专利名称：一种具有抗血小板性栓塞活性的蛋白质及生产方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及文昌鱼基因AmphiClqDC及其编码的蛋白PclqDC,以及该蛋白在制备治疗 心血管性疾病的药物上的应用。
背景技术：
血小板在止血、血栓形成、动脉粥样硬化过程中起着重要的作用。长期的临床实践证 实，抗血小板药具有抑制血小板的黏附、聚集和释放功能，从而防止血栓形成，可有效地 防止心血管疾病的发生，并能延长患者的生存期。近年来，随着人们对冠状动脉粥样硬化 性心脏病，特别是急性冠脉综合征和支架植入后血栓形成机制的深入理解，抗血小板药物 在上述领域的应用越来越广泛。而且人口老龄化正推动心脑血管市场的增长， 一些新开发 药物为制药公司提供大量机会。在国内市场中，抗血小板凝集类药物己抢占溶栓类和抗凝 血类药物的市场份额，占据抗血栓药物市场首位。近年来，溶栓药物市场份额缩水较厉害， 抗凝血药物的市场份额也呈逐年减少趋势。但相关分析可以看出，抗血小板凝集类药物的 增长情况良好，近年来的增长率为30%~65%。Clq家族为生物体内中含有Clq结构域(因为折叠成球状，也常称为global Clq domain,简称gClq)的一大类分子。该家族的各个成员在gClq区域有高度的保守性， 这类分子包括经典补体途径的核心亚成分Clq (complement component 1 )、参与糖脂和能 量代谢的adiponectin、胶原蛋白VI和X 、某些和动物冬眠相关的蛋白以及EMILIN等等。 ClqTNFl即为ClqTNF相关蛋白1,也是Clq家族成员之一，它具有Clq家族的特征性 胶原区和Clq球状区，并在血管壁组织中高度表达。通过重组人的ClqTNFl蛋白发现 它可以和纤维状胶原特异结合并阻断胶原蛋白诱导的血小板凝集，阻断机理在于它竞争了 vWF和胶原的结合位点。因而，从医学角度，通过灵长类动物模型研究发现，ClqTNFl 可以阻止血小板性血栓形成，在医学的血管损伤性疾病中有重要意义。文昌鱼(SrawcMwtow" 6e/c/zen')，属于脊索动物门(Chordate)，头索动物亚门 (cephalochordate)，是现存和脊椎动物亲缘关系最近的无脊椎动物，是一种海洋源性的 潜在药物开发物种。我们从文昌鱼中克隆了一个与人的ClqTNFl基因直系同源的Clq家族成员AmphiClqDC，并对其蛋白Pcupc进行了制备及研究了功能，发现PclqDC能够阻 止血小板性血栓形成，是一种潜在的治疗血栓的药物。发明内容本发明的目的在于提供一种来源于文昌鱼的新的抗血小板栓塞药物AmphiClqDC基因及其编码的蛋白。本发明的另一目的在于提供上述基因的Pcupc蛋白在制备治疗感染性疾病的药物中的 应用。本发明通过兼并引物扩增和RACE全长扩增的方法从文昌鱼中分离得到AmphiClqDC 基因，其DNA序列如序列表中<400> 1序列所示。上述本发明AmphiClqDC基因所编码的蛋白(重组蛋白ClqDC，命名为PclqDC)，其 氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示；去除信号肽的成熟蛋白等电点为6.93，分子量为 25.8 kDa。该成熟蛋白通过表达载体pETTRX-AmphiClqDC在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达。所述表达载体pETTRX-AmphiClqDC是建立以硫氧环蛋白为融合伴体，中间插入His 的亲和标记位点及蛋白酶3C识别位点的高效表达载体，该系统使Pcupc在大肠杆菌中大量表达。本发明所选择的青岛文昌鱼(Bra"c/ /oWoma 6e/cZ/en'加力gtowe"^)采集于山东省沙子 口水域。本发明通过兼并引物扩增从成体文昌鱼的cDNA—链中克隆得到了含有Clq结构域的 部分片段，并对这个片段进行了 5'和3'RACE扩增，得到了含有Clq结构域基因序列的全 长克隆，命名为AmphiClqDC (其DNA序列如序列表中<400>1序列所示)。新基因编码 251个氨基酸(其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示)，含有16个氨基酸的信号肽。 去除信号肽的成熟蛋白等电点为6.93，分子量为25.8kDa。具有抑制血小板凝集的活性。本发明通过设计了一对引物，将编码新基因AmphiClqDC的成熟蛋白序列克隆到原核 融合表达载体pETTRX上(本实验构建，经Merck公司的pET-21b载体引入TRX蛋白序列 及EK酶酶切位点)，构建表达质粒并将其转化大肠杆菌co//Rosetta-gamiTM。此表达载体(pETTRX-AmphiClqDC)以T7为启动子，TRX为分子融合伴体，帮助重组蛋白正确折叠， 以可溶的形式表达，TRX的C端有柔链区和6XHis结构，便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。所设计的上游引物含有蛋白酶3C位点，利于外源蛋白单体的获得。通过对培养时间，诱导时间，温度等条件的摸索和优化，PdqDC融合蛋白的表达量有所提高较高。为了得到更多的蛋白，我们对超声破碎后的包涵体进行了变复性处理，得到了浓度和纯度 都比较高的蛋白。本发明还摸索和优化了重组PdqDC蛋白的纯化条件包括可溶的表达产物Ni^ Chelating Sepharose亲和色谱层析得到融合蛋白，可得到纯度在95%以上的Pcupc蛋白。本发明的表达质粒复制方法参照Sambrook(Sambrook， etal. 1989， Molecular cloning. Cold Spring Harbor Labroratory Press. USA)方法，用CaCl2的方法将质粒转化E.co// DH5。， 用含氨苄青霉素(100 、g/mL)的LB培养基培养转化菌株或者将工程载体转化到￡. Rosetta-gamiTM菌株，用含50 mg/L氨卞青霉素，15 mg/L卡那霉素，35 mg/L氯霉素和12.5 mg/L四环素的LB培养基培养转化菌株，碱法提取质粒。附图
表说明图l为本发明文昌鱼PaqDc蛋白与其它Clq家族成员蛋白的序列比较结果。Be,蜡样芽孢杆菌f5a"'〃iw cerews) ; Ci,海鞘(C7o a ; Hs,人类(//bwo 51—ms);La,七鱼哲鱼曼(lamprey) ; Mm,小鼠(她s ) ; Sp，海胆(S/wwg/oce"/rotojwpwmft/ . The sequence used in alignment and phylogenetic analysis: Bc.ClqDCl(AAP09230); Bc.ClqDC2 (AAP09231); Bc.ClqDC3 (AAP09378); Sp.ClqDCl(AAK11302); Sp.ClqDC2 (AAK11303); Sp.ClqDC3 (AAG16425); Sp.ClqDC4(AAK11309); Sp.ClqDC5 (AAK11305); Ci.ClqDCl (ENSC諸00000006605);Ci.ClqDC2 (ENSCINP00000005965); La.Clq (BAD22833); Hs,cqtl (AAQ88790);Hs.cqt2 (AAH11699); Hs.cqt3 (AAQ88754); Hs.cqt4 (AAH35628); Hs.cqt5(AAH29485); Hs.cqt6(AAH20551); Hs.cqt7 (AAH24015); Hs.cqt8 (P60827);Hs.gliacolin (CAH73145); Hs.adiponectin (NP—004788). 图2为兼并引物扩增的AmphiClqDC基因片段。1. DNA分子量标准(DL2000); 2. 52°C退火进行扩增得到的产物；3.5(TC退火进行扩增得到的产物。图3为5'RACE和3'RACE扩增得到的AmphiClqDC基因目的片段。1. 5'RACE内巢扩增片 段；2. 5'RACE外套扩增片段；3.DNA分子量标准(DL2000); 4.3'RACE内巢扩增 片段；5.3'RACE内巢扩增片段；6.DNA分子量标准(DL2000)。图4扩增得到的AmphiClqDC基因全长片段。图5为基因AmphiClqDC的重组表达质粒pETTRX-AmphiClqDC构建图。 图6为重组PdqDC蛋白诱导表达、亲和层析电泳图。1.未经诱导的pETTRX-AmphiClqDC菌体总蛋白；2.经IPTG诱导的pETTRX- AmphiClqDC 菌体总蛋白；3.诱导菌超声沉淀总蛋白；4.诱导菌超声上清总蛋白。 图7为TRX-Pc1qDC蛋白经Ni柱纯化后的蛋白电泳图。图8重组蛋白PdqDC的血小板凝集抑制实验。
具体实施方式
以下实施将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本 发明。实施例l :文昌鱼总RNA的提取和AmphiClqDC部分片段扩增。 总RNA的提取和RACE cDNA合成取文昌鱼全鱼，采用Trizol试剂法提取总RNA,酚 /氯仿抽提去除蛋白质，获得文昌鱼总RNA。取l、g总RNA,按照TOYOBO公司的First Strand cDNA Synthesis Kit i ewrTVa Jce-a-TM (code No. FSK-100)说明书操作进行逆转录合 成第一链。取2 、1 cDNA —链产物,以根据Clq家族其他基因设计的兼并引物5TCR Primer: 5'-GG(A/G)GAACG(C/G/A) GGGT T(C/T)CCT-3'和3' PCR Primer: 5'-AAC(T/C)AAATGIC CATT(G/A)AAGGTG-3'为引物进行RT-PCR扩增AmphiClqDC的部分片段350 bp，经1% 琼脂糖凝胶检测如图2所示。将扩增得到的目的片段连接到pGEX T easy vector (promega) 后转化DH5ct大肠杆菌,挑选重组克隆测序。Blast同源分析表明，获得了这个片段含有gClq 结构域，是Clq家族成员。实施例2: RACE扩增AmphiClqDC基因5'和3'末端。按照Invitrogen的GeneRacer Kit进行RNA的去磷酸化RACE、脱帽反应、RNAoligo的连接及mRNA的逆转录从而合成cDNA —链，采用Takara的LA Taq聚合酶按照GeneRaCerTMKit的反应体系进行PCR扩增。其中根据上面扩增得到的部分AmphiClqDC的序列设计进行5'RACE扩增的基因特异的外套引物为5'-gene-specific primer:5'-GCTGCGAATGACAGAG AAGGCTGAT-3';内巢引物为 5'-nested primer:5'-CTTGGGTCCAGGAGGTCCAGC AACA-3'; AmphiClqDC的3'RACE扩增的基因特异的外套引物为5'-gene-specific primer: 5'-CGCAGCATCATGCAGTCCCAGA-3';内巢引物为5'-nested primer: 5'-GACCAGGTATGGATGAGGATGGACTA-3';扩增得到的目的片段如图3。将扩增得到的目的片段连接到pGEX T easy vector (promega)后转化DH5a大肠杆菌，挑选重组克隆测序。并与前面得到的目的片段进行拼接得到了 AmphiClqDC基因的全长EST序列，长度是978bp，编码251个氨基酸的Pdqoc蛋白。。 实施例3: AmphiClqDC全长的扩增及序列分析。根据上面拼接得到的序列设计引物5'-TCAGCAGCAGTCCCACCAT-3'和 5'陽GATTTGTAGTCACAACAGAGG-3'采用Takam的LA T叫聚合酶扩增AmphiClqDC的 全基因，扩增得到的900bp片段的电泳图谱如图4。将扩增得到的目的片段连接到pGEXT easy vector (promega)后转化DH5a大肠杆菌，挑选重组克隆测序。Blast同源分析表明， 获得了编码AmphiClqDC全基因的EST序列，其序列如序列表400<1>所示。用NCBI的在线BLASTX搜索，发现这段序列比对上的都是Clq家族成员，其中与 ClqTNFl相似性最高，达到51%。我们对得到的AmphiClqDC与其他物种中发现的Clq 家族蛋白进行了进化分析，发现AmphiClqDC是ClqTNFl的直系同源基因。实施例4:重组PdqDC表达质粒的构建依据AmphiClqDC基因的两端序列合成一对引物，上游引物含I和3C蛋白酶 Prescission Protease切割位点，下游引物含7Vw I切割位点。上游引物(Pl):保护碱基I 3C蛋白酶切割对应位点 AmphiClqDC基因序列下游引物(P2):5，-ATA AG A AT GCGGCCGC TCAGGCTGATGCATTGTTGCC-3， 保护碱基 iVW I AmphiClqDC基因序列以含AmphiClqDC基因的pGEX质粒为模板，Pl、 P2为引物PCR扩增，得到特异扩 增的单一条带，产物大小在700bp左右。将PCR扩增产物克隆到原核融合表达载体 pETTRX(本实验构建，经Merck公司的pET-21b载体引入TRX蛋白序列及EK酶酶切位点) 上，得到重组表达载体pETTRX-AmphiClqDC (其构建过程如图5所示)。表达载体 pETTRX-AmphiClqDC中的外源基因经测序鉴定正确。所设计的上游引物中含Prescission 蛋白酶切割位点，以便切除融合伴侣TRX。实施例5:文昌鱼PdqDC融合蛋白的表达将pETTRX-AmphiClqDC转化大肠杆菌￡ co// Rosetta-gamiTM，基因工程菌超声裂解上清液与沉淀经SDS-PAGE电泳分析表明，菌株经诱导后有明显的特异表达产物带，分子量与用软件DNATOOLS6.0预测的TRX-PclqDC融合蛋白大小约38 kD —致，并且预测得到该蛋白pl值6.23。对培养时间，诱导浓度，温度等条件的摸索得出基因工程菌的培养条件为挑取单菌落接种于含有50 mg/L氨卞青霉素，15 mg/L卡那霉素，35 mg/L氯霉素和12.5 mg/L四环素的LB培养基中，37"C振摇培养过夜活化菌种，按照1:100的比例接种到200 ml 2xYT培养基，37。C放大培养至OD600约为0.9时，加入IPTG至终浓度为0.1 mM， 18°C 诱导培养36 hr后离心收集菌体。将总菌体用Tris缓冲液(150 mMNaCl， 50 mM Tris, pH 8.5) 洗涤，再用适量的Tris缓冲液(150mMNaCl， 50 mM Tris, pH 8.5)悬浮，超声处理后，裂 解上清液和超声后的沉淀经SDS-PAGE电泳分析表明，在此条件下Pdqoc融合蛋白的表达 量占菌体总蛋白的50%以上，处于部分可溶状态(图6)。 实施例6:重组文昌鱼Pcnpc融合蛋白的纯化超声后的上清液经Ni2+ Chelating Sepharose亲和色谱层析纯化，收集重组蛋白的洗脱 峰。实验发现TRX-PdqDc能被N产柱所吸附，用50mM洗N产柱时，能把大部分吸附在 柱上的杂蛋白洗下，而用100mM、 200mM浓度的咪唑能把目的蛋白TRX-Pdqoc洗下。 为了提高重组蛋白的得率和浓度，简化实验步骤，縮短对重组蛋白的处理时间，在用N产 柱亲和色谱层析纯化重组蛋白时，我们采用一步法进行纯化。根据载体质粒pETTRX所 表达的外源蛋白与N产亲和柱的结合能力较强的特点，我们选用了较简化的洗脱条件先 用50mM的咪唑洗N产柱，弃洗脱峰，然后直接用200mM的咪唑洗N产柱，收集重组 蛋白的洗脱峰。我们可以得到纯度比较高的融合蛋白TRX-PclqDC (图7)。实施例11: PdqDC重组蛋白的血小板凝集抑制实验血小板的收集取健康供血者新鲜全血(3.8%枸橼酸三钠1 : 9抗凝)，用sepharose 2B 富集PRP血浆。将血小板与TRX-PclqDC或者TRX对照蛋白混合，加入在终浓度为1.25昭/ml的胶原I ，检测632nm的透光率的变化，以加入TRX对照蛋白由胶原I诱导的血 小板凝集为基准比较加入TRX-Pcupc蛋白的抑制效果。图8表示TRX-PclqDC能够抑制 由胶原引起的血小板凝集。<110〉中山大学〈120〉一种具有抗血小板性栓塞活性的蛋白质及生产方法和应用<160〉 3 〈210〉 1 〈211〉 987 〈212〉 DNA〈213〉文昌鱼(5r"wc/ /os^ /n" 6e/c/zen')〈220〉〈221〉 protein<222> (51)…(804)〈400〉 1ctccggccgc catggcggcc gcgggaa/ttc gatttcagca gcagtcccacc atg acgetc Leutea Seragt Serctg LeuThrgta Valctg Leu 5 tat Tyr 25 ggc Gly 45 cct Pro 65gggGly85gccAlatac Tyrtct Sercag Ginact Thrgac Asptgt CysGin His卿 Lysggc Glyatg Metcct Progtc Valcag Gingtg Valatg Metgga Glycct Proctg Leuggg Glyagg Arggca AlaProggc Glyatelie10犯s匕ys30tgcCys50teaSer70aaaLys90Proliecat Histgc Cysgag Glugga Glyccs ProProtct SerPro犯g 匕ysHisgag Glugcc Alaggc Glycag Gingga Gly鄉 LysLystgc Cyscga Arggac Aspgat Aspggt Glyetc LeuctgLeu15gggGly35犯cAsn55aaaLys75gttVal95cagGingcg AlaLysgtc Valcag GinPro Progga Glyget Alagca Alagaa Glugga Glytea Serage Sertct Serggg Glycgt Argcct Progcc Alaate liegag Glucct Proggg GlyPrott:c PhetatTyr20g3gGlu40cagGin60ttcPhe80ggaGly100tctSerMet 1ggc Glygcg Alaate liecct Procct Progtc ValThrcag Gincct Proate liegga Gly鹏 Gluate lietec 60 Serggg 120 Glygag 180 Gluget 240 Alaaga 300 Arggga 360 Glycgc 420 Argage SerAsnTyr朋g Lystec Serggs Glytta Leu105 aaa Lys 125 act Thr 145 tac Tyr 165 犯c Asn 185Gin 205 gac Asp 225 gtt Val 245Progga GlyUc Pheatg MetGluSerg3gGluacg Thrcat HisUc PheHisgcc Alaggg GlyUc PheAsn Gin Progtc Valetc LeuProatg Metgcc Alaacg ThrThrcag Ginttg Leuat a lietat Tyr1103CCThr 130Asn 150 gtc Val 170 gtc Val 190 gag Glu 210 ttt Phe 230Asn 250犯g Lysttg LeuHisate liectg Leuggt Glyatg Mett8t Tyrttc Pheage Serctg Leuata liegat Asptac TyrThrtac TyrUt Phegtg Valgag Glucag Ginggg GlyAsngcc Alaggg GlyGlu115gtg Val 135 犯g Lys 155 age Ser 175 cag Gin 195 gac Asp 215 gat Asp 235gtc ValUc Pheegg Arggag Glucag Gingcc Alaatg Mettac Tyracg Thrggg Glygtg Valtac Tyrteic Tyrtgg CysThrAsptgg Trpate liegac Aspgtc Valtac Tyrcgc Argatg MetThr120 aaa Lys 140 ate lie 160 eta Leu 180 age Ser 200 agg Arg 220 ttc Phe 240gtg Valcct Procat Hisate lieatg Met兆t Sertga ttt ateagaegta tattgtaaga atgaatatccttg gtt 柳 Leu Valggc ate 540 Gly liectg atg 600 Leu Metatg cag 660 Met Gingac tac 720 Asp Tyrgga cat 780 Gly His840tgaaaatttt tgatactaag agtcctgatt ttttttgtcc tttacacata tgtcagccac atggtatacc agtacctctg ttgtgactac aaatcaatca ctagtgaatt cgcggccgcc tgeaggtega ccatatggga gagctxc TGC AGG TCG ACC ATA TGG GAG AGC TCC■ 960 987〈210〉 2 〈211> 251 〈212〉 PRT<213>文昌鱼(Branchiostomabelcheri)〈220〉〈221〉 protein〈222〉 (1)…(251) <400〉 2Met Thr Ser Leu Leu Tyr Thr Val Leu lie lie Pro Ala Cys Leu Ala51015Val Ser lie Tyr Gly Gin Gly Ser Tyr Ser Asp Gin Gly Lys His Ser20 25 30Gly Arg Gly Lys Gin Ser Glu Glu Ala Pro Glu Ser Gly Gin Cys Val35 40 45Arg Cys Cys Pro Gin Asp Asn Pro Pro Gly Pro Gin lie lie Ala LeuPro65Pro50 GinHis Met AlaGly Arg ThrGly 85Ser70Lys55 60Glu Lys Gly Asp Lys Gly Glu Arg Gly75Met Gly Pro Lys Gly His Lys Gly90Gly Pro Pro Gly Pro Glu Gly Val Ala Gly Pro Pro Gly100 105 Lys Leu Gin Ala Ser Ala Phe Ser Val lie Arg SerPro 110 ProVal95ProPhe80AlaGluMet GluLys115 120 125Gly Thr Lys Tyr Tyr Gin Val Val Met Tyr Asp Lys Val Leu Val AsnThr 145 Pro130GlyGlu His PheAsn 150Gly lie Tyr Tyr Phe Ser Ala Thr135 140 Leu Phe Thr Gly Lys Phe Tyr Cys Val165Thr Thr Tyr Leu His Leu Met Lys180Phe Ala Gin Glu Gly Asp ArgLeuAsp 225 SerGlu 210 His195 LeuSer 200Asn 185 lieVal 170 Asn155 HisSer Tyr AsnGin Pro GinMet Gin SerGin 205Val 190 ThrSer 175 lielie 160 ArgLeuVal Metlie Val Gly Asp Gin Val Trp Met Arg Met Asp Tyr Gly 215 220 Leu Ala lie Phe Gly Asp Glu Glu Asp Ala Tyr lie Thr230 235 Gly His Leu Val Phe Pro Thr Tyr Asn Met 245 250Phe 24012<220> 〈221〉 <222〉 <400>成熟蛋白 (1)…(251)3Val 1GlySer lie Tyr Gly Gin Gly Ser Tyr Ser Asp Gin Gly Lys His Ser51015Arg Gly Lys Gin Ser Glu Glu Ala Pro Glu Ser Gly Gin Cys Val 20 25 30Arg Cys Cys Pro Gin Asp Asn Pro Pro Gly Pro Gin lie lie Ala Leu35 40 45Pro Gin His Met Ala Ser Glu Lys Gly A印Lys Gly Glu Arg Gly Phe50 55 60Pro Gly Arg Thr Gly Lys Met Gly Pro Lys Gly His Lys Gly Val AlaGly 80 Lys65 70 75Pro Pro Gly Pro Glu Gly Val Ala. Gly Pro ProGly Pro ProLeu Gin Ala. _ Pro85 90 Ala Phe Ser Val lie Arg Ser Lys ProSer100 105 Gly Thr Lys Tyr Tyr Gin Val Val Met Tyr 115 120Asp Lys ValLeu 125Met 110 ValGlu95GluAsnThr Gly Glu His Phe Asn Leu Phe Thr Gly Lys Phe Tyr Cys Val lie130 135 140Pro Gly lie Tyr Tyr Phe Ser Ala Thr Val His Ser Tyr Asn Ser Arg 145 150 155Thr 160 PheThr Tyr Leu His Leu Met Lys Asn Asn 165Ala Gin Glu Gly Asp Arg Ser lie 180Leu Glu Leu lie Val Gly A印Gin 195Met 185 TrpGin 170 GinProGin Val lieSer Gin ThrMet Arg MetAsp HisSerGly 225Leu 210 HisAlaVal 200lie Phe Gly Asp Glu Glu Asp Ala215Leu Val Phe Pro Thr Tyr Asn Met * 230Tyr 220Val 190 Asp Tyr 205lie ThrLeu 175 MetGlyPhe
权利要求
1.从中国青岛文昌鱼中克隆得到的AmphiC1qDC基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。
2. 权利要求1所述基因编码的蛋白质PclqDC，其氨基酸序列如序列表中〈400〉2序列所示。
3. 权利要求2所述的蛋白质PdqDc的成熟蛋白，其氨基酸序列如序列表400〈3〉所示。
4. 权利要求3所述的蛋白PdqDC在大肠杆菌中以部分可溶的形式表达的方法，按照以下步骤进行(1) 重组表达载体pETTRX-AmphiClqDC的构建；(2) 将pETTRX-AmphiClqDC转化大肠杆菌co// Rosetta-gami ;(3) 对转化的大肠杆菌co// Rosetta-gamiTM进行培养；(4) 重组文昌鱼PclqDC融合蛋白的纯化。
5. 根据权利要求4所述的蛋白PclqDC在大肠杆菌中以可溶的形式表达的方法，其特征在 于所述的重组表达载体pETTRX-AmphiClqDC的构建包括以下步骤(a) 依据权利要求1所述的AmphiClqDC基因的两端序列合成一对引物，上游引物含i^" I和3C蛋白酶Prescission Protease切割位点，下游引物含iVW I切割位点；上游引物(P1):保护碱基3C蛋白酶切割对应位点 AmphiClqDC基因序列下游引物(P2): 5，-ATAAGAAT GCGGCCGC TCACATGTTATACGTGGGGAAAA-3， 保护碱基 iVW I AmphiClqDC基因序列(b) 以含AmphiClqDC基因的pGEM T easy vector质粒为模板，P 1、 P2为引物PCR扩 增；(e)将PCR扩增产物克隆到原核融合表达载体pETTRX上，得到重组表达载体 pETTRX-AmphiC 1 qDC 。
6. 根据权利要求4所述的蛋白PdqDC在大肠杆菌中以可溶的形式表达的方法，其特征在于-步骤(3)的培养条件为挑取单菌落接种于含有50mg/L氨卞青霉素，15mg/L卡那霉素, 35mg/L氯霉素和12.5 mg/L四环素的2xYT培养基中，37'C振摇培养过夜活化菌种，按照 1:100的比例接种到含有相应抗生素的200 ml 2xYT液体培养基，37"C放大培养至OD600 约为0.9时，加入IPTG至终浓度为0.1 mM， 18'C诱导培养36 hr后离心收集菌体。
7. 根据权利要求4所述的蛋白Paqrx:在大肠杆菌中以可溶的形式表达的方法，其特征在于步骤(4)重组文昌鱼Pcupc融合蛋白的纯化方法为将总菌体用Tris缓冲液(150 mM NaCl， 50 mM Tris, pH 8.5)洗涤，再用适量的Tris缓 冲液(150mMNaCl， 50 mM Tris, pH 8.5)悬浮，超声处理后，裂解上清液经Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析纯化，收集重组蛋白的洗脱峰。
8. 权利要求2所述的蛋白在制备治疗心血管性疾病的药物的应用。
全文摘要
本发明涉及一种新的抗血小板凝集的AmphiC1qDC及编码该蛋白的基因，以及该蛋白质在制备治疗心血管性疾病药物中的应用。本发明通过兼并引物扩增，从文昌鱼中分离得到AmphiC1qDC基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。该基因编码的蛋白质(P<sub>C1qDC</sub>)，其推测的氨基酸序列如序列表<400>2序列所示。本发明的重组文昌鱼P<sub>C1qDC</sub>蛋白具有抑制由胶原诱导的血小板凝集作用，可用于制备治疗心血管性疾病的药物。
文档编号C07K14/435GK101328478SQ20081002764
公开日2008年12月24日 申请日期2008年4月24日 优先权日2008年4月24日
发明者余英才, 徐安龙, 潘岷溟, 禹艳红, 黄慧清, 黄盛丰 申请人:中山大学