专利名称：从转基因乳铁蛋白水稻中提取乳铁蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种从转基因乳铁蛋白水稻中提取乳铁蛋白的方法。
背景技术：
乳铁蛋白质(LF)是母乳中的最主要活性物质之一。它是一种具有多种生物学功能的蛋白质(B.Lo¨nnerdal，S.Iyer，Lactoferrin(1995)Molecular structure andbiological function，Annu.Rev.Nutr.1593-110)。它不仅参与铁的转运，而且具有抗微生物、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等功能，被认为是一种新型的抗菌抗癌药物和极具开发潜力的食品和饲料添加剂。
LF可以促进中性白细胞或巨噬细胞的杀菌作用和吞噬作用，对NK细胞的活性和淋巴细胞、中性白细胞的繁殖具有调节作用。在一般情况下，血清中含有LF 0.30～0.5μg/mL；但一旦发生感染，LF将从活化的嗜中性粒细胞中释放到血液中，而且放出量可增加到平时的20倍，因此LF可被视为抗炎因子。
人和牛的LF都已被发现有抑制脂质过氧化的作用(Shinmoto，等)，因此用作食品和饲料添加剂可以起到抗氧化剂的作用。
LF还具有直接的杀菌能力，但具体的杀菌机理目前还不十分清楚。Ellison等报道，LF可粘附于细菌胞膜通过改变膜的通透性而使细菌死亡。Ellison等报道LF可以导致革兰氏阴性菌外膜中脂多糖的释放，从而改变胞膜的通透性。
LF还具有杀真菌的能力，对于假丝酵母属作用研究报导的较多。这些抗细菌和真菌活性不仅仅靠夺取病原体微环境中的铁离子，而且还通过以其N一端结合细菌和真菌的细胞壁破坏细胞膜，导致细胞内容物的泄露来杀死它们。
新西兰科学家在牛奶中新发现一种能增强人体骨质的乳铁蛋白，这一发现使牛奶成为一种具备对抗骨质疏松的武器。直接注射乳铁蛋白能导致的骨生长明显加快的现象说明，这种方法可适用于治疗骨折，使骨折患者早日康复。
乳铁蛋白以前主要从动物乳中提取，但成本高，产量低。人的乳铁蛋白由于缺乏原料，大量生产不可能。但是植物转基因技术使利用植物生产乳铁蛋白成为可能。利用水稻生产乳铁蛋白有已有报道(Suzuki等2003 J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.36190-199)。但是植物中乳铁蛋白含量较低，通常只有总重量1％以下。尽管含有乳铁蛋白的植物可以直接食用，但提取高浓度乳铁蛋白可以更广泛地利用乳铁蛋白。
Nandi等(2002)报道用含0.35M的NaCl的PBS缓冲液从转基因水稻种子中提取乳铁蛋白(Nabdi et al.，Plant Science 163713-722)。但是如此浓度的NaCl会影响乳铁蛋白的实际应用。例如，将含高浓度NaCl的乳铁蛋白直接作为食品添加剂或作为原料配制成的各种饮料，会造成产品的高NaCl含量，不符合实际需要。而采用脱盐步骤，即增加成本又可能造成部分产量(乳铁蛋白)的损失。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种成本低、产量高的从转基因乳铁蛋白水稻中提取乳铁蛋白的方法。
本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的提供一种从转基因乳铁蛋白水稻中提取乳铁蛋白的方法，依次包括以下步骤1)、在转基因乳铁蛋白水稻种子中加入水或缓冲液，混合后进行粉碎，形成湿粉末；或者直接将转基因乳铁蛋白水稻种子进行粉碎，粉碎后加入水或缓冲液混合形成湿粉末；上述缓冲液均为NaCl的浓度＜0.1mol/L、且pH值为6～9的缓冲液，上述粉碎过程温度均保持在70℃以下，水或缓冲液与转基因乳铁蛋白水稻种子的投料比为1～10毫升/克。
2)、将上述湿粉末混合震荡；再5000g离心10分钟后，分离沉淀和上清溶液。
作为本发明的从转基因乳铁蛋白水稻中提取乳铁蛋白的方法的一种改进先在所得的沉淀中加入水或缓冲液，混合后形成湿粉末，所述缓冲液为NaCl的浓度＜0.1mol/L、且pH值为6～9的缓冲液，所述水或缓冲液与沉淀的投料比为1～10毫升/克；再重复步骤2)1～3次。
作为本发明的从转基因乳铁蛋白水稻中提取乳铁蛋白的方法的进一步改进步骤2)中混合震荡2～3小时。
在发明过程中，发明人作了如下的对比试验试验1、不同NaCl浓度提取液对乳铁蛋白提取量的影响(仅缓冲液中NaCl的浓度不同，其余均参照本发明的步骤)取二份各2克的乳铁蛋白水稻种子，分别在5mL的含0.3M NaCl和不含NaCl的PBS(pH7.5)缓冲液中粉碎，以250转/分钟的频率震荡2小时，再5000g离心10分钟后，分离沉淀和上清溶液。对上清溶液中的乳铁蛋白进行了SDS-PAGE分析，并以牛BSA蛋白质为标准蛋白质，通过光密度扫描技术对SDS-PAGE分析的样品中的乳铁蛋白总量进行了测算。利用PBS含0.3M NaCl提取液，乳铁蛋白的提取量为3.1mg/mL；而利用PBS不含NaCl则为3.4mg/mL。
试验2、提取液不同的pH对乳铁蛋白提取量的影响(仅缓冲液pH不同，其余均参照本发明的步骤)乳铁蛋白水稻种子粉碎后，每克粉末中加入10mL不同pH的缓冲液。以250转/分钟的频率震荡2小时，再5000g离心10分钟后，分离沉淀和上清溶液。将上清溶液中的乳铁蛋白进行了SDS-PAGE分析，并以牛BSA蛋白质为标准蛋白质，通过光密度扫描技术对SDS-PAGE分析的样品中的乳铁蛋白总量进行了测算，具体结果见表1。
表1、不同pH的缓冲液所得的乳铁蛋白量
从上述数据得知，提取液的适宜pH值为6～9。
用本发明的从转基因乳铁蛋白水稻中提取乳铁蛋白的方法，能使乳铁蛋白浓度占总蛋白质(即上清溶液)的40％以上；且能保证最终提取的乳铁蛋白中没有盐或仅含有低浓度盐。因此用本发明方法提取的乳铁蛋白，适用于配制饮料，使饮料中含有活性的植物性来源的乳铁蛋白；还适用于当作食品添加剂、或饲料添加剂，能起到加强功能食品性能和饲料质量的作用。利用本发明的方法，能更简单快速地从转基因水稻种子中提取乳铁蛋白，从而降低生产成本；还由于不用或大量减少了盐的使用量，因此能节省脱盐造成的成本的增加和产量的损失。
图1是本发明所提取得到的乳铁蛋白的蛋白质凝胶电泳图。
具体实施例方式
以下实施例中所使用分子生物学和生物化学的方法均为已知的技术，在Ausubel编写的John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in MolecularBiology等文献均有详细的说明。
实施例1、表达乳铁蛋白的转基因水稻种子的获得人乳铁蛋白质基因(hLF)由上海生工合成，启动子是水稻Gt启动子。Gt和hLF被克隆在质粒pCAM1300中获得pCAM1300-GT-hLF。pCAM1300-GT-hLF通过农杆菌转入水稻品种秀水11和台北309。hLF由启动子Gt1控制，能在水稻种子中表达。在获得的40个转基因株系(为2801～2840)中，其中二个转基因株系，乳铁蛋白2824和乳铁蛋白2831，可以表达比较高水平的乳铁蛋白，被用作为本发明的材料。
当然，所有的转基因乳铁蛋白水稻种子均可作为本发明所使用的材料。
实施例2、水稻种子中人乳铁蛋白质的提取，依次进行以下步骤(本实施例中所指的水是指不含NaCl的水)方法A步骤1、在实施例1所得的水稻种子中加入水或缓冲液，混合后进行粉碎，形成湿粉末；或者直接将实施例1所得的水稻种子进行粉碎，粉碎后加入水或缓冲液混合形成湿粉末；所用的缓冲液均为NaCl的浓度＜0.1mol/L、且pH值为6～7.5的缓冲液，上述粉碎过程温度均保持在70℃以下。水或缓冲液与该水稻种子的投料比为1毫升/克。
步骤2、将上述湿粉末以250转/分钟的频率混合震荡2～3小时，再5000g离心10分钟后，分离沉淀和上清溶液。
步骤3、收集上述步骤所得的沉淀，先在所得的沉淀中加入水或缓冲液，混合后形成湿粉末，所述缓冲液为NaCl的浓度＜0.1mol/L、且pH值为6～7.5的缓冲液，水或缓冲液与沉淀的投料比为5毫升/克；再重复步骤2)1～3次。
收集所有的上清溶液即为总蛋白质。
方法B步骤1中水或缓冲液与该水稻种子的投料比改为5毫升/克；步骤3中水或缓冲液与该沉淀的投料比改为1毫升/克；其余均同方法A。收集所有的上清溶液即为总蛋白质。
方法C步骤1中水或缓冲液与该水稻种子的投料比改为10毫升/克；步骤3中水或缓冲液与该沉淀的投料比改为10毫升/克；其余均同方法A。收集所有的上清溶液即为总蛋白质。
采用上述方法，所得的总蛋白质重量的40％以上为乳铁蛋白。
实施例3、乳铁蛋白含量和纯度分析提取的乳铁蛋白可以用SDS-PAG分析含量和纯度。根据SDS-PAGE的通用方法(奥斯伯，F布伦特，R金斯顿，等.精装分子生物学实验指南[M].北京科学出版社，1998，334-338)。对实施例2提取的乳铁蛋白样品进行了分析。Western分析表明SDS-PAGE胶上的主要蛋白带为乳铁蛋白。光密度扫描分析发现其占总蛋白质含量的40～60％，具体如图1所示当选用乳铁蛋白2824进行实施例2时，1代表从乳铁蛋白水稻2824中所提取的乳铁蛋白；当选用乳铁蛋白2831进行实施例2时，2代表从乳铁蛋白水稻2831所提取的乳铁蛋白；3、4、5代表的是阴性对照；当选用乳铁蛋白2803进行实施例2时，6代表从乳铁蛋白水稻2803所提取的乳铁蛋白；7代表的是标准蛋白质。
实施例4、乳铁蛋白提取品的应用上述提取的乳铁蛋白可用作食品添加剂、或饲料添加剂，能加强功能食品的性能和饲料的质量；还可以作为原料配制成各种饮料。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种从转基因乳铁蛋白水稻中提取乳铁蛋白的方法，其特征是包括以下步骤1)、在转基因乳铁蛋白水稻种子中加入水或缓冲液，混合后进行粉碎，形成湿粉末；或者直接将转基因乳铁蛋白水稻种子进行粉碎，粉碎后加入水或缓冲液混合形成湿粉末；所述缓冲液均为NaCl的浓度＜0.1mol/L、且pH值为6～9的缓冲液，上述粉碎过程温度均保持在70℃以下，所述水或缓冲液与转基因乳铁蛋白水稻种子的投料比为1～10毫升/克；2)、将上述湿粉末混合震荡，再5000g离心10分钟后，分离沉淀和上清溶液。
2.根据权利要求1所述的从转基因乳铁蛋白水稻中提取乳铁蛋白的方法，其特征是先在所得的沉淀中加入水或缓冲液，混合后形成湿粉末，所述缓冲液为NaCl的浓度＜0.1mol/L、且pH值为6～9的缓冲液，所述水或缓冲液与沉淀的投料比为1～10毫升/克；再重复步骤2)1～3次。
3.根据权利要求1或2所述的从转基因乳铁蛋白水稻中提取乳铁蛋白的方法，其特征是所述步骤2)中混合震荡2～3小时。
全文摘要
本发明公开了一种从转基因乳铁蛋白水稻中提取乳铁蛋白的方法，包括以下步骤1)在转基因乳铁蛋白水稻种子中加入水或缓冲液，混合后进行粉碎，形成湿粉末；或者直接将转基因乳铁蛋白水稻种子进行粉碎，粉碎后加入水或缓冲液混合形成湿粉末；缓冲液均为NaCl的浓度＜0.1mol/L、且pH值为6～9的缓冲液，上述粉碎过程温度均保持在70℃以下，水或缓冲液与转基因乳铁蛋白水稻种子的投料比为1～10毫升/克。2)将上述湿粉末混合震荡，再5000g离心10分钟后，分离沉淀和上清溶液。用本发明的方法提取乳铁蛋白，具有成本低、产量高的特点。
文档编号C07K14/415GK1824674SQ20061005007
公开日2006年8月30日 申请日期2006年3月29日 优先权日2006年3月29日
发明者沈志成 申请人:浙江大学