专利名称：二苯乙烯苷衍生物的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及何首乌中有效单体2，3，5,4'-四羟基二苯乙烯 -2-CH3-D-葡萄糖苷的分离纯化工艺；还涉及2，3,5，4'-四羟基二苯乙烯-2-0-|3-0-葡萄糖苷的晶体及其制备方法，以及以其为主要成分的药物组合物。
背景技术：
何首乌为蓼科植物何首乌(pllygonummultiflorumThunb.)的块根，为常用中药，药用历史悠久，国内外的大量研究结果表明何首乌具有免疫调节，保肝，抗氧化，抗肿瘤、降血脂等多方面药理活性。随着研究的深入，对其化学成分的研究也越来越清晰，大量研究表明，何首乌中的起主要作用的是2，3，5,4'-四羟基二苯乙烯-2-0-P-D-葡萄糖苷(以下简称二苯乙烯苷)。二苯乙烯苷的生 理活性主要有抗衰老作用、降血脂作用、保肝护肝作用、改善记忆功能、抗 肿瘤作用等(参见鲁坚、侯双秋等，二苯乙烯苷的研究进展，安徽化工，2006(3)， 10~13)。中国专利ZL01134284.6中公开了二苯乙烯苷在治疗痴呆症中的应用。 中国专利申请CN01134283.8中公开了二苯乙烯苷在治疗缺血性脑血管疾病中的 应用。随着二苯乙烯苷的药用功效不断被发现，工业上希望获得大量的适合药用 的二苯乙烯苷原料，所述适合药用的二苯乙烯苷原料至少应该具备较高的纯度 和制备制剂所要求的物理性质。但由于工艺水平的限制，高纯度二苯乙烯苷的 分离纯化仍然一直处在实验室极少量制备的水平，未见有适合工业化生产规模 的高纯度二苯乙烯苷制备工艺的报道，因此，开展适合药用的二苯乙烯苷的分 离纯化工艺研究具有重要意义。目前，现有技术中主要采用高效液相色谱法、结晶法、树脂柱等方法来制 备高纯度的二苯乙烯苷。高效液相色谱法虽然能够得到纯度极高的二苯乙烯苷，但其纯化效率难以 提高，纯化成本也相对较高，因而此法主要用于实验室制备，难以应用于工业 化生产。班翊等人公开了一种结晶精制二苯乙烯苷的方法(参见班翊、刘其礼、金悠等，二苯乙烯苷的稳定性研究，中草药，2004， 35(11)， 1235~1237)。该方法 利用乙醇回流法所得的何首乌浸膏，用适量蒸馏水稀释后以等量乙醚萃取3次， 分离出水层；水层用两倍体积的醋酸乙酯热回流5 6小时，收集醋酸乙酯层， 减压浓縮至原体积的1/10，室温静置，析晶，滤过，得粗品。粗品于适量热水 或热醋酸乙酯中溶解，趁热滤过，放冷析晶，如此反复结晶，得灰色无定型结 晶粉末，mp.l62 163'C，经分析，二苯乙烯苷纯度为99.94%。此法虽能够得到 纯度很高的二苯乙烯苷产品，但需反复多次结晶，工艺繁琐，有机溶剂消耗量 大，资源利用率低，而且要用到乙醚等易燃易爆的试剂，不适合工业化生产。另一些文献公开了采用大孔吸附树脂分离纯化二苯乙烯苷的方法(参见朱 海升等，大孔吸附树脂分离纯化何首乌有效成分二苯乙烯苷的研究，解放军药 学学报，2006， 22(4)， 269 273和吕丽爽等，大孔树脂纯化何首乌中二苯乙烯苷 的工艺研究，食品科学，2005， 6(26)， 178-181)。这些文献也都是基于实验室 研究所进行的基础研究，所用的树脂量一般也只有几克，和工业化生产工艺还 无法相比，而且制得的二苯乙烯苷纯度也远未达到单体的质量要求。另外，中国专利ZL98120290.X公开了一种制备二苯乙烯苷的方法，该方法 将用于分离纯化的层析柱进行破坏性切割，再进行取样分离，过程烦琐，成本 极高，也是典型的实验室制备微量样品的方法，无法达到工业化生产的要求。本发明提供了一种二苯乙烯苷的提取分离方法，此法操作简便，成本低廉， 收率稳定，完全能够满足工业化生产规模的需求，制得的二苯乙烯苷纯度在保 证低成本和高收虑的同时，能获得高纯度的二苯乙烯苷结晶，达到了工业化生 产的要求。此外本发明还提供一种新物理形态的二苯乙烯苷，以及含有该形态 的药物组合物，新的物理形态具有更适宜制备制剂的物理性质。发明内容本发明的目的在于提供一种提取分离结构如式l的化合物的方法，所述的 提取分离方法如下式Ia) 提取取何首乌药材，酌于碎断，加入一定量的水、甲醇、乙醇中的一种或一种以上溶剂组成的混合溶剂，调节提取液的pH至7.0-8.0，加热提取1 4次， 每次1 3小时，加热温度为4(TC 回流温度，合并提取液，放冷，过滤。其中提 取溶剂优选水；调节提取液pH值的可以是酸、碱或盐，优选氢氧化钠、亚硫酸 钠、亚硫酸氢钠、碳酸钠，最优选为亚硫酸钠；提取液的pH值优选为7.5;加 热提取优选提取3次，每次1.5小时。b) 分离将上述提取液过大孔树脂柱，加水充分洗脱去除提取液中的无机盐及 其它杂质后，改用一定浓度的有机溶剂洗脱，收集含二苯乙烯苷的洗脱液。大 孔树脂的型号可以为HPD-400、 HPD-IOO、 AB-8、 D1300，优选的大孔树脂型号 为HPD-400;洗脱溶剂可以为乙醇、甲醇或丙酮，优选为乙醇，更优选浓度为 70°%的乙醇。c) 萃取将洗脱液在60 80'C下减压浓縮至原洗脱液体积的1/10^1/30 (V/V)， 如浓縮液体积较小可以加入适量的水，加入浓縮液体积1 2倍的石油醚、乙醚、 氯仿、乙酸乙酯或正丁醇萃取24次，收集有机层萃取液，将有机层萃取液减 压浓縮至干，得到固体粗提物；优选将洗脱液浓縮至原体积的1/20。萃取所用 的有机溶剂优选乙酸乙酯；优选用浓縮液体积的1倍的有机溶剂萃取3次。d) 纯化上述粗提物溶于适量的有机溶剂，过层析柱，选用适当溶剂进行洗脱， 收集含二苯乙烯苷成份的洗脱液，浓缩，干燥，得二苯乙烯苷粗品。层析柱的 填料可以为硅胶或氧化铝，优选氧化铝；目数是100-200目或200-300目，优选 为200-300目；柱层析前溶解粗提物所用溶剂可以是丙酮、乙醇、乙酸乙酯，优 选为乙醇；柱层析过程中所用洗脱液可以是丙酮、乙酸乙酯、乙醇、甲醇或氯 仿中的一种或几种溶剂组成的混合溶剂，优选为乙酸乙酯。e) 结晶将上述二苯乙烯苷粗品在丙酮、水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯中的一种 或几种溶剂组成的混合溶剂中加热溶解，优选的结晶溶剂为丙酮水乙酸乙 酯的混合溶剂，其比例为1~10: 5~20: 1 10 (V:V:V)，最优选丙酮水乙酸 乙酯为2:10: l(V:V:V)，结晶溶剂的用量是为二苯乙烯苷粗品的1 10倍(V/W)， 优选的溶剂用量为二苯乙烯苷粗品的5倍(V/W)，活性炭脱色，过滤，静置析 晶，结晶温度为-20 10。C，优选为-10 5。C，最佳温度为-4。C，过滤，干燥，即 得到高纯度的二苯乙烯苷。本发明的二苯乙烯苷提取物以高效液相色谱法检测其纯度可达到90%以 上，优选在95%以上，最优选985^以上。本发明中二苯乙烯苷的含量测定采用高效液相色谱(HPLC)法进行。其中 使用的2,3，5,4，-四羟基二苯乙烯-2-0-P-D-葡萄糖苷对照品购于中国药品生物制 品检定所；使用的流动相为乙腈水=15: 85;检测器为JASW UV-1575;流 速为lmL/min;色谱柱采用Agilent Extend C-18 (4.6mmx250mm，5Mm);柱温为 30'C，具体测试方法如下 1.标准曲线的建立精密称取2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-0-P-D-葡萄糖苷对照品5.15 mg，用水 溶解并定容至100 ml，配成对照品储备液，分别取储备液1 ml， 2 ml， 4 ml， 6 ml， 8 ml，各自加水定容至10ml，分别取上述各浓度的对照品溶液20nJ,依次注入 色谱仪，得到表一所示的峰面积数据，由此制得表二所示的二苯乙烯苷标准曲 线，可见进样量与峰面积间呈良好的线性关系。线性范围5 50|xg/ml 回归方程为Y=80909X+19722 相关系数R-0.9992表一 二苯乙烯苷标准品浓度与峰面积数据浓度(吗/ml)5.1510.3020.6030.卯41.20峰面积(mv/s)4157978881281706896244592233921922. 二苯乙烯苷样品的含量测定方法准确称取二苯乙烯苷对照品(简称对照品)和自制的二苯乙烯苷样品(简 称供试品)各20.00mg,分别用水溶解，并定容至100ml，各取1 ml加水稀释 定容至10ml，得到对照品溶液和供试品溶液。分别吸取上述两种溶液各20^1 依次注入色谱仪，记录峰面积，运用外标法计算，得到供试品中二苯乙烯苷的 含量。本发明的二苯乙烯苷和二苯乙烯苷对照品(购于中国药品生物制品检定所) 的高效液相色谱图如附图5和附图6所示。本发明的另一个目的在于提供二苯乙烯苷的新型晶体及其制备方法，本发明的再一个目的在于提供含有所述的二苯乙烯苷晶体的药物组合物。本发明的二苯乙烯苷晶体基本不含水和其它有机溶剂，其X-射线粉末衍射 光谱图(该图谱是在X、TRA-X射线衍射仪上用Cu-Ka辐射测量)，在d值为 4.772、 4.471、 3.678、处有衍射峰，典型的在14.572、 12.200、 4.772、 4.471、 3.678、 3.622处有衍射峰，更典型的在14.572、 12.200、 7.320、 4.772、 4.471、 3.678、 3.622、 3.343、 2.384处有衍射峰。本发明的二苯乙烯苷晶体的差示扫描量热分析(采用NETZSCHDSC 204 Fl 仪器)，以10K/分钟的速率升温，其吸收热转变峰值约为178°C。本发明的二苯乙烯苷晶体用KBr压片测定的红外吸收光谱在3333cm—1 (宽 峰)、1607cm—、 1593cm"、 1515cm"处有吸收峰。本发明的二苯乙烯苷晶体的热失重分析图谱如附图4所示。本发明的二苯乙烯苷晶体可由如下方法制备将二苯乙烯苷粗品或纯品在 丙酮、水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯中的一种或几种溶剂组成的混合溶剂中加热 溶解，优选的结晶溶剂为丙酮水乙酸乙酯的混合溶剂，其比例为1 10: 5 20:1 10 (V:V:V),最优选丙酮水:乙酸乙酯为2: 10: 1 (V:V:V)，结晶溶剂的 用量是为二苯乙烯苷粗品的1 10倍(v/w)，优选的溶剂用量为二苯乙烯苷粗 品的5倍(V/W)，活性炭脱色，过滤，静置析晶，结晶温度为-2(Kl(TC,优选 为-10~5匸，最佳温度为-4t:，过滤，干燥，即得到高纯度的二苯乙烯苷结晶。根据上述步骤制得的二苯乙烯苷晶体，还可以与适当的药用辅料混合，制 成一定形式的组合物，包括片剂、胶囊、滴丸、软胶囊、注射液或其它适于施 用的制剂形式，以方便临床上施用。本发明提供了一种含量高、成分明确、质量可控、药效确切、副作用小的 新型二苯乙烯苷结晶及其制备方法，二苯乙烯苷结晶不同于无定型的二苯乙烯 苷，其更稳定，同时溶解度和生物利用度都不同，其中二苯乙烯苷结晶更容易 制备成药剂。所以本发明包括了含有高纯度二苯乙烯苷结晶的药物组合物，该 药物组合物在治疗高血脂症、动脉粥样硬化、抗氧化等效果明显。本发明的制 备工艺已经通过多批生产验证，证明其重复性、稳定性都好，并且总收率高， 只需一步结晶，既适合于工业化大生产又降低了生产的成本。本发明所提供的 方法制备的二苯乙烯苷纯度高，杂质少，不但改善了中成药常有的服用剂量大、 成分不明确等缺点，而且其在临床上药效显著，具有很好的适用性。
图l 二苯乙烯苷晶体的x射线粉末衍射光谱图。图2 二苯乙烯苷晶体的差示扫描量热分析(DSC)图谱。 图3 二苯乙烯苷晶体的红外吸收图谱。 图4 二苯乙烯苷晶体的热失重分析(TGA)图谱。 图5 二苯乙烯苷晶体的高效液相色谱图。图6 二苯乙烯苷对照品的高效液相色谱图。 图7 二苯乙烯苷标准曲线
具体实施例方式以下非限制性实施例是为了更好地说明本发明所提供的新型高纯度二苯乙 烯苷晶体的制备方法，并不意味着对本发明的任何限制。下列实施例中，所用的提取用水为自来水；所用乙醇为药用级；何首乌药 材产地为安徽亳州中药材市场；硅胶和氧化铝均购自青岛海洋化工有限公司。 实施例l取干燥的何首乌药材100kg，切成l-3mm的薄片，装入热回流提取罐，加 入10倍量的水及亚硫酸钠适量，调节提取液pH至7.6，加热回流提取3次，每 次1小时，合并提取液，过滤，收集滤液。滤液过HPD-400大孔吸附树脂柱， 加水500L洗脱后，加80%乙醇洗脱，收集含二苯乙烯苷的洗脱液，总计200L， 于6(TC减压浓縮至IOL，加入乙酸乙酯萃取3次，每次用量IOL， 60。C减压浓縮 乙酸乙酯液至干，得二苯乙烯苷粗提物2.5kg。取上述粗提物，加入乙醇5.0L，加热搅拌使其充分溶解，过滤，滤液过 200-300目中性氧化铝层析柱，上柱完成后改用乙酸乙酯洗脱，薄层监测，收集 含二苯乙烯苷组分的洗脱液，于5(TC减压浓縮至干，得到二苯乙烯苷粗品1.82kg。取上述粗品，加入丙酮水乙酸乙酯(2: 10: 1， V/V/V) 9L, 60。C力口 热至溶解，加入适量活性炭后，加热回流15分钟，趁热过滤，滤液置-5'C条件 下静置15小时，析晶充分后，过滤，干燥，得到白色二苯乙烯苷结晶1.28化8。 取上述样品，用高效液相色谱法进行含量测定，二苯乙烯苷粗品含量为90.3%， 二苯乙烯苷结晶的含量为98.9%。实施例2取干燥的何首乌药材100kg，粉碎成粗粉，装入热回流提取罐，加入8倍量的水及亚硫酸氢钠适量，调节提取液pH至7.5，加热回流提取2次，每次2 小时，合并提取液，过滤，收集滤液。滤液过HPD-100大孔吸附树脂柱，加水 600L洗脱后，加70°/。乙醇洗脱，收集含二苯乙烯苷的洗脱液，总计300L，于 70'C减压浓縮至15L，加入正丁醇萃取2次，每次用量15L， 8(TC减压浓縮，浓 縮正丁醇至干，得二苯乙烯苷粗提物2.3kg。取上述粗提物，加入乙酸乙酯8.0L，加热搅拌使其充分溶解，过滤，滤液 过200-300目硅胶层析柱，上柱完成后改用乙酸乙酯丙酮(2: 1)洗脱，薄层 监测，收集含二苯乙烯苷组分的洗脱液，于6(TC减压浓縮至干，得到二苯乙烯 苷粗品1.60 kg。取上述粗品，加入水乙酸乙酯(20: 1， V/V) 8L， 6(TC加热至溶解，加 入适量活性炭后，加热回流5分钟，趁热过滤，滤液置-l(TC条件下静置10小时， 析晶充分后，过滤，干燥，得到白色二苯乙烯苷结晶1.28kg，结晶为针状，聚 集成簇。取上述样品，用高效液相色谱法进行含量测定，二苯乙烯苷粗品含量 为91.1%， 二苯乙烯苷结晶的含量为99.6%。实施例3取干燥的何首乌药材120kg，粉碎成粗粉，装入热回流提取罐，加入7倍 量的水及碳酸钠适量，调节提取液pH至7.8，加热回流提取3次，每次1.5小 时，合并提取液，过滤，收集滤液。滤液过AB-8大孔吸附树脂柱，加水600L 洗脱后，加90%乙醇洗脱，收集含二苯乙烯苷的洗脱液，总计320L，于70。C减 压浓縮至20L，加入乙酸乙酯萃取3次，每次用量20L， 80。C减压浓縮，浓縮乙 酸乙酯至干，得二苯乙烯苷粗提物2.92kg。取上述粗提物，加入丙酮12 L，加热搅拌使其充分溶解，过滤,滤液过200-300 目中性氧化铝柱，上柱完成后改用乙酸乙酯洗脱，薄层监测，收集含二苯乙烯 苷组分的洗脱液，于5(TC减压浓縮至干，得到二苯乙烯苷粗品1.9kg。取上述粗品，加入丙酮水乙酸乙酯(1: 10: 1， V/V/V) IOL， 50 。C加热至溶解，加入适量活性炭后，加热回流10分钟，趁热过滤，滤液置-(C条件下静置20小时，析晶充分后，过滤，干燥，得到白色二苯乙烯苷结晶1.51kg，结晶为针状，聚集成簇。取上述样品，用高效液相色谱法进行含量测定，二苯乙烯苷粗品含量为92.8%, 二苯乙烯苷结晶的含量为99.9%。
权利要求
1. 一种提取分离结构式如下的化合物的方法，所述的提取分离方法包括id="icf0001" file="A2007100204430002C1.gif" wi="67" he="51" top= "38" left = "68" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>a.取何首乌药材，酌于碎断，加入水、甲醇、乙醇中的一种或一种以上溶剂组成的混合溶剂，调节提取液的pH至7.0～8.0，加热提取，放冷，过滤；b.将上述提取液过大孔树脂柱，加水洗脱后，改用有机溶剂洗脱，收集含二苯乙烯苷的洗脱液，大孔树脂的型号可以为HPD-400、HPD-100、AB-8、D1300，洗脱溶剂可以为乙醇、甲醇或丙酮；c.将洗脱液减压浓缩，加入石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯或正丁醇萃取，收集有机层萃取液，将有机层萃取液减压浓缩至干，得到固体粗提物；d.上述粗提物溶于有机溶剂，过层析柱，收集含二苯乙烯苷成份的洗脱液，浓缩，干燥，得二苯乙烯苷粗品，层析柱的填料可以为硅胶或氧化铝，目数是100-200目或200-300目，柱层析前溶解粗提物所用溶剂可以是丙酮、乙醇、乙酸乙酯，柱层析过程中所用洗脱液可以是丙酮、乙酸乙酯、乙醇、甲醇或氯仿中的一种或几种溶剂组成的混合溶剂；e.将上述二苯乙烯苷粗品在丙酮、水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯中的一种或几种溶剂组成的混合溶剂中加热溶解，结晶溶剂的用量是为二苯乙烯苷粗品的1～10倍(V/W)，活性炭脱色，过滤，静置析晶，结晶温度为-20～10℃，过滤，干燥，即得二苯乙烯苷。
2. 权利要求
3. 权利要求
4. 权利要求
5. 权利要求
6. 权利要求
7. 权利要求步骤a中，提取溶剂为水。步骤b中，大孔树脂型号为HPD-400。步骤b中，洗脱溶剂为乙醇。步骤c中，萃取所用的有机溶剂是乙酸乙酯。步骤d中，层析柱的填料为氧化铝。步骤d中，柱层析过程中所用洗脱液为乙酸乙酯,
8. 权利要求l步骤e中，结晶溶剂为丙酮水乙酸乙酯为1 10: 5~20: 1~10的混合溶剂，溶剂用量为二苯乙烯苷粗品的5倍。
9. 一种基本不含水和其它有机溶剂的二苯乙烯苷晶体，其特征在于其X-射线 粉末衍射光谱图在d值为4.772、 4.471、 3.678、处有衍射峰。
10. 权利要求9所述的二苯乙烯苷晶体，其X-射线粉末衍射光谱图在d值为 14.572、 12.200、 4.772、 4.471、 3.678、 3.622处有衍射峰。
11. 权利要求9所述的二苯乙烯苷晶体，以10K/分钟的速率升温，其差示扫描量 热吸收热转变峰值约为178'C。
12. —种药物组合物，其特征在于，含有权利要求9、 lO或ll所述的二苯乙烯苷晶体(
全文摘要
本发明涉及一种新型2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷晶体及其制备方法，以及含有该晶体的药物组合物。高效液相色谱法测定所述晶体的含量为90～99.9％，所述方法是通过何首乌提取、有机溶剂萃取、柱层析分离及适当溶剂中结晶等步骤，得到所述高纯度的二苯乙烯苷晶体。本发明提供的制备工艺得率高，成本低，适合工业化生产。
文档编号A61K125/00GK101255180SQ20071002044
公开日2008年9月3日 申请日期2007年2月27日 优先权日2007年2月27日
发明者杨永安, 鸯 王 申请人:江苏正大天晴药业股份有限公司