用于蛋白质纯化的吸附剂的制作方法

专利名称：：用于蛋白质纯化的吸附剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及化合物及其作为亲和配体用于蛋白质纯化的用途。
背景技术：
：抗体是具有基本单体结构单元的免疫球蛋白糖蛋白。所述单体是由四条多肽链(其中两条是相同的重链，两条是相同的轻链，通过二硫桥相连)组成的Y形蛋白质。存在五种不同类型的重链(Y、ft、《、s和5)，它们可用于区分免疫球蛋白的种类(分别是IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)。还存在由不同基因产物所产生的两种不同类型的轻链U和K)。IgG(大小约150kD的单体免疫球蛋白)提供了对抗入侵病原体的基于抗体的免疫性，由于IgG在体内对特异性抗原具有高度特异性，因此它是免疫学研究和临床诊断中最常用的试剂。单克隆抗体(本文中称为Mab)是对单一抗原具有相同特异性的抗体，其由单一克隆细胞所形成的细胞系所产生。Mab构成了生物药品产业中增长最迅速的部分，估计到2010年其销售额将达到300亿美元(美国)。在近20年来，来自哺乳动物细胞培养物的抗体效价持续增加，需要可替代的下游技术和色谱吸附剂来解决Mab处理中的方法瓶颈。抗体片段(整个抗体分子的部分)提供了优于整个抗体的几个优点。它们更易于生产且更具成本效益，由于缺乏Fc(重链)区，它们通过降低细胞因子释放的风险以及与之相关的毒性而在患者中具有较少的副作用，可将其进行修饰以包含治疗性有效负载。存在几种类型的抗体片段，其或者是通过特异性内肽酶的酶消化而制备的IgG结构域或者其是在细胞系中通过基因工程而得到的。这些抗体片段包括单价片段如Fab，、Fab和scFv;二价片段如F(ab，)2二聚体抗体(diabody)和微型抗体(minibody);以及多价片段如三聚体抗体(triabody)和四聚体抗体(tetrabody)。有多种抗体片段产品正处在用作治疗剂或用于诊断的开发当中。预块成象应用)中60亿美元(美国)的重要份额(Holliger,P.,&HudsonP.J"iV化丑/Wedi23(9;2005)1126-1136)。大多数抗体片段产品缺乏蛋白A结合位点，因此与完整链的抗体不同，其不能通过蛋白A亲和色镨进行纯化。在大多数情况下，常规色镨技术用于纯化抗体片段。蛋白L是一种源自大消化链球菌(i^/7toW/^/^ococcws附"gwMS)属细菌的分子量为35000道尔顿的蛋白质，已知其与抗体轻链结合，并且已对其用于纯化一些抗体片段进行了研究，但并不认为蛋白L是有成本效益的，且其不能以商业量而得到。WO97/10887公开了可用作亲和吸附剂的式I的基于三溱的化合物其中R是H、烷基、羟烷基、环己基、NH2、苯基、萘基、l-苯基吡唑、吲唑、苯并噻唑、苯并嗯唑或苯并咪唑，其中任一所述芳族基团均可被烷基、烷氧基、酰氧基、酰氨基、氨基、NH2、OH、C02H、磺酰基、氨基甲酰基、氨磺酰基(sulphamoyl)、烷基磺酰基和卣素中的一个或多个所取代；一个X是N，另一个X是N、C隱C1或C-CN;Y是O、S或NRsZ是O、S或,；R2和R3各自是H、烷基、羟烷基、爷基或p-苯基乙基；Q是苯、萘、苯并噻唑、苯并嗯唑、l-苯基吡唑、吲唑或苯并咪唑；R4、Rs和R6各自是H、OH、烷基、烷氧基、氨基、NH2、酰氧基、酰基氨基、C02H、磺酸、氨基曱酰基、氨磺酰基、烷基磺酰基或卣素；n是06jp是020;和A是任选地通过间隔基(spacer)连接到含有X的环上的载体基质。公开了式I化合物对蛋白质(比如免疫球蛋白、胰岛素、VII因子或人生长激素)具有亲和力。在WO00/67卯0和WO03/097112中公开了具有相关结构的化合物。它们对内毒素具有亲和力。WO97/10887中所公开的某些基于三溱的化合物对免疫球蛋白具有亲和力。显示这种亲和力的化合物的一个实例是式II的化合物例如II的化合物能够从复杂混合物或原料(比如人血浆)中特异性地除去免疫球蛋白。另一种类型的常见的原料是工业上生产的细胞培养上清，其中单克隆抗体以高达5g/l上清的浓度而存在。例如II的化合物还可用于从这些混合物中特异性地除去单克隆抗体，尽管已知其性能因细胞培养添加剂(比如普流尼克F-68(PluronicF-68))的存在而受到影响。普流尼克F-68是哺乳动物细胞培养中常用的消泡剂。其为聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物，分子量为约8000道尔顿。普流尼克F-68用于保护细胞免受剪切和气泡的损伤，通常以量为1g/L用于细胞培养上清中。其存在可降低或消除例如II的化合物除去这些原料中的免疫球蛋白的能力，这代表了利用这些配体从哺乳动物细胞培养基中直接捕获单克隆抗体的相当大的障碍。
发明内容出乎意料地，发现某些化合物(其中许多均是新的)甚至在存在化合物比如普流尼克F-68的情况下可用于免疫球蛋白(包括但不限于单克隆抗体和抗体片段)的基于亲和力的纯化。用于本发明的化合物是式III的化合物其中A是H、烷基、芳基、羟烷基、环己基、氨基或杂环基，例如萘基、l-苯基吡唑、吲唑、苯并噻唑、苯并嗯唑或苯并咪唑，其中任一所述芳族基团均可包含另一个稠合的环并且可被烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、酰氨基、氨基、OH、C02H、磺酰基、氨基曱酰基、氨磺酰基、烷基磺酰基和卣素中的一个或多个所取代；一个X是N，另一个X是N、C-C1或C-CN;Y是O、S或NR2;Z是O、S或NRs;R2和R3各自是H、烷基、羟烷基、苄基或p-苯基乙基；Q是苯、萘、苯并噻唑、苯并嗯唑、l-苯基吡唑、吲唑或苯并咪唑；R4、Rs和R6各自是H、OH、烷基、芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、氨基、酰氧基、酰氨基、C02H、磺酸、氨基甲酰基、氨磺酰基、烷基磺酰基或卣素，或者R4、Rs和R6中的两个或多个相连接形成环状结构；U和V是相同或不同的d-K)直链亚烷基，其任选地被羟基、烷基、芳基、羟烷基、p-苯基乙基和卣素中的一个或多个所取代，比如CHOH;以及A是任选地通过间隔基连接到含有X的环上的载体基质。此外，本发明的化合物包括对应的配体，其中A被直接或间接与三唤环相连的官能团所替代，所述官能团可被固定到载体基质上。在下文中，术语"配体"和"吸附剂"可互换使用。实施方式WO97/10887、WO00/67卯0和WO003/097112公开了如何在固体栽体上构建配体组合文库。它们的公开内容(包括与本发明共同的实施方案和方法的实施例)通过参考并入本文。在利用含有白蛋白、免疫球蛋白和普流尼克F-68的原料筛选一套这些组合文库的过程中，多种配体被鉴定为能够选择性结合和洗脱免疫球蛋白。可通过本领域技术人员公知的方法制备用于本发明的式III化合物。这些方法描述于上述的3篇PCT公开文献中；可容易地采用它们来制备新化合物。在用于本发明的化合物中，优选&和/或QR4R5R6是环状结构或者包含环状结构；任一个或每个环状结构优选具有OH或S03H取代基。优选地，每个X均是N。另夕卜，优选U和/或V被取代，例如是CHOH。这些被取代的化合物均是新的。本发明优选的结合免疫球蛋白的配体或吸附剂是式IV-XIII的那些<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>本文中所述的结合免疫球蛋白的配体可用于从复杂混合物中纯化免疫球蛋白，所述复杂混合物包括但不限于人血浆和重组发酵上清。下述实施例2中利用多种原料通过色镨实验证实了该实用性。本文中使用术语"免疫球蛋白"来描述完整的免疫球蛋白本身(包括IgG、IgA、IgM和IgE)以及具有免疫球蛋白的功能或结构特性(例如根据与本文中所述给定化合物的亲和力)的类似物。因此，分析物可以是作为免疫球蛋白的功能片段的蛋白质，或具有一个、多个或全部相同结合位点的结构类似物，或融合蛋白。任选的连接子可包括将本发明的配体与载体基质相连接并使所述配体与所述载体基质表面间隔开的任何方式。所述载体基质可包含任何材料，可溶性或不溶性的、颗粒或非颗粒(包括纤维和膜)、多孔或非多孔的。其提供了一种将本发明的配体从接触溶液的溶质中分离出来的便利方法。载体基质和任选的连接子A的实例包括碳水化合物基质(比如琼脂糖、纤维素、葡聚糖、淀粉、藻酸盐或角叉菜胶)、合成聚合物基质(比如聚苯乙烯、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、聚曱基丙烯酸酯(例如聚(羟乙基甲基丙烯酸酯))、聚乙烯醇、聚酰胺或全氟化碳)、无机基质(比如玻璃、二氧化硅或金属氧化物)以及复合材料。以下实施例举例说明本发明。实施例1-吸附剂的合成所述类型吸附剂的合成在WO97/10887、WO00/67卯0和WO003/097112中做了i兌明。描述了吸附剂XI的合成，该合成具有代表性。将6%交联PuraBead琼脂糖凝胶(650g，置于RO水中)与RO水(650mL)、10M氢氧化钠(NaOH)(88mL)和表氯醇(124mL)一起调浆。搅拌所述浆19小时以上。然后再加入10M氢氧化钠(NaOH)(22mL)、表氯醇(37mL)，并搅拌所述浆1.5小时以上。在取出样品供分析后，过滤浆，然后以RO水(12xlL)洗涤。环氧基的分析表明每g已沉降凝胶被21.6nmol环氧基衍生化。在加入RO水(780mL)和0.88比重的氨水溶液(200mL)之前将所述凝胶的溶剂排空。将混合物搅拌并加热至40'C，然后在此温度下搅拌16小时以上。在取出样品供分析后，过滤浆，然后以12xlLRO水洗涤(12xlL)。胺基的TNBS分析表明每g已沉降凝胶被20.8nmol胺基衍生化。将已沉降的胺化凝胶(475g)在1M磷酸钾(475mL)中调浆并使之沉降。然后加入1M磷酸钾(140mL),剧烈搅拌混合物，加入丙酮(70mL)。在一次性地全部加入在冷丙酮(120mL)中的氰尿醜氯(11.9g)之前，将混合物在冰盐浴中冷却至0'C。将浆在0-4。C搅拌1小时以上，之后排水，然后用50%v/v丙酮水溶液(5x500mL)、RO水(5x500mL)、50%v/v丙酮7JC溶液(5x500mL)和RO7JC(10x500mL)洗涤。分析表明每g已沉降凝胶上连接了25nmol二氯三嗪基。将二氯三溱基琼脂糖(50g)在RO水(55mL)中调浆。将盐酸去甲苯福林(1.99g)溶于RO水(15mL)中，加入10MNaOH(0.95mL)，在将所述混合物加入到二氯三溱基琼脂糖中之前，在冰上冷却混合物。使混合物在60'C反应19小时以上。在将凝胶贮存于冷室中20%乙醇水溶液中之前，用50%DMF(5x100mL)、ROK(5x100mL)、0.1MHC1(5x100mL)、30%IPA/0.2MNaOH(5x100mL)、RO水(10x100mL)、和20%乙醇水溶液(3x100mL)洗涤凝胶。实施例2-色镨法利用表l中列出的每种吸附剂进行色谱实验。对所有实验来说，使用床高5.5cm、柱体积(CV)4.3mL、直径1cm的柱，其中线性流速为300cm/小时。最初用10CV的pH7.4的磷酸盐緩冲盐水(PBS)平衡吸附剂，然后负载下述样品纯IgG、IgG原料1(1g/LIgG、1g/L普流尼克F-68、以及其它蛋白质以模拟细胞培养上清)或IgG原料2(1g/LIgG、1g/L普流尼克F-68并含有5%胎牛血清)、或浓度高达30g/L吸附剂的鼠IgGi原料。然后在用5CVpH3.5的50mM柠檬酸洗脱IgG之前，用10CVpH7.4的PBS洗涤吸附剂。然后将吸附剂用5CV0.5M氢氧化钠进行原位清洗(CIP)，然后用7CVpH7.4的PBS进行重新平衡。在色镨实验后，通过浊度法、A280、HPLC或GPC评价负载物(load)、负载后洗涤液、洗脱液和CIP级分中的IgG含量以评价结合能力和洗脱能力，通过SDSPAGE分析以评价纯度。结合能力和洗脱能力归纳于表l中。纯IgG原料在pH7.4的PBS中含有1g/L多克隆IgG，并且存在或不存在1g/L普流尼克F-68。模拟品原料1含有在CHO细胞培养基中的1g/L多克隆IgG、1g/L马肌红蛋白、5g/L人血清白蛋白和1g/L普流尼克F-68。模拟品供料原料2含有在CHO细胞培养基中的1g/L多克隆IgG、5%胎牛血清和1g/L普流尼克F-68。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>洗脱緩沖液50niMpH3.5的柠檬酸,含有30%乙二醇和Na('l为评价所述材料的纯化能力，还研究了吸附剂XI的色镨性能。使用床高2.5cm、柱体积(CV)2.0mL、直径1cm的柱完成实验，其中线性流速为50cm/小时(保留时间3分钟)。最初用10CVpH7.4的磷酸盐緩冲盐水(PBS)平衡吸附剂。向柱上加载60mL在CHO(中国仓鼠卵巢)细胞培养上清中的IgGi至浓度为54g/L吸附剂。然后在用5CVpH3.0的50mM杼檬酸钠洗脱IgG之前，用10CVpH7.4的PBS洗涤吸附剂。然后将吸附剂用5CV0.5M氢氧化钠进行原位清洗(CIP),然后用7CVpH7.4的PBS进行重新平衡。在整个色语过程中收集级刺2mL)并分析IgG含量(蛋白AHPLC)、DNA含量(Picogreen分析)和总蛋白质(Bradford总蛋白质测定)。IgG!对吸附剂XI的突破曲线(breakthroughprofile)表明结合能力为21.6g/L，洗脱能力为20.9g/L。利用凝胶渗透色谱，被洗脱的IgG的纯度测定为92.8%，吸附剂XI的DNA清除率为2个对数级。利用吸附剂XI，使用通过酶(胃蛋白酶)消化而制备的抗体片段完成色谱实验。胃蛋白酶是仅在酸性PH下有活性而在中性或碱性pH下则不可逆地变性的非特异性内肽酶。胃蛋白酶消化导致形成一个F(ab，)2片段和Fc片段的几个小肽。通过使IgG与胃蛋白酶在pH4.0下于37。C接触1小时而制备人、绵羊和牛多克隆抗体的片段(混合的抗体群)。通过调节pH到7.0以上而停止消化，通过凝胶过滤分离F(ab，)2片段。研究吸附剂XI的色镨性能以评价用于抗体片段的材料的纯化能力。使用床高2.511、柱体积(CV)2.0mL、直径1cm的柱完成实验，其中线性流速为50cm/小时(保留时间3分钟)。最初用10CVpH7.4的磷酸盐緩冲盐水(PBS)平衡吸附剂。每mL吸附剂负栽约20mgF(ab，)2片段。然后在用5CVpH3.0的50mM柠檬酸钠洗脱所述片段之前，用10CVpH7.4的PBS洗涤吸附剂。然后将吸附剂用5CV0.5M氢氧化钠进行原位清洗(CIP)，然后用7CVpH7.4的PBS进行重新平衡。所有实验的对照均是蛋白质L吸附剂(使用与吸附剂XI相同的实验条件)。收集来自色镨柱的每个级分并利用Western印迹技术进行分析。该技术表明吸附剂XI与人的k和X轻链以及绵羊和牛的F(ab，)2片段结合；蛋白质L仅与人的k轻链结合而不与绵羊和牛的片段结合。权利要求1.亲和吸附剂用于蛋白质物质的分离、去除、离析、纯化、表征、鉴定或定量的用途，其中所述亲和吸附剂是式III的化合物其中R1是H、烷基、芳基、羟烷基、环己基、氨基或杂环基，其任选地被烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、酰氨基、氨基、OH、CO2H、磺酰基、氨基甲酰基、氨磺酰基、烷基磺酰基和卤素中的一个或多个所取代；一个X是N，另一个X是N、C-Cl或C-CN；Y是O、S或NR2；Z是O、S或NR3；R2和R3各自是H、烷基、羟烷基、苄基或β-苯基乙基；Q是苯、萘、苯并噻唑、苯并噁唑、1-苯基吡唑、吲唑或苯并咪唑；R4、R5和R6各自是H、OH、烷基、芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、氨基、酰氧基、酰氨基、CO2H、磺酸、氨基甲酰基、氨磺酰基、烷基磺酰基或卤素，或者R4、R5和R6中的两个或多个相连接形成环状结构；U和V是相同的或不同的C1-10直链亚烷基，其任选地被羟基、烷基、芳基、羟基烷基、β-苯基乙基和卤素中的一个或多个所取代；并且A是任选地通过间隔基连接到含有X的环上的载体基质。2.权利要求l的用途，其中&和/或QR4RsR6是环状结构或者包含环状结构。3.权利要求2的用途，其中任一个或每个环状结构具有OH或S03H取代基。4.根据前述权利要求中任一项的用途，其中U和V中任一个或每一个是CHOH。5.根据前述权利要求中任一项的用途，其中每个X均是N。6.权利要求l的用途，其中所述吸附剂是式III化合物。7.权利要求l的用途，其中所述吸附剂是式IV化合物。8.权利要求l的用途，其中所述吸附剂是式V化合物。9.权利要求l的用途，其中所述吸附剂是式VI化合物。10.权利要求l的用途，其中所述吸附剂是式VII化合物。11.权利要求l的用途，其中所述吸附剂是式VIII化合物。12.权利要求l的用途，其中所述吸附剂是式IX化合物。13.权利要求l的用途，其中所述吸附剂是式X化合物。14.权利要求l的用途，其中所述吸附剂是式XI化合物。15.根据前述权利要求中任一项的用途，其中所述蛋白质物质是免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或蛋白质。16.权利要求15的用途，其中所述物质是单克隆抗体。17.权利要求15的用途，其中所述物质是选自Fab、Fab，、F(ab，)2、scFV、二聚体抗体、微型抗体、三聚体抗体和四聚体抗体片段的免疫球蛋白片段。18.根据前述权利要求中任一项的用途，其中所述蛋白质物质处于细胞培养物中。19.根据前述权利要求中任一项的用途，其中所述蛋白质物质与消泡剂相联合。20.权利要求19的用途，其中所述消泡剂是聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物。21.如权利要求1至14中任一项所定义的式III化合物，其中U和/或v被取代。22.权利要求21的化合物，其中所述取代基是OH、芳基或卤素。23.权利要求21的化合物，其中U和/或V是CHOH。全文摘要本发明描述了亲和吸附剂用于蛋白质物质的分离、去除、离析、纯化、表征、鉴定或定量的用途，其中所述亲和吸附剂是式(III)的化合物，其中R₁是H、烷基、芳基、羟烷基、环己基、氨基或杂环基，其任选地被烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、酰氨基、氨基、OH、CO₂H、磺酰基、氨基甲酰基、氨磺酰基、烷基磺酰基和卤素中的一个或多个所取代；一个X是N，另一个X是N、C-Cl或C-CN；Y是O、S或NR₂；Z是O、S或NR₃；R₂和R₃各自是H、烷基、羟烷基、苄基或β-苯基乙基；Q是苯、萘、苯并噻唑、苯并噁唑、1-苯基吡唑、吲唑或苯并咪唑；R₄、R₅和R₆各自是H、OH、烷基、芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、氨基、酰氧基、酰氨基、CO₂H、磺酸、氨基甲酰基、氨磺酰基、烷基磺酰基或卤素，或者R₄、R₅和R₆中的两个或更多个相连接形成环状结构；U和V是相同的或不同的C_1-10直链亚烷基，其任选地被羟基、烷基、芳基、羟基、烷基、β-苯基乙基和卤素中的一个或多个所取代；以及A是任选地通过间隔基连接到含有X的环上的载体基质。文档编号C07D251/48GK101415692SQ200780011865公开日2009年4月22日申请日期2007年3月2日优先权日2006年3月2日发明者凯利·莱里克,海伦·塔顿,詹森·理查德·贝特利,马修·韦布申请人:普罗米蒂克生物科学有限公司