专利名称：胁迫抗性植物的制作方法
胁迫抗性植物 发明领域本发明提供了增加植物或植物细胞胁迫抗性的方法，其中在植物中表达参与NAD补救合成途径和/或NAD从头合成途径的酶，所迷酶来自除 酉良酒酵母(5ViccAflf o附yce51 ce"v/s^e)以夕卜的真菌或酵母才羊生物。考虑到对最终增加作物植物的实际产率的永无止境的需求，对不利生 长条件的植物耐受性是这些作物非常理想的特性，所述不利生长条件包括 干旱、高光照强度、高温、营养限制、盐生长条件等等。实现提高通常称为植物胁迫抗性或胁迫耐受性目的的多种方法已有描述。由于不同的非生物胁迫条件经常导致产生有害的活性氧(ROS))，如超 氧化物或过氧化氢，因此，提高植物耐受性的初期尝试着眼于阻止产生 ROS或将其除去。这些方法的实例是过表达ROS清除酶，如过氧化氢酶、 过氧化物酶、超氧化物歧化酶等，或者甚至增加ROS清除分子如抗坏血 酸、谷胱甘肽等的量。改造胁迫耐受性植物的这些方法和其它尝试综述于， 如wang等人，2003， Planta 218:1-14。如WO00/04173和PCT/EP2004/003995中分别描述的，植物细胞和植 物的胁迫耐受性也可以通过减少内源聚ADP核糖聚合酶(ParP)或聚(ADP 核糖)糖苷水解酶(ParG)的活性或水平而实现。人们认为，在这种方法中， 遭受胁迫条件的植物细胞中，导致创伤性细胞死亡的致死的NAD和ATP 衰竭可以被避免或充分地推迟，以使受胁迫的细胞存活并适应胁迫条件。Uchimiya等人(2002)描述了命名为YK1的稻基因的分离，以及嵌合 YK1基因用于增加含有这种基因的转基因稻类植物对稻瘟病和几种非生 物胁迫如NaCl、 UV-C、淹涝(submergence)和过氧化氩耐受性的用途(Uchimiya等人，2002， molecular breeding 9: 25-31)。Uchimiya等人还发表一篇会议摘要，描述的是在稻细胞中过表达 NAD依赖性还原酶基因(YKl)还通过上调NAD合成酶的活性提高 NAD(P)(H)的水平，并且推断这种改变进而产生ROS胁迫抗性所需的氧化 还原物质库(Uchimiya等人，2003 Keystone symposium on Plant biology: Functions and control of cell death, Snowbird Utah, 2003年4月10-15曰)。酵母中的NAD合成酶已进行了充分表征，而且它是NAD从头合成途 径以及NAD补救途径中最后的一个酶。在从头合成途径中，壹啉(quinolate) 是合成NAD的前体，并且是作为色氨酸降解产物产生。在补救途径中， 烟酰胺(为NAD的降解产物，通过多种酶如PARP、 NAD依赖性脱乙酰酶 或其它NAD糖苷水解酶的作用产生)是前体分子。在第一步中，烟酰胺由 烟酰胺酶脱去酰胺基变成烟酸。烟酸在烟酸酯磷酸核糖基转移酶的作用下 转移到5-磷酸核糖基-l-焦磷酸上产生烟酸单核苷酸。这一化合物是NAD 从头合成途径和补救合成途径共同拥有的。因此，在从头合成途径中通过 NAD+焦磷酸化酶和NAD合成酶完成这一化合物的进一步转化。在酵母中，过表达PNC1 (编码烟酰胺酶)已经由于卡路里限制和低强 度胁迫而与生命期延长相关联(Anderson等人，2003 Nature 423: 181-185 页；Gallo等人，2004， Molecular and Cellular Biology 24: 1301-1312)。WO2004/016726描述了调节真核和原核细胞生命期以及保护细胞抵 御某些胁迫的方法和组合物。 一种方法包括调节细胞中NAD+补救途径的 通量，例如，调节选自PNC1、 NMA1、 NPT1和NMA2中的一种或多种 蛋白的水平或活性。对植物中NAD生物合成途径中的相应酶所知甚少。Hunt等人，2004 描述了可利用的拟南芥基因组信息用于鉴定这些酶的植物同源物的用途 (Hunt等人，2004， New Phytologistl63(l): 31-44)。已经鉴定的DNA序列具 有如下登录号烟酰胺酶At5g23220、 At5g23230和At3gl6190;烟酸酯 磷酸核糖基转移酶At4g36940、 At2g23420;烟酸单核苷酸腺苷转移酶 At5g55810以及NAD合成酶Atlg550卯(所有的核苷酸序列在此引用作为参考)。PCT/EP 2005/010168描述了增加才直物和植物细胞胁迫抗性的方法，其 中在植物中表达参与NAD补救合成途径和/或NAD从头合成途径的酶。依然需要能增加植物胁迫耐受性的备选方法，而下面描迷的实施方案， 包括权利要求，提供了这样的方法和手段。发明概述在本发明的一个实施方案中，提供了获得胁迫抗性增加的植物的方法， 所述方法包括将嵌合基因引入植物细胞中获得转基因细胞，其中所述嵌合 基因包括如下有效连接的DNA片段i. 植物可表达的启动子；ii. 编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成途径中植物功能酶的DNA 区，所述酶选自烟酰胺酶、烟酸酯磷酸核糖基转移酶，烟酸单核苷酸腺普 转移酶或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶；iii. 参与转录终止和多聚腺苷酸化作用的3，末端区域；随后，由转基因植物细胞再生获得转基因植物群；并从转基因植物群 选择比类似的非转基因植物表现出增加的胁迫抗性的植物，或在胁迫条件 下表现出活性氧水平降低或维持高水平NADH的植物，其中所述方法的特 征在于DNA区所编码的植物功能酶的氨基酸序列包括如下之一登录号 XP—"4840 (光滑假丝酵母(CflwAV/" g/"6m似))的氨基酸序列，登录号 XP—4560"(乳酸克鲁维斯酵母(iT/"^wrawj^s to"/力)的氨基酸序列，登录 号NP_986013 (棉阿舒囊霉(E/rwW/ie"'"附g仍s，i7))的氨基酸序列，登录号 XP—幼8958 (白色念珠菌(Omrfi甴"的氨基酸序列，登录号 XPS00320 (解脂耶氏酵母(Kimwf'" /i/w/拌'c^))的氨基酸序列，登录号 XP389372 (玉蜀黍赤霉(。'^"//" wfle))的氨基酸序列，登录号XP一749509 (烟曲霉(Js/^rg,7/附/"附^i/附))的氨基紗列，登录号XP_712112 (白色念 珠菌)的氨基酸序列，登录号BAE56421 (米曲霉(>^/^/^///"5 0^z"e))的氨基 i^f列，登录号XP_56<7125 (新型隐球菌(O"tococc"s "eo/o附""s))的氨基酸序列，登录号XP—964547 (粗糙脉孢菌(7Ve"/YW/wm cimsa))的氛基酸序 列，登录号XP—712135 (白色念珠菌)的氨基酸序列，登录号XP一448179 (光 滑假丝酵母)的氨基酸序列，登录号XP一453643 (乳酸克鲁维斯酵母)的氨基 酸序列，登录号NP_987024 (棉阿舒嚢霉)的氨基酸序列，登录号XPj00272 (解脂耶氏酵母)的氨基酸序列，登录号XP一722371 (白色念珠菌)的氨基酸 序列，登录号XP—456405 (汉氏德巴利氏酵母(Z)W"ra附FM /^附e",7))的氨 基酸序列，登录号BAE61562 (米曲霉)的氨基酸序列，登录号XP_759702 (玉米黑粉菌(t/Wi7"go wfly^fo))的氨基酸序列，登录号EAL18079 (新型隐球 菌(Oy/，tococc附"^/w附a附))的氨基酸序列，登录号NP一587771 (粟酒裂殖 酵母C^/r/^wicc/^/v附j;cM/w附Ae))的氨基酸序列，登录号XP_681472 (构巢 曲霉(^印e/^,7/附wiV/"/"ws))的氨基紗歹'J ，登录号XP—959191 (粗糙脉孢菌) 的氨基酸序列，登录号XP_567726 (新型隐球菌)的氨基酸序列，登录号 EAQ卯706 (球毛壳菌(C7^etoim"附g/M仍"w))的氨基酸序列，登录号 XP—387574 (玉蜀黍赤霉)的氨基酸序列，登录号XP—748008 (烟曲霉)的氨 基酸序列，登录号XP—361704 (灰色大角间座壳菌(Afflgwfl/wW/^gW^fl))的 氨基酸序列，登录号Q06178的氨基酸序列，登录号XP一444815 (光滑假丝 酵母)的氨基酸序列，登录号NP—986687 ((棉阿舒嚢霉))的氨基酸序列，登 录号XP—453005 (乳酸克鲁维斯酵母)的氨基酸序列，登录号XP—458184(汉 氏德巴利氏酵母)的氨基酸序列，登录号XP一718656 (白色念珠菌)的氨基酸 序列，登录号XP—504391 (解脂耶氏酵母)的氨基酸序列，登录号NP—592856 (粟酒裂殖酵母)的氨基酸序列，登录号XPJ762639 (玉米黑粉菌)的氨基酸 序列，登录号XPJ71297 (新型隐球菌)的氨基酸序列，登录号BAE57070 (米曲霉)的氨基酸序列，登录号XP_750776 (烟曲霉)的氨基酸序列，登录 号XP_659349 (构巢曲霉)的氨基酸序列，登录号XP—389652 (玉蜀黍赤霉) 的氨基酸序列，登录号XP一957634 (粗糙脉孢菌)的氨基酸序列，登录号 XP一36"64 (灰色大角间座壳菌)的氨基酸序列，登录号XP_758n9 (玉米黑 粉菌)的氨基酸序列，登录号EAQ8W19(球毛壳菌)的氨基酸序列，登录号 CAA85352 (酿酒酵母)的氨基酸序列，登录号XP—448893 (光滑假丝酵母)的氨基酸序列，登录号乂？_453357 (乳酸克鲁维斯酵母)的氨基酸序列，登 录号NP—983S62 (棉阿舒嚢霉)的氨基酸序列，登录号XP—462577 (汉氏德 巴利氏酵母)的氨基酸序列，登录号XP一889008 (白色念珠菌)的氨基酸序 列，登录号XP_500338 (解脂耶氏酵母)的氨基酸序列，登录号XP—746744 (烟曲霉)的氨基酸序列，登录号BAEG""(米曲霉)的氨基酸序列，登录号 XP_965789 (粗糙脉孢菌)的氨基酸序列，登录号EAQ93453 (球毛壳菌)的 氨基酸序列，登录号XP—682385 (构巢曲霉)的氨基酸序列，登录号 AAN74808 (串珠状赤霉((7幼&"//"附0/1//|/^柳&))的氨基酸序列，登录号 Q9UTK3的氨基酸序列，登录号XP一361075 (灰色大角间座壳菌)的氨基酸 序列，登录号EAL18922 (新型隐球菌)的氨基酸序列，登录号XP—568039 (新型隐球菌)的氨基酸序列，登录号XP_760597 (玉米黑粉菌)的氨基, 列，登录号NP一011524的氨基酸序列，登录号XP一444815 (光滑假丝酵母) 的氨基酸序列，登录号NP一986687 ((棉阿舒嚢霉)的氨基酸序列，登录号 XP—453005 (乳酸克鲁维斯酵母)的氨基酸序列，登录号XP—458184 (汉氏德 巴利氏酵母)的氨基酸序列，登录号XP_718656 (白色念珠菌)的氨基酸序 列，登录号XP一504391 (解脂耶氏酵母)的氨基酸序列，登录号NP—592856 (粟酒裂殖酵母)的氨基酸序列，登录号XP—762639 (玉米黑粉菌)的氨基酸 序列，登录号XPJ71297 (新型隐球菌)的氨基酸序列，登录号BAE57070 (米曲霉)的氨基酸序列，登录号XP—750776 (烟曲霉)的氨基酸序列，登录 号XP_659349 (构巢曲霉)的氨基酸序列，登录号XP_38%52 (玉蜀黍赤霉) 的氨基酸序列，登录号XP_957634 (粗糙脉孢菌)的氨基酸序列，登录号 XP_36"64 (灰色大角间座壳菌)的氨基酸序列，登录号XP_758H9 (玉米黑 粉菌)或登录号EAQ85219 (球毛壳菌)的氨基酸序列。在另一实施方案中，本发明涉及本文所述的嵌合基因、包含这些嵌合 基因的植物细胞、基本上由含有这些嵌合基因的植物细胞组成的植物以及 这样的植物的种子。这些植物和植物细胞的特征在于其在胁迫条件下比类 似的不包含这样的嵌合基因的植物拥有更低水平的活性氧。而在另 一个实施方案中，本发明涉及所述嵌合基因用于增加植物胁迫抗性或降低胁迫条件下植物或植物细胞中活性氧水平的用途。本发明还提供编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成途径中植物功能酶的所述DNA序列之一用于增加植物胁迫抗性或降低胁迫条件下植物或植 物细胞中活性氧水平或维持NADH水平的用途，所述酶选自真菌或酵母样 生物来源的烟酰胺酶、烟酸酯磷酸核糖基转移酶、烟酸单核苷酸腺苷转移 酶或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶。发明详述本发明是基于这样的发现，即编码酵母NAD补救途径中植物功能酶 的DNA序列能够用来获得转基因植物，所述转基因植物比不包含这些 DNA序列的植物对胁迫特别是对非生物胁迫的抗性更强。与对照植物相 比，转基因植物在胁迫条件下也表现出活性氧("ROS，，)水平显著降低和维 持高水平的NADH。因此在本发明的一个实施方案中，提供了获得具有增加的胁迫抗性的 植物的方法，所述方法包括步骤-将如本文描述的胁迫抗性嵌合基因引入植物细胞中以获得含有所述 胁迫抗性嵌合基因的细胞；-再生这些含有胁迫抗性嵌合基因的细胞以获得含有胁迫抗性嵌合基 因的植物群，和-从这些植物群中选择植物，所述植物与类似的非转基因植物相比表 现出增加的胁迫抗性和/或在胁迫条件下ROS水平降低和/或维持高水平的 NADH。因此所述胁迫抗性嵌合基因包含有效连接于DNA区的植物可表达的 启动子和参与转录终止和多聚腺苷酸化的3，末端区域，所迷DNA区编码 烟酰胺腺噤呤二核苷酸补救合成途径中的植物功能酶，所述酶选自真菌或 酵母样生物来源的烟酰胺酶、烟酸酯磷酸核糖基转移酶、烟酸单核苷酸腺 苷转移酶或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶。如本文所用，"烟酰胺腺噤呤二核苷酸补救合成途径中的植物功能酶"是指当连接于适当的控制元件如植物可表达的启动子和终止子区并将其引入到植物中时，能够转录和翻译产生在植物细胞中有功能的NAD补救合 成途径中的酶。包括NAD补救合成途径中的酶(和编码基因)，从不同于酿 酒酵母的酵母或真菌中获得。后述来源的蛋白质非常适用于本发明的方法， 因为这些蛋白质较少可能受到酶反馈调节等，而类似的植物来源的酶则容 易受酶的反馈调节。参与NAD补救合成途径的酶包括如下—烟酰胺酶(EC3.5.1.19)催化烟酰胺上的酰胺基团水解，由此释放出 烟酸和NH3。该酶又称为烟酰胺脱氨酶、烟酰胺酰胺酶、YNDase或烟酰 胺酰胺水解酶。一烟酸酯磷酸核糖基转移酶(EC 2.4.2.11)又称为烟酸核糖核苷酸酶、 烟酸单核苷酸糖苷水解酶、烟酸单核苷酸焦磷酸化酶、烟酸磷酸核糖基转 移酶，催化如下反应烟酸酯-D-核糖核苷酸+二磷酸=烟酸酯+5-磷酸-a-D-核糖l-二磷酸。一烟酸酯-核苷酸腺苷转移酶(EC 2.7.7.18)又称为脱酰胺NAD+焦磷 酸化酶、烟酸酯单核苷酸腺苷转移酶、脱酰胺烟酰胺腺嘌呤二核苷酸焦磷 酸化酶、NaMT-ATase、烟酸单核苷酸腺普转移酶，催化如下反应ATP+烟酸酯核糖核苷酸=二磷酸+脱酰胺NAD+。一 NAD合酶(EC6.3.1.5)又称为NAD合成酶、NAD+合酶、烟酰胺腺 嘌呤二核苷酸合成酶、二磷酸吡啶核苷酸合成酶，催化如下反应脱酰胺NAD++ATP+ NHfAMP+二磷酸+NAD+。在本发明的一个实施方案中，编码NAD补救合成途径中不同的酶的 编码区包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有本文所示氨基酸 序列的蛋白质。编码真菌或酵母样生物来源、类似于酿酒酵母PNC1的烟酰胺酶的适 宜核苷酸序列包括这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含选自如下 氨基酸序列的烟酰胺酶登录号XP_444840 (光滑假丝酵母)的氨基酸序列登录号XP_456073 (乳酸克鲁维斯酵母)的氨基酸序列 登录号NP_986013 (棉阿舒嚢霉)的氨基酸序列 登录号XP_888958 (白色念珠菌)的氨基酸序列 登录号XP500320 (解脂耶氏酵母)的氨基酸序列 登录号XP389372 (玉蜀黍赤霉)的氨基酸序列 登录号XP_749509 (烟曲霉)的氨基酸序列 登录号XP一712112 (白色念珠菌)的氨基酸序列 登录号BAE56421 (米曲霉)的氨基酸序列 登录号XP一567125 (新型隐球菌)的氨基酸序列 登录号XP_964547 (粗糙脉孢菌)的M酸序列 登录号XP_712135 (白色念珠菌)。编码真菌来源、类似于酿酒酵母Qnsl的NAD(+)合成酶的适宜核苷酸 序列包括这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含选自如下氨基^ 列的NAD(+)合成酶登录号XP_448179 (光滑假丝酵母)的氨基酸序列登录号XP_453643 (乳酸克鲁维斯酵母)的氨基酸序列登录号NP_987024 (棉阿舒嚢霉)的氨基酸序列登录号XP—500272 (解脂耶氏酵母)的氨基酸序列登录号XP_722J71 (白色念珠菌)的氨基酸序列登录号XP_456405 (汉氏德巴利氏酵母)的氨基酸序列登录号BAE61562 (米曲霉)的氨基酸序列登录号XP—759702 (玉米黑粉菌)的氨基酸序列登录号EAL18079 (新型隐球菌)的氨基酸序列登录号NP_587771 (粟酒裂殖酵母)的氨基酸序列登录号XP—681472 (构巢曲霉)的氨基酸序列登录号XP_959191 (粗糙脉孢菌)的氨基酸序列登录号XP_567726 (新型隐球菌)的氨基酸序列登录号EAQ90706 (球毛壳菌)的氨基酸序列登录号XPj8"74 (玉蜀黍赤霉)的氨基酸序列登录号XP一748008 (烟曲霉)的氨基酸序列登录号XP_361704 (灰色大角间座壳菌)的氨基酸序列。编码真菌来源、类似于酿酒酵母NMA1的烟酸单核苷酸腺苷转移酶的 适宜核苷酸序列包括这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含选自如 下氨基酸序列的烟酸单核苷酸腺苷转移酶登录号Q06178的氨基酸序列登录号XP一444815 (光滑假丝酵母)的氨基酸序列登录号NP_986687 ((棉阿舒嚢霉)的氨基酸序列登录号XP_453005 f乳酸克鲁维斯酵母)的t^JA序列登录号XP_458184 (汉氏德巴利氏酵母)的氨基酸序列登录号XP_718656 (白色念珠菌)的氨基酸序列登录号XP_504391 (解脂耶氏酵母)的氨基酸序列登录号NP—592856 (粟酒裂殖酵母)的氨基酸序列登录号XP_762639 (玉米黑粉菌)的氨基酸序列登录号XP—571297 (新型隐球菌)的氨基酸序列登录号BAE57070 (米曲霉)的氨基酸序列登录号XP_750776 (烟曲霉)的氨基酸序列登录号XP_659349 (构巢曲霉)的氨基酸序列登录号XP_389652 (玉蜀黍赤霉)的氨基酸序列登录号XP_957634 (粗糙脉孢菌)的氨基酸序列登录号XP_363364 (灰色大角间座壳菌)的氨基酸序列登录号XP一758179 (玉米黑粉菌)的氨基酸序列登录号EAQ85219 ((球毛壳菌)的氨基酸序列。编码真菌或酵母样生物来源、类似于酿酒酵母NPT1的烟酸酯磷酸核 糖基转移酶的适宜核苷酸序列包括这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编 码包含选自如下氨基酸序列的烟酸酯磷酸核糖基转移酶登录号CAA85352 (酿酒酵母)的氨基酸序列登录号XP_448893 (光滑假丝酵母)的氨基酸序列 登录号XP_453357 (乳酸克鲁维斯酵母)的氨基酸序列 登录号NP_983562 (棉阿舒囊霉)的氨基酸序列 登录号XP—462577 (汉氏德巴利氏酵母)的氨基酸序列 登录号XP_889008 (白色念珠菌)的氨基酸序列 登录号XP_500338 (解脂耶氏酵母)的氨基酸序列 登录号XP—746744 (烟曲霉)的氨基酸序列 登录号BAE64333 (米曲霉)的氨基酸序列 登录号XP_965789 (粗糙脉孢菌)的氨基酸序列 登录号EAQ93453 (球毛壳菌)的M酸序列 登录号XP_682385 (构巢曲霉)的氨基酸序列 登录号AANM808(串珠状赤霉)的氨基酸序列 登录号Q9UTK3的氨基酸序列登录号XP—361075 (灰色大角间座壳菌)的氨基酸序列 登录号EAL18922 (新型隐球菌)的氨基酸序列 登录号XP—568<B9 (新型隐球菌)的氨基酸序列 登录号XP_760597 (玉米黑粉菌)的氨基酸序列。编码真菌或酵母样生物来源、类似于酿酒酵母NMA2的烟酸单核苷酸 腺苷转移酶的适宜核苷酸序列包括这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编 码包含选自如下氨基酸序列的烟酸单核苷酸腺苷转移酶登录号NP一011524的氨基酸序列登录号XP一444815 (光滑假丝酵母)的氨基酸序列登录号NP_986687 ((棉阿舒嚢霉)的氨基酸序列登录号XP—453005 (乳酸克鲁维斯酵母)的氨基酸序列登录号XP_458184 (汉氏德巴利氏酵母)的氨基酸序列登录号XPJ718656 (白色念珠菌)的氨基酸序列登录号XP一504391 (解脂耶氏酵母)的氨基酸序列登录号NP_592856 (粟酒裂殖酵母)的氨基酸序列登录号XP一762639 (玉米黑粉菌)的氨基酸序列登录号XP_571297 (新型隐球菌)的氨基酸序列登录号BAE57070 (米曲霉)的氨基酸序列登录号XP_750776 (烟曲霉)的氨基酸序列登录号XP_659349 (构巢曲霉)的氨基酸序列登录号XP_389652 (玉蜀黍赤霉)的氨基酸序列登录号XP—957634 (粗糙脉孢菌)的氨基酸序列登录号XP—363364 (灰色大角间座壳菌)的氨基酸序列登录号XP一758179 (玉米黑粉菌)的氨基酸序列登录号EAQ85219 ((球毛壳菌)的氨基酸序列。所有以其登录号述及的氨基酸序列并入本文作为参考。但是，显然也可以使用这些序列的变体，包括其插入、缺失和取代， 达到同样的效果。所述序列的变体与鉴定的NAD补救合成途径酶序列具 有优选至少约80%，或85%、或卯％或95%的序列同一性。优选这些变 体是与NAD补救途径中的酶具有相同酶活性的功能性蛋白。出于本发明 的目的，用百分比表示的两个相关核苷酸或氨基酸序列的"序列同一性，， 是指两个最佳比对序列中相同残基位置的数目(x IOO)除以所有比较残基 位置的数目。空位即这样的位置，在比对中一个序列在该位置上存在残基， 而另一个序列则无，视为没有相同残基的位置。两个序列的比对用 Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970)执行。上述计算 机辅助的序列比对可以用标准软件程序如GAP方便地执行，GAP为10.1 版威斯康星软件包(Wisconsin Package Version 10.1)(美国威斯康星州麦迪 逊市遗传计算机研究组，Genetics Computer Group, Madision, Wisconsin, USA)的一部分，使用默认得分矩阵，空位建立罚分为50,而空位延伸罚 分为3。也可以使用鉴定的编码NAD补救合成途径中酶的核苷酸序列作为探 针，在严格条件下通过杂交鉴定和分离来自其他真菌或酵母样生物的同源 核苷酸序列。如本文所用，"严格杂交条件"意指杂交通常发生在探针和耙序列之间的同一性至少为95%，并优选至少97%的情况下。严格杂交条件的实例是 在含有50%甲醛、5 x SSC (150 mM NaCl、 15mM柠檬酸三钠)、50 mM 磷酸钠(pH 7.6)、 5 x Denhardt溶液、10%硫酸葡聚糖和20照/ml变性剪 切的载体DNA(如鲑鱼精DNA)的溶液中孵育过夜，然后用O.lxSSC在大 约65'C洗涤杂交支持物，优选洗两次每次约10分钟。其他的杂交和洗涤 条件是众所周知的，并且示例于Sambrook等人，《分子克隆实验指南》 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual),第二版，Cold Spring Harbor, NY (1989)，特别是第11章。可以使用本发明的方法获得耐受不同种类胁迫诱导条件特别是非生物 胁迫条件的植物，所述非生物胁迫条件包括淹涝、高光照条件、高UV辐 射水平、增加的过氧化氢水平、干旱条件、高温或低温、增加的盐度条件。 本发明的方法也可以用来降低在不利条件下特别是非生物胁迫条件下生长 的植物细胞中ROS的水平，所述非生物胁迫条件包括淹涝、高光照条件、 高UV辐射水平、增加的过氧化氢水平、干旱条件、高温或4氐温、增加的 盐度条件等。可以用本领域公知的方法包括实施例3中所述的方法测定 ROS水平或NADH水平。使用本文所述方法可以获得植物，其中在非胁迫条件下，例如但不限 于低光照条件下，其ROS的水平等于或低于对照植物。在非胁迫条件下， 这些植物中的ROS水平范围可以是在低光照条件下对照植物水平的50% 至100%，尤其是约60%至约85%。在胁迫条件下，这些植物中的ROS 水平是胁迫条件下对照植物的ROS水平的大约50%至80%，相当于非胁 迫条件下对照植物中的ROS水平的大约60。/o至80。/Q。与此类似，在非胁 迫条件下，例如但不限于低光照条件下，这些植物的NADH水平等于或高 于对照植物中的水平。在非胁迫条件下，这些植物中的NADH水平范围是 在低光照条件下的对照植物中NADH水平的100%至160%,尤其是大约 120%至大约140%。在胁迫条件下这些植物中的NADH水平是胁迫条件 下对照植物中NADH水平的大约200%至300%，相当于非胁迫条件下对照植物中NADH水平的大约100%至160%。获得转基因植物的方法不是本发明的关键，可以使用适合具体植物物 种的任何转化方法和再生方法。这些方法是本领域众所周知的，包括农杆 菌04gro^"m'"iw)介导的转化、基因枪递送、显微注射、完整细胞的电穿 孔、聚乙二醇介导的原生质体转化、原生质体电穿孔、脂质体介导的转化、 硅须(silicon-whiskers)介导的转化等。然后，用这种方式得到的转化细胞可 以再生为成熟的有繁殖能力的植物。获得的转化植物可以用于传统的育种方案以产生更多的具有相同特征 的转化植物，或将本发明的嵌合基因引入相同或相关植物物种的其它品种 中或引入杂交植物中。从转化植物获得的种子含有作为稳定的基因组插入 片段的本发明的嵌合基因，并且也涵盖在本发明中。显然本文描述的不同胁迫抗性嵌合基因含有编码NAD补救途径中不 同酶的DNA区域，这些嵌合基因可以在一个植物细胞或植物中组合以进 一步提高含有所述嵌合基因的植物的胁迫耐受性。因此，在本发明的一个 实施方案中，提供的植物细胞和植物含有至少两种胁迫抗性嵌合基因，每 一种嵌合基因含有不同的编码区。如WO 00/04173和PCT/EP2004/003995所述，根据本发明的转基因 植物细胞和植物抹系还可以含有能减少内源PARP和/或PARG基因表达 的嵌合基因。可以例如通过将本发明的转基因植物林系与含有减少PARP也可以通过将本发明的嵌合基因引入或转化到含有减少PARP或PARG基 之亦然。出于本发明的目的，启动子是植物可表达的启动子。本文所用术语"植 物可表达的启动子"意指能在植物细胞中控制(起始)转录的DNA序列。这 包括任何植物来源的启动子，也包括任何非植物来源的但能在植物细胞中 指导转录的启动子，即病毒或细菌来源的某些启动子，如CaMV35S (Harpster等人，1988 M< /， Ge". 212,182-190)、地下三叶草病毒启动子No4或No7(W09606932)、或T-DNA基因启动子，而且还包括组织特 异性或器官特异性启动子，其包括但不限于种子特异性启动子(例如 WO89/03887)、器官原基特异性启动子(An等人，1996， 77^ iV""《CW/ 8， 15-30)、茎特异性启动子(Keller等人，1988， / 7， 3625-3633)、叶特异性启动子(Hudspeth等人，1989，/Va"f Mo/5iW 12， 579-589)、叶肉特异性 启动子(如光诱导的核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisco)启动子)、根特异 性启动子(Kdler等人，1989， GertMZ)eve/. 3， 1639-1646)、块茎特异性启动子 (Keil等人，1989，五M50丄8， 1323-1330)、维管组织特异性启动子(Peleman 等人，1989， 84， 359-369)、雄蕊选择性启动子(WO 89/10396、 WO92/13956)、开裂区(dehiscence zone)特异性启动子(WO 97/13865)等等。本发明的嵌合基因也可以装备在植物中有功能的核定位信号 ("NLS，，)，如SV40NLS，所述核定位信号有效连接于编码NAD补救途径 中的酶的DNA区。读到本篇文献，本领域的技术人员将会立即认识到，只要获得其中编 码NAD补救途径中的酶的内源基因更加活跃或以更高水平表达的植物的 天然变体可，就以获得增加胁迫抗性的类似效果。这样的变体植物可以这 样得到对植物群进行诱变，例如但不限于EMS诱变，然后再筛选NAD 补救途径中任何一个酶或其组合的活性增加的植物。同样立即显而易见的是，可以对不同的品种或栽培种群就前面提到的 一般性胁迫条件或具体选择的非生物胁迫条件耐受性的增加进行篩选，然 后将对胁迫条件增加的耐受性与存在编码NAD补救途径中酶的任何内源 基因的特定等位基因相关联。如果这些物种是性亲和的，可以通过杂交将 这样的等位基因引入目的植物中；或者使用本文描述的常规方法(包括杂交 技术或PCR扩增技术)对其进行鉴定并用重组DNA技术引入植物中。用 育种技术引入特别期望的等位基因后，可以接着用特异于目的等位基因的 分子标记进行检测。相信本文描述的方法和手段适合所有植物细胞和植物，既包括双子叶、 又包括单子叶植物细胞和植物，包括但不限于棉花、芸苔属植物、油料种子油菜、小麦、谷物或玉米、大麦、向日葵、稻、燕麦、甘蔗、大豆、蔬 菜(包括菊苣、生菜、番茄)、烟草、马铃薯、甜菜、木瓜、菠萝、芒果、拟南芥(Jm6,V/o/w&狄"/iVi"fl),也包括在园艺、花卉或林业中使用的植物。如本文所用，"包含"应阐释为说明陈述特征、整体、步骤或成分的存 在，但是并不排除存在或增加一种或多种特征、整体、步骤或成分，或它 们组成的组。因此，例如，包含核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白质可以 比实际引述的核酸或蛋白质包含更多的核苷酸或氨基酸，即所述实际引述 的核酸或蛋白质包含在更大的核酸和蛋白质中。含有以功能或结构定义的DNA区的嵌合基因可以包含额外的DNA区等。
具体实施方式
以下非限制性实施例描述了能增加植物细胞和植物胁迫抗性的嵌合基 因的构建和这些基因的用途。除非在实施例中另有说明，所有重组DNA技术都是根据Sambrook 等人(1989)《分子克隆实验指南》第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY和Ausubel等人(1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA第1、 2巻中描述的标准方案实施。植物分子工作 的标准材料和方法在R.D.D. Croy编著的由BIOS Scientific Publications Ltd (UK)和Blackwell Scientific Publications, UK联合出版的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中描述。标准分子生物学技术的其它参考 书包括Sambrook和Russell (2001)《分子克隆实验指南》第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY，以及Brown所著巻I和II (1998) Molecular Biology LabFax，第二版，Academic Press (UK)。聚合酶链式反 应的标准材料和方法见Dieffenbach和Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 以及 McPherson等人(2000) PCR - Basics: From Background to Bench,第一版， Springer Verlag， Germany 。在通篇说明书中，述及如下序列表条目SEQ ID No. 1: XP_444840 (光滑假丝酵母) SEQ ID No. 2: XP—456073 (乳酸克鲁维斯酵母) SEQ ID No. 3: NP一986013 (棉阿舒嚢霉) SEQ ID No. 4: XP_888958 (白色念珠菌) SEQ ID No. 5: XP500320 (解脂耶氏酵母) SEQ ID No. 6: XP389372 (玉蜀黍赤霉) SEQ ID No. 7: XP_749509 (烟曲霉) SEQ ID No. 8: XP—712112 (白色念珠菌) SEQ ID No. 9: BAE56421 (米曲霉) SEQ ID No. 10: XP—567125 (新型隐球菌) SEQ ID No. 11: XP一964547 (粗糙脉孢菌) SEQ ID No. 12: XP_712135 (白色念珠菌) SEQ ID No. 13: XP—448179 (光滑假丝酵母) SEQ ID No. 14: XP_453643 (乳酸克鲁维斯酵母) SEQ ID No. 15: NP_987024 (棉阿舒嚢霉) SEQ ID No. 16: XP_500272 (解脂耶氏酵母) SEQ ID No. 17: XP_722371 (白色念珠菌) SEQ ID No. 18: XP—456405 (汉氏德巴利氏酵母) SEQ ID No. 19: BAE61562 (米曲霉) SEQ ID No. 20: XP_759702 (玉米黑粉菌) SEQ ID No. 21: EAL18079 (新型隐球菌) SEQ ID No. 22: NP—587771 (粟酒裂殖酵母) SEQ ID No. 23: XP一681472 (构巢曲霉) SEQ ID No. 24: XP_959191 (粗糙脉孢菌) SEQ ID No. 25: XP—567726 (新型隐球菌) SEQ ID No. 26: EAQ卯706 ((球毛壳菌) SEQ ID No. 27: XP—387574 (玉蜀黍赤霉) SEQ ID No. 28: XP—748008 (烟曲霉)SEQ ID No. 29: XP_361704 (灰色大角间座壳菌) SEQ ID No. 30: Q06178 SEQ ID No. 31: XP—444815 (光滑假丝酵母) SEQ ID No. 32: NP—986687 ((棉阿舒嚢霉) SEQ ID No. 33: XP—453005 (乳酸克鲁维斯酵母) SEQ ID No. 34: XP—458184(汉氏德巴利氏酵母) SEQ ID No. 35: XP_718656 (白色念珠菌) SEQ ID No. 36: XP—504391 (解脂耶氏酵母) SEQ ID No. 37: NP_592856 (粟酒裂殖酵母) SEQ ID No. 38: XP—762639 (玉米黑粉菌) SEQ ID No. 39: XP—571297 (新型隐球菌) SEQ ID No. 40: BAE57070 (米曲霉) SEQ ID No. 41: XP一750776 (烟曲霉) SEQ ID No. 42: XP—659349 (构巢曲霉) SEQ ID No. 43: XP—389652 (玉蜀黍赤霉) SEQ ID No. 44: XP_957634 (粗糙脉孢菌) SEQ ID No. 45: XP—363364 (灰色大角间座壳菌) SEQ ID No. 46: XP—758179 (玉米黑粉菌) SEQ ID No. 47: EAQ85219 (球毛壳菌) SEQ ID No. 48: CAA85352 (酿酒酵母) SEQ ID No. 49: XP—448893 (光滑假丝酵母) SEQ ID No. 50: XP_453357 (乳酸克鲁维斯酵母) SEQ ID No. 51: NP—983562 (棉阿舒嚢霉) SEQ ID No. 52: XP—462577 (汉氏德巴利氏酵母) SEQ ID No. 53: XP一889008 (白色念珠菌) SEQ ID No. 54: XP_500338 (解脂耶氏酵母) SEQ ID No. 55: XP一746744 (烟曲霉) SEQ ID No. 56: BAE64333 (米曲霉)SEQ ID No.57:XP一965789 (粗糙脉孢菌)SEQ ID No.58:EAQ93453 ((球毛壳菌)SEQ ID No.59:XP_682385 (构巢曲霉)SEQ ID No.60:AA1WS0S(串珠状赤霉)SEQ ID No.61:Q9UTK3SEQ ID No.62:XP_361075 (灰色大角间座壳菌)SEQ ID No.63:EAL18922 (新型隐球菌)SEQ ID No.64:XP_568039 (新型隐J求菌)SEQ ID No.65:XP_760597 (玉米黑粉菌)SEQ ID No.66:NP一011524。所有以其登录号述及的氨基酸序列并入本文作为参考。实施例实施例l:组装胁迫抗性嵌合基因并引入到植物中为了增加植物的胁迫抗性，用常规技术构建嵌合基因，其依次包含如下DNA片段 来自花椰菜花叶病毒的启动子区(CaMV35S); 对应Cab22L非翻译前导序列的约60 bp的DNA片段； 本文别处所述的编码真菌和酵母样生物来源的NAD补救途径中的酶的DNA片段，所述酶不同于酿酒酵母的PNC1、NMA1、NMA2或NPT1; 来自CaMV35S转录物的3'非翻译末端的片段(3，35S)。 将嵌合基因与可选择标记基因一起引入到T-DNA载体的左边界和右边界序列之间。用常规方法将T-DNA载体引入到含有辅助Ti质粒的农杆菌菌林中。 用常规转化方法将嵌合基因引入到植物中。转基因植物与其不含转基因的 对应植物相比表现出更高的胁迫抗性。
权利要求
1.获得具有增加的胁迫抗性的植物的方法，所述方法包括a.向植物细胞中引入嵌合基因获得转基因细胞，所述嵌合基因包含如下有效连接的DNA片段i.植物可表达的启动子；ii.编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成途径中的植物功能酶的DNA区，所述酶选自烟酰胺酶、烟酸酯磷酸核糖基转移酶、烟酸单核苷酸腺苷转移酶或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶；iii.参与转录终止和多聚腺苷酸化作用的3’末端区域；b.再生所述转基因细胞以获得转基因植物群；和从所述转基因植物群中选择表现出增加的胁迫抗性的植物或选择在胁迫条件下与类似的非转基因植物相比表现出降低的活性氧水平或维持高水平NADH的植物，其特征在于所述DNA区编码的氨基酸序列包含SEQ IDNo1-29、31-47或49-66中的任一氨基酸序列，或包含与SEQ ID No1-29、31-47或49-66中任一氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
2. 如权利要求1中所定义的嵌合基因。
3. 含有权利要求2所述嵌合基因的植物细胞。
4. 含有权利要求2所述嵌合基因的植物。
5. 权利要求4所述的植物，其特征还在于在胁迫条件下与不含这类嵌 合基因的类似植物相比，其活性氧水平更低。
6. 权利要求4或5所述植物的种子，所述种子含有权利要求2所述的 嵌合基因。
7. 权利要求2所述嵌合基因用于增加植物胁迫抗性的用途。
8. 权利要求2所述嵌合基因的用途，所述用途为在胁迫条件下降低植水i。 ，.、 ' Z 、^ 二 '
9. DNA序列增加才直物胁迫抗性的用途，所述DNA序列编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成途径中的植物功能酶，所述酶选自烟酰胺酶、烟酸 酯磷酸核糖基转移酶、烟酸单核苷酸腺苷转移酶或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 合成酶，其特征在于所述植物功能酶来源于不同于酿酒酵母的真菌或酵母 样生物。迫条件下植物或植物细胞中NAD水平的用途，所述DNA序列编码烟酰胺 腺嘌呤二核苷酸补救合成途径中的植物功能酶，所述酶选自烟酰胺酶、烟 酸酯磷酸核糖基转移酶、烟酸单核苷酸腺苷转移酶或烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸合成酶，其特征在于所述植物功能酶来源于不同于酿酒酵母的真菌或酵 母样生物。
全文摘要
通过使用编码参与NAD补救合成途径和/或NAD从头合成途径的酶的核苷酸序列(例如在植物中过表达)使植物和植物细胞获得胁迫耐受性，所述酶来自除酿酒酵母以外的真菌或酵母样生物。
文档编号C07K14/39GK101405396SQ200780009977
公开日2009年4月8日 申请日期2007年3月16日 优先权日2006年3月21日
发明者M·德布洛克, M·梅茨拉夫, V·格瑟勒 申请人:拜尔生物科学公司