专利名称：：一种二苯乙烯苷提取物的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种从植物中提取有效成分的方法，尤其涉及一种从何首乌中提取二苯乙烯苷的方法，属于中药领域。
背景技术：
：何首乌，为寥科植物何首乌PolygonummultiflorumThunb的干燥块根。根据其炮制方法不同又有生首乌与制首乌之分。生首乌味苦、涩、性平，具有润肠、解毒、截疟之功效，用于肠燥便秘，痈疽瘰疬等症。制首乌味苦、甘、涩、性温，具有补肝肾、益精血、壮筋骨、乌须发之效，主要用于肝肾精血亏虚、头昏目眩、须发早白、腰膝酸软及遗精等症，历代《本草》有记载。成分主要有羟基蒽醌类化合物和糖苷类化合物，如二苯乙烯苷等，还有一些酰胺类化合物、色原酮类化合物以及卵磷脂等，糖苷类化合物含量最多的是二苯乙烯苷类化合物。何首乌有抗衰老、神经保护、抗炎免疫、促进生长发育等作用。本发明人多年来以研究治疗神经退行性病变为主要研究方向，特别是从祖国传统中医中药中筛选治疗老年痴呆的新药，经过对大量中药的筛选，发现何首乌有较好的作用。进一步分析研究，发现了四羟基二苯乙烯苷(TSG)提取物在P-淀粉样蛋白(AP)致神经细胞损伤模型上具有明显的神经保护作用；在体外试验中TSG可明显抑制p-分泌酶的活性；在A(3前体蛋白APP转基因小鼠、AP脑室注射模型、胆碱能神经元损伤大鼠模型、D-半乳糖小鼠模型和慢性脑缺血大鼠模型等拟痴呆动物模型上，TSG可明显提高学习记忆功能，减少脑内淀粉样斑块和Ap的形成，降低P-分泌酶和，分泌酶含量，增高脑组织M受体亲和力，增强胆碱乙烯转移酶(ChAT)活性，抑制脂质过氧化和细胞浆内钙超载，提高总抗氧化能力，增加谷胱甘肽(GSH)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性，增强海马神经生长因子(NGF)、神经营养因子-3(NT-3)和NGF的受体TrkA的表达。现有二苯乙烯苷提取物的制备方法技术，采用水提取或者乙醇提取，浓縮，用硅胶柱层析，得率低，时间长，成本高，用本发明可以克服以上缺点。
发明内容本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的二苯乙烯苷(二苯乙烯武，全名为2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-0-p-D-葡萄糖甙)提取物的方法，该方法所制备的二苯乙烯苷提取物中，二苯乙烯苷的含量大于55%。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的一种二苯乙烯苷的制备方法，该方法包括以下步骤(1)何首乌加乙醇，加热回流，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓縮至无醇味，得浓縮液或浸膏；(2)向浓縮液或浸膏中加水，搅匀，静置，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取，合并萃取液；(3)将合并后的萃取液回收乙酸乙酯并浓縮至稠膏，干燥，粉碎，得到二苯乙烯苷。为了提取到更高含量的二苯乙烯苷，一种优选的二苯乙烯苷制备方法，包括以下步骤(1)将何首乌加6_12倍重量的40-95%乙醇，加热回流提取1-5次，每次1-4小时，将回流提取液合并后滤过，滤液回收乙醇后，浓縮至无醇味，得浓縮液；(2)向浓縮液或浸膏中加水，搅匀，静置，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取，合并萃取液；(3)将合并后的萃取液回收乙酸乙酯并浓縮至稠膏，干燥，粉碎，得到二苯乙烯苷。一种较优选的二苯乙烯苷制备方法是(1)将何首乌加6-12倍重量的40-90%乙醇，加热回流提取1-5次，每次1-4小时，将回流提取液合并后滤过，滤液回收乙醇后，浓縮至无醇味，得浓縮液；(2)将浓縮液加水，搅匀，静置4-12小时，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取2-4次，合并萃取液；(3)将合并后的萃取液回收乙酸乙酯并浓縮至稠膏，60-9(TC温度下减压干燥,粉碎成细粉，得到二苯乙烯苷。一种进一步优选的二苯乙烯苷制备方法是(1)将何首乌加8倍重量60%乙醇，加热回流提取3次，每次2小时，将回流提取液合并后滤过，滤液回收乙醇后，浓縮至相对密度为1.248(34°C)的浸膏；(2)向浸膏中加水，搅匀，静置6小时，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液；(3)将合并后的萃取液回收乙酸乙酯并浓縮至稠膏，8(TC温度下减压干燥，粉碎成细粉，得到二苯乙烯苷。一种更优选的二苯乙烯苷制备方法，包括以下步骤(1)将何首乌加8倍重量60%乙醇，加热回流提取3次，每次2小时，将回流提取液合并后滤过，滤液回收乙醇后，浓縮至相对密度为1.248(34°C)的浸膏；(2)向浸膏中加水，使水的体积为浸膏体积的4-6倍搅匀，静置6小时，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液；(3)将合并后的萃取液回收乙酸乙酯并浓縮至稠膏，减压干燥(80°C)，粉碎成细粉，得到二苯乙烯苷。一种最优选的二苯乙烯苷制备方法，包括以下步骤(1)将何首乌加8倍重量60%乙醇，加热回流提取3次，每次2小时，将回流提取液合并后滤过，滤液回收乙醇后，浓縮至相对密度为1.248(34°C)的浸膏；(2)向浸膏中加水，使水的体积为浸膏体积的4-6倍搅匀，静置6小时，滤过，滤液加1.5倍重量乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液；(3)将合并后的萃取液回收乙酸乙酯并浓縮至稠膏，减压干燥(80°C)，粉碎成细粉，得到二苯乙烯苷。本发明进行了一系列的正交试验，最终摸索到了一种从何首乌中提取高含量的二苯乙烯苷的方法，使提取到的二苯乙烯苷的含量超过55%，符合《药品注册管理办法》中药、天然药物5类新药的规定。本发明得率高，用时少，成本低。具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步说明。应当指出，这些实施例仅仅是本发明的例证，不应理解为对本发明的限制。说明1、本发明中所述的术语"二苯乙烯苷"与术语"2，3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-0-P-D-葡萄糖苷"二者等同。2、2，3,5，4'-四羟基二苯乙烯-2-0-e-D-葡萄糖苷(TSG)的含量测定方法避光操作，采用高效液相法(参照《中华人民共和国药典》2000版一部附录VID)。①仪器与试药仪器美国AgilentllOO型高效液相色谱仪，联想数字处理中心试药2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-0-P-D-葡萄糖苷标准品(供含量测定用，由中国药品生物制品检定所提供，批号0844-9802，)。乙腈为色谱纯(美国Fisher)，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。②色谱条件色谱柱YWG-C18(4.6mmX250mm,10um)反相柱，流动相乙腈沐(25:75)，检测波长320腿，流速1.0ml/min，柱温25。C[2]。③工作曲线制作精密称取2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-0-e-D-葡萄糖苷对照品2.31mg，置10ml量瓶中，稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为0.231mg/ml的对照品溶液。每次分别吸取6、8、10、12、14pl注入液相色谱仪，按上述条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，2，3,5，4'-四羟基二苯乙烯-2-0-e-D-葡萄糖苷进样量为横坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程为Y=3523.7X-104.31，r=0.99992，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-0-e-D-葡萄糖苷在1.3863.234i!g范围内呈线性关系。实施例1取何首乌20g，加6倍重量的95%乙醇，加热回流提取1次，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓縮至无醇味，加水，搅匀，静置4-12小时，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，萃取液回收乙酸乙酯并浓縮至稠膏，减压干燥，粉碎成细粉，得到二苯乙烯苷7.1g，经测定，二苯乙烯苷含量大于55%，提取率3.55%。实施例2取何首乌20g，加12倍重量的40%乙醇，加热回流提取5次，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓縮至无醇味，加水，搅匀，静置4-12小时，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，萃取液回收乙酸乙酯并浓缩至稠膏，干燥，粉碎成细粉，得到二苯乙烯苷7.2§，经测定，二苯乙烯苷含量大于55%，提取率3.6%。实施例3取何首乌20g，加8倍重量体积60%乙醇，加热冋流提取3次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓縮至无醇味，加水，搅匀，静置6小时，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，萃取液回收乙酸乙酯并浓缩至稠膏，减压干燥(60-90°C)，粉碎成细粉，得到二苯乙烯苷7.25g，经测定，二苯乙烯苷含量大于55%，提取率3.62%。实施例4取何首乌20g，加8倍量60%乙醇，加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓縮至相对密度为1.248(34°C)的浸膏，加入水，搅匀，静置6小时，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，萃取液回收乙酸乙酯并浓縮至稠膏，减压干燥(80°C)，粉碎成细粉，得到二苯乙烯苷7.35g，经测定，二苯乙烯苷含量大于55%，提取率3.675%。实施例5取何首乌20g，加8倍量60%乙醇，加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓縮至相对密度为1.248(34°C)的浸膏，加入水使水的体积为浸膏体积的4倍，搅匀，静置6小时，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，萃取液回收乙酸乙酯并浓縮至稠膏，减压干燥(80°C)，粉碎成细粉，得到二苯乙烯苷7.4g，经测定，二苯乙烯苷含量大于55%，提取率3.7%。实施例6取何首乌20g，加8倍量60%乙醇，加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓縮至相对密度为1.248G4。C)的浸膏，加入水使水的体积为浸膏体积的6倍，搅匀，静置6小时，滤过，滤液加1.5倍重量乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，萃取液回收乙酸乙酯并浓縮至稠膏，减压干燥(8CTC)，粉碎成细粉，得到二苯乙烯苷7.6g，经测定，二苯乙烯苷含量大于55%，提取率3.8%。对比试验例1何首乌块根中含有二苯乙烯类化合物，被认为是何首乌的主要成分之-，其中有2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-0-e-D-葡萄糖苷等。2,3，5,4'-四羟基二苯乙烯-2-0-e-D-葡萄糖苷能溶于水和醇，本试验分别将生何首乌进行了水提和醇提，以考察二者的优劣。具体方法如下①水煎法称取生何首乌150g，加入4倍水煎煮3次，每次2小时，滤过，合并滤液，浓縮至50ml，再加6倍量水搅匀，离心去沉淀，上清液用醋酸乙酯萃取3次，每次醋酸乙酯用量同上清液体积，合并萃取液，减压回收，浓縮并减压干燥，得干浸膏备用。②乙醇回流称取生何首乌150g，以60%乙醇回流提取3次，每次2小时，加醇量为药材量的4倍。滤过，合并滤液，回收乙醇至无醇味，浓縮至50ml，再加6倍量水搅匀，离心去沉淀，上清液用醋酸乙酯萃取3次，每次醋酸乙酯用量同上清液体积，合并萃取液，减压回收，浓縮并减压干燥，得干浸膏备用。③供试品溶液的制备精密称取一定量的上述各样品，置于10ml容量瓶中，加稀乙醇超声处理5分钟使溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45iim微孔滤膜过滤进样。按前述2,3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-0-3-D-葡萄糖苷的含测方法，测定2个样品中2，3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-0-e-D-葡萄糖苷的含量。由表1可知，乙醇回流法所提取的2，3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-0-P-D-葡萄糖苷(TSG)的含量明显要高于水煎煮法。表1不同提取方法提取四羟基二苯乙烯苷(TSG)数据表〈table>Complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>试验例1本发明最佳提取工艺考察试验1、何首乌的最佳提取条件考察试验称取生何首乌50g药材，共9份，按表2的因素水平，表3的提取条件分别进行正交试验(其中提取时间固定为2小时)，提取后滤液合并，量取体积，从中取出lml滤液至10ml容量瓶中，加入稀乙醇至刻度，摇匀。按上述方法测定2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-0-e-D-葡萄糖苷的含量。并对结果进行方差分析，结果见表4。表2K素水平表<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注以D因素为误差项表3提取正交实验表<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表4正交试验方差分析表<table>complextableseeoriginaldocumentpage１０</column></row><table>*:F0.10(2,2)=9.00**:F,(2，2)=19.00方差分析结果表明以提取出2，3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-0-13-D-葡萄糖苷的量为指标，因素A、C有差异但均无显著性差异，B因素无差异，因此从正交表中应选A,B3C3，C因素是提取次数，C2、(:3相差2.8%，考虑到工业生产热能消耗问题，应选择A!B3C2。故本发明确定生何首乌的提取条件为用60%的乙醇，8倍量，共提取3次。取50g生何首乌药材，分别用8倍量的50%、60%、70%乙醇热回流提取3次，每次2h，滤过，合并滤液，并量取体积，从中精密量取lml至10ml容量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，用0.45"m微孔滤膜滤过，按前述方法测定2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-0-P-D-葡萄糖苷的含量。并对结果进行分析。由表5可知，以60%乙醇提取2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-0-P-D-葡萄糖苷(TSG)的含量和转移率最高，故进一步证实了采用乙醇提取何首乌时，乙醇的浓度为60%时，提取效果最好。表5不同醇浓度提取四羟基二苯乙烯苷(TSG)数据表<table>complextableseeoriginaldocumentpage1０</column></row><table>2、加热回流的最佳提取时间的工艺考察试验分别取50g生何首乌药材，每次用8倍量的60%乙醇加热回流提取3次，一份提取时间分别为2h、lh、lh，另一份提取时间分别为2h、2h、lh，滤过，合并滤液，并量取体积，从中精密量取lml至10ml容量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，用0.45um微孔滤膜过滤，按上述方法测定2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-0-P-D-葡萄糖苷的含量。并对结果进行分析，结果见表6.由表6可知，每次提取2h提出的2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-0-e-D-葡萄糖苷(TSG)的含量比前两次提取2h，第三次提取lh的高出6.59Q/。，故最佳提取时间应为每次2h。表6不同提取时间提取四羟基二苯乙烯苷(TSG)数据表<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>3、最佳纯化工艺考察试验为了进一步提高有效成分的含量和纯度，需将生何首乌的醇提物水沉后离心去沉淀，上清液再用醋酸乙酯萃取。取405g何首乌药材，按上述最佳提取方法提取，将提取液合并，回收乙醇，浓縮到相当于生药材l:3(ml/g)，即135ml，平均分成9份，按表7的因素水平进行正交试验，萃取后分别合并萃取液，量取体积，从中精密量取lml滤液至10ml容量瓶中，将滤液放在水浴中蒸干，用稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。按上述方法测定2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-0-e-D-葡萄糖銜TSG)的含量。并对结果进行方差分析，结果见表8、9。表7因素水平表<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注以D因素为误差项表8水沉萃取正交实验含量测定表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表9正交试验含量测定方差分析表<table>complextableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*:F0.10(2,2)=9.00**:F,(2,2)=19.00由表9可知，因素A〉OB，因素B、C无差异，因素A有差异，但无显著性差异，因此综合考虑后，最优选的纯化条件为稠浸膏加46倍的水(Wv)稀释，离心，上清液用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯的用量每次不少于药液的1.5倍。权利要求1、一种二苯乙烯苷的制备方法，包括以下步骤(1)向何首乌中加入乙醇，加热回流，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至无醇味，得浓缩液或浸膏；(2)向浓缩液或浸膏中加水，搅匀，静置，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取，萃取液备用；(3)将萃取液回收乙酸乙酯并浓缩至稠膏，干燥，粉碎，得到二苯乙烯苷。2、按照权利要求1的制备方法，其特征是步骤(1)中将何首乌加6-12倍重量的40-95%乙醇，加热回流提取l-5次，每次l-4小时。3、按照权利要求2的制备方法，其特征是步骤(1)中将何首乌加8倍重量的60%乙醇，加热回流提取3次，每次2小时。4、按照权利要求1的制备方法，其特征是步骤(2)向浓縮液或浸膏中加水，搅匀，静置4-12小时，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取2-4次。5、按照权利要求1的制备方法，其特征是步骤(1)中将何首乌加8倍重量60%乙醇，加热回流提取3次，每次提取2小时，将回流提取液合并后滤过，滤液回收乙醇后，浓縮至34。C测定时相对密度为1.248的浸膏。6、按照权利要求1的制备方法，其特征是步骤(1)中将何首乌加8倍重量60%乙醇，加热回流提取3次，每次2小时，将回流提取液合并后滤过，滤液回收乙醇后，浓縮至34。C测定时相对密度为1.248的浸膏；步骤(2)中向浸膏加水时，使水的体积为浸膏体积的4-6倍，搅匀，静置4-12小时，滤过，滤液加1.5倍重量乙酸乙酯萃取2-4次。7、按照权利要求1的制备方法，其特征是步骤(3)中将稠膏于60-9(TC温度下减压干燥。8、按照权利要求7的制备方法，其特征是将稠膏于8(TC温度下减压干燥。全文摘要本发明公开了一种新的二苯乙烯苷的制备方法，该方法包括以下步骤(1)何首乌加乙醇，加热回流，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至无醇味，得浓缩液或浸膏；(2)向浓缩液或浸膏中加水，搅匀，静置，滤过，滤液用乙酸乙酯萃取；(3)将萃取液回收乙酸乙酯并浓缩至稠膏，干燥，粉碎，得到二苯乙烯苷。本发明提取方法所制备的提取物中，二苯乙烯苷的含量大于55％。本发明方法具有收率高、产品质量好、步骤简捷等优点。文档编号C07H15/18GK101195646SQ20061016486公开日2008年6月11日申请日期2006年12月7日优先权日2006年12月7日发明者林李,文王,艾厚喜,魏海峰申请人:首都医科大学宣武医院