专利名称：一种提取橡胶树树皮组织全蛋白的方法
技术领域：
本发明属于植物生物化学领域，涉及一种高效提取橡胶树树皮组织总蛋白的 方法。
背景技术：
-各种生物材料中全蛋白质和可溶性蛋白的提取方法主要包括TCA-丙酮沉淀 法和双乙法，在此基础上，针对特定的样品，由于其性质的特异性，还需要作一 些适当的改进，以便能够采取相应的提取方法，获得高质量的蛋白质样品。植物 树皮组织由于质地坚硬、蛋白质含量低，加之纤维素以及酚类、色素等杂质含量 高，对其进行蛋白质提取存在一定的难度。目前在国内还没有关于植物树皮组织 中全蛋白和可溶性蛋白提取方法的研究报道，即便是在国际上，也还没有较理想 的树皮蛋白提取方法。
发明内容
本发明的目的是从橡胶树树皮组织中高效提取总蛋白，用于开展与橡胶树死 皮机制、砧穗相互作用和乙烯利等激素刺激相关的蛋白质组学研究。一种高效提取橡胶树树皮组织中总蛋白的方法，包括树皮样品采集和预处 理、蛋白质提取和定量等步骤。其特征是1. 树皮样品的采集和预处理选择待采集样品的植株，用锋利的小刀刮去采集部位的树皮周皮，然后将树 皮分割为若干小块，划割深度到木质部；用刀片撬起树皮，并用锡箔纸包住，做 好标记，然后迅速冰浴或者置液氮中，带回实验室。用刀将树皮切成薄片，-70--80 'C保存备用。2. 蛋白质提取采用改进的三氯醋酸(TCA) —丙酮沉淀法(先抽提后沉淀)结合双乙法提取植物树皮组织中的总蛋白。具体操作流程为(1) 将干净研钵、包含10% TCA的丙酮溶液A以及丙酮置于-2(TC冰箱预冷；(2) 称取一定量的树皮样品置于液氮中冷却；(3) 用液氮荡洗研钵卜2次，然后将样品置入研钵中，加入样品的质量的 0. 5y。-2。/。聚乙烯吡咯垸酮(PVPP)，然后加液氮充分研磨树皮样品(约10-30 min)，至细粉末状。将粉末盛装于离心管；(4) 按1:10-20 (w/v)的比例向粉末中加入蛋白抽提液l， w是重量，单位为 克、v是体积，单位是毫升。蛋白抽提液l的pH-8.5，配方为4-7M尿素，0.5-2 M试剂A， 0.5-2 °/。 CHAPS (3-丙磺酸内盐)，0.5-2 °/。两性电 解质载体(pH3. 5-9.5)， 40mMTris (三羟甲基氨基甲烷)，％均为质量百 分比，M为摩尔，mM为毫摩尔。然后加入苯甲基磺酰氟(PMSF)和EDTA (乙二胺四乙酸)，PMSF和EDTA的终浓度均为1-2 mM。涡旋混匀，冰浴 5-10 min;(5) 加入二硫苏糖醇(DTT)至终浓度为10mM，超声5min，室温放置1 h (或 者37'C孵育1 h)，其间不断混匀样品，以充分溶解蛋白；(6) 4-10。C， 30， 000-40， OOOg离心10-30 min，收集上清液；(7) 向上清液中加入相当于5-10倍体积(w/V)的溶液A，再加入PMSF和EDTA， PMSF和EDTA的终浓度均为1-2 mM，涡旋混匀，冰浴5min;加DTT至终 浓度10 mM，超声1 tnin，于-2(TC下静置2-15 h后，4-10。C、30' 000-40， OOOg 离心10-30 min,弃上清得到沉淀A;(8) 沉淀A用冰浴丙酮重悬浮，冰浴丙酮体积是沉淀A的5-10倍，再加入PMSF 和EDTA， PMSF和EDTA的终浓度均为1-2 mM，涡旋混匀，冰浴5 min;加 DTT至终浓度为10 mM，摇匀，于-2(TC下静置0.5-2 h后，4-l(TC、 30， 000-40, 000 g离心10-30 min，弃上清得到沉淀B;(9) 重复步骤8—至两次，得到沉淀C;(10) 取出沉淀C真空干燥或置超净工作台风干(冰浴中)约5-10 min，以除 尽有机溶剂。所得干粉末置-70—8(TC保存备用或接下一步；(11) 按1:10-20 (w/v)的比例向干粉末中加蛋白抽提液2，蛋白抽提液2的 pH=8. 5，配方7-9 M尿素，0.5-4 °/。 CHAPS， 0.5-2 °/。两性电解质载体 (pH 3. 5-9. 5) ， 40 mM Tris，然后加入PMSF和EDTA至终浓度为1-2 mM， 涡旋混匀，冰浴5-10 min;加DTT至终浓度10raM，超声1-5 min，室温 放置l-2 h (或者37'C孵育1-2 h)，其间不断混匀样品，以充分溶解蛋 白，4-10。C、 30, OOOg-40, 000 g离心10-30 min，上清为蛋白溶液A;(12) 向蛋白溶液A中加入TCA粉末至终浓度为12鬼,充分摇匀使TCA溶解，4-10 。C放置30 min-2 h;(13) 4。C、 30, 000-40 , OOOg离心10-30min，得到沉淀D，取沉淀D用4。C预冷 的10-20倍体积样品的乙醇乙醚(1:1)重悬，于-20。C下静置0. 5-2 h;(14) 4'C、 30， 000-40， 000 g离心10-30 min，弃上清；得到沉淀E，取出沉淀 E真空干燥或置超净工作台风干(冰浴)约5-10 rain，以除尽有机溶剂；(15) 按1:5-20 (w/v)的比例，向干粉末中加入蛋白抽提液2，然后加入PMSF 和EDTA至终浓度为1-2 mM,涡旋混匀，冰浴5-10 min;加DTT至终浓度 10幽，超声2-5 min，然后4-1CTC、 30， 000-40'000 g离心10-30 min，上清即为所需的蛋白溶液B;(16) 蛋白溶液B用1.5 mL印pendorf离心管分装，-70—-8(TC保存备用。 3.蛋白质定量采用Bio-rad公司的蛋白质定量试剂盒对所获得的样品进行定量，方法见试 剂盒使用说明书。利用本发明，可以从橡胶树的树皮组织中提取获得高质量和高得率的蛋白质 样品，用于开展与橡胶树死皮机制、砧穗相互作用和乙烯利等激素刺激相关的蛋 白质组学研究。
具体实施方式
以下实施例将对本发明作进一步说明。从橡胶树树皮组织中提取蛋白质样品。其详细步骤为1. 橡胶树树皮样品的采集和预处理选择待采集样品的橡胶树，用锋利的小刀刮去采集部位的树皮周皮，然后将树皮分割为若干小块，划割深度到木质部；用刀片撬起树皮，并用锡箔纸包住， 做好标记，然后迅速冰浴或者是置液氮中，带回实验室。用刀将树皮切成薄片， -8(TC保存备用。2. 蛋白质的提取(1) 将干净研钵、溶液A (包含10% TCA的丙酮溶液)和丙酮置于-2(TC冷却；(2) 称取一定量的样品置于液氮中冷却；(3) 用液氮预冷研钵，然后将样品置入研钵中，加1%的交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)以及少量石英砂，然后加液氮充分研磨树皮样品(约15 rain)， 至细粉末状，将粉末盛装于离心管；(4) 按1:20 (w/v)的比例，向粉末中加入蛋白抽提液1 pH=8. 5、配方6M尿 素，1.5M试齐i」A， 0. 5%CHAPS， 2%两性电解质载体(pH3.5-9. 5)， 40 mM Tris，然后加入苯甲基磺酰氟(PMSF)和EDTA至终浓度分别为1 mM和2 mM,涡旋混匀，冰浴5min;(5) 向上述体系加入二硫苏糖醇(DTT)至终浓度为10 mM，超声5 min， 37 °〇孵育1 h，其间不断混匀样品；(6) 4'C， 35,000 g离心15 min，收集上清液；(7) 向上清液中加入相当于5-10倍体积(w/V)的溶液A，加入PMSF和EDTA 至终浓度分别为1 mM和2 mM，涡旋混匀，冰浴5 min;加DTT至终浓度 10 mM,超声lmin，于-2(TC下静置2 h后，4°C， 35,000 g离心15 min， 弃上清；(8) 沉淀用10倍体积于样品的冰浴丙酮重悬浮，加入PMSF和EDTA至终浓度 分别为1 mM禾卩2 mM，涡旋混匀，冰浴5 min;加DTT至终浓度为10 mM， 摇匀，于-2(TC下静置0. 5h后，4'C、 35,000 g离心10 min，弃上清；(9) 重复步骤8—次；(10) 取出沉淀真空干燥或置超净工作台风干(冰浴中)约5min，以除尽有机 溶剂。所得干粉置-8(TC保存备用或接下一步；(11) 按1:20 (w/v)的比例，向粉末中加蛋白抽提液2 pH=8. 5、配方7 M尿素，2%CHAPS， 0. 5°/。两性电解质载体pH3. 5-9. 5， 40 mM Tris'然后加入 PMSF和EDTA至终浓度分别为1 mM禾n2 mM，涡旋混匀，冰浴5 min;加 DTT至终浓度10 raM，超声5 min， 37。C孵育lh，其间不断混匀样品。4 °C、 35,000 g离心15 min,上清为蛋白溶液A; (12)向蛋白溶液A中加入TCA粉末至终浓度为12%，充分摇匀使TCA溶解，4。C放置30 min-GS) 4'C， 35,000 g离心15 min,取沉淀用4'C预冷的IO倍体积样品的乙醇 乙醚(1:1)重悬，于-20。C下静置0.5 h;(14) 4'C， 30，000 g离心15min，弃上清；取出沉淀置超净工作台风干(冰浴) 5 min，以除尽有机溶剂；(15) 按1:10 (w/v)的比例，向干粉末中加入蛋白抽提液2,然后加入PMSF 和EDTA至终浓度分别为1 mM和2 mM，涡旋混匀，冰浴5 min;加DTT 至终浓度10 raM，超声5 min，然后IO'C、 35,000 g离心15 min，上清 即为所需的样品蛋白溶液B;(16) 蛋白溶液B用1.5 mL印pendorf离心管分装，-8CTC保存备用。 3.蛋白质定量采用Bio-rad公司的蛋白质定量试剂盒对所获得的样品进行定量，方法见试 剂盒使用说明书。
权利要求
1.一种高效提取橡胶树树皮组织中总蛋白的方法，包括树皮样品采集和预处理、蛋白质提取和定量，其特征是1)树皮样品的采集和预处理选择待采集样品的植株，用锋利的小刀刮去采集部位的树皮周皮，然后将树皮分割为若干小块，划割深度到木质部；用刀片撬起树皮，并用锡箔纸包住，做好标记，然后迅速冰浴或者置液氮中，带回实验室，用刀将树皮切成薄片，-70--80℃保存备用；2)蛋白质提取采用改进的三氯醋酸-丙酮沉淀法结合双乙法提取植物树皮组织中的总蛋白；具体操作流程为(1)将干净研钵、包含10％TCA的丙酮溶液A以及丙酮置于-20℃预冷；(2)称取一定量的样品置于液氮中冷却；(3)用液氮荡洗研钵1-2次，然后将样品置入研钵中，加入样品的质量的0.5％-2％PVPP，然后加液氮研磨树皮样品10-30min，至细粉末状，将粉末盛装于离心管；(4)按1∶10-20(w/v)的比例向粉末中加入蛋白抽提液1，w是重量，单位为克、v是体积，单位是毫升，蛋白抽提液1pH＝8.5、配方为4-7M尿素，0.5-2M试剂A，0.5-2％CHAPS，0.5-2％两性电解质载体(pH3.5-9.5)，40mM Tris，％均为质量百分比，M为摩尔，mM为毫摩尔；然后加入PMSF和EDTA，PMSF和EDTA的终浓度均为1-2mM，涡旋混匀，冰浴5-10min；(5)加入DTT至终浓度为10mM，超声5min，室温放置1h或者37℃孵育1h，其间不断混匀样品，以充分溶解蛋白；(6)4-10℃，30,000-40,000g离心10-30min，收集上清液；(7)向上清液中加入相当于5-10倍体积(w/V)的溶液A，再加入PMSF和EDTA，PMSF和EDTA的终浓度均为1-2mM，涡旋混匀，冰浴5min；加DTT至终浓度10mM，超声1min，于-20℃下静置2-15h后，4-10℃、30,000-40,000g离心10-30min，弃上清得到沉淀A；(8)沉淀A用冰浴丙酮重悬浮，冰浴丙酮体积是沉淀A的5-10倍，再加入PMSF和EDTA，PMSF和EDTA的终浓度均为1-2mM，涡旋混匀，冰浴5min；加DTT至终浓度为10mM，摇匀，于-20℃下静置0.5-2h后，4-10℃、30,000-40,000g离心10-30min，弃上清得到沉淀B；(9)重复步骤8一至两次，得到沉淀C；(10)取出沉淀C真空干燥或置超净工作台风干5-10min，以除尽有机溶剂；所得干粉末置-70-80℃保存备用或接下一步；(11)按1∶10-20(w/v)的比例向干粉末中加蛋白抽提液2，蛋白抽提液2pH＝8.5、配方7-9M尿素，0.5-4％CHAPS，0.5-2％两性电解质载体、pH3.5-9.5，40mM Tris，然后加入PMSF和EDTA至终浓度为1-2mM，涡旋混匀，冰浴5-10min；加DTT至终浓度10mM，超声1-5min，室温放置1-2h或者37℃孵育1-2h，其间不断混匀样品，以充分溶解蛋白，4-10℃、30,000g-40,000g离心10-30min，上清为蛋白溶液A；(12)向蛋白溶液A中加入TCA粉末至终浓度为12％，充分摇匀使TCA溶解，4-10℃放置30min-2h；(13)4℃、30,000-40,000g离心10-30min，得到沉淀D，取沉淀D用4℃预冷的10-20倍体积样品的乙醇∶乙醚(1∶1)重悬，于-20℃下静置0.5-2h；(14)4℃、30,000-40,000g离心10-30min，弃上清；得到沉淀E，取出沉淀E真空干燥或置超净工作台风干5-10min，以除尽有机溶剂；(15)按1∶5-20(w/v)的比例，向干粉末中加入蛋白抽提液2，然后加入PMSF和EDTA至终浓度为1-2mM，涡旋混匀，冰浴5-10min；加DTT至终浓度10mM，超声2-5min，然后4-10℃、30,000-40,000g离心10-30min，上清即为所需的蛋白溶液B；(16)蛋白溶液B用1.5mL eppendorf离心管分装，-70--80℃保存备用；3)蛋白质定量采用Bio-rad公司的蛋白质定量试剂盒对所获得的样品进行定量。
全文摘要
本发明属于植物生物化学领域，涉及一种从橡胶树树皮组织中提取蛋白质样品的方法。特点是采用改进的三氯醋酸(TCA)-丙酮沉淀法(先抽提后沉淀)结合双乙法提取植物树皮组织中的全蛋白，不仅可以提高样品的得率，还可以有效去除酚和色素等杂质。本发明可以为与树皮有关的研究提供高质量的蛋白质样品。
文档编号C07K1/14GK101274955SQ200810007660
公开日2008年10月1日 申请日期2008年3月4日 优先权日2008年3月4日
发明者曹建华, 杨礼富, 林位夫, 王真辉, 坤 袁 申请人:中国热带农业科学院橡胶研究所