专利名称：从植物材料制备单酰-或二酰甘油的糖苷产物的方法
技术领域：
本发明涉及从植物材料制备单酰-或二酰甘油的糖苷产物的方法，
以及从该方法获得的产物。具体来说，本发明涉及特别是从蔷薇果(rosehip)材料制备含有3-(3-0-吡喃半乳糖氧基-2-(十八碳-9Z,12Z,15Z-三烯酰氧基)丙基十八碳-9Z,12Z,15Z-三烯酸酯的产物。
背景技术：
在US 6,024,960中，发现具有高维生素C含量的蔷薇果浓縮物能够缓解与炎症有关的症状。具体来说，该浓縮物是按照在保留相对高的维生素C含量以及多种其它维生素含量的条件下，对磨碎的蔷薇果进行干燥的工艺获得的。
在相关的US 6,485,752中，描述了 口服施用蔷薇果浓縮物和鱼油的组合可用于缓解关节疼痛和僵硬，特别是与关节炎有关的关节疼痛和僵硬。用于生产蔷薇果浓縮物的方法与上面US 6,024,960中描述的方法相同。
此外，WO 03/043613涉及使用单酰-或二酰甘油的糖苷产物治疗炎性疾病，更具体来说，涉及从天然来源例如蔷薇果(狗蔷薇(Rosacanina)的果实)获得的或通过全合成制备的3-(3-0-吡喃半乳糖氧基-2-(十八碳-9Z,12Z,15Z-三烯酰氧基)丙基十八碳-9Z，12Z,15Z-三烯酸酯(也被称为GOPO)用于炎症的治疗。该化合物的作用显示为减少多形核单核细胞的化学发光和单核白细胞的趋化性。此外，WO 03/043613中发现，该化合物可以通过对表明含有该高度活性的抗炎剂的蔷薇果进行提取，特别是使用有机溶剂进行提取，和生物引导的(bio-guided)分级程序来获得。与口服蔷薇果显示出有效缓解炎症疼痛相似，分离的抗炎剂的口服制剂显示出有效治疗与炎性疾病相关的症状。
基于对单酰-或二酰甘油化合物的糖苷作为能够在哺乳动物中缓解和治疗炎性病症的活性成分的活性的了解，对于开发提取和释放所述单酰-或二酰甘油化合物的糖苷的改进方法以及开发具有商业利益的含有该活性成分的新产品，使用更安全的方法提供较高含量的可用活性成分以及更安全和更稳定的产品，是有兴趣的。
发明概述
因此，在本发明的一个方面，可以提供从植物材料制备单酰-或二酰甘油的糖苷产物的方法。该方法包括下列步骤(i)任选将植物材料磨碎，(ii)用第一种水性提取溶液提取任选磨碎的植物材料，获得第一
个液相和第一个固相，以及(iii)将液体相与固体相分离以获得单酰-或
二酰甘油的糖苷产物。
在本发明的另一方面，提供了含有可以通过本发明的方法获得的单酰-或二酰甘油的糖苷产物的汁液产品。
在本发明的另一方面，提供了含有可以通过本发明的方法获得的单酰-或二酰甘油的糖苷产物的酊剂产品。
在本发明的另一方面，提供了含有可以通过本发明的方法获得的单酰-或二酰甘油的糖苷产物的固体浓縮物。
在本发明的另一方面，可以提供含有汁液产品、酊剂产品和/或固体浓縮物的产品。
在一方面，提供了汁液产品、酊剂产品、固体浓縮物或含有汁液产品、酊剂产品或固体浓縮物的产品，用于在需要的哺乳动物中治疗、缓解或防止炎性病症。
10发明的具体说明
本发明的发明人意外发现，植物材料例如蔷薇果，可以用作生产 含有可以作为高活性抗炎剂的单酰-或二酰甘油化合物的几种不同提取 产品的来源。
植物材料例如蔷薇果获得的这类提取产品的例子，是通过使用本 发明的方法制备的、可能含有高含量的半乳糖脂例如单酰-或二酰甘油 化合物的汁液产品和固体浓縮物以及酊剂。此外，体外实验显示，这 些制品被证实具有有效的抗炎以及抗氧化剂活性。这些体外发现与以 前关于在治疗哺乳动物的炎性病症、例如患有骨关节炎的患者的关节 僵硬中的有益的抗炎和抗氧化剂活性的报道关联得很好。
在本发明的优选实施方案中，可以提供从植物材料制备单酰-或二 酰甘油产物的糖苷的方法。该方法包括下列步骤
(i) 任选将植物材料磨碎，
(ii) 用第一种水性提取溶液提取任选磨碎的植物材料，获得第一 个液相和第一个固相，以及
(iii) 将液体相与固体相分离以获得单酰-或二酰甘油产物的糖苷。
在步骤(i)中，在对植物材料进行步骤(ii)中的第一次提取程序之前， 可以将植物材料磨碎。在本发明的背景下，术语"磨碎的"是指在研 磨机中将植物材料切碎、碾碎或所述操作步骤的组合。植物材料也可 以使其通过分离步骤进行处理，以除去在收获过程中可能伴随着植物 材料的坚果、毛须和其它外来物质。在本发明的实施方案中，植物材 料在被磨碎之前可以被干燥。
步骤(ii)中的第一次提取程序可以在第一种提取温度下进行，该温
度范围为20-110°C，诸如40-100°C、例如60-95°C，诸如75-卯。C、例 如90。C。优选步骤(ii)中的第一次提取程序可以进行大约10秒到20分
11钟的时间范围，诸如从30秒到10分钟、例如从45秒到5分钟，诸如 从1分钟到2分钟、例如大约1分钟。
上述的方法还可以包括下列步骤
(iv)用第二种提取溶液提取步骤(iii)获得的固体相，获得第二个液 体相和第二个固体相。
步骤(iv)中的第二个提取程序可以在第二种提取温度下进行，该温 度范围为20陽75。C，例如30-60°C、如40-55°C，例如45-50°C、如50°C。 优选步骤(iv)中的第二次提取程序可以持续一段时间，该时间在1分钟 到500分钟的范围内，例如从10分钟到400分钟，诸如从50分钟到 300分钟、例如从100分钟到200分钟，诸如从120分钟到180分钟、 例如180分钟。
在本发明的实施方案中，步骤(iv)中的第二个提取程序的pH可以 被调整到在pH l-10范围内的pH值，例如pH2-9，诸如pH3-7、例如 pH4-6，例如pH4.5。在本发明的实施方案中，pH可以用NaOH或HCl调整。
在本发明的优选实施方案中，第二种提取溶液还含有细胞壁降解 酶或细胞壁降解酶的混合物。在本发明的背景中，术语"细胞壁降解 酶"是指能够降解细胞壁以从植物材料中释放细胞内成分的酶。有许 多不同的细胞壁降解酶和酶混合物是可商购的，例如Novozymes A/S 的Celluclast 1.5 L、 Finizym 200 L、 Ultraflo L和Viscozyme L。酶混合 物可以含有不同的酶活性，例如纤维素酶、|3-葡聚糖酶、木聚糖酶、阿 拉伯聚糖酶、戊聚糖酶。
细胞壁降解酶可以是选自纤维素酶、P-葡聚糖酶、木聚糖酶、阿 拉伯聚糖酶和戊聚糖酶的一种或多种酶，例如所述酶的2种以上，诸 如所述酶的3种以上、例如所述酶的4种。当两种或多种细胞壁降解酶加入到步骤(iv)中的第二次提取程序中时，它是细胞壁降解酶的混合 物。
在本发明的实施方案中，所述的pH调整的调整方式是为了提供偏 离细胞壁降解酶的最适pH或细胞壁降解酶混合物的最适活性最多4个 pH单位的pH值。
当步骤(iv)中的第二次提取步骤完成时，优选在获得一种或多种单 酰-或二酰甘油的糖苷产物之前，可以将酶活性失活。这种失活可以通 过加热或通过加入酸或碱来实现。在本发明的优选实施方案中，酶活 性的失活通过提高第二种提取介质的温度来实现，优选增加到至少 30°C的温度、诸如至少40°C，例如至少50°C、诸如至少60°C，例如至 少70°C、诸如至少80°C，例如至少90。C、诸如至少100°C，例如至少 110oC。
上面的方法还可以包括下列步骤
(V)将第二个液体相与第二个固体相分离，以获得第二个和第三个 单酰-或二酰甘油的糖苷产物。
为了从上面的步骤(iii)和/或步骤(V)描述的第一个和/或第二个液 体相中分离第一个和/第二个固体相，可以通过倾析、离心、过滤或其 组合来进行分离。
在本发明的优选实施方案中，第一种和/或第二种水性提取溶液是 水。优选上述的提取步骤(ii)和/或提取步骤(iv)不涉及有机溶剂的使用。
在本发明的优选实施方案中，在全部的步骤(i)到步骤(v)的一个组
合工艺中，可以生产第一个、第二个和第三个单酰-或二酰甘油的糖苷 产物。在本发明的背景中，术语"植物材料"是指可以从下述获得的材 料，蔷薇果优选蔷薇果从野生蔷薇灌木获得，具体来说，蔷薇果选自
狗蔷薇(Rosacanina)("狗蔷薇果")、法国蔷薇(Rosagallica)、 Rosa condita、玫瑰(Rosa rugosa)、黄蔷薇(Rosa hugonis) 、 Rosa nitida、 雪山蔷薇(Rosapendulina)、茴开叶蔷薇(Rosa pimpinellifolia)和绢 毛蔷薇(Rosa sericea);水果、蔬菜和谷类，优选水果、蔬菜和谷类 选自橄榄(例如油橄榄(Olea eur叩aea))、苜蓿(例如紫花苜蓿(Mediargo sativaL.))、大豆(例如大豆(Glycine max))、马铃薯(例如马铃 薯(Salanum Turerosum L.))、胡椒(例如辣椒(Capsicum a應um L.))、 燕麦(例如燕麦(Avenasativa))、筷子芥菜(例如拟南芥(Arabidopsis thaliana))、矮牵牛(Petunia hybrida)、披碱草(例如披碱草属(Elymus arenarius))、金雀花(例如金雀花(Sarothamnus scoparius))、款 冬(例如款冬(Tussilago farfara))、藜科植物(chenopodiaceae)、 海甘蓝(例如海芥兰(Crambe maritima))、黑刺李(例如黑刺李(Prunus spi廳a))、刺芹(例如刺芹(Eryngium))、海马齿(例如Honckenya peploides)、黑莓、野花楸(例如欧洲花楸(Sorbus aucuparia))、花楸 木(例如花楸树(Sorbus domestica))、沙棘(例如大果沙棘(Hippophae rhamnoides ))、兰草属植物(例如大麻叶泽兰(Eupatorium cannabinum))、黄瓜(例如苦瓜(M. charantia)或M. rustrata)、长 春花、紫杉(例如欧洲短叶红豆杉(Taxusbaccata))、槲寄生(例如 白果槲寄生(Viscum album))、木贼(例如黑蒴(M. arvense))、 绣线菊(例如旋果蚊子草(Filipendulaulmaria))、六瓣合叶子(例如 F. hexapetala) 、 Ephidera (例如E. sp.)、芦苇(例如芦苇(Phragmites communis ))、连钱草(例如欧活血丹(Glechomahederacea))、绵 马(例如绵马(Lastrea filix mas))、鳞毛蕨(例如鳞毛蕨(Dry叩teris))、 以及羽衣草属植物(例如斗篷草(Alchemilla vulgaris));海藻，优 选海藻选自Anfeltia tobuchiensis(红藻门(Rhodophyta))、、海带(Laminaria japonica)、海蒿子(Sargassum pallidum)(褐藻门(Phaeophyta))、 Ulva fenestrate (绿藻门(Chlorophyta))、大叶藻(Zostera marina)(胚 生植物(Embriophyta))、海藻(墨角藻(Fucus vesiculosus))、绿
14藻(小球藻(Chlorella vulgaris))、蓝细菌(例如纤细席藻(Phormidium tenue))禾口冲绳海绵(海绵(Phyllospongia Foliascens))。
在本发明的实施方案中，可以使用的植物、蔬菜和谷类的部分选 自叶、茎、果、根或其任何组合。
为了实现植物材料的充分提取，第一种水性提取溶液与植物材料 的混合比率为100:1到1:100，优选比率为50:1到1:50，例如25:1到 1:25，优选比率为10:1。此外，第二种水性提取溶液与植物材料可以以 50:1到1:50的比率混合，优选比率为25:1到1:25，例如10:1到1:10， 优选为5:1的比率。
上述方法适合从植物材料制备单酰-或二酰甘油的糖苷产物。优 选，单酰-或二酰甘油的糖苷产物可以是汁液产品、酊剂产品和/或固体 浓縮物的形式。
在本发明的优选实施方案中，步骤(iii)获得的第一个液体相含有第 一个单酰-或二酰甘油的糖苷产物。优选步骤(iii)获得的第一个单酰-或 二酰甘油的糖苷产物可以包含在汁液产品中。
在本发明的另一个优选实施方案中，步骤(v)获得的第二个液体相 含有第二个单酰-或二酰甘油的糖苷产物。优选第二个单酰-或二酰甘油 的糖苷产物可以包含在酊剂产品中。
在本发明的另一个优选实施方案中，步骤(v)获得的第二个固体相 可以含有第三个单酰-或二酰甘油的糖苷产物。优选第三个单酰-或二酰 甘油的糖苷产物可以包含在固体浓縮物中。
本发明的固体浓縮物可以被干燥。干燥的浓縮物可以是粉末或颗 粒材料的形式，优选粒度小于lmm，最优选大约0.1到0.5mm。在本发明的背景中，术语"粉末"将用于涵盖干燥的固体浓縮物的所有范 围，不论它采取何种固体形式。
在本发明的优选实施方案中，产品、汁液产品、酊剂产品和/或固 体浓縮物是富含单酰-或二酰甘油的糖苷的产品。
汁液产品、酊剂产品和/或固体浓縮物可以掺入到或用于人们可以 每天消耗的许多食品和饮料中。可以制造的适合的食品和饮料包括但 不限于营养饮料、软饮料、水果饮料和汁液、含电解质的饮料、布丁、 烘焙食品(即曲奇、核仁巧克力饼、乳脂软饼(fudge)、蛋糕、面包)、 非烘烤的挤压食品(即棒)、色拉调味料、佐料、糖食(即糖果)、
小吃食品(即薯片、椒盐脆饼干、玉米面饼)、滴抹或涂抹食品(drips amd spreads)、冰激凌、口香糖、糖果、冷冻甜点和花式品、乳制品 例如酸奶、人造黄油类涂抹食品、调味品例如用于肉类、家禽、海鲜 和色拉的调味品。本发明还包含这些食品的无脂肪的、减少脂肪的和 低卡路里的品种。
将本发明的汁液产品、酊剂产品和/或固体浓縮物掺入到食品/饮料 中，可以提供患者在延长的时期内使用的依从性的优点、以及以更适 宜消费者的形式而不是例如药物的优点。
此外，汁液产品、酊剂产品和/或固体浓縮物可以掺入到或配制到 或用于天然的药物产品、膳食补充品或药用产品中。
术语"单酰-或二酰甘油的糖苷"以及类似的术语意指一类单酰-或二酰甘油的糖苷(以及醚)，例如可以从例如本发明说明的植物中 分离到的、并且不是二十碳五烯酸的酯的那些。"糖苷"部分典型为 戊糖、己糖或庚糖，特别是己糖例如半乳糖和葡萄糖，例如半乳糖， 但是也可以是含有两个或多个糖部分的组合的二糖和寡糖，特别是二 糖苷例如二半乳糖苷和二葡萄糖苷，例如6-0-(0^-吡喃半乳糖基)-0^-吡喃半乳糖。
在本发明的背景中，术语"单酰-或二酰甘油的糖苷产物"涉及从 植物材料获得的、含有单酰-或二酰甘油的糖苷化合物的产物。单酰-或二酰甘油的糖苷产物可以从植物材料通过使用层析、微过滤、过滤、 离心、提取或其任何组合进行分离来获得。
在本发明的实施方案中，单酰-或二酰甘油的糖苷化合物可以具有
式I:
其中R和R'独立地选自氢、(:1().24-垸基和<:1().24-酰基，所述烷基和
酰基基团含有0到5个不饱和键，并且R1、 R2、 113和114独立地选自氢 和糖苷部分；第一个条件是R和R'不同时为氢，第二个条件是R和R' 都不是二十碳五烯酰基。
这里显示的式中的"波状键"意指所讨论的取代基所位于的碳原 子可以处于(R)或(S)构型。在"糖"部分(糖苷)中，这两种不同的构 型有时被命名为a和P。特别感兴趣的组合是P-吡喃糖形式的葡萄糖或
半乳糖。
尽管这里显示的式中的"糖"部分被画成吡喃糖形式，但应该理 解，抗炎剂也可以以呋喃糖形式(或吡喃糖和呋喃糖形式的混合物) 作为固体存在和以溶液存在。
17200680055210.4
在本文的背景中，术语"(:1().24-垸基"是指具有10到24个碳原子 的线性或支化的烃基团，例如癸基、十一烷基、十二垸基、十四垸基、 十六烷基、十八烷基、十九烷基、二十垸基等。
在本文的背景中，术语"01().24-酰基"是指具有10到24个碳原子 的线性或支化的烃基团，其中该基团的第一个碳是羰基(09.23-垸基 -C(-O)-)，即具有10到24个碳原子的脂肪酸残基。其例子是月桂酸 (C12)、肉豆蔻酸(C14)、棕榈酸(C16)、硬脂酸(C18)等的残基。
烷基和酰基基团可以具有0到5个不饱和键例如双键或三键，特 别是双键。具有一个或多个不饱和双键的酰基基团的例子是棕榈油酸 (C16:l)、油酸(C18:l)、亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)、花 生烯酸(C20:3)、视黄酸(C20:5)等的残基。
更具体来说，甘油的单酯或二酯(或醚)的糖苷是二酯、二醚或 单醚-单酯，即R和R'独立地选自(:1().24-垸基和(:1().24-酰基。
目前最优选的是二酯的糖苷，即R和R'是独立的(:1().24-酰基。在 所有情况下，垸基和酰基基团具有0到5个不饱和键。
就烷基和酰基基团的饱和程度而言，目前相信，任何具有0到4 个不饱和键、诸如l-3个不饱和键、例如2或3个不饱和键、特别是3 个不饱和键的垸基和酰基基团，最适合用作R和R'。
此外，目前相信，任何不饱和键优选为双键。
这就是说，设想得到，特别感兴趣的抗炎剂是其中R和R'都是具 有1到3个双键的016.2()-酰基、例如具有3个双键的C,8-酰基的抗炎剂， 特别是其中"糖"部分是葡萄糖或半乳糖，特别是半乳糖。
18正如上面提到的那样，r1、 r2、 W和W独立地选自氢和糖苷部分， 优选在r1、 r2、 rS和W中最多只有一个是糖昔部分。后面的实施方案 涉及通常在蔬菜来源中发现的化合物以及其中r1、 r2、 113和114都是氢 的化合物。在某些有趣的实施方案中，所有的r1、 r2、 113和114都选为氢。
术语"糖苷部分"是指单糖或二糖部分，例如源自于O-吡喃半乳 糖、O-吡喃葡萄糖、O-吡喃半乳糖基吡喃半乳糖、O-吡喃葡萄糖基吡 喃半乳糖、0-吡喃半乳糖基吡喃葡萄糖和O-吡喃葡萄糖基吡喃葡萄糖。
此外，设想得到单酰-或二酰甘油的糖苷化合物优选具有式ii: 氛 ,4
其中r、 r'、 r1、 r2、 R3和R4都如上述定义。
特别感兴趣的单酰-或二酰甘油的糖苷化合物的更具体例子选自 (3-D-吡喃半乳糖基衍生物、a-D-吡喃半乳糖基衍生物、p-D-吡喃葡萄糖 基衍生物和ot-D-吡喃葡萄糖基衍生物，例如(3-D-吡喃半乳糖基和 6-0-(01-0-吡喃半乳糖基)-P-D-吡喃半乳糖基衍生物。
单酰-或二酰甘油的糖苷化合物的更具体的例子是3-P-D-吡喃半乳 糖氧基-2-(十八碳-9Z,12Z,15Z-三烯酰氧基)丙基十八碳-92，122，152-三烯酸酯、3^-0-吡喃葡萄糖氧基-2-(十八碳-9Z,12Z,15Z-三烯酰氧基) 丙基十八碳-9Z,12Z,15Z-三烯酸酯、3-01-0-吡喃半乳糖氧基-2-(十八碳-92，122,152-三烯酰氧基)丙基十八碳-9Z，12Z，15Z-三烯酸酯、3-a-D-吡喃葡萄糖氧基-2-(十八碳-9Z,12Z,15Z-三烯酰氧基)丙基十八碳 -9Z，12Z,15Z-三烯酸酯、6-0-(a-D-吡喃半乳糖基)-3-卩-D-吡喃半乳糖氧 基-2-(十八碳-9Z,12Z,15Z-三烯酰氧基)丙基十八碳-9Z,12Z,15Z-三烯 酸酯和6-0-(01-0-吡喃半乳糖基)-3-01-0-吡喃半乳糖氧基-2-(十八碳 -9Z，12Z，15Z-三烯酰氧基)丙基十八碳-9Z,12Z，15Z-三烯酸酯，例如 3-卩-0-吡喃半乳糖氧基-2-(十八碳-9Z，12Z,15Z-三烯酰氧基)丙基十八 碳-9Z,12Z,15Z-三烯酸酯或3+0-吡喃葡萄糖氧基-2-(十八碳 -92,12&152-三烯酰氧基)丙基十八碳-9Z，12Z,15Z-三烯酸酯，例如可 以从蔷薇果中分离的3-(3-D-吡喃半乳糖氧基-2-(十八碳-9Z,12Z,15Z-三烯酰氧基)丙基十八碳-9Z，12Z,15Z-三烯酸酯。
在本发明的实施方案中(可以由
图1中的工艺配置图说明)，植 物材料被任选干燥磨碎，然后将磨碎的植物材料在反应罐中与第一种 水性提取溶液例如水进行混合，植物材料与第一种水性提取溶液的混 合比率按照说明书中的描述，例如以l:9的比率。第一次提取过程在说 明书描述的温度例如85°C的温度下进行，并持续说明书中定义的一段 时间，例如1分钟。第一次提取过程由分离步骤终止，优选为离心， 以获得第一个液体相和第一个固体相。然后将获得的第一个固体相与 第二种水性提取溶液在反应罐中按照说明书中的描述混合，例如以1:1 的比率，并且该第二次提取过程的温度按照说明书中的描述，例如 50°C， pH按照说明书中的描述调整，例如用5MNaOH调整到pH4.5。 此外，将细胞壁降解酶或细胞壁降解酶的混合物，例如Viscozyme(l% w/w)，加入到第二次提取过程中，第二次提取过程持续说明书中描述 的一段时间，例如180分钟。然后按照说明书中的描述终止酶活性， 例如通过将温度升高到85。C大约1分钟(足以使酶活性失活)。该第 二次提取过程由分离步骤终止，例如离心，以获得第二个液体相和第 二个固体相。获得的第一个液体相、第二个液体相和第二个固体相分 别产生了第一种单酰-或二酰甘油的糖苷产物、第二种单酰-或二酰甘油 的糖苷产物和第三种单酰-或二酰甘油的糖苷产物。该第一种、第二种和第三种单酰-或二酰甘油的糖苷产物可以包含在汁液产品、酊剂产品 和固体浓縮物中。优选固体浓縮物被干燥，优选使用喷雾干燥器，以 获得干燥的固体浓縮物。
在本发明的实施方案中，第一种单酰-或二酰甘油的糖苷产物、第 二种单酰-或二酰甘油的糖苷产物和第三种单酰-或二酰甘油的糖苷产 物是结构类似的产物或基本上类似的产物，但彼此的差别在于从植物 材料的不同提取中获得。
在本发明的另一个实施方案中，第一种单酰-或二酰甘油的糖苷产 物、第二种单酰-或二酰甘油的糖苷产物和第三种单酰-或二酰甘油的糖
苷产物，可以包含根据本发明属于单酰-或二酰甘油的糖苷化合物范围 内的各种不同化合物的组合。
在本发明的实施方案中，从植物材料制备单酰-或二酰甘油的糖苷 产物的方法包括下列步骤(i)任选将植物材料磨碎，(ii)用第一种水 性溶液提取任选磨碎的植物材料，获得第一个液体相和第一个固体相， (iii)将液体相与固体相分离以获得单酰-或二酰甘油的糖苷产物，(iv)
用第二种提取溶液提取步骤(iii)的固体相，获得第二个液体相和第二个
固体相，以及(v)将第二个液体相与第二个固体相分离，以获得第二个
和第三个单酰-或二酰甘油的糖苷产物，其中第二种提取溶液还含有细 胞壁降解酶或细胞壁降解酶的混合物。
含有汁液产品、酊剂产品或固体浓縮物的药物，可用于预防、治 疗或缓解由病患或医学状况例如病毒或细菌疾病引起的炎症(通常称
为"炎性病症")。在Stedman医学字典(Stedman，s Medical Dictionary) 第26版中，"炎症"被定义为"由受影响的血管和邻近组织响应物理、 化学或生物因素引起的损伤或异常刺激而产生的细胞学和化学反应的 动态混合构成的基础病理过程，包括局部反应和产生的形态变化、破 坏有害物质的清除、以及导致修复和治愈的应答"。相关的炎性病症
21的例子是肝炎、脑膜炎、风湿性关节炎、炎性肠病例如克罗恩病
(Crohn's)病、过敏综合征、糖尿病、充血性心脏病、银屑病、反应 性或骨关节炎或其它关节炎性皮疹(arthritides)例如骨关节病、多发 性硬化症、动脉粥样硬化、败血症/感染性休克、皮肤炎症、移植排斥 以及对肿瘤病的化疗或放疗的继发炎症。
目前认为本发明特别适合关节炎和/或骨关节病的治疗。
可以通过口服、颊服、肠胃外、局部、直肠、经皮或鼻内给药进 行施用，优选通过口服给药。
术语"哺乳动物"意指包括较大型哺乳动物例如人类以及家养或 农场动物，例如马、狗、绵羊、猪、奶牛等。在这些哺乳动物中，人 类是从本发明获益的特别感兴趣的对象。
如上所述，汁液产品、酊剂产品或固体浓縮物可以配制用于通过 不同的给药途径投送。因为使用方便，口服给药是优选的。单位剂量 可以包含每日单次给药(例如口服或通过肠内饮食的饲管)的治疗有 效量的汁液产品、酊剂产品或固体浓縮物，或者配制成每天提供多剂。 单位剂量将取决于许多因素，包括年龄、状况以及疾病状态，但是， 在任何情况下，每日的总剂量将是对于个体来说在生理上可接受并且 可以在较长的时期内每日给药的剂量。
尽管仍处于研究中，但相信在汁液产品、酊剂产品或固体浓縮物 中，每日0.001-50mg/kg体重的单酰-或二酰甘油的糖苷化合物的剂量， 例如每日0.005-20 mg/kg体重(mg/kg/天)，对于治疗炎性病症特别是 关节炎和骨关节病以及缓解与其相关的症状，将是有效的。类似地， 每曰施用较低的剂量率可作为预防。
在本发明的另一个实施方案中，药物可以是在汁液产品、酊产品或固体浓縮物中，以单剂或多剂应用于每天施用大约0.005- 50 mg/kg 体重的单酰-或二酰甘油的糖苷化合物的日剂量形式。
优选的单位剂量为大约0.001到大约50、例如0.001-20 mg/kg/天。 每日总剂量将为大约0.1到大约5000 mg/天，例如0.5-500 mg/天。例 如，单位剂量可以通过复合到片剂或胶囊中来给药，每个含有在汁液 产品、酊剂产品或固体浓縮物中的0.01-500 mg单酰-或二酰甘油的糖 苷化合物，例如3-|3-0-吡喃半乳糖氧基-2-(十八碳-9Z,12Z,15Z-三烯酰 氧基)丙基十八碳-9Z,12Z，15Z-三烯酸酯，使用者每天服用1到4粒胶 囊。
本发明将在下面非限制性图和下面非限制性实施例中进一步公开。
图1显示了本发明的工艺设置。
图2显示了蔷薇果浓縮物对于作为抗炎活性的人类外周血白细胞 的迁移(趋化性)的影响。结果是三次实验的平均值。
图3显示了蔷薇果浓縮物对人类外周血白细胞的氧爆(oxidative burst)反应(化学发光)的影响。结果是三次实验的平均值。
实施例 实施例1
植物原料是磨碎的蔷薇果壳原料。 将水和磨碎的蔷薇果壳在90。C混合(10:1) l分钟。 混合物通过3000 rpm离心10分钟进行分离。获得的水相显示出含有单酰-或二酰甘油的糖苷化合物，并且原则 上准备被装瓶作为汁液产品。
在固体相中加入水(5:1)，将温度调整到50。C ，用2MNaOH将 pH调整到4.5。
以初始蔷薇果原料的2% v/w加入Viscozyme L(Novozymes A/S)， 进行180分钟酶反应。 .
180分钟后，将混合物加热到85°C 1分钟以失活酶活性。
失活后，将混合物在3000 rpm离心IO分钟进行分离。
获得的固体相显示出含有单酰-或二酰甘油的糖苷化合物，并准备 用作固体浓縮物，并且原则上可以准备用于片剂等中。
获得的水相显示出含有单酰-或二酰甘油的糖苷化合物，原则上随 时准备用于酊剂中。
实施例2
生物学活性
方法
测定不同提取物(浓縮物)的抗炎和抗氧化剂活性，作为它们的 生物学活性的度量。
趋化性。通过趋化性分析测量提取物的抗炎活性。该分析测量人 类外周血多形核白细胞(PMN )朝向生物活性化学引诱物的迁移。该 分析广泛用作体外炎症的测量。简单来说，将细胞与各种不同浓度的 提取物预温育。在预温育后，测定细胞的迁移。化学发光。通过化学发光分析测量提取物的抗氧化剂活性。该分 析测量活化的人类外周血多形核白细胞(PMN )的氧爆反应。活化的 细胞产生反应性氧自由基。将细胞与各种不同浓度的提取物预温育。 在预温育后，用已知的激活剂例如调理过的酵母聚糖颗粒活化细胞， 然后测定活化细胞产生的氧自由基。
在这两种分析中，细胞都从健康对象的外周血获得。
结果
如图2和3所示，球丸(GC507)和水提取物(GC508)都以浓度 依赖性的方式在浓度低至10mg/ml、或1/10稀释的情况下抑制趋化性。
对于抑制化学发光反应(图2)作为抗氧化剂活性的量度(图3)， 也发现了类似的情况。
结论
在本发明中展示的这些结果显示，提取物以及球丸都被证明具有 相当高的抗炎和抗氧化剂活性。本工艺的另一个优点是，有可能破坏 活性成分GOPO的酶被该工艺中和了，因此使得GOPO稳定。本工艺 的另一个优点是，通过该工艺防止了活性成分GOPO的最终氧化。
权利要求
1. 从植物材料制备单酰-或二酰甘油的糖苷产物的方法，所述方法包括下列步骤(i)任选将植物材料磨碎，(ii)用第一种水性提取溶液提取任选磨碎的植物材料，获得第一个液体相和第一个固体相，(iii)将液体相与固体相分离，以获得单酰-或二酰甘油的糖苷产物。
2. 权利要求1的方法，其中液体相含有第一种单酰-或二酰甘油的 糖苷产物，并且第一种单酰-或二酰甘油的糖苷产物是汁液产品的形式。
3. 前述权利要求任一项的方法，其中第一种水性提取溶液与植物材料以100:1到1:100的比率混合，优选比率为50:1到1:50，诸如25:1 到1:25，优选比率为10:1。
4. 前述权利要求任一项的方法，其中步骤(ii)中的提取在20-110。C 的第一种提取温度下进行，诸如40-100°C、例如60-95°C范围，诸如 75-90°C、例如90。C。
5. 前述权利要求任一项的方法，其中步骤(ii)中的提取的执行时段 为10秒到20分钟，诸如30秒到10分钟、例如45秒到5分钟，诸如 1分钟到2分钟、例如1分钟。
6. 前述权利要求任一项的方法，其中所述方法还包括下列步骤(iv) 用第二种提取溶液提取步骤(iii)获得的固体相，获得第二个液 体相和第二个固体相。
7. 前述权利要求任一项的方法，其中所述方法还包括下列步骤(iv) 用第二种提取溶液提取步骤(iii)获得的固体相，获得第二个液 体相和第二个固体相。
8. 权利要求7的方法，其中第二种水性提取溶液与植物材料以50:1到1:50的比率混合，优选比率为25:1到1:25，诸如10:1到1:10， 优选比率为5:1。
9. 权利要求7-8任一项的方法，其中步骤(iv)中的提取在20-75°C 的第二种提取温度下进行，诸如30-60°C、例如40-55°C，诸如45-50°C、 例如50°C。
10. 权利要求7-9任一项的方法，其中步骤(iv)中提取的pH被调 整到pH 1-10范围内的pH值,诸如pH2墨9、例如pH3-7,诸如pH 4-6、 例如pH4.5。
11. 权利要求10的方法，其中pH用NaOH调整。
12. 权利要求7-11任一项的方法，其中第二种提取溶液还含有细 胞壁降解酶或细胞壁降解酶的混合物。
13. 权利要求12的方法，其中细胞壁降解酶是选自纤维素酶、卩-葡聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯聚糖酶和戊聚糖酶的一种或多种酶。
14. 权利要求12或13的方法，其中在获得(a)进一步分离的单酰-或二酰甘油的糖苷产物之前，将酶活性失活。
15. 权利要求14的方法，其中酶活性通过加热或通过加入酸或碱 失活。
16. 权利要求7-15任一项的方法，其中所述方法还包括下列步骤 (v)将第二个液体相与第二个固体相分离，以获得第二个和第三个单酰-或二酰甘油的糖苷产物。
17. 权利要求16的方法，其中第二个液体相含有第二个单酰-或二酰甘油的糖苷产物，并且是酊剂产品的形式。
18. 权利要求16或17任一项的方法，其中第二个固体相含有第三个单酰-或二酰甘油的糖苷产物，并且是固体浓縮物的形式。
19. 前述权利要求任一项的方法，其中单酰-或二酰甘油的糖苷产物是汁液产品、酊剂产品和/或固体浓縮物的形式。
20. 权利要求18或19任一项的方法，其中所述固体浓縮物被干燥。
21. 前述权利要求任一项的方法， 分离通过倾析、离心或过滤进行。
22. 前述权利要求任一项的方法， 的使用。
23. 前述权利要求任一项的方法， 取溶液是水。其中步骤(iii)和/或步骤(vii)中的其中所述方法不涉及有机溶剂其中第一种和/或第二种水性提
24. 前述权利要求任一项的方法，其中植物材料是蔷薇果，例如 狗牙蔷薇(Rosacanina)("狗蔷薇")、法国蔷薇(Rosa gallica)、 Rosa condita、玫瑰(Rosa rugosa)、黄蔷薇(Rosa hugonis) 、 Rosa nitida、 雪山蔷薇(Rosapendulina)、茴齐叶蔷薇(Rosa pimpinellifolia)和绢 毛蔷薇(Rosa sericea)。
25. 权利要求19-24任一项的方法，其中第一个、第二个和第三个 单酰-或二酰甘油的糖苷产物以全部的步骤(i)到步骤(v)的一个组合工艺生产。
26.权利要求l-25任一项的方法，其中单酰-或二酰甘油的糖苷产物含有具有下式i的单酰-或二酰甘油的糖苷化合物 R3" 7。R4其中r和r'独立地选自氢、<:1().24-烷基和<:1().24-酰基，所述烷基和酰基基团具有0到5个不饱和键，并且R1、 R2、 113和114独立地选自氢 和糖苷部分；第一个条件是R和R'不同时为氢，和第二个条件是R和 R'都不是二十碳五烯酰基。
27. 权利要求26的方法，其中任何烷基和酰基基团具有0到4个 不饱和键，诸如1-3个不饱和键、例如2或3个不饱和键，特别是3 个不饱和键。
28. 权利要求26或27任一项的方法，其中任何不饱和键是双键。
29. 权利要求26-28任一项的方法，其中R和R'都是具有1到3 个双键的(:16.2()-酰基，诸如具有3个双键的ds-酰基。
30. 权利要求26-29任一项的方法，其中所述化合物具有式ii: r30 or4其中R、 R'、 R1、 R2、 113和114都与权利要求l-5任一项中的定义相同。
31. 权利要求26-30任一项的方法，其中所述化合物选自(3-D-吡 喃半乳糖基衍生物、a-D-吡喃半乳糖基衍生物、(3-D-吡喃葡萄糖基衍生 物和a-D-吡喃葡萄糖基衍生物。
32. 权利要求26-31任一项的方法，其中所述化合物选自3-P-D-吡喃半乳糖氧基-2-(十八碳-9Z,12Z,15Z-三烯酰氧基)丙基十八碳 -92，122，152-三烯酸酯、3-(3-0-吡喃葡萄糖氧基-2-(十八碳-9Z，12Z，15Z-三烯酰氧基)丙基十八碳-9Z,12Z，15Z-三烯酸酯、3-a-D-吡喃半乳糖氧 基-2-(十八碳-9Z，12Z,15Z-三烯酰氧基)丙基十八碳-9Z,12Z,15Z-三烯 酸酯和3-01-0-吡喃葡萄糖氧基-2-(十八碳-9Z,12Z,15Z-三烯酰氧基)丙 基十八碳-9Z,12Z，15Z-三烯酸酯。
33. 汁液产品，其含有可以通过权利要求1-32的方法获得的单酰-或二酰甘油的糖苷产物。
34. 酊剂产品，其含有可以通过权利要求1-32的方法获得的单酰-或二酰甘油的糖苷产物。
35. 固体浓縮物，其含有可以通过权利要求l-32的方法获得的单 酰-或二酰甘油的糖苷产物。
36. 产品，其含有权利要求33的汁液产品、权利要求34的酊剂 产品或权利要求35的固体浓縮物。
37. 权利要求36的产品，其中所述产品是食品、天然药物产品或 膳食补充品。
38. 权利要求33的汁液产品、权利要求34的酊剂产品或权利要求 35的固体浓縮物在制备治疗、缓解或预防哺乳动物炎性病症的药物中 的应用。
39. 权利要求38的应用，其中所述药物适合于口服、颊服、肠胃 外、局部、直肠、经皮或鼻内给药。
40. 权利要求38或39任一项的应用，其中所述药物的形式是适 用于以单剂或多剂每天施用大约0.005- 50 mg/kg体重的日剂量形式。
41. 权利要求38-40任一项的应用，其中炎性病症选自肝炎、脑膜 炎、风湿性关节炎、炎性肠病、过敏综合征、糖尿病、充血性心脏病、 银屑病、反应性或骨性关节炎或其它关节炎性皮疹、多发性硬化症、 败血症/感染性休克、皮肤炎症、移植排斥以及肿瘤病的化疗或放疗的 继发炎症。
42. 权利要求38-41任一项的应用，其中炎性病症是关节炎。
43. 权利要求38-42任一项的应用，其中炎性病症是骨关节病。
44. 在需要的哺乳动物中治疗、缓解或防止炎性病症的方法，所 述方法包括施用含有权利要求33的汁液产品、权利要求34的酊剂产 品或权利要求35的固体浓縮物的药物或产品的步骤。
45. 权利要求44的方法，其中所述药物适合口服、颊服、肠胃外、 局部、直肠、经皮或鼻内给药。
46. 权利要求44或45任一项的方法，其中所述药物的形式是适 用于以单剂或多剂每天施用大约0.005- 50 mg/kg体重的日剂量形式。
47. 权利要求44-46任一项的方法，其中炎性病症选自肝炎、脑膜 炎、风湿性关节炎、炎性肠病、过敏综合症、糖尿病、充血性心脏病、 银屑病、反应性或骨性关节炎或其它关节炎性皮疹、多发性硬化症、 败血症/感染性休克、皮肤炎症、移植排斥以及肿瘤病的化疗或放疗的 继发炎症。
48. 权利要求44-47任一项的方法，其中炎性病症是关节炎。
49. 权利要求44-48任一项的应用，其中炎性病症是骨关节病。
全文摘要
本发明提供了从植物材料制备单酰-或二酰甘油的糖苷产物的方法。该方法包括下列步骤(i)任选将植物材料磨碎，(ii)用第一种水性提取溶液提取任选磨碎的植物材料，获得第一个液体相和第一个固体相，(iii)将液体相与固体相分离以获得单酰-或二酰甘油的糖苷产物，(iv)用第二种提取溶液提取步骤(iii)中的固体相，获得第二个液体相和第二个固体相，以及(v)将第二个液体相与第二个固体相分离，以获得第二个和第三个单酰-或二酰甘油的糖苷产物，其中第二种提取溶液还含有细胞壁降解酶或细胞壁降解酶的混合物。
文档编号C07H1/00GK101479286SQ200680055210
公开日2009年7月8日 申请日期2006年7月3日 优先权日2006年7月3日
发明者保罗·亨尼什·马德森, 克里斯蒂安·洛伦兹·巴格尔, 托马斯·尼斯加德·布林克, 阿尔萨兰·哈拉兹米 申请人:海本维塔莱斯有限公司