专利名称：一种链霉菌产生的新化合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种链霉菌产生的新化合物及其制备方法和应用。
背景技术：
众所周知，癌症已经严重地威胁人类健康和生命，据WHO统计，全球每 年因癌症死亡的人数已经超过600万，新增癌症患者高达1000多万，并有逐年 上升趋势。目前，紫杉醇已成为治疗癌症公认的首先药物，由于紫杉醇的独特 疗效和产量低，使其价格极为昂贵，曾高达500万美元/公斤。
徼生物作为一类重要的天然药用资源，为人类的健康做出了巨大的贡献。 现已研究开发和利用持续了半个多世纪，但新发现的药用微生物及其活性化合 物的数量仍在稳步增长，近年来，随着分子生物学和人类基因组研究的飞速发 展，人们设计了许多特异性的针对人体各种疾病的新药筛选模型，使得从微生 物中筛选新的药用生物活性物质的研究又迎来了一个新的春天，必将发挥越来 越重要的作用。
1928年，英国学者AlFleming发现青霉素及其在细菌性感染疾病的治疗方 面应用发展是人类制药历史上具有划时代意义的里程碑。此后，美国著名土壤 微生物学家Sdman A. Waksman在20世纪40年代先后发现了链霉素等放线 菌产生的抗生素。青霉素和链霉素的发现，极大地推动了抗生素研究的发展和 新抗生素的发现，使抗生素在抗感染药物的治疗中发挥了主导性的作用，奠定 了现代抗生素制药工业发展的基础。
在近几十年内，抗生素的研究又有了飞速的发展，相继发现了氯霉素、金霉 素、土霉素、四环素、新霉素和红霉素等抗菌素。已找到的抗生素有数千种， 其中具有临床效果并已利用发酵法大量生产和广泛应用的多达百余种。
一个好的抗生素应具有较广的抗菌谱外，还应具有较好的选择性，不产生 过敏和耐药性，有高度的稳定性，收率高，成本低，适于工业先产。目前生产 和应用的抗生素还不能完全满足以上要求，寻找新的抗生素仍然是很重要的任 务。(张致平.微生物药物学.化学工业出版社，20(B.)现在以抗肿瘤、抗病毒、抗 真菌、抗原虫、广谱和抗耐药菌的抗生素为主要研究方向，已成功地建立了用 于治疗艾滋病，抗老年性痴呆症，消除肥胖症，控制糖尿病并发白内障，抑制 前列腺肿大的抗生素的筛选模型，估计近年内可取得一系列成功。因此，现在利
用发酵技术生产的"抗生素"可以把微生物代谢产生的对人类疾病的预防和治
疗有用的物质都包括进去。
发明内容
本发明的目的是提供一种链霉菌产生的新化合物及其制备方法和应用 本发明的技术方案如下 一种链霉菌发酵产生的新化合物，其结构式(A)如下
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一种链霉菌产生的新化合物的制备方法，包括菌种的发酵和产物的分离提 纯，生产菌是小白链霉菌徐州变种，拉丁文名称Streptomyces albulus 、ar. xuzhoiiensis，是徐州师范大学江苏省药用植物生物技术重点实验室提供保存在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，编号为CGMCC No. 1815。将该菌在含无机盐及维生素的培养基上进行液体发酵，获得含发酵产 物的发酵液，发酵液经浓縮后用正丁醇或氯仿或乙酸乙酯萃取发酵产物，通过 硅胶层析法、凝胶层析法，纯化得到成品。
所述的发酵产物为2-(6-氨基-嘌啉-9-基乙炔基)-5-羟甲基四氢呋喃-3， 4 二
醇。该发酵产物在小白链霉菌发酵液中。 具体步骤如下 1).产生菌
生产菌来源小白链雾菌徐州变种，拉丁文名称Streptomyces albiilm 、ar. xuzhoueiisis，是徐州师范大学江苏省药用植物生物技术重点实验室提供保存在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，编号为CGMCC No.1815。
种子培养培养基成分葡萄糖0.5-1.5%，牛肉膏0 .2-1%，黄豆饼粉 l-2 % ， 0.2-0.6%(NEl)2S04 , 0. 001—0. 004%K2HP04， 0. 001-O. 006%MgS04, 0. 001-0. 005% Fe2S04, p服.5-8. 5，28"C振荡培养36-72小时。
2) .液体发酵
发酵培养培养基成分玉米粉1-3%,黄豆饼粉1-4%,葡萄糖1-5% ， (NH4)2S04 0.1-0.8% ， K2HP04 0. 001-0. 006%,MgS04 0. 002-0. 007%, ， Fe2S04 0. 001 -0.005%,水1000 ml;条件是pH6. 5-7. 5， 28"培养36-96小时。
3) .发酵产物的分离提纯
将发酵液用旋转蒸发器浓縮10-20倍，用正丁醇或氯仿或乙酸乙酯萃取2-3 次，合并萃取液后浓縮得含有新化合物(A)的混合物。
发酵产物在发酵液中经过滤后用大孔树脂分离得新化合物。具体方法是 将过滤后发酵液加入到大孔树脂上，加压让含有新化合物的物质吸附到大孔树 脂上，其他从大孔树脂上流出，然后用不同比例的乙醇洗脱，即得到含有新化 合物的混合物。将含有新化合物的混合物经硅胶柱和LH20凝胶株分离纯化得新 化合物(A)
该新化合物抗肿瘤活性测定
(1) 用JffTT法测定该新化合物对对肺癌细胞NCI-H460的抑制活性IC50为 29.6ng/ml。
(2) 用MTT法测定该新化合物对对胃癌细胞SGC7901的抑制活性IC50为 12 ng/mL
具体实施例方式
实施例1 链霉菌产生的新化合物及其制备方法和应用
种子培养培养基成分葡萄糖1%,牛肉膏0.5%,黄豆饼粉1%，
0.4%(NH4)2S04, 0.002%K2HP04, 0. 003%MgS04, t 0. 003% Fe2S04， pH6. 5-8. 5， 28
X:振荡培养36-72小时。.
在发酵權中用发酵培养基发酵小白链霉菌徐州变种CGMCC1815得含2-(6-氨基-嘌啉-9-基乙炔基)-5-羟甲基四氢呋喃-3， 4二醇的发酵液，该发酵培养基成 分3X玉米粉，2%黄豆饼粉，2%葡萄糖，0.4%(NH4)2S04, 0.002%k2HP04, 0. 003%MgS04, 0. 003% Fe2S04，水1000ml; pH 7. 2， 28"C培养72小时。放罐 体积为15升，先将发酵液进行浓縮，再进行酸化处理，用盐酸调至PH=4. 0-5. 5， 用氯仿萃取，浓缩后用石油醚/氯仿=9: 4 (体积比)进行硅胶柱层析，收集洗 脱液，对各洗脱组分进行抗肺癌细胞NCI-H460活性测定，确定活性最大组分。 将上述抗肺癌细胞NCI-H460活性最大组分上LH20凝胶柱，用甲醇和氯仿5: 1 的比例进行洗脱，得抗肺癌细胞NCI-H460活性最大化合物。根据波谱技术 (1H-NMR, 13C-NMR，质谱等)对所得抗肺癌细胞NCI-H460活性最大化合物进行 结构鉴定，确定为新化合物(A)。
实施例2
① 将链酶菌发酵培养的发酵液离心后，取上清液，过大孔树脂柱，用丙酮 洗脱得粗提物。
② 将所得粗提物，上硅胶层析柱，用乙酸乙酯和甲醇进行梯度洗脱，收集 洗脱液，对各洗脱组分进行抗肺癌细胞NCI-H460活性测定，确定活性最大组分。
③ 将上述抗肺癌细胞NCI-H460活性最大组分上LH20凝胶柱，用甲醇和氯 仿5: l的比例进行洗脱，得抗肺癌细胞NCI-H460活性最大化合物。
④ 根据波谱技术(1H-NMR， 13C-NMR，质谱等)对所得抗肺癌细胞NCI-H460 活性最大化合物进行结构鉴定，确定为新化合物(A)。
实施例3
① 将链嗨菌发酵培养的发酵液离心后，取上清液，用旋转蒸发器浓縮，用 氯仿萃取，得氯仿萃取物。
② 将所得氯仿萃取物，上硅胶层析柱，用氯仿和甲醇进行梯度洗脱，收集 洗脱液，对各洗脱组分进行抗肺癌细胞NCI-H460活性测定，确定活性最大组分。
③ 将上述抗肺癌细胞NCI-H460活性最大组分上LH20凝胶柱，用甲醇和氯 仿5: l的比例进行洗脱，得抗肺癌细胞NCI-H460活性最大化合物。
④ 根据波谱技术(1H-NMR, 13C-NMR,质谱等)对所得抗肺癌细胞NCI-H460活性最大化合物进行结构鉴定，确定为新化合物(A)。 实施例4链霉菌产生的新化合物的应用
用MTT法测定该新化合物(A)对对肺癌细胞NCI-H460的抑制活性IC50 为29. 6ng/ml。
用MTT法測定该新化合物对对胃癌细胞SGC7901的抑制活性IC50为12 ng/ml
附新化合物(A)结构表征
质谱(ESI) m/z: 288 (M—3), 270 (M—3-H20)
■NMR ( 8 ppm): 3.58 ( 1H, m， J = 4， C5'-H ) ; 3.66 ( 1H, m， J = 4.5， C5—H ); 3.94 (1H， q， J = 3.6， Cr-H ); 4.11 (IH， q， J = 4, C3'-H ); 4.38 ( 1H， q， J = 5.6， Cr-H ); 5.17 ( 1H， d, J = 5.2, OH ); 5.19 ( 1H， d， J = 5.6 ， OH); 5.44 ( 1H， d, J = 6， OH ); 6.06 (1H， d， J = 5.6， C,'-H); 6.89 ( 2H， b, NH2); 8.23 ( 1H， s， C8-H ); 8.44 ( 1H， s， QrH)
13NMR( S叩m): 61.39 ( C5' ); 70.37 ( C3, ); 74.42 ( C2， )； 83.15 ( C2" ); 85.64 ( C4,); 87.97 ( Cr ); 101.43 ); 115.48 ( C5); 132.55 ( C8 ); 150.31 ( C4 ); 153.71 ( C2); 157.20 ( C6 )
附
图1新化合物(A)核磁共振氢谱
附图2新化合物(A)核磁共振氢谱(重水交换)
附图3新化合物(A)核磁共振碳谱
附图4新化合物(A)核磁共振碳一氢相关谱。
权利要求
1.一种链霉菌发酵产生的新化合物，其结构式(A)如下id="icf0001" file="A2006101614590002C1.gif" wi="48" he="59" top= "40" left = "73" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>2-(6-氨基-嘌啉-9-基乙炔基)-5-羟甲基四氢呋喃-3，4-二醇(A)。
2. —种权利要求1所述的新化合物的制备方法，包括菌种的发酵和产物的 分离提纯，其特征在于，生产菌是小白链霉菌徐州变种(Streptomycesalbulusvar. xuzhouensis)CGMCC No. 1815,将该菌在含无机盐及维生素的培养基上进行液体 发酵，获得含发酵产物的发酵液，发酵液经浓縮后用正丁醇或氯仿或乙酸乙酯萃 取发酵产物，萃取物通过硅胶层析法、凝胶层析法，纯化得到成品；所述的发酵 产物为2-(6-氨基-嘌啉-9-基乙炔基)-5-羟甲基四氢呋喃-3， 4 二醇。
3. 根据权利要求2所述的新化合物的制备方法，其特征在于，所述的发酵 液经过滤后上大孔树脂，用丙酮洗脱，分离得含新化合物的混合物。
4、 根据权利要求2所述的新化合物的制备方法，其特征在于，所述的发酵 方法包括菌种的活化、摇瓶培养和液体发酵培养，获得发酵产物。
5、 根据权利要求2或4所述的新化合物的制备方法，其特征在于小白链 霉菌徐州变种CGMCC1815的种子培养基成份为葡萄糖0.5-1.5%，牛肉膏 0 .2-1%，黄豆饼粉1-2%， (NHJ2S04 0.2-0.6%， K2HP04 0.001-0.004%, MgS04 0.001-0.006%, Fe2S04 0.001-0.005%; PH6. 5-8. 5， 28。C振荡培养36-72小时。
6、根据权利要求2或4所述的新化合物的制备方法，其特征在于，所述的 液体发酵培养基成份为玉米粉1-3%,黄豆饼粉1-4%,葡萄糖1-5%, (NH4)2S040.卜0.8%, K2HP040. 001-0. 006%, MgS04 0. 002-0. 007%4， Fe2S04 0.001-0. 005%,水1000 ml,条件是在pH 6. 5-7. 5， 28℃下培养36-96小时。
7、权利要求l所述的新化合物的应用，其特征在于，该新化合物具有抗肿 瘤活性，可用于抗肿瘤药物。
全文摘要
本发明公开了一种链霉菌产生的新化合物及其制备方法，用小白链霉菌徐州变种CGMCC1815(Streptomyces albulus var.xuzhouensis)作生产菌。该链霉菌在含有无机盐及维生素的培养基里进行液体发酵，获得链霉菌菌丝体、发酵上清液和各种代谢产物。对发酵后的发酵上清液和菌丝用氯仿或乙醇萃取，通过提取分离和纯化等方法，得到结构式如上新化合物。该新化合物具有抗肿瘤活性。
文档编号C07D473/00GK101200467SQ200610161459
公开日2008年6月18日 申请日期2006年12月15日 优先权日2006年12月15日
发明者何放亭, 冯友建, 蒋继宏 申请人:徐州师范大学;何放亭