专利名称：可结合血管内皮细胞生长因子及胎盘生长因子的重组蛋白及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术-重组基因工程领域。本发明报道了三种可结合血管内皮细胞生长 因子(VEGF)及胎盘生长因子(PLGF)的重组蛋白制备方法及其应用。
背景技术：
血管增生或新生(angiogenesis)是指体内的已存在的血管(如毛细血管和小静脉)通 过出芽或分裂的方式而产生新的血管的过程。血管新生在维持机体的许多正常的生理过程 如组织胚胎发育、外伤伤口的癒合与修复等是有益的和必需的。但过度的血管新生或增生 也与许多病理变化(如肿瘤的增生扩散，炎症反应等)息息相关。体内的血管能够不断地 增生与增长的关键是其内衬的血管内皮细胞具有不断分裂增生及定向迁移置入已有的血管 管壁的能力。血管内皮细胞的增生受体内正(即刺激血管增生)、负(即抑制血管增生) 两大方面因子的调控。其中正面调控血管内皮细胞增生的最为重要的因子是血管内皮细胞 生长因子(vascular endothelial growth factor-A，以下简称VEGF-A或VEGF)及胎盘 生长因子(placental growth factor,以下简称PLGF)。
VEGF及PLGF通过与其表达在血管内皮细胞上的特异受体的结合而介导出刺激血管内 皮细胞分裂及增生的活性(Leung DW等Science 1989， 246:1306;Keck PJ等Science, 1989,246:1309)。目前已知的血管内皮细胞生长因子的受体主要有三种即VEGFR1 (fms-like tyrosine kinase, 简称FLT-1) (Shibuya M等Oncogene, 1990， 5:519; De Vries等Science 1992， 255: 989) ;VEGFR2 (Kinase-insert Domain Rec印tor， 简称 KDR;在小鼠中称为Flk-1) (Terman BI等Biochem Biophys Res Commun 1992， 187: 1579-1586)和VEGFR3 (简称FLT_4)。 VEGF/PLGF的受体在结构上很相似，均为I型跨细 胞膜糖蛋白，由一含7个免疫球蛋白样结构的胞外区， 一个膜穿透区及一含2个酪氨酸激 酶的膜内区组成。其中的胞外免疫球蛋白样结构区是维持VEGF受体与其配体VEGF高度结 合的关键部位(Davis-Smyth T等EMB0J， 1996,15:4919; Fuh G等J Biol Chem， 1998, 273, 11197)。除了表达在细胞膜上的受体之外，体内还存在有另一种以可溶性蛋白形式 流离于细胞外间质的VEGF受体(Kendall RL and Thomas KA 1993 (Kendall RL and Thomas
5KA Proc Natl Acad Sci USA, 1993， 90: 1070)。该类可溶性VEGF受体为截短的VEGF 受体即只含胞外免疫球蛋白样结构区，而不含穿膜区及膜内酪氨酸激酶区。与完整的膜 上VEGF受体一样，截短的可溶性VEGF受体保留有与VEGF/PLGF高度结合的生物活性。但 与完整的膜上VEGF受体不同的是:截短的可溶性VEGF受体由于其不含酪氨酸蛋白激酶区， 故在与VEGF/PLGF结合后， 一般不会介导出刺激血管内皮细胞分裂及血管新生的活性。相 反的，截短的可溶性VEGF受体更会通过与表达在细胞膜上的完整的VEGF受体竞争结合 VEGF/PLGF,进而抑制VEGF/PLGF及其受体介导的促血管增生。
但体内流离的VEGF/PLGF受体表达水平一般很低，故难以提取与分离到足够量的天然 的VEGF/PLGF受体蛋白以作为药物及研究之用。而以基因工程及细胞培养或细菌发酵技术 在体外大量表达生产重组的VEGF/PLGF受体蛋白则是解决该问题的理想方案。但鉴于 VEGF/PLGF受体富含二硫键(S—S)结构，而二硫键对维持其三级结构及生物学活性起重要 作用，故药物之用的重组VEGF/PLGF受体的表达以采用真核细胞中分泌性表达系统最为理 想。常用的真核表达宿主细胞包括:哺乳动物细胞、昆虫细胞及酵母细胞等，而其中的酵母 细胞(節如/Vc^'a/^toris(毕赤巴斯德酵母)由于兼有原核细胞的生长快速、培养方 便经济、生产成本低廉,及真核细胞的对表达产物的加工修饰的双重^t点，近年来已发成为 工业化大规模表达生产重组基因蛋白的最理想宿主。
在酵母中表达可溶性VEGF/PLGF受体已见有个别报导。如马骊等在2001年报导了利 用聚合酶链反应(PCR)技术，扩增出Fit-1受体胞外区2-3 lo叩基因片段，并克隆于 pastor's酵母载体中及转化酵母宿主，再经筛选多拷贝整合转化子、及在1%甲醇 诱导下摇瓶培养表达,获得了具有生物活性的重组可溶性Flt-1受体胞外区2-3 loop蛋白 (与騵筝.'乂ii^皮潘應f长尿f "f-7^沐應游^" 7oo/ 吝A'c力ia pa"orys摩母 W游表这i ,主激学薪丝欲究.^腐」旁茇学染,吉^^东第77巻,第< 燕必页J 。但 该文献中报导的重组Fit-1受体由于不含对保持双聚体蛋白结构所需的受体胞外区的第 4-loop片段，故其分泌表达的重组Flt-l受体蛋白只是以单体形式存在。而已有的研究资 料表明，以单体形式存在的VEGF/PLGF受体蛋白(包括其截短的可溶性受体)其与 VEGF/PLGF的亲合结合强度比其相应的双聚体的受体蛋白要低近十倍。
为了克服单体VEGF/PLGF受体蛋白存在的与其配体的低亲合结合的缺陷,本发明采用基因工程与蛋白质工程技术的方法，制备出三种新的以双聚体形式存在的重组可溶性 VEGF/PLGF受体蛋白。这三种重组蛋白的共同特征是其N-端中含有VEGF/PLGF受体的胞膜 外免疫球蛋白样结构区，而其C-端的最后2至20个氨基酸序列中含有至少一对由pro(脯 氨酸)及cys(半胱氨酸)相邻排列的俩氨基酸。由于C-端的cys氨基酸的存在与作用，细 胞分泌表达的这三种重组蛋白 一般以双聚体形式存在于表达上清中的。这种以双聚体形式 存在的重组可溶性VEGF/PLGF受体蛋白，保持有与VEGF及PLGF高度亲合力结合的生物活 性，在实验研究及血管增生相关疾病的临床诊治上具有广泛的用途。
发明内容
本发明的一大目的是公开了三种新的以双聚体形式存在的重组可溶性VEGF/PLGF受体 蛋白。这三种重组蛋白的共同特征在于该类重组蛋白的N-端中含有VEGF受体的胞膜外免 疫球蛋白样结构区，而其C-端的最后2至20个氨基酸序列中含有至少一对由pro及cys 相邻排列的俩氨基酸。由于C-端的cys氨基酸的存在与作用，这三种重组蛋白一般以双聚 体形式存在于表达细胞分泌表达上清中。
这三种重组蛋白的结构特征描述如下
1) .重组蛋白F2F3-PC，其结构如图一所示。该蛋白为由相同的俩个单体蛋白通过其C-端的cys形成的二巯键而形成双聚体，其中每一单体蛋白的N-端含有VEGF受体Fit-1的胞 膜外结构区中的第2及第3免疫球蛋白样胞结构区；
2) .重组蛋白F2K3-PC,其结构如图二所示。该蛋白为由相同的俩个单体蛋白通过其C-端的cys形成的二巯键而形成双聚体，其中每一单体蛋白的N-端含有VEGF受体Flt_l的胞 膜外结构区中的第2及VEGF受体KDR的胞膜外第3免疫球蛋白样结构区；
3) .重组蛋白F2F3-PC/F2K3-PC)，为由重组蛋白单体F2F3-PC与重组蛋白单体 (F2K3-PC)构成的异源双聚体，其结构如图三所示。
本发明的另一大目的是公开了制备这三种以双聚体形式存在的重组蛋白的方法。其特 征在于这三种蛋白都是以重组基因工程与细胞或细菌培养的方法而表达生产。其歩骤包括:1) 利用聚合酶链反应(PCR)技术扩增出编码VEGF的两个最主要受体Fit-1及KDR的胞 膜外结构区；
2) 将含有该类胞膜外结构区的基因片段插入到相应的表达载体，获得重组表达载体；
3) 再通过基因转染将表达载体转入真核宿主细胞(宿主细胞包括但不限于如酵母细 胞、哺乳动物细胞如CHO、 293细胞等)；
4) 筛选与扩增重组基因表达阳性的细胞，并收集培养上清液及细胞裂解液
5) 收集的培养上清液/细胞裂解液上样至层析柱,分离提取重组蛋白。
本发明还涉及对分离提取的重组蛋白进行体外非放射性化学偶联标记处理的方法。
本发明的另一大目的是公开了这三种重组蛋白(包括化学偶联标记的或未标记的)在实 验研究及临床诊治上的应用。这三种重组蛋白可单个的或组合在一起使用，以发挥其中和 吸附VEGF/PLGF的作用。
本发明的具体内容如下
1 。编码本发明中的三种重组蛋白的基因克隆扩增及其表达载体的构建。
编码本发明中的重组蛋白的基因克隆扩增及其表达载体的构建的具体技术与操作方法
可参见《分子克隆》等书。其中本发明中的F2F3-PC及F2K3-PC蛋白中的VEGF/PLGF受 体结合区的Flt-l的胞膜外结构区可采用RT-PCR方法从健康人外周细胞中克隆扩增获得。 用于PCR的上、下游引物可参照已报道的Flt-1/KDR胞膜外结构区核苷序列体外合成。
克隆获得的VEGF受体上的免疫球蛋白样结构区基cDNA基因经限制性内切酶酶切处 理，再用T4连接酶将其定向插入到表达载体中并将其定向插入到相应的表达载体，从而获 得含重组基因的表达载体。其中可用于表达生产这三种重组蛋白的宿主细胞包括但不限于 如酵母细胞、哺乳动物细胞如CHO、 293细胞等)或原核细胞等。但鉴于重组蛋白具有含 二硫键(S—S)及糖基等结构，其表达生产策略将以在真核细胞中的分泌性表达最为理想。可 用于真核细胞表达的载体包括如pcDNA3. 1 (Invitrogen)，逆转录病毒载体pLXSN (Clonetech)载体，腺病毒(双链DNA)及"c力ia.(毕赤巴斯德酵母)载体等。该类表达载体的特征是包括真核细胞表达启动子/增强子hCMV启动子、5' LTR及polyA等序列在内。细胞分泌表达蛋白的另一大优点是合成的蛋白可集聚于细胞培养液中，便于回收分离。保证蛋白在真核细胞分泌性表达的一大关键因素是需要一段信号肽(signalp印tide)以引导新合成的蛋白质穿透过细胞内质网，并最终分泌到细胞外间质。编码信号肽的基因可来自于VEGF受体基因，免疫球蛋白基因，或其他外源基因如IL-2等基因。
2. 重组蛋白的表达
本发明中的重组蛋白的表达生产以在真核细胞中的分泌性表达为理想，其中尤以在尸ic力ia.pastorA (毕赤巴斯德酵母)中表达最为理想。保证F2F3-PC或F2K3-PC蛋白在真核细胞如酵母细胞中高效稳定表达的关键因素是1)高效地将表达载体转入细胞内2)筛选与扩增出带多拷贝F2F3-PC或F2K3-PC基因的细胞株(克隆)。其中在本发明中，采用电转化(即电穿孔法)将VEGF表达载体转入真核酵母细胞中。电转化的仪器可采用Bio-Rad公司的Gene pusler进行。2F3-PC及F2K3-PC蛋白在电转化后酵母细胞的表达量与F2F3-PC及F2K3-PC基因在宿主染色体中整合的拷贝数正相关。而在表达质粒载体转化后的酵母细胞获得了对G418的抗性，其抗药能力与表达质粒在酵母菌染色体中的拷贝数正相关。因此可通过筛选对G418具有高抗药性的克隆得到高表达目的基因的菌株。
在获到含多拷贝F2F3-PC或F2K3-PC基因的酵母细胞株后，挑取数个克隆用于诱导表达F2F3-PC或F2K3-PC蛋白。诱导表达在摇床培养中进行，以1%甲醇诱导。在诱导表达2-3天，收集酵母细胞培养上清液，离心后，再以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegel electrophoresis, PAGE)及免疫印迹试验或ELISA方法定量检测。经分析鉴定证明F2F3-PC或F2K3-PC蛋白表达高度阳性的细胞株再扩增培养，并收集培养上清液。收集的培养液用于分离提取重组蛋白。
3. 重组蛋白的分离提纯
本发明的重组蛋白F2F3-PC或F2K3-PC的分离提纯可采用免疫亲和层析或其他层析方法。如用免疫亲和层析柱来分离提取该类重组蛋白，可采用的层析柱填冲物包括但不限于:偶联抗人VEGF受体的抗体或VEGF蛋白(如重组VEGF165蛋白等)的粒株(如S印harose4B)。
9以免疫亲和层析分离提取F2F3-PC或F2K3-PC蛋白的操作步骤包括
1) 取收集的细胞培养上清液，经离心及以滤膜过滤后，将滤液上样至亲合层析柱，重组蛋白F2F3-PC或F2K3-PCVEGF蛋白由于与抗VEGF受体的抗体或VEGF蛋白的非共价耦联，被特异吸附于亲合层吸柱中；
2) 上样完毕后，先以PBS洗脱去除杂蛋白，再以低pH甘氨酸液洗脱层吸柱，并同时收集被洗脱下的蛋白；
3) 收集的样品经调节pH至中性，再对PBS透析后即获得纯化的F2F3-PC或F2K3-PC重组蛋白；
4) 纯化的F2F3-PC或F2K3-PC重组蛋白再经进一步的理化鉴定实验。鉴定实验包括SDS-PAGE/考马斯亮蓝染色；免疫印迹/ELISA试验；与VEGF蛋白的特异结合试验等。
4.重组蛋白的体外化学标记处理
本发明的另一大内容是对纯化的重组蛋白体外非放射性化学偶联标记处理。可用于化学标记蛋白的常用标记物包括各种酶(辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，葡萄糖氧化酶，微过氧化物酶)；荧光素(异硫氰酸荧光素(FITC);生物素-抗生物素及胶体金等；在本发明中，用于体外化学偶联标记VEGF蛋白的首选标记物是生物素(Biotin)。
生物素是一种小分子量的维生素，它与亲和素(avidin，又名卵白素)及亲和素样蛋白质具有很高的结合能力。通过适宜的方法，生物素可以偶联到许多蛋白质，并不改变蛋白原有的生物学活性。生物素标记蛋白的原理是生物素通过《=0基与蛋白/多肽N末端的a氨基或赖氨酸残基的e氨基连接反应而形成稳定的胺酰键。生物素标记的蛋白可与亲和素形成高度亲合、专一稳定结合，可用于ELISA、 dot-blot或Western-blot等许多试验。一个蛋白质通常包括多个可标记位点，包括氨基端的伯氨基以及赖氨酸侧链上的伯氨基。而生物素标记蛋白质的效果或效率高低则取决于蛋白质的大小、蛋白质表面伯氨基的分布以及生物素标记试剂的使用量。通常情况下，等量的蛋白质在低浓度条件下标记比在高浓度条件下标记所费的试剂多很多倍。在本发明中，可根据目的蛋白的浓度和分子量，对反应的摩尔比进行优化，计算所需标记试剂的量，获得理想的标记效果。
105. 重组蛋白的体外生物活性测定
本发明的重组蛋白的一大特征是保持有与VEGF/PLGF相特异结合的生物活性。其中一 种鉴定重组蛋白与VEGF/PLGF特异结合的方法如下先以含VEGF或PLGF基因的表达载体 转染入哺乳动物细胞如CHO细胞，24-48 h后，转染的CHO细胞经lx PBS液漂洗及以固定 后，分别加入生物素标记的的F2F3-PC或F2K3-PC重组蛋白或阴性对照蛋白，25° C孵育 1-2h，以PBS液洗脱，再加入酶(如辣根过氧化物酶HRP)标记的亲和素(avidin)， 25° C孵育1-2 h，再以PBS液洗脱，然后加入显色液，室温至显色，于显微镜下观察显色结 果。如加入重组蛋白的孔有显色阳性的细胞，而加入对照蛋白的孔里细胞应无显色，证明 重组蛋白保持有与VEGF相特异结合的生物活性。
重组蛋白与VEGF/PLGF的结合活性还可通过与1251标记或biotin标记的VEGF/PLGF蛋 白的直接结合实验而测定。如以biotin标记的VEGF/PLGF蛋白来测定为例先用重组蛋 白包被96孔ELISA板，4"C过夜，经lx PBS液漂洗及2% BSA液室温封闭l 2h后，分别加 入含不同浓度biotin标记的VEGF/PLGF, 4° C孵育1-2 h;经PBS液洗脱后，再加入辣根 过氧化物酶标记的Avidin， 4° C孵育l -2 h;PBS液洗脱后，加入显色液，室温至显色， 再以酶联免疫仪测定特定波长处各孔的吸光值。根据测定0D值可判定重组蛋白与 VEGF/PLGFF的结合活性。
6. 重组蛋白用于体内外吸附及分离VEGF/PLGF表达阳性细胞与组织
本发明的重组蛋白(未标记的或生物素标记处理的)可应用于体内外吸附与分离 VEGF/PLGF表达阳性的细胞与组织。如用重组蛋白F2F3-PC体外吸附分离VEGF表达阳性 的细胞与组织为例，可先将重组蛋白F2F3-PC吸附在适当的固相载体上(固相载体包括如 细胞培养板，细胞培养皿，硝酸纤维素膜等)，再加入含VEGF表达阳性的细胞或组织，4 ° C孵育1-2 h，再以lx PBS液洗脱，即达到吸附与分离VEGF表达阳性细胞或组织成分 的目的。
而如用生物素标记的重组蛋白F2F3-PC体外吸附分离VEGF表达阳性的细胞或组织，其 步骤包括
l)先将亲和素(avidin)吸附在适当的固相载体上(如细胞培养板、细胞培养皿、硝酸
11纤维素膜或尼龙膜等)；
2) 在固相载体上滴加含牛血清白蛋白(BSA)的封闭液，温育l-2小时；
3) 用PBS洗涤，在固相载体上滴加生物素偶联标记的重组蛋白F2F3-PC，温育1-2小时；
4) 再加入细胞或其他样品，于室温温育1-2小时；
5) 用PBS洗涤后，获得被吸附的细胞，达到分离吸附VEGF表达阳性细胞或组织的效果。
7.重组蛋白用于拮抗VEGF/PLGF介导的促血管皮细胞增殖作用
本发明的三种重组蛋白因具有与高度特异结合VEGF/PLGF的活性，故可作为药用成分， 用于中和体内的VEGF/PLGF蛋白及拮抗VEGF/PLGF介导的促血管皮细胞增殖的作用。其在 临床上的治疗适应症包括但不限于:各种与血管增生有关的疾病如恶性肿瘤的发生与转移 等。作为药用成分，本发明中的重组蛋白的生产应在符合GMP条件下进行。生产的重组蛋 白经过滤消毒等处理后，在与溶剂(如生理盐水)混合后，可经皮下、肌肉或静脉注射入体 内。注射的挤量应在卜20 mg/Kg体重间。
本发明的三种蛋白在用作VEGF的中和吸附或拮抗剂时，既可单个的独立使用，也可几 种组合在一起使用，以发挥最大的药理/药效作用。
图1为重组蛋白F2F3-PC的同源双聚体结构示意图。
其中的D2及D3分别代表VEGF受体-1 (Flt-1)的胞膜外结构区中的第2及第3免疫球 蛋白样胞结构区(从N-端开始,下同)。
图2为重组蛋白F2K3-PC的同源双聚体结构示意图。
其中的D2及代表VEGF受体-1 (Flt-1)的胞膜外结构区中的第2免疫球蛋白样胞结构 区,K3代表VEGF受体-2 (KDR)的胞膜外结构区中的第3免疫球蛋白样胞结构区。
12图3为重组蛋白F2D3/F2K3-PC的异源双体结构示意图。 图4为ELISA法检测重组蛋白与VEGF的结合。 图5为ELISA法检测重组蛋白与PLGF的结合。
本发明
具体实施例方式
实施例一重组蛋白表达载体的构建
1.1 PCR扩增编码Fltl受体的胞外免疫球蛋白区D2及D3的基因片段
编码人Fltl受体的胞外免疫球蛋白区D2及D3的基因片段采用多聚酶链式反应(RT -PCR)方法从健康人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells , HUVEC) 中克隆获得。其具体实施如下以Trizol按常规方法从获取的HUVEC细胞中提取总RNA。 再取1 li g总RNA,加入到逆转录酶的反应液里(总体积为20 y ，包括5Xbuffer L、 Oligo(dT)引物2 u L及lOmmol/L dNTP 8 u L， RNasin 1 u L，反转录酶5U 10U)， 经 70°C变性IO分钟，42°C l小时，42°C 30分钟，70°C 15分钟，逆转录反应终止，合成 得到cDNA。再以该cDNA为摸板，PCR扩增人F1U-D2D3基因片段。
该PCR扩增的引物为
正向上游引物引物(flt1-FD2-F-ER，28 mer) : ggcgsi^li(:; att agt gat aca ggt aga
及
反向下游弓l物弓l物(fltl-RD3a332, 33mer) :gatcgcggccgc ttt ate ata tat
atg
PCR扩增体系 5XPrimestar buffer d鮮s (2. 5mM each) Primer-F-EcoR I (10uM) Primer-R-Not I (10 uM) 质粒pQY-VEGF 165 Primerstar聚合酶 DD water
10ul 4ul
5ul 5ul 2ul 0. 5ul
2ul50ul
PCR扩增条件94°C 5分/ 94°C 30秒，55。C 30秒，72°C 40秒，共20个循环。 PCR扩增完毕，取少量经琼脂糖凝胶电泳分析，于约600bp处有一扩增条带，片断大 小与预期相符。
1. 2 PCR扩增编码Fltl受体的胞外免疫球蛋白D2区的基因片段及KDR受体的胞外免疫球 蛋白D3区的基因片段
编码人Fltl受体的胞外免疫球蛋白D2区的基因片段及KDR受体的胞外免疫球蛋白D3 区的基因片段也以PCR扩增。
其中，PCR扩增人Fltl-D2基因片段的引物为
正向上游弓l物(flt1-FD2-F-ER， 28 mer) :ggcggaattc att agt gat aca ggt aga及 反向下游引物(flt1-RD2a230): gcgggatcc tat gat tgt att ggt ttg tcg PCR扩增体系与PCR扩增条件与前相同；PCR扩增完毕，取少量经琼脂糖凝胶电泳分 析，于约300bp处有一扩增条带，片断大小与预期相符。
而PCR扩增人KDR-D3基因片段的引物为
正向上游引物(KDR-FD3a221， 28mer) :gccggga^ tat agg att tat gat gtg及 反向下游弓l物(KDR-RD3a328, 33mer): gatcgcggccgc g￡§ lM鄉ttt ttc atg gac PCR扩增体系与PCR扩增条件与前相同；PCR扩增完毕，取少量经琼脂糖凝胶电泳分析， 于约320bp处有一扩增条带，片断大小与预期相符。
1. 3酵母表达质粒pPic9K-F2F3-PC的构建和鉴定
上述PCR扩增的含编码人VEGF受体Fltl的D2区及D3区的基因片段，用EcoR I和Not I双酶切，同时酵母表达质粒pPic9K质粒也用&^/和Abf /双酶切，随后用琼脂糖凝胶 电泳分离并回收目的片断。将上述两种回收的酶切片断各取约10ng混合后16'C连接过夜。 连接产物转化DH5a感受态细胞。随机挑选阳性克隆若干，小量提取质粒DNA，获得含 Fltl-D2D3-PC基因片段的pPic9K-F2F3-PC表达载体.构建的表达载体pPic9K-F2F3-PC用 EcoRl和Notl双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳分析，于约600bp处有一酶切条带，片断大 小与预期相符。随后挑选经酶切鉴定正确的克隆进行DNA序列测定,测序引物选择通用引物a -factor primer,测序结果证明Flt卜D2D3-PC基因片段己经插入到质粒pPic9K的预 期位置，其读码框与a-factor分泌信号相符。
1. 4 pPic9K-F2K3-PC质粒的构建和鉴定
上述PCR扩增的人Fltl-D2基因片段经EcoR I和BamH I双酶切，而PCR扩增的人 KDR-D3基因片段经BamH I和Not I双酶切后，随后用琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的片 断。将上述两种回收的酶切片断各取约10ng与经EcoR I和Not I双酶切的pPic9K质粒混 合后，16'C连接过夜。连接产物转化DH5a感受态细胞。随机挑选阳性克隆若干，小量提 取质粒DNA，获得含F1U-D2K3-PC基因片段的pPic9K-F汰3-PC表达载体.构建的表达载 体pPic9K-F2K3-PC用EcoRl和Notl双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳分析，于约600bp处有 一酶切条带，片断大小与预期相符。随后挑选经酶切鉴定正确的克隆进行DNA序列测定， 测序引物选择通用引物a -factor primer,测序结果证明Fltl-D2K3-PC基因片段已经插入 到质粒pPic9K的预期位置，其读码框与a-factor分泌信号相符。
实施例二表达载体转化GS115宿主菌
2. 1采用碱裂解-PEG纯化法丛100ml菌液中制备pPic9K-F2F3-PC及pPic9K-F2K3-PC质粒。 具体步骤参考《分子克隆三》相关章节进行。
2. 2取两管各约15ug pPic9K-F2F3-PC或pPic9K-F2K3-PC质粒用30U Sal I彻底酶切线性 化。酶切结束后，质粒用乙醇沉淀并分别用5ul超纯无菌去离子水重溶。
2.3 GS115感受态细胞的制备
(1) 接种单克隆于3ml YPD培养基，3CTC培养过夜
(2) 按300ul上述新鲜菌液于300 ml YPD培养基中，30°C 培养18小时。此时0D值为1. 3左右。
(3) 1500g离心5分钟收集细菌，随后用300ral冰冷的无菌去离子水重悬。
(4) 1500g离心5分钟收集细菌，随后用150ml冰冷的无菌去离子水重悬。
(5) 1500g离心5分钟收集细菌，随后用20ml冰冷的1M山梨醇重悬。
(6) 1500g离心5分钟收集细菌，随后用500ul冰冷的lM山梨醇重悬，放置于冰上。
152.4电转化
采用Bio-Rad公司的Gene pusler进行电转化。电转杯间隙lmm，
电转条件1000KV 25uF 200 Q。电击结束后立刻加入lml 1M山梨醇，将细菌转移至
50ml无菌离心管中，30。C静置l小时。然后加入lmlYPD， 30。C摇床培养4小时。将细菌
涂布于RD-His平板，培养3天。
2.5筛选整合有多拷贝F2F3-PC或F2K3-PC基因的克隆
通常目的基因的表达量与目的基因在宿主菌染色体中整合的拷贝数正相关。同时转化 后的酵母获得了对G418的抗性，且其抗药能力也与表达质粒在酵母菌染色体中的拷贝数正 相关。因此通过筛选对G418具有高抗药性的克隆便可能得到高表达目的基因的菌株。
筛选方法如下
(1) 配制含0、 0.25、 0.5、 0.75、 1.0、 1.5、 2.0、 3.0、 4. Omg/ml G418的YPD平 板各两块备用。
(2) 吸取5 ml YPD培养基滴于转化平板表面，用无菌Tips将所用阳性克隆全部刮 下，并转移至15 ml无菌离心管中充分混匀。
(3) 加入无菌甘油至终浓度为20%，充分混匀后lml分装，留一管备用，其余立即 冻存于-20 °C。
(4) 取10ul上述菌液，用无菌水梯度稀释后分别涂布于YPD平板，3(TC培养过夜， 第二天通过菌落计数计算菌液的滴度(cfu/ml)。
(5) 取一管冻存菌融化(第3步所得)，根据第4步测定的滴度。取适量菌液用无 菌水稀释至106cfu/ml，然后取100ul分别涂布于第1步配制的梯度浓度的G418平板上。 30'C培养2-5天。
3、诱导表达
从低浓度G418平板和高浓度G418平板分别随机挑取数个克隆用于诱导表达试验。诱 导步骤如下。
(1) 挑取单克隆接种于20ml BMGY培养基中，培养至0D600=2_6;
(2) 1500g离心5分钟收集菌体，并用2ml BMMY培养基重悬；
(3) 1500g离心5分钟收集菌体，并用2ml B讓Y培养基重悬；
(4) 取lml重悬的菌液转移至15ml圆底离心管中，放入摇床进行诱导表达。
16(5) 另lml重悬的菌液转移至250ml无菌三角瓶中，加入19ml新鲜B画Y培养基， 放入摇床进行诱导表达。
(6) 每12小时补加100%的甲醇至终浓度为0.5%，每24小时取样适量；样品 12000rpm离心2分钟后将上清和菌体分别冻存于-2(TC。
实施例三重组蛋白F2F3-PC的分离纯化与检测分析
经DNA测序鉴定正确的表达质粒pPic9K-F2F3-PC采用电激转化法转化GS115酵母宿主 菌，获得上千个重组克隆。随后用梯度浓度的G418进行筛选，获得数十个在含4 mg/ml G418 的YPD平板上生长良好的菌落。挑取数个克隆进行诱导表达。诱导48-96小时后，离心取 表达上清进行SDS-PAGE和Western-blot分析，以质粒pPic9K转化克隆表达上清作为阴性 对照。结果如图4:与阴性组对比(lane 3)， pPic9K-F2K3-PC-GS115表达上清经DTT还 原后，在约25-28KD左右可见特异性条带(lane 2， 4和5)与F2F3-PC的双倍体分子 量相符；而在未还原(即无DTT)组的样品中，其特异性条带则在50-55KD左右，与F2F3-PC 的双倍体分子量相符。此结果表明在该酵母系统表达的重组蛋白F2F3-PC目为同源双聚体。
重组蛋白F2F3-PC表达阳性的酵母培养液，经离心(2000 rpm xl0min)及以0.45 y m滤膜过滤后，滤液上清上样于含重组人VEGF165蛋白的亲合层析柱中(1L/I0ml层析柱)； 亲合层析柱先以PBS洗脱去除杂蛋白，再以低pH(2.7)甘氨酸(O. 1M)洗脱液被吸附的融合 蛋白。洗脱液再以lmol/L Tris(pH9. O)调节pH至7. 0，再对10倍的体积的lx PBS透析 12 16后即获得纯化的VEGF蛋白。
实施例四重组蛋白的生物活性检测分析
重组蛋白的生物活性分析可通过检测其与VEGF或PLGF蛋白的特异亲合结合力水平 来检测。该类检测可采用ELISA法或免疫印迹等方法来检测。在本实施例中，采用ELISA 法以作进一步说明，其检测步骤如下
1) 用重组人VEGF165蛋白包被96-well-ELISA板(2 u g/ml，50 ul/孔)，4。C过夜；
2) 经lx PBS液漂洗及2% BSA (in PBS-0.1% tween20液)室温封闭1 2h;
3) 经PBS-T洗脱3次后，加入，37° C孵育l-2h;
4) 经PBS-T洗脱3次后，加入含不同稀释度的重组蛋白的样品，37° C孵育l-2h;4) 经PBS-T洗脱3次后，加入小鼠抗人VEGF受体Flt-l的抗体(1: 500) 37° C孵 育lh;， 37° C孵育1-2 h;
5) 经PBS-T洗脱3次后，再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠Ig抗体(l: 1000)， 37° C孵育1 h;
5) 经PBS-T洗脱5次后，加入显色液(邻苯二胺)-3%双氧水，室温10-20min;
6) 加入lmol/LHCL终止反应，以酶联免疫仪测定测定492 nm波长处各孔的吸光值。
ELISA结果如图4，在加入含不同稀释度的表达F2F3-PC重组蛋白的酵母样品组中 (VEGF165)，显色反应呈明显阳性，而加入酵母表达的对照样品组中(neg)显色反应为 阴性。此结果表明表达的F2F3-PC重组蛋白保持有与VEGF蛋白高度结合的生物活性。
实施例五:重组蛋白的体外化学标记处理
在本发明实施中，用于标记重组蛋白的生物素试剂是N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯酰活 化的生物素。在pH 7-9的缓冲液中，NHS活化的生物素能够非常有效的与蛋白质的伯氨 基(-NH2)反应，形成稳定的酰胺键。在本实例中，采用的标记试剂与重组蛋白F2F3-PC
的反应摩尔比为50: 1;其标记步骤如下
1 )、溶解重组蛋白F2F3-PC于PBS中；
3)、按上述计算结果，加入适量的标记试剂(NHS-生物素)与重组蛋白样品混合，并 混匀；室温反应30-60分钟；
3)、通过透析或脱盐去除未反应的过量生物素，即得到生物素标记的重组蛋白F2F3-PC。
实施例六重组蛋白用于检测VEGF/PLGF的水平
本发明中的重组蛋白(包括生物素标记处理的重组蛋白)还可与其他试剂成分合并使 用，组成试剂盒，用于体外定量检测各种生物样品(如血清、细胞裂解液、细胞培养上清 液等)中VEGF/PLGF蛋白的水平。检测VEGF/PLGF的水平的方法包括ELISA或免疫印 迹等。
如用ELISA法来检测样品中PLGF的水平为例，其检测步骤包括
1)用含不同溶度的重组人PLGF131蛋白或阴性对照蛋白的样品包被96-well-ELISA板， 4'C过夜；
182)经lxPBS液漂洗及2。/。BSA(inPBS-0.1。/。tweeii20液)室温封闭1 2h后，加入重组 蛋白F2F3-PC， 37° C孵育l-2h;
4) 经PBS-T洗脱3次后，加入小鼠抗人VEGF受体Flt-l的抗体(1: 500) 37° C孵
育1-2 h;
5) 经PBS-T洗脱3次后，再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠Ig抗体(l: 1000)， 37° C孵育1 h;
5) 经PBS-T洗脱5次后，加入显色液(邻苯二胺)-3%双氧水，室温10-20 min;
6) 加入1 mol/LHCL终止反应，以酶联免疫仪测定492 nm波长处各孔的吸光值。
ELISA结果如图5，包被了 PLGF131蛋白的样品组(PLGF131 )，显色反应呈明显阳性， 且显色反应强度与孔中包被的PLGF131蛋白的溶度呈明显正相关；而仅包被了阴性对照的 样品组(neg)中无明显显色。
实施例七F2F3-PC /F2K3-PC异源双倍体蛋白的表达。
本发明中的F2F3-PC / F2K3-PC异源双倍体蛋白的表达生产可以通过将含F2F3-PC M 的表达质粒与含F2F3-PC的表达质粒共转染入宿主细胞(如CHO)后而获得。将表达F2F3-PC 的质粒和表达F2K3-PC的质粒共转染入细胞后，可获得表达三种不同组合的重组蛋白即重 组蛋白F2F3-PC;重组蛋白F2K3-PC;及F2F3-PC / F2K3-PC的异源双倍体重组蛋白。与重 组蛋白F2F3-PC—样，异源双倍体(F2F3-PC/F2K3-PC)的蛋白分离提纯也采用免疫亲和 层析柱法从收集的转染细胞培养液中分离提取。
分离提取的异源双倍体(F2F3-PC / F2K3-PC)也可作为VEGF/PLGF的中和吸附剂用于分 离吸附VEGF分子及VEGF分泌表达阳性的细胞与组织；及用于体内外拮抗抑制VEGF/PLGF 介导的肿瘤区域血管的新生等。
权利要求
1. 一种可结合血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及胎盘生长因子(placental growth factor，PLGF)的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的N-端中含有VEGF受体的胞膜外免疫球蛋白样结构区，而其C-端的最后2至20个氨基酸序列中含有至少一对由pro(脯氨酸)及cys(半胱氨酸)相邻排列的俩氨基酸。
2. 根据权利要求l的重组蛋白，其特征在于该蛋白的C-末端的最后2至20个氨基酸中所 含有的相邻俩个pro及cys氨基酸的排列序列(从N-端到C-端)为pro-cys或cys-pro.
3. 根据权利要求l的重组蛋白，其特征在于该蛋白为含二巯基的同源二聚体。
4. 一种根据权利要求1的重组蛋白F2F3-PC，其特征在于该蛋白的N-端含有VEGF受体 Flt-1的胞膜外结构区中的第2及第3免疫球蛋白样区。
5. —种根据权利要求1的重组蛋白F2K3-PC,其特征在于该蛋白的N-端含有VEGF受体 Fit-1的胞膜外结构区中的第2免疫球蛋白样区及VEGF受体KDR的胞膜外结构区中的第3 免疫球蛋白样区。
6. —种根据权利要求1的重组蛋白F2F3-PC/ F2K3-PC，其特征在于该蛋白为由F2F3-PC 单体及F2F3-PC单体聚合而成的异源二聚体。
7. —种制备权利要求l所述的重组蛋白的方法，其特征在于其包括下列步骤1) 以多聚酶链式反应(RT-PCR)从健康人细胞组织中克隆获得含编码人VEGF受体的 胞膜外免疫球蛋白样结构区的cDNA;2) 克隆扩增获得的cDNA经限制性内切酶处理后，再用T4连接酶将其与经相应的限制 性内切酶处理的表达载体相连，获得重组表达载体；3) 将上述重组表达载体转入真核宿主细胞，经筛选、扩增培养后获得高效稳定分泌表 达重组人VEGF受体的胞膜外免疫球蛋白样结构区的宿主细胞；4) 收集细胞培养上清液，经离心及以滤膜过滤后，将滤液直接上样至含有偶联有VEGF/PLGF蛋白或抗-VEGF受体的抗体的亲合层析柱中；5) 亲合层析柱先经PBS洗脱后，再以低pH液洗脱回收被吸附的蛋白；6) 洗脱回收的蛋白再经调节pH至中性及透析与理化鉴定后，即获得纯化的重组人 VEGF受体蛋白。
8 . —种根据权利要求7所述的制各重组蛋白的方法，其特征在于所述的用于表达重组 VEGF受体蛋白的宿主细胞为真核细胞。
9 . 一种根据权利要求7所述的制备重组蛋白的方法，其特征在于所述的用于表达该重组 蛋白的真核宿主细胞为酵母细胞。
10. —种根据权利要求7所述的制备重组蛋白的方法，其特征在于所述的用于表达该重组 蛋白的宿主细胞为原核细胞。
11. 一种带有生物素(Biotin)标记物的可溶性重组VEGF受体蛋白，其特征在于该标记的 蛋白多肽中偶联有一个或多个生物素，且保持有可同时与VEGF/PLGF及亲和素(Avidin)结 合的双重活性。
12. —种制备如权利要求11所述的带生物素标记的重组VEGF受体蛋白的方法，其特征在 于该标记方法包括下列步骤1) 重组VEGF受体蛋白溶解于pH为7-9的缓冲液中；2) 按标记试剂与重组VEGF受体蛋白的反应摩尔比在10: l至50: l间，加入适量的 活化的生物素标记试剂与重组VEGF受体蛋白样品混合，并混匀，室温反应30-60分钟；3) 通过透析或脱盐去除未反应的过量生物素，得到生物素标记的重组VEGF受体蛋白。
13. —种含有权利要求1或权利要求11的重组蛋白为检测试剂用于进行体内或体外检测 VEGF/PLGF表达水平的试剂盒；其特征在于被检测的VEGF/PLGF是以流离降级的可溶性物 质形式存在于体液(如血清、血浆、唾液等)与细胞培养上清液中或以膜蛋白形式表达于 细胞/组织中。
14. 一种用权利要求1或权利要求11所述的重组蛋白为吸附剂，来分离或清除VEGF蛋白 及VEGF表达阳性的细胞或组织的用途，其特征在于包括下列步骤-1) 将亲和素(Avidin)吸附在适当的固相载体上(如细胞培养板，硝酸纤维素膜等)；2) 在固相载体上滴加含牛血清白蛋白的封闭液，封闭温育；3) PBS洗漆，在固相载体上滴加生物素标记的重组蛋白，温育1-2小时；4) 加入含VEGF/PLGF的生物样品或VEGF/PLGF表达阳性的细胞或组织，温育1-2小时;5) PBS洗涤后，分离得到VEGF/PLGF蛋白或VEGF/PLGF表达阳性的细胞或组织。
15. —种含有权利要求1或权利要求2所述的重组蛋白为主要活性成分及其他辅助溶剂或 载体的候选药物，其特征在于该候选药物具有中和抑制VEGF/PLGF介导的促血管新生的活 性。
16. —种候选药用组合物，其特征在于该药用组合物中含有不同比例的根据权利要求4， 权利要求5和权利要求6中所述的各种重组蛋白。
全文摘要
本发明属于生物技术-重组基因工程领域。本发明公开了可结合血管内皮细胞生长因子(VEGF)及胎盘生长因子(PLGF)的重组蛋白及其制备方法与应用。该重组蛋白的特征在于其N-端中含有可结合VEGF及PLGF的免疫球蛋白样结构区，而其C-端的最后2至20个氨基酸序列中含有至少一对由pro及cys相邻排列的两氨基酸。本发明的重组蛋白可作为VEGF/PLGF的拮抗剂，广泛用于实验研究及临床上早期干预或治疗各种与血管增生有关的疾病如恶性肿瘤的发生与转移等。
文档编号C07K14/71GK101486760SQ200810019159
公开日2009年7月22日 申请日期2008年1月15日 优先权日2008年1月15日
发明者青 周, 周群敏, 徐一清, 罗师平, 胡红群, 谢凤娟 申请人:苏州思坦维生物技术有限责任公司