，并用OsteoMeasure软件系统测量新骨的骨量。实验证明，重组BMP-9促进小鼠新骨的形成(图5)。实施例6、重组BMP-9诱导小鼠异位骨形成。将1mg纯化的BMP-9与I型胶原溶液混和后，冰冻干燥，种植于一月龄小鼠股骨附近的肌肉内，一个月后，做X光照相，并将动物处死后，将移植部位组织用福尔马林固定和12％EDTA脱钙，经石蜡包埋后，做组织切片和H&E染色。BMP-9诱导小鼠异位骨形成(图6)。实施例7、重组BMP-9促进骨缺损的修复。由骨肿瘤手术后或创伤后造成的大块骨缺损(Segmentalbonedefect)，在临床上，目前只有用骨移植的方法进行治疗，且疗效往往不成功。用人BMP-9与其载体制成的复合物填充于骨缺损部位，可诱导成骨细胞的增殖与分化，保进新骨的形成。将BMP-9与脱钙骨基质混和后，将二月龄大鼠颅骨表皮做手术切开，用特制的手术电钻制成1cm的圆形骨缺损。将BMP-9/脱钙骨基质混合物种植于骨缺损处。对照组大鼠种植不含BMP-9的脱钙骨基质。8周后，将大鼠处死，做X光照相，取出颅骨组织，福尔马林固定，脱钙，石蜡包埋，组织切片处理后做H&E染色。BMP-9可诱导颅骨骨缺损的修复，在骨缺损处可观察到新骨和骨髓腔的形成(图7)。实施例8、重组BMP-9促进骨折修复。对于难愈合性骨折(Non-unionfracture)，目前临床上尚无有有效的治疗方法，应用BMP-9，可有效地促进难愈合性骨折的愈合。将二月龄的小鼠用Thomas-Einhorn装置制成股骨骨折后，将BMP-9(0.5mg)连续7天注射于骨折部位，观察动物骨折2-3周后骨痂形成和骨折愈合的情况，对照组为注射等量生理盐水。BMP-9对动物骨折愈合有明显的促进作用(图8)。权利要求1.一种分离的DNA分子，其特征在于它编码人骨形态发生蛋白9(BMP-9)核苷酸序列。2.一种蛋白质，其特征在于哺乳细胞及大肠杆菌表达人骨形态发生蛋白9重组蛋白质。3.一种载体，其特征在于将编码BMP-9核苷酸序列基因段重组于质粒载体，当该质粒载体在哺乳细胞和大肠杆菌扩增时，重组BMP-9得以表达。4.一种宿主细胞，其特征在于使重组BMP-9在其表达的哺乳细胞及大肠杆菌宿主细胞。5.一种人骨形态发生蛋白9重组蛋白质的生产方法，其特征在于方法的步骤如下在哺乳细胞1)利用RNA逆转录-多聚核苷酸链反应，合成人BMP-9的cDNA，RNA提取自人成骨细胞株U2-OS细胞，并逆转录成cDNA；2)将cDNA克隆至pcDNA3载体，这一BMP-9/pcDNA3表达质粒适合BMP-9蛋白在哺乳细胞的表达；3)利用DNA稳定转染的方法，将人BMP-9cDNA转染至中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；4)通过新霉素筛选和细胞克隆，获得稳定表达人BMP-9的单克隆细胞株，用Northern印渍的方法，测出人BMP-9在CHO细胞的表达；5)收集培养CHO/BMP-9细胞的条件培养液，将此培养液加入到成骨细胞中测定BMP-9活性。在大肠杆菌1)将人BMP-9成熟肽的cDNA克隆至pGEM-GST-KG载体，然后转导至DH5α大肠杆菌中；2)含有人BMP-9的大肠杆菌培养液蛋白经过凝胶电泳和离子交换层析方法纯化，然后经过透析及复性处理冷冻干燥后，制成纯化的，有活性的人BMP-9重组蛋白质。6.一种人骨形态发生蛋白9重组蛋白质的用途，其特征在于它用于制备刺激成骨细胞分化和新骨形成、促进骨折愈合，治疗骨折、骨缺损疾病的药物。全文摘要本发明公开了一种人骨形态发生蛋白9重组蛋白质核苷酸序列及生产方法和用途。一种分离的DNA分子，它编码人骨形态发生蛋白9(BMP－9)核苷酸序列。一种蛋白质哺乳细胞及大肠杆菌表达人骨形态发生蛋白9重组蛋白质。一种载体将编码BMP－9核苷酸序列基因段重组于质粒载体，当该质粒载体在哺乳细胞和大肠杆菌扩增时，重组BMP－9得以表达。一种宿主细胞使重组BMP－9在其表达的哺乳细胞及大肠杆菌宿主细胞。人骨形态发生蛋白9重组蛋白质用于制备刺激成骨细胞分化和新骨形成、促进骨折愈合，治疗骨折、骨缺损疾病的药物。本发明的优点是1.利用哺乳细胞和大肠杆菌首次成功表达人BMP－9重组蛋白质；2.BMP－9重组蛋白质具有刺激骨形成，促进骨缺损和骨折修复的功能。文档编号C07K14/435GK1844391SQ200610050518公开日2006年10月11日申请日期2006年4月26日优先权日2006年4月26日发明者陈棣,耿健晨,李恒林,鲍忆申请人:嘉兴波亿生物科技开发有限公司